יעילות האבחון של miR-362-3p בפלזמה בשילוב עם אולטרסאונד דופלר באבחון סרטן השד

סיכום

שיעור האבחון של סרטן השד נמוך יחסית. שיטת הטבלה המרובע שימשה לניתוח ערך האבחון של miR-362-3p בשילוב עם אולטרסאונד דופלר לסרטן השד. השילוב של אולטרסאונד דופלר ו-miR-362-3p שיפר ביעילות את יעילות האבחון, וסיפק שיטה מבטיחה לאבחון סרטן השד.

תקציר

סרטן השד הוא הגידול הממאיר השני בשכיחותו בעולם, המאיים ברצינות על חיי נשים ומטיל נטל כלכלי כבד. מחקר זה נועד לבחון את הערך של miR-362-3p בשילוב אולטרסאונד דופלר באבחון סרטן השד. בסך הכול נכללו במחקר זה 182 חולות סרטן שד ו-147 מטופלות עם מחלת שד שפירה. רמות miR-362-3p בפלזמה נמדדו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR). מבחן הכי-ריבוע שימש לניתוח ההבדלים בפרמטרים של אולטרסונוגרפיית דופלר בין שתי קבוצות המטופלים. עקומת מאפיין מפעיל המקלט (ROC) שימשה להערכת יעילות האבחון של miR-362-3p, מדד ההתנגדות (RI) ומדד הדופק (PI). יעילות האבחון של אולטרסאונד דופלר בשילוב עם miR-362-3p בפלזמה בסרטן השד נותחה באמצעות שיטת הטבלה הארבעה. רמות miR-362-3p ירדו משמעותית בקרב חולות סרטן השד. היו הבדלים משמעותיים בפרמטרי אולטרסאונד דו-ממדיים. miR-362-3p, RI ו-PI בעלי ערך אבחוני לסרטן השד. ערך האבחון המשולב של שלושת הגורמים היה גבוה יותר. אולטרסאונד בשילוב עם miR-362-3p שיפר משמעותית את הרגישות, הדיוק והערך החיזוי השלילי באבחון סרטן השד. אולטרסאונד דופלר בשילוב עם miR-362-3p עשוי לשפר את יעילות האבחון של סרטן השד, מה שעשוי לספק כלי אבחון לא פולשני ופוטנציאלי עזר לסרטן השד.

מבוא

לפי נתוני הסוכנות הבינלאומית למחקר סרטן, שיעור השכיחות של סרטן השד עלה על שיעור סרטן הריאות בשנת 2020^. סרטן השד הוא גידול ממאיר שמופיע לעיתים קרובות ומהווה סיבה מובילה למוות הקשור לסרטן בקרב נשים ברחבי העולם^. אבחון בזמן של סרטן השד מועיל לתחזית המטופלות. ביופסיית רקמה היא התקן הזהב לאבחון סרטן השד. עם זאת, מדובר באבחנה פולשנית, והיא אינה חלה על מטופלות עם סרטן שד בשלב מוקדם².

אולטרסאונד דופלר הוא טכניקת דימות נפוצה לסקר סרטן השד ואבחון עזר³. אולטרסאונד דופלר יכול להעריך במדויק את גודל הגושים, אותות זרימת הדם, ומצב הגרורות בבלוטות הלימפה⁴. אולטרסאונד דופלר של השד, בשל יתרונותיו כגון היעדר קרינה מייננת, בטיחות ואי-פולשניות, וכן היכולת לבצע בדיקות חזרתיות, הפך לאחת מטכניקות ההדמיה הנפוצות ביותר בסקר ואבחון סרטן השד⁵. עם זאת, אולטרסאונד דופלר נוטה להפריע על ידי רקע הרקמה בעת זיהוי סרטן שד בצפיפות נמוכה או בנפח קטן, מה שמוביל לירידה משמעותית ברגישות האבחנתית ולקשה על מענה לצרכים הקליניים לאבחון מוקדם⁶. לכן, יש צורך לפתח סמנים ביולוגיים בפלזמה שיכולים להתגבר על מגבלות טכנולוגיית אולטרסאונד דופלר. אם השילוב של שתי השיטות יכול לשפר את רגישות האבחון של סרטן השד, יהיה לכך ערך קליני משמעותי ומשמעות מעשית.

מיקרו-RNA (miRNAs) הם קבוצה של מולקולות RNA שאינן מקודדות באורך של כ-20 עד 24 נוקלאוטידים ^7,8. אחת המאפיינים של miRNA היא רמת שימור גבוהה במהלך תהליך האבולוציה. ל-miRNA יש פיזור רקמתי רחב, שאינו מתבטא רק בתאי רקמה אנושיים שונים, אלא גם יכול להתקיים באופן יציב בנוזלי גוף שונים כמו דם ורוק^. מאפייני התפלגות אלו מספקים יתרונות לפיתוח סמנים אבחנתיים לא פולשניים. פונקציונלית, miRNA מפרקים mRNA על ידי קישור משלים ל-3' אזורים לא מתורגמים (UTR)^10,11, ומשתתפים בסדרת תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים מרכזיים כגון תגובות דלקתיות תאיות, לחץ חמצוני, אפופטוזיס, והתרבות והבדילה¹². מספר רב של מחקרים אישרו כי השינויים החריגים בפרופילי ביטוי miRNA היו קשורים קשר הדוק להתרחשות ולהתפתחות סרטן השד^13,14. הפרעה בביטוי miRNA יכולה לקדם את הטרנספורמציה הממאירה של תאי אפיתל השד על ידי ויסות רשתות הביטוי של אונקוגנים או גנים מדכאי גידול. miR-362-3p הוא גורם טיפוסי שמעכב את התקדמות הגידול. דיווחים רבים מצאו כי miR-362-3p עיכב את התקדמות סרטן השד 15,16,17. Assiri ואח' דיווחו כי ביטוי נמוך של miR-362-3p היה קשור קשר הדוק לתחזית לקויה ולהישרדות כוללת קצרה יותר בקרב חולות סרטן השד¹⁵. מבחינה מכנית, miR-362-3p הפעיל אפקט אנטי-גידולי בסרטן השד על ידי התמקדות בהליקאז DEAD-box 5 (DDX5) לקידום התפשטות, פלישה והגירה של תאי סרטן¹⁶. בנוסף, הצוות בראשות קאנג מצא כי miR-362-3p היה מופחת משמעותית ברקמות סרטן השד, ויסות ממוקד של ביטוי miR-362-3p עשוי לשמש כאסטרטגיה טיפולית חדשנית לניהול סרטן השד¹⁷. עם זאת, לא פורסם דיווח האם miR-362-3p יכול לשמש כסמן אבחוני מוקדם לסרטן השד.

מחקר זה מדד את רמת הביטוי של miR-362-3p בפלזמה ובמקביל ניתח את פרמטרי התמונה המרכזיים של אולטרסאונד דופלר בחולות סרטן השד. המחקר בחן לעומק את ערך היישום המשולב של רמות הביטוי miR-362-3p בפלזמה ופרמטרי תמונת אולטרסאונד דופלר, והראה בבירור את יעילות הגישה האבחנתית המשולבת הזו בסקר סרטן השד ובאבחנה שונה בין מחלות שד שפירות לממאירות.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. האישור ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף של אוניברסיטת שאנדונג השנייה לרפואה, בית הספר לרפואה קלינית, אוניברסיטת שאנדונג השנייה לרפואה (מספר אישור: wyfy-2023-ky-124). התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים המעורבים במחקר. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. נבדקים ניסיוניים

חישוב גודל המדגם בוצע באמצעות תוכנת G*Power 3.1 המבוססת על מבחן t מדגם עצמאי. גודל אפקט בינוני (d של כהן = 0.5, בשימוש נרחב במחקרים תצפיתיים קליניים), מבחן דו-זנבי (α = 0.05, ועוצמה (1 − β) = 0.95 נקבע. החישוב הצביע על כך שלפחות 105 משתתפים נדרשו בכל קבוצה. לבסוף, נרשמו 182 מטופלות סרטן השד ו-147 מטופלות עם נגעים שפירים בשד, וגודל המדגם בפועל של שתי הקבוצות עלה בהרבה על גודל המדגם המינימלי הנדרש, מה שהבטיח כוח סטטיסטי מספק לתמיכה במסקנות המחקר ושליטה בסיכון לטעות מסוג II בטווח מקובל. כל המשתתפים נרשמו בקפדנות וברצף לפי קריטריונים מאוחדים של הכללה והחראה.

בשנים 2023 עד 2024, כל המטופלים היו רשומים בבית החולים המסונף של אוניברסיטת שאנדונג השנייה לרפואה, בית הספר לרפואה קלינית, אוניברסיטת שאנדונג השנייה לרפואה. נגעים שפירים: נגעים לא ממאירים אושרו על ידי פתולוגיה. סרטן השד: גידולים ממאירים אושרו על ידי פתולוגיה. נאספו דגימות דם ורידי מכל המשתתפים לאחר צום לילה. דגימות הדם הוורידיים נוגדות קרישה וצנטריפוגה להפרדת הפלזמה, בהתאם לנהלים הסטנדרטיים, ואז הועברו לטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח, אשר שימש לאחר מכן להפקת miRNA. כל דגימות הפלזמה הוגבלו בקפידה לשני מחזורי הקפאה-הפשרה לפני חילוץ ה-RNA כדי למנוע פירוק של miRNA. כל המטופלים קיבלו מידע מלא על פרוטוקול המחקר וקיבלו הסכמה מדעת בכתב מרצון לפני ההרשמה.

קריטריוני הכללה לחולות סרטן השד: (1) מטופלות עם סרטן שד ראשוני שאושר פתולוגית. (2) אין טיפול כירורגי לפני ההרשמה. (3) לא קיבל טיפול קרינתי או כימותרפיה לפני איסוף דגימות.

קריטריוני הכללה למטופלות מחלת שד שפירה: (1) נגעים שפירים בשד שאושרו פתולוגית. (2) ללא גידולים ממאירים מערכתיים אחרים או נגעים טרום-סרטניים. (3) לא בהריון ולא מניק. (4) אין זיהום חריף חמור או מחלת דלקת כרונית.

קריטריוני החרגה לחולות סרטן השד ונגעים שפירים: (1) זיהום שד חמור או מחלה קריטית חריפה. (2) תפקוד כבד או כליה חמור, או מחלה אוטואימונית. (3) מטופלים שקיבלו טיפול הורמונלי בתוך 6 חודשים.

2. בדיקת אולטרסאונד דופלר

השדיים הדו-צדדיים של המטופלת נבדקו ביסודיות בארבעה רבעים באמצעות אולטרסאונד דופלר. סריקת אולטרסאונד דו-ממדית שימשה לתיעוד מאפייני הנגע, כולל גבולות, צורה, הדהוד פנימי, גלי הדהוד אחוריים ויחס גובה-רוחב של הנגע. הדמיית זרימת דופלר צבעונית יושמה להערכת פרמטרי זרימת הדם של הפצע, כולל מדד ההתנגדות (RI), מדד הדופק (PI) ומהירות זרימת הדם המרבית (V_max). אותות זרימת הדם דורגו לפי מערכת סיווג שדווחה קודם¹⁸: דרגה 0: אין אות זרימת דם; דרגה I: אות זרימת דם מינימלי; דרגה II: אורך אות זרימת הדם עולה על חצי מקוטר הנגע; דרגה III: אות זרימת דם בשפע.

3. הגדרה חיובית לאבחון סרטן השד באולטרסאונד

אלה כללו (1) גבולות מעורפלים; (2) צורה לא סדירה; (3) הדהוד פנימי לא אחיד; (4) הדהוד אחורי מוחלש; (5) יחס גובה-רוחב >1; (6) RI > 0.70; (7) PI > 1.50; (8) קצב זרימת דם מרבי (Vmax)> 18.00 ס"מ/שנייה; (9) אות זרימת הדם ≥ דרגה II. כל נגע שעומד באחד מהקריטריונים החשודים לעיל מסווג כחיובי לאולטרסאונד, בעוד שכל נגע ללא מאפיינים חשודים מסווג כשלילי לאולטרסאונד.

4. תגובת שרשרת פולימראז כמותית פלואורסצנציה בזמן אמת (RT-qPCR)

מי-רנ"א של הפלזמה הופקו באמצעות ערכת חילוץ miRNA ייעודית. דגימות ה-RNA שחולצו בהצלחה שימשו לסינתזת cDNA באמצעות ערכות שעתוק הפוך של miRNA ייעודיות. תנאי תגובת שעתוק הפוכה עבור miR-362-3p: הנפח הכולל של תגובה זו היה 20 מיקרוליטר. הליך תגובת ה-PCR היה כדלקמן: (1) התערובת נדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, (2) תגובת השעתוק ההפוכה בוצעה במשך 50 דקות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס, (3) האנזים נוטרל למשך 5 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. המוצר אוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. תנאי התגובה של qPCR: הנפח הכולל של מערכת התגובה היה 20 מיקרוליטר. תנאי ההגברה בוצעו כך: (1) ה-cDNA עבר דנטור מוקדם, והפולימראז הופעל בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. (2) גדילי ה-DNA משנים ומתארכים למשך 30 שניות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. שני השלבים הנ״ל בוצעו בסך הכל במשך 40 מחזורים. הביטוי היחסי של הגנים חושב באמצעות הנוסחה 2^-(ΔΔCt). הביטוי היחסי miR-362-3p כויל על ידי U6. כדי להצדיק את השימוש ב-U6 כבקרה אנדוגנית, היציבות של U6 הוערכה באמצעות אלגוריתם BestKeeper בקוהורט הפלזמה. מקדם השונות (CV) של ערכי U6 Ct בכל הדגימות היה קטן מ-2%, המצביע על יציבות ביטוי גבוהה. לכן, U6 אומת ונבחר כגן ייחוס לנרמול ביטוי miR-362-3p במחקר הנוכחי. הרצף המורד של הפריימרים סופק על ידי הערכה. רצפי הפריימר היו כדלקמן:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCACATATACT.

5. עקומת מאפיין תפעול מקלט (ROC)

מדד יודן שימש לקביעת ערך החיתוך האופטימלי ל-miR-362-3p באבחון סרטן השד על ידי חישוב ערכי הרגישות והספציפיות של עקומת ROC. המודל האבחוני המשולב נבנה באמצעות רגרסיה לוגיסטית בינארית ב-SPSS, כאשר miR-362-3p, RI ו-PI הוזנו כמשתנים בלתי תלויים. משתנים נכללו בשיטת Enter כדי ליצור את ערך ההסתברות החזוי של האבחנה המשולבת עבור כל נבדק. הנוסחה להסתברות החיזוי (PRE): . עקומות ROC צוירו על בסיס ה-PRE. מבחן דלונג שימש להשוואת ההבדלים בערכי Area Under Curve (AUC) בין עקומות ROC שונות.

6. הגדרת פרמטרי התוצאה

פרמטר התוצאה העיקרי היה היעילות האבחנתית הכוללת של המודל המשולב של miR-362-3p בפלזמה ואולטרסאונד דופלר לסרטן השד, כאשר אבחנה פתולוגית היא הסטנדרט הזהב. פרמטרי התוצאה המשניים כללו את ביצועי האבחון של אולטרסאונד דופלר בלבד ופלזמה miR-362-3p בלבד.

7. סטטיסטיקות נתונים

רמות הביטוי של miR-362-3p ועקומות ה-ROC של שתי קבוצות המטופלים נותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. מבחן t שימש להשוואת ההבדלים במשתנים רציפים בין שתי הקבוצות. מבחן החי-ריבוע ושיטת הטבלה המרובע נותחו באמצעות SPSS 26.0. מבחן חי-ריבוע שימש להערכת ההבדלים הסטטיסטיים בין משתנים קטגוריים; השילוב הדו-אינדקסי (miR-362-3p + אולטרסאונד דופלר) נחשב לניתוח הראשוני, המייצג מסקנה אבחנתית איכותנית שגרתית בפרקטיקה הקלינית; אם היו מאפיינים חשודים שנגזרו מסיווג מערכת דיווח ונתוני הדמיית השד (BI-RADS), הנגע הוגדר כחיובי; שיטת הטבלה המרובע שימשה לחישוב הספציפיות, הערך החיזוי החיובי, הערך החיזוי השלילי והדיוק של האבחנה המשולבת של אולטרסאונד דופלר ו-miR-362-3p. תוצאות האבחון בין אולטרסאונד דופלר ל-miR-362-3p כללו חיובי אמיתי (a), חיובי שגוי (b), שלילי שגוי (c) ושלילי אמיתי (d). נוסחת חישוב: רגישות = a / (a + c); ספציפיות = d / (d + b); ערך חיזוי חיובי = a / (a + b); ערך חיזוי שלילי = d / (d + c); דיוק = (a + d) / (a + b + c + d). שלוש שיטות האבחון (miR-362-3p, אולטרסאונד ואבחון משולב) בוצעו באמצעות מבחן Pearson χ² לטבלאות חירום R×C. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

רמת miR-362-3p ירדה באופן משמעותי בקרב חולות סרטן השד

המידע הקליני הבסיסי והמאפיינים הפתולוגיים הקליניים של 182 חולות סרטן השד ו-147 מטופלות עם נגעים שפירים בשד הושוו. הנתונים המפורטים סוכמו בטבלה 1. RT-qPCR שימש למדידת רמות miR-362-3p בפלזמה בשתי קבוצות של מטופלים. התוצאות הראו כי הביטוי במחזור הנפשי של miR-362-3p אצל חולות סרטן השד היה נמוך משמעותית מאשר במטופלות עם מחלות שד שפירות (איור 1A). ני...

דיון

סרטן השד הוא אחד מסוגי הגידולים הממאירים הנפוצים ביותר, והופך לבעיה בריאותית ציבורית משמעותית המאיימת על בריאות האדם^19,20. שיעורי השכיחות והתמותה הגבוהים לא רק גורמים לטראומה פסיכולוגית קשה למשפחות המטופלים, אלא גם יוצרים נטל כבד על החברה והכלכלה. רוב חולות סרטן השד כבר חוו פלישה מקומית או גרורות מרוחקות בזמן האבחון ^21,22. דבר זה מעלה משמעותית את קושי הטיפול ומפחית את שיע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	לאספת דם ורידי והכנת פלזמה לניתוח miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	מכשיר PCR פלואורסצנטי כמותי 96-well עם 6 ערוצים, המשתמש בהולכה בסיבים אופטיים והדמיית CCD קרה, עם איסוף פלואורסצנטי סינכרוני בכל באר ללא עיכוב. הטווח הדינמי מגיע ל-10 סדרי גודל, והוא תואם הן ל-qPCR קונבנציונלי והן לניתוח עקומת התכה בעלת רזולוציה גבוהה (HRM). התוכנה תומכת ביצוא בפורמט RDML, תואמת הן למחקר והן לבדיקות קליניות, ונמצאת בשימוש נפוץ בניסויים כגון כימות ביטוי גנים, טיפוס SNP ונתוח מתילציה.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	משמש להכנת ולביצוע תגובות qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	משמש לאחסון דגימות, הכנת ריאגנטים וצנטריפוגה במהלך חילוץ miRNA ותעתוק לאחור.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	להפרדה ולטיהור של RNA סה"כ כולל miRNA מדגימות פלזמה אנושיות, תוך שימוש בטכנולוגיה מבוססת עמוד ספין.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	לתעתוק לאחור של miRNA מטוהר ל-cDNA של גדיל ראשון באמצעות שיטת הזנב הפולי(A).
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	לגילוי PCR כמותי זמן אמת באמצעות SYBR Green I-based chemistry.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	משמש למבחני PCR כמותי זמן אמת במכשיר Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	גשושית מערך ליניארי בתדר גבוה, עם טווח תדרים של 5–14 MHz, המיועד במיוחד לבדיקת איברים שטחיים כגון השד והתריס. הוא כולל רזולוציה גבוהה וניגודיות רקמות מעולה, ותומך באלסטוגרפיה וסריקת נפח אוטומטית של השד.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	מערכת האולטראסאונד דופלר צבעוני תומכת בהדמיה בזמן אמת בתלת-ממד/ארבע-ממד ותפקודי הדמיית גמישות, והיא נמצאת בשימוש נרחב במחלקות שונות כגון בטן, לב וכלי דם, גינקולוגיה ומיילדות ושד.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	מכשיר PCR מדורג בעל 96 ערוצים, תומך באופטימיזציה של טמפרטורת שיפוע; בעל דיוק בקרת טמפרטורה גבוה; משמש לסינתזת cDNA והגברה ב-PCR קונבנציונלי.