פיתוח פרוטוקול שיקום ווסיקולת COPII ללא תא לחקירת מיון STING במערכת מבוססת תאים HEK-293

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מערכת מותאמת ללא תאים לשיקום שילוב STING בווזיקולות COPII, המאפשרת ניתוח ביוכימי מבוקר של מיון מטען במהלך ייצוא ER.

תקציר

מסלול cGAS–STING הוא מרכיב מרכזי במערכת החיסון המולדת. עם ההפעלה, חלבון STING התושב ברשתית האנדופלזמית (ER) נארז בתוך וזיקולות COPII ומועבר למכשיר הגולג'י כדי להתחיל איתות במורד הזרם. למרות חשיבות התהליך הזה, המנגנונים המולקולריים השולטים במיון STING לוולזיקולות COPII נותרו לא מובנים במלואם. כאן מוצגת זרימת עבודה אופטימלית לשיקום פנימי של וזיקולות COPII במבחנה , כדי להקל על ניתוח מבוקר של בחירת מטען. מתוארת שיטה ניתנת להרחבה להכנת ציטוזול בריכוז גבוה (30–40 מ"ג/מ"ל) מתאי תלייה HEK-293F, בשילוב עם הליך פשוט ליצירת תאי HEK-293T חדירים למחצה כמקור ממברנה מוגדר. בהשוואה למערכות מסורתיות מבוססות תאים, גישה זו משפרת את ההרחבה, מפחיתה עלויות ומשפרת את השחזוריות. באמצעות STING כמטען מודל, ניצנות ושילוב המטען של COPII מאומתים באמצעות ניתוח Western blot, עם יעילות אריזה בסיסית של כ-20% בתנאים מוגדרים. מערכת זו מאפשרת מניפולציה מבוקרת של פרמטרים ביוכימיים, כולל גירוי נוקלאוטידים, כדי להעריך את השפעותיהם על שילוב המטען. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה חזקה וגמישה לחקר מיון מטענים בתיווך COPI וניתן להרחיבו לחקר חלבונים טרנסממברניים נוספים וגורמים רגולטוריים המעורבים בייצוא ER.

מבוא

מסלול האיתות cGAS-STING משמש כמנגנון יסודי במערכת החיסון המולדת, ומזהה DNA דו-גדילי ציטוזולי (dsDNA) כדי להתחיל תגובה אנטי-ויראלית. לאחר זיהוי dsDNA, האנזים cGAS מייצר את הדינוקלאוטיד המחזורי cGAMP, הפועל כשליח שני הנקשר ל-STING ^1,2. חשוב לציין ש-STING שוכנת כדימר לא פעיל ברשתית האנדופלזמית (ER) במצב יציב³. הפעלתו דורשת העברה מהירה ומוסדרת היטב מה-ER למכשיר הגולג'י. בגולג'י STING מגייס ומפעיל את הקינאזות TBK1 ו-IRF3 במורד הזרם, מה שמוביל לייצור אינטרפרונים מסוג I וציטוקינים פרו-דלקתיים⁴.

ההובלה של STING מתווכת על ידי וזיקולות מצופות COPII, הכלים האוניברסליים לייצוא חלבונים מה-ER⁵. הרכבת שכבת COPII — הכוללת את ה-GTPase Sar1 הקטן, קומפלקס Sec23/24 הפנימי של השכבה הפנימית Sec13/31 — אחראית הן לעיוות ממברנת ה-ER לווסיקולות והן לגיוס סלקטיבי של מטען ^6,7. Sec22b ממויין לווסיקולות COPII באמצעות אפיטופ מבני המוכר על ידי קומפלקס Sec23/24 של COPII⁸. מטענים נוספים כוללים את משפחת p24 ואת הסמן ERGIC ERGIC-53, ששניהם תלויים במוטיב דיהידרופובי φC בקצה C למיון⁹. לעומת זאת, חלבונים מסוימים המעוגנים ב-ER, כמו ריבופורין I (RPN1), נשארים מוגבלים ל-ER ומשמשים כסמנים למבני ER שלמים, שכן הם אינם מועברים דרך וזיקולות COPII¹⁰. כתוצאה מכך, בניסויי שיקום וזיקולות COPII ללא תאים, Sec22b ו-p24 נחשבים לעיתים קרובות כמטעני COPII, בעוד שריבופורין משמש כסמן לניטור זיהום ER בתכנות וזיקולות. בעוד שהמנגנון הכללי של הובלת COPII מאופיין היטב, הרמזים המולקולריים הספציפיים שמפעילים את הבידוד הסלקטיבי של STING מופעל לתוך הווסיקולות הללו עדיין בלתי מושגים. הבנת מנגנוני המיון הללו חיונית, שכן חוסר ויסות בהעברת STING קשור למחלות אוטואימוניות ודלקתיות שונות, כגון וסקולופתיה הקשורה ל-STING עם הופעת התינוקות (SAVI) ותסמונת COPA¹¹. עם זאת, חקר אירועים חולפים ודינמיים אלה בתאים שלמים נותר אתגר טכני.

כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחה מערכת שיקום מותאמת ללא תאים כדי לבחון את הדרישות המולקולריות של מיון מטענים בתיווך COPI. בעוד שבדיקות ניצנות במבחנה הן מזה זמן רב מרכיב מרכזי בביולוגיית התא¹², האימוץ הנרחב שלהן מוגבל לעיתים קרובות בשל העלות הגבוהה והמורכבות של הכנת רכיבים איכותיים. במחקר זה הוכנס תהליך עבודה יעיל המשתמש בתאי תלייה HEK-293F כמקור כלכלי לתאי HEK-293T פעילים ותאי HEK-293T חדירים למחצה כתורם ממברנה עמיד. זרימת העבודה הכוללת של מערכת שיקום וזיקולות COPII ללא תא מוצגת באיור 1. במערכת זו, Sec22b שימש כבקרה חיובית לאישור הטמעת מטען בווזיקולות, בעוד RPN1 שימש כבקרה שלילית למעקב ושלילת זיהום ממברנת ER. באמצעות STING כמטען הוכחת מושג, מחקר זה הראה שהמערכת מדמה ביעילות היבטים ביוכימיים חיוניים של מיון STING. פלטפורמה זו סיפקה כלי רב-שימושי וניתן להרחבה לזיהוי גורמים ציטוזוליים ואותות ממברנה השולטים במיון STING, עם יישומים פוטנציאליים לחקר מגוון רחב של מסלולי הובלה וזיקולריים נוספים.

פרוטוקול

קווי התאים HEK-293F (RRID: CVCL_6642) ו-HEK-293T (RRID: CVCL_0063) התקבלו ממרכז משאבי התאים במכללת הרפואה של פקין יוניון. שני קווי התאים אומתו באמצעות פרופילינג קצר של חזרה טנדם (STR) ואושרו כי הם נקיים מזיהום מיקופלסמה. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

לא השתתפו בני אדם או בעלי חיים חולייתיים במחקר זה. לכן, לא נדרש אישור אתי. כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

1. הכנת ציטוזול תא HEK-293F

1. תאי HEK-293F זרעים בצפיפות של 1 × 10⁶ תאים למ"ל בתווך תרבית יונקים מוגדרת ב-100 מ"ל, עם תוספת של 1% פניצילין–סטרפטומיצין. תרבית את התאים בבקבוק קוני של 500 מ"ל.
2. דגרו את תרבית המתלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ באינקובטור ניעור למשך 60 שעות.
3. קצור את התאים בצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. קבעו את מספר התאים הכולל באמצעות מונה תאים אוטומטי.
4. שטפו את כדור התא עם 50 מ"ל מלח קר עם מפופר פוספט (PBS). צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. החזירו את כדור התא בנפח שווה של בופר B88 קר (20 mM HEPES, pH 7.3; 250 mM סורביטול; 150 mM אשלגן אצטט; 5 mM מגנזיום אצטט).
6. ליז את התאים על קרח על ידי העברת המתלה דרך מזרק 5 מ"ל המצויד במחט 22 ליותר מ-100 פעימות.
7. בדוק את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופיה אור. הסר שאריות תאים בצנטריפוגה ב-20,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. העבר את הסופרנטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה ב-100,000 × גרם לשעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
   אזהרה: ודאו שצינורות האולטרה-צנטריפוגה מאוזנים כראוי כדי למנוע נזק לציוד וסיכוני בטיחות.
9. אסוף את הסופרנטנט המובהר. ריכזו את הדגימה באמצעות מכשיר אולטרה-פילטרציה של 3 kDa במשקל חיתוך מולקולרי (MWCO) בטמפרטורה של 4,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
10. מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA). כוון את הריכוז ל-30–40 מ"ג/מ"ל.
    אזהרה: לטפל בחנקן נוזלי עם ציוד מגן מתאים כדי למנוע פגיעות קריוגניות.
11. Aliquot הציטוזול. הקפיאו את האליקוות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס (איור 2A)
    אזהרה: הימנע מיותר משני מחזורי הקפאה-הפשרה. אחסן אליקווט בטמפרטורה של −80°C עד 6 חודשים.

2. הכנת תאי HEK-293T חדירים למחצה

1. תאי HEK-293T בלוחות המבטאים STING אנושי באורך מלא בצפיפות של 3 ×-10⁶ תאים לכל צלחת של 15 ס"מ ב-15 מ"ל DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
2. קצור את התאים בנקודת חיבור של כ-60%.
3. שאוף את המדיום ושוטף את התאים פעמיים עם 10 מ"ל PBS קר מאוד.
4. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין–EDTA. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 2–3 דקות כדי לנתק את התאים.
5. הוסף 200 מיקרוליטר מעכב טריפסין סויה (1 מ"ג/מ"ל) כדי לעצור את הטריפסיניזציה. החזירו את התאים לבופר KHM קר של 10 מ"ל (20 מ"מ HEPES, pH 7.2; 110 מ"מ מול אצטט אשלגן; 2 מ"מ מגנזיום אצטט).
6. הפל את התאים בצנטריפוגציה ב-250 × גרם למשך 3 דקות. זרוק את הסופרנטנט.
   אזהרה: דיגיטונין הוא רעיל. תטפלו במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.
7. החזירו את התאים לבופר KHM קר של 6 מ"ל. הוסף תמיסת מלאי דיגיטונין של 6 מיקרוליטר (40 מ"ג/מ"ל ב-DMSO).
8. מערבבים בעדינות באמצעות היפוך. דגר על קרח במשך 5 דקות.
9. הוסף בופר של 8 מ"ל KHM כדי לדלל את הדיג'יטונין. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 3 דקות לאיסוף תאים חדרים.
10. החזירו את הכדור ל-14 מ"ל בופר HEPES קר (50 מ"מ HEPES, pH 7.3; 90 מ"מ אצטט אשלגן 90 מ"מ). דגרו על קרח במשך 10 דקות.
11. צנטריפוגה ב-250 × גרם למשך 3 דקות. החזיר את הכדור ל-1 מ"ל KHM קר קרח· בופר Cl (20 mM HEPES, pH 7.3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. צנטריפוגה ב-10,000 × גרם ל-15 שניות. זרוק את הסופרנטנט.
13. החזירו את הכדור ל-50 מיקרוליטר KHM· בופר קל. מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA והתאימו ל-5–7 מ"ג/מ"ל.

3. ניסוי שיקום וזיקולת COPII ללא תאים

1. הכינו את כל החומרים המופיעים בטבלת החומרים. אליקווט ואחסן בטמפרטורה של −80°C.
2. הכינו תערובת תגובה של 50 מיקרוליטר המכילה 110 מילימטר KCl, 20 מ"מ HEPES (pH 7.2), 2 מ"מ MgCl₂, קוקטייל מעכב פרוטאז (1×), 0.2 מ"מ GTP, ומערכת רגנרציה של ATP (40 מ"מ קריאטין פוספט, 0.2 מ"מ ל-מ"ל קריאטין פוספוקינז, 1 מ"מ ATP).
3. הוסיפו את cGAMP לריכוז סופי של 10 מיקרומון. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
4. הוסף 50 מיקרוגרם תאי HEK-293T חצי-חדירים. ערבב בעדינות.
5. הוסף ציטוזול HEK-293F של 80 מיקרוגרם כדי להתחיל את היווצרות וזיקולות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
6. מניחים את התגובה על קרח כדי לסיים את הנביטה. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. אסוף את הסופרנטנט המכיל וזיקולות. שמור על הכדור המכיל אברונים.
8. אולטרצנטריפוגה של הסופרנטנט ב-100,000 × גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החזירו את כדור הווסיקולה ל-30 מיקרו-ליטר בופר טעינת חלבון.
9. דגימות חום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-20,000 × גרם למשך 5 דקות להסרת משקעים.
10. לבצע SDS-PAGE ולהעביר חלבונים לממברנות PVDF. גלאי עם נוגדנים נגד Sec22b, STING ו-RPN1.

תוצאות

במהלך הכנת ציטוזול תא HEK-293F, הוערכו שני פרמטרים להערכת איכות הציטוזול. תאי HEK-293F גודלו בצפיפות גבוהה, והניבו תמציות ציטוזוליות עם ריכוזי חלבון גבוהים. בנוסף, היקף ההפרעה בתאי לאחר ליזזה מבוססת מזרק הוערך במיקרוסקופיה אורית, מה שאישר ניתוק יעיל של התא בתנאים המיושמים (איור 2B).

לצורך יצירת תאי HEK-293T חדירים למחצה, התרביות נאספו בכ-60% מפגש גוף. בשלב זה, האברונים התוך-תאיים נראו מפוזרים היטב ושלמים מורפולוגית, כפי שנצפה במיק...

דיון

ההרכבה מחדש של תגובות ביוכימיות חיוניות במבחנה הניחה את היסודות למערכות ללא תאים, שהיו גורם מרכזי בגילויים פורצי דרך רבים. אלה כוללים זיהוי cGAS כחיישן DNA ציטוזולי^14,15, הבהרת תפקיד הציטוכרום c באפופטוזיס, וגילוי הדמתילאז ההיסטוני הראשון, JHDM1^16,17. גישות ביוכימיות מוגדרות כאלה עוצמתיות במיוחד לניתוח שלבים צמודים בסחר ב-STING, מהיציאה מהרשתית האנדופלזמית (ER) ו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרקים סטריליים של 5 מ"ל	WEGO	V526273	משמש לניתוח מכני של תאים
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט (ATP)	MCE	HY-B2176	מלאי של 100 מ"מ במים, pH 7.3, מאוחסן ב-& מינוס; 80 & deg; C
אדובי אילוסטרייטור	אדובי סיסטמס אינקורפורייטד	SCR_010279	משמש ליצירת איורים קונספטואליים ודיאגרמות סכמטיות
מערכת רגנרציה של ATP (10×)	—	—	תערובת מתחדשת אנרגיה המכילה קריאטין פוספט, קריאטין קינאז ו-ATP
ערכת בדיקת חלבון BCA	תרמו פישר	23227	בדיקת חלבון קולורימטרית
BioRender	BioRender	SCR_018361	משמש ליצירת איורים קונספטואליים ודיאגרמות סכמטיות
BSA	ביאוריג'ין	BN20815	תגובת חסימה
חממת ניעור פחמן דו-חמצני	ג'יצ'ו	ZCZY-CS8	שומר על טמפרטורה, CO<תת->2, וערבוב לצורך תרבית השעיה
חממת CO2	תרמו פישר	3110	שומר על טמפרטורה ו-CO2 עבור תרבית דבק
מיקרוסקופ קונבנציונלי	אולימפוס	CX43	משמש להערכת ניתוק תאים ומורפולוגיה
קריאטין קינאז	רוש	CKRO	20 מ"ג/מ"ל במאגר בבופר, מאוחסן ב-& מינוס; 80 & deg; C
קריאטין פוספט	רוש	CRPHO-RO	רכיב במערכת ההתחדשות של ATP
צנטריפוגה שולחנית	אפנדורף	5810R	משמש לצנטריפוגציה במהירות נמוכה
דיגיטונין	סיגמא	D5628	מלאי 40 מ"ג/מ"ל ב-DMSO, מאוחסן ב-& מינוס; 20 ודרגה C
DMEM	קורנינג	10-013-CMR	מדיום גדילה לתאי HEK-293T
D-סורביטול	סאנגון	A100691	תמיסת מלאי של 1 מטר במים, מאוחסנת ב-4&g; C
מגיב זיהוי ECL	ביאוריג'ין	BN16009	מצע כימילומינסנטי
מיכל אלקטרופורזה	ביו-ראד	1658001	Apparatus for SDS-PAGE
סרום בקר עוברי (FBS)	קורנינג	35-015-CV	תוסף סרום
רוטור בזווית קבועה (TFT 80.2)	תרמו פישר	54456	רוטור לאולטרה-צנטריפוגציה
תאי FreeStyle 293-F	תרמו פישר	R79007	משמש להכנת ציטוזול
IgG נגד עכבר עזים (H+L)	Invitrogen	31430	נוגדן משני מצומד ל-HRP
עז נגד ארנב IgG (H+L)	Invitrogen	31460	נוגדן משני מצומד ל-HRP
פריזמת GraphPad	תוכנת GraphPad	SCR_002798	משמש לביצוע ניתוח סטטיסטי (ANOVA חד-כיווני) וליצירת גרף עמודות כמותי באיור 4D.
גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט (GTP)	MCE	HY-113225	מלאי מים של 10 מ"מ, pH 7.3, מאוחסן ב-& מינוס; 80 & deg; C
תאי HEK-293T המבטאים סטינג אנושי	—	—	נוצר בתוך הארגון; משמש כמקור ממברנה
בופר HEPES (1 מ', pH 7.3)	ביוטיים	C0215	רכיב בופר להכנת תמיסה
מערכת הדמיה	ביו-ראד	12003153	משמש לזיהוי אותות
מגנזיום אצטט טטרהידרט	המפטון ריסרץ'	HR2-561	רכיב בופר להכנת B88
מגנזיום כלוריד הקסיהידרט	המפטון ריסרץ'	HR2-559	רכיב מאגר
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	5420R	משמש לצנטריפוגציה במהירות בינונית
מיקרוצנטריפוגה	אפנדורף	5420	משמש לצנטריפוגה שגרתית
ספקטרופוטומטר ננו-טיפה	תרמו פישר	840-317400	משמש לכימות חלבונים
מדיום OPM-CD Trans293	OPM	P82019	מדיום ללא סרום לתרבות מתלים HEK-293F
פניצילין– סטרפטומיצין (100×)	סרוויסביו	G4003	תוסף אנטיביוטי לתרבות תאים
פנילמתיל סולפוניל פלואוריד (PMSF)	סאנגון	A610425	מעכב פרוטאז
מעכבי פוספטאז	Lablead	C0104	מניעת דה-פוספורילציה של חלבונים
סליין ממוגן בפוספט (PBS)	סרוויסביו	G4202	בופר לשטיפת תאים
אשלגן אצטט	סיגמא	236497	תמיסת מלאי של 1 מטר במים, מאוחסנת ב-4&g; C
אספקת חשמל	ביו-ראד	1645052	מספק מתח לאלקטרופורזה
קוקטייל מעכב פרוטאז, ללא EDTA	רוש	4693132001	תערובת מעכבי פרוטאז רחבת טווח
ממברנת PVDF	מיליפור	ISEQ00010	ממברנה ל-Western Bloting
נוגדן RPN1 (mAb של ארנב)	אבקאם	ab197888	סמן חדר מיון
SDS-PAGE gel (4– 20%)	—	—	משמש להפרדת חלבונים
בופר טעינה SDS-PAGE (5×)	סולרביולוגיה	P1040	בופר להכנת דגימת חלבון
נוגדן Sec22b (ארנב mAb)	אבקאם	ab181076	סימן מטען COPII
מעכב טריפסין סויה (SBTI)	סיגמא	T9128	מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS, מאוחסן ב-& מינוס; 20 ודרגה C
נוגדן STING (mAb של ארנב)	CST	13647	נוגדן ראשוני
בופר TBST	סרוויסביו	G0004	שטיפה של בופר לאימונובלוטינג
מחזור תרמי	ביו-ראד	186-1096	משמש לחימום ודגירה
אמבט מתכת תרמוסטטי	DLAB	5062102100	שומר על טמפרטורה קבועה
תא העברה	ביו-ראד	1703930	משמש להעברת חלבון
טריפסין-EDTA (0.25%)	סרוויסביו	G4011	משמש לניתוק תאים
אולטרה-צנטריפוגה	תרמו פישר	75000100	משמש לצנטריפוגציה במהירות גבוהה
צינורות אולטרה-צנטריפוגה (2 מ"ל)	תרמו פישר	54460	שפופרות התואמות לאולטרה-צנטריפוגציה
צינור אולטרפילטרציה (4 מ"ל, 10 קילודאלטון MWCO)	מיליפור	UFC8010	משמש לריכוז ציטוזולים