בדיקה מבוססת אימונופלואורסצנציה לזיהוי מוקדי RAD51 גרעיניים כסמן לתיקון רקומבינציה הומולוגית בתאי סרטן שחלות

סיכום

מוקדי גרעיני RAD51 הם סמן לפעילות רקומבינציה הומולוגית (HR). מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לאימונופלואורסצנציה לזיהוי מוקדים אלו בתאי סרטן, המאפשרת הערכת תפקוד דופק הדופק ותמיכה בחקירה פרה-קלינית של תגובות לסוכנים המזיקים ל-DNA.

תקציר

RAD51 הוא חלבון מרכזי במסלול הרקומבינה ההומולוגית (HR) וחיוני לתיקון מדויק של שבירות DNA כפולות (DSBs). לאחר היווצרות DSB, כריתת קצה ה-DNA מייצרת סובסטרטים חד-גדיליים של DNA שמסייעים בגיוס והרכבה של סיבי נוקלאופרוטאין RAD51 באתרי נזק. תהליך זה מוביל להיווצרות מוקדי RAD51 גרעיניים בדידים, המשמשים כקריאה תפקודית מקובלת של פעילות HR וסמן חלופי למיומנות HR. מכיוון שפגמים בדופק נפוצים במספר ממאירות, במיוחד סרטן השחלות והשד, הערכת יצירת מוקדי RAD51 הפכה לגישה חשובה להערכת יכולת תיקון DNA ולחיזוי תגובה לטיפולים המזיקים ל-DNA, כולל תרכובות פלטינה ומעכבי פוליאמוראז (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP), שיעילותם מושפעת מאוד ממצב תיקון הדוR. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט, אמין וניתן לשחזור מבוסס אימונופלואורסצנציה לגילוי וכימות של מוקדי גרעיני RAD51 בתאי סרטן שחלות מתורבת. השיטה כוללת השראת נזק ל-DNA באמצעות קרינה מייננת (IR), לאחר מכן קיבוע קבע, צביעת חיסון בנוגדנים נגד RAD51 ו-γH2AX, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח כמותי ידני של מוקדי RAD51/γH2AX המקומיים. הפרוטוקול יכול להיות מיושם בתנאים בסיסיים או לאחר הפרעות גנטיות ופרמקולוגיות כדי לקבוע את השפעותיהן על תפקוד הדוHR. תוצאות מייצגות מראות השראה חזקה של מוקדי RAD51 בתאי סרטן שחלה מיומנים בדופק לאחר נזק ל-DNA, בעוד שהידלדול RAD51 מפחיתה משמעותית את היווצרות המוקדים למרות רמות דומות של DSBs, מה שמאשר את הספציפיות לבדיקה. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק מבחן פונקציונלי חזק וניתן לשחזור להערכת כשירות משאבי אנוש, עם יישומים רחבים במחקר פרה-קליני ואולי גם במחקר סרטן תרגומי.

מבוא

שבירות DNA כפולות (DSBs) הן מהצורות החמורות ביותר של נזק ל-DNA, מכיוון שתיקון לא מדויק עלול לפגוע ביציבות הגנום ולתרום להתפתחות גידול או למוות תאים ^1,2,3. כדי להתמודד עם איומים אלו, תאים משתמשים במספר מסלולי תיקון DNA, כולל רקומבינציה הומולוגית (HR), הנחשב למנגנון המדויק ביותר לתיקון^{DSBs 2,4,5}. בניגוד למסלולי תיקון המועדים לשגיאות, HR משתמש ברצף DNA הומולוגי כתבנית לשחזור מידע גנטי באתר הפגוע. כתוצאה מכך, HR פועל בעיקר במהלך שלבי S ו-G2 של מחזור התא, כאשר כרומטידות אחיות זמינות לשמש כתבניות תיקון ^2,5. ראוי לציין כי HR חיוני לתיקון מדויק של DSBs הנובעים ממקורות אנדוגניים כגון לחץ שכפול, וכן פגיעות חיצוניות כולל קרינה מייננת (IR) וסוכנים כימותרפיים המזיקים ל-DNA^2,5.

RAD51 הוא אפקטור מרכזי של מסלול הדוR ומשחק תפקיד קריטי בחיפוש הומולוגיה ובפלישת חוטים במהלך תיקון מתווך HR של^{DSBs 2,5}. לאחר היווצרות DSB, קצות ה-DNA עוברים כריתה, תהליך שמתחיל על ידי קומפלקס MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) והגורמים הנלווים שיוצר בליטות DNA חד-גדיליות בגובה 3′. אזורים חד-גדיליים אלו מצופים תחילה בחלבון שכפול A (RPA), שמונע היווצרות מבנה משני ומייצב את ביניים^{התיקון 4,5,6}. לאחר מכן מתחילה HR באמצעות פעולות מתואמות של BRCA1, PALB2 ו-BRCA2, שמאפשרות גיוס וטעינת RAD51 על DNA שנלקח, מזיזות את RPA ומקדמות יצירת סיבי נוקלאופרוטאין^{המכילים} RAD51 ^4,5,6. לאחר ההרכבה, הסיבים הללו מחפשים רצפי DNA הומולוגיים בתוך הכרומטידים האחות ומזרזים את חילופי הגדלים, ובכך מאפשרים שיקום נאמן של ה-DNA^{הפגוע 4,5,6}. הצטברות RAD51 באתרי DSB נראית מיקרוסקופית כמוקדים גרעיניים מנוקדים שניתן לזהות באמצעות אימונופלואורסצנציה 7,8,9,10. מכיוון שהיווצרות מוקדים אלו משקפת הפעלה מוצלחת של מנגנון הדופק, ניתוח מוקדי RAD51 הפך לגישה פונקציונלית נפוצה להערכת קיבולת הדופק ומיומנות תיקון DNA בתאים 7,8,9,10. חשוב לציין כי בדיקה זו מודדת את יכולת התאים לבצע תגובה דופק לאחר נזק ל-DNA במקום להסתמך רק על רמות הביטוי של גנים או חלבונים הקשורים ל-HR.

פגמים בדופק נצפים לעיתים קרובות בסרטן, במיוחד בגידולים עם שינויים בפרלוגי BRCA1, BRCA2, RAD51 או גנים אחרים המעורבים בדופק, והם נפוצים במיוחד בסרטן השחלות והשד 4,11,12,13,14. לחסר בדופק יש השלכות טיפוליות חשובות, שכן הוא מעניק רגישות מוגברת לחומרים המזיקים ל-DNA כגון טיפול בפלטינה ולמעכבי פוליאטרל (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) באמצעות עקרון הקטלנות הסינתטית 4,11,12,13,14,15 . כתוצאה מכך, מבחנים פונקציונליים אמינים להערכת פעילות HR הם קריטיים הן למחקרים מכניים והן למחקר תרגומי.

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת אימונופלואורסצנציה לזיהוי וכימות של מוקדי RAD51 גרעיניים לאחר נזק ל-DNA בתאי סרטן שחלה. תהליך העבודה כולל השראה של DNAs DSB באמצעות IR, ולאחר מכן זיהוי אימונופלואורסצנטי של RAD51 ו-γH2AX וכימות של מוקדי גרעין מקומיים במיקרוסקופיה קונפוקלית. הפרוטוקול מודגם באמצעות תאי OVCAR-8 מיומנים ב-HR ותאי ABT^R2 עמידים למעכבי PARP ומספק גישה תפקודית לשחזור להערכת פעילות HR לאחר היווצרות DSB. למרות שניתוח מוקדי RAD51 משמש באופן נרחב כמדד פונקציונלי לפעילות דומ אדם, השיטות הזמינות מתמקדות לעיתים קרובות בסביבות ניסוי ספציפיות ולעיתים קרובות חסרות הנחיות מפורטות לשילוב השראה מבוקרת של נזק DNA, אישור יצירת DNA, בקרות אימות בדיקות וכימות מבוסס תמונה סטנדרטי. בנוסף, גישות חלופיות להערכת תפקוד הדופק, כולל בדיקות צלקות גנומטיות, חתימות מוטציות וניתוחי ביטוי גנים או חלבונים, מספקות מדידות עקיפות למצב הדופק ואינן מעריכות ישירות את היכולת התאית לגייס RAD51 לאתרי נזק DNA. בדיקות מבוססות דיווח כמו DR-GFP מציעות מדידות ישירות של פעילות HR אך דורשות הנדסה גנטית יציבה ואינן ישימות בקלות על מודלים ניסיוניים רבים. לכן, זרימת העבודה המתוארת כאן משלבת נזק DNA המושרה על ידי IR עם צביעת אימונופלואורסצנציה כפולה של RAD51/γH2AX כדי לאמת בו-זמנית את יצירת DSB וכימות גיוס RAD51 לכרומטין פגוע. גישה זו מספקת שיטה מעשית, ביולוגית רלוונטית ורחבה להערכה פונקציונלית ישירה של מיומנות HR בתאי סרטן מתרבתים, תוך שילוב בקרות בדיקה, שלבי אימות ונהלי כימות מוקדים סטנדרטיים.

פרוטוקול

כל החומרים והתגובות המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים, כולל מידע על יצרן, מספרי קטלוג ודילול נוגדנים. סקירה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

הערה: קווי התאים של סרטן השחלות OVCAR-8 ו-ABT^R2 משמשים בפרוטוקול זה ותוארו בעבר 15,16,17,18,19,20. תאי OVCAR-8 סופקו בנדיבות על ידי ד"ר לארי קרניץ (Mayo Clinic), שקיבל אותם במקור מד"ר דומיניק סקודיירו (המכון הלאומי לסרטן, NIH). תאי ABT^R2 סופקו בנדיבות על ידי ד"ר סקוט קאופמן (Mayo Clinic)²⁰. ABT^R2 הוא נגזרת עמידה ל-PARPi של BRCA2.-קו תאי סרטן השחלות PEO1 שקיבל עמידות באמצעות שיקום ביטוי BRCA2. מכיוון ששיקום BRCA2 חידש את פעילות הטעינה וה-HR של RAD51, תאי ABT^R2 משמשים כמודל מייצג למיומנות ב-HR. זהות קו התא אומתה על בסיס מקור המקור ותכונות מבוססות שדווחו בספרות 15,16,17,18,19,20. ניסויים בוצעו באמצעות תאי מעבר נמוך (מעברים 3–12) שנשמרו בתרבית לא יותר מחודש לאחר הפשרה. קווי התאים נבדקו באופן שגרתי לזיהום מיקופלזמה כל 6 חודשים באמצעות ערכת זיהוי מיקופלסמה, וכל התרביות ששימשו במחקר זה אושרו כנטולות מיקופלסמה.

אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ויש להכין ולטפל בו באמצעות מכסה אדים כימי מוסמך תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים. קווי תאים שמקורם בבני אדם צריכים להיות מטופלים בהתאם לנהלי בטיחות ביולוגית מוסדיים תוך שימוש בפרקטיקות בידוד מתאימות. יש לטפל ב-Triton X-100, מדיום ההתקנה ולק לציפורניים בהתאם להמלצות הבטיחות של היצרן. יש לנהל IR רק על ידי אנשי מקצוע מיומנים ובהתאם למדיניות בטיחות קרינה מוסדית. להשליך פסולת כימית, ביולוגית ופסולת הקשורה לקרינה בהתאם לדרישות מוסדיות ורגולטוריות מקומיות.

1. תרבית תאים ותחזוקה

1. תאי תרבית במכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI)-1640 הוסבו עם 8% סרום בקר עוברי באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   הערה: תנאי התרבית הללו תואמים לאלו ששימשו במחקרים קודמים שלנו על תאי OVCAR-8 ו-ABT^R2 15,16,17,18,19. בתנאים אלו, שני קווי התאים מציגים גדילה חזקה ופנוטיפים ניתנים לשחזור של נזק DNA.
2. אם רוצים, יש לבצע הפרעות (למשל, הפלת גנים/השמדת גנים), בהתאם לתנאים ניסיוניים אופטימליים^15,17.
   הערה: בפרוטוקול זה, הפלה מתווכת siRNA של RAD51 מוצגת כדוגמה מייצגת להפרעה גנטית לפני ניתוח אימונופלואורסצנציה.
   1. הכינו 5 ×-10⁶ תאים ב-180 מיקרוליטר RPMI-1640 בתוספת 8% סרום בקר עוברי.
   2. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת siRNA של 20 מיקרומום (2 מיקרומום siRNA לכל טרנספקציה) וערבב בעדינות.
      הערה: השתמש ב-siRNA הבאים: siRNA לוסיפראז בקרה לא ממוקד (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAAA-3′. כל ה-siRNA נרכשו מ-Horizon Discovery.
   3. העבר את מתלה התא לקובט אלקטרופורציה של 4 מ"מ.
   4. אלקטרופורט תאים באמצעות אלקטרופורטור BTX ECM 830 עם שני פולסים של 10 מילישניות ב-280 וולט.
   5. העבירו את התאים למדיום גדילה מלא ודגרו בתנאי תרבית סטנדרטיים בצלחת בגודל 10 ס"מ למשך 24 שעות.
   6. חזרו על אלקטרופורציית siRNA באותם תנאים המתוארים בשלבים 1.2.1–1.2.4.
   7. דגרו את התאים בתנאי תרבית סטנדרטיים בצלחת של 15 ס"מ למשך 48 שעות נוספות.
   8. זרעו חלק מהתאים לבדיקת האימונופלואורסצנציה כפי שמתואר בשלב 2. שמרו את התאים הנותרים לאימות RAD51 knockdown באמצעות אימונובלוטינג.
   9. אימות הפלת RAD51 על ידי אימונובלוטינג
      1. תאי ליז בבופר ליזיס קר המכיל 50 מ"מ HEPES (pH 7.6), 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1% טריטון X-100, 10 מ"מ נפר, 30 מ"מ פירופוספט נתרן, 1 מ"מ Na₃VO₄, 10 מ"מ β-גליסרופוספט, וקוקטייל מעכב פרוטאז (טבליה אחת לכל 10 מ"ל בופר ליזיס).
      2. ניקוי הליזאטים באמצעות צנטריפוגה ב-18,800 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי וקבע ריכוז חלבון באמצעות מבחן חלבון מתאים.
      3. ערבבו כמות מתאימה של חלבון ליזאט עם בופר דגימות 4× Laemmli כדי להגיע לריכוז סופי של 1×.
      4. הוסיפו β-מרקפטואתנול לריכוז סופי של 20%, וחממו את הדגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות לפני SDS-PAGE.
      5. הפרדו כמויות שוות של חלבון באמצעות SDS-PAGE והעבירו חלבונים לממברנה מתאימה לניתוח אימונובלוט.
      6. חסום את הממברנה בחלב 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור.
      7. שטפו את הממברנה שלוש פעמים (5 דקות כל אחת) עם 1× טריס-בופר מלח עם טווין 20 (TBST) בטמפרטורת החדר עם ניעור.
      8. דגרו את הממברנה בנוגדן אנטי-RAD51 פוליקלונלי של ארנב (דילול 1:1,000) או נוגדן אנטי-אקטין (דילול 1:1000) בטמפרטורה של 4°C למשך 16–18 שעות עם ניעור.
      9. שטוף את הממברנה עם 1× TBST (5 דקות כל אחד) בטמפרטורת החדר עם ניעור.
      10. דגרו את הממברנה בנוגדן משני נגד ארנבות או עכבר עם ניעור נוגדן משני נגד ארנבות או עכבר (1:10,000 דילול) למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור.
      11. שטוף את הממברנה עם 1× TBST (5 דקות כל אחת) בטמפרטורת החדר עם ניעור, וזיהוי רצועות אימונוריאקטיביות באמצעות שיטת זיהוי כימילומינסנציה מתאימה, ואישור דלדול RAD51 ביחס לתאים שהועברו עם siRNA הבקרה הלא-מכוונת.

2. זריעת תאים

1. כאשר התאים מגיעים לשלב הגדילה הלוגריתמי (כ-70–80% מפגש גוף), שאופים את מדיום התרבית ושוטפים בעדינות את התאים פעם אחת עם תמיסת מלח סטרילית עם בופר פוספט (PBS) כדי להסיר סרום שנותר.
2. הוסיפו מספיק תמיסת טריפסין–EDTA של 0.25% כדי לכסות את שכבת התא המונולרית (למשל, 1–2 מ"ל לבקבוק T175) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2–5 דקות, תוך ניטור היפרדות התאים תחת מיקרוסקופ.
3. לאחר שהתאים נפרדו, יש לנטרל מיד את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית מלא המכיל FBS.
4. אסוף את תליית התא לתוך צינור קוני של 15 מ"ל
5. קבעו את הקיימות והריכוז של התאים באמצעות הדרת טרייפן בלו והמוציטומומטר או מונה תאים אוטומטי לפני הזריעה.
6. הכינו תלייה חד-תאית במדיום גדילה מלא בריכוז של 4 ×-10⁴ תאים/מ"ל.
7. זרע 200 מיקרוליטר של תליית התא לכל באר של מחסנית זכוכית בת 8 בארות להשגת צפיפות סופית של 8,000 תאים בכל באר.
8. דגרו את מחלקות התא למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ כדי לאפשר חיבור תאים.
   הערה: מספר התאים לזריעה עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא. הכן מתלה תא עודף מספיק לפחות לבאר אחת נוספת כדי להתחשב בשונות הפיפטינג. זרע כל תנאי בכפילה או יותר כדי להבטיח שחזוריות. אם רוצים ויסות פרמקולוגי של הדופק, יש לטפל בתאים לאחר ההצמדה הלילית (12–16 שעות לאחר הזרעה). יש להתאים את צפיפות הזריעה לפי הצורך כדי להבטיח שהתאים יגיעו למפגש המתאים בזמן הטיפול והניתוח במורד הזרם, תוך התחשבות בהשפעות הצפויות של הסוכן הפרמקולוגי על התרבות או חיוניות התאים. מכיוון שדופק הלב מתרחש בעיקר בשלבי S ו-G2 במחזור התא, יש לשמור על תרביות בצמיחה לוגריתמית ולהימנע מהתנגשות יתר. בניסויים הכוללים טיפולים שעשויים לשנות את התקדמות מחזור התא, ניתן לבצע שילוב EdU, ניתוח תוכן DNA או מדידות מחזור תא אחרות כדי להקל על פירוש תוצאות מוקדי RAD51. לכלול בקרות לא מטופלות (–IR) ובקרות קרינה (+IR) בכל ניסוי כדי לקבוע היווצרות מוקדי RAD51 המושרים מנזק בסיסי ו-DNA, בהתאמה. בעת ביצוע הפרעות המתווכות על ידי siRNA, כולל siRNA בקרה שאינו ממוקד (למשל,si LUC) ותנאי siRNA ספציפיים למטרה (למשל,si RAD51.). מומלץ בקרה ללא נוגדנים ראשוניים וללא נוגדנים משניים במהלך אופטימיזציה של נוגדנים להערכת צביעה לא ספציפית ופלואורסצנציה רקעית.

3. השראת נזק DNA על ידי IR

1. תאי חשיפה בתא מחליקים ל-IR במינון של 6 Gy²¹ כדי לעורר DSBs של DNA.
2. החזר מיד את המגלשות לאינקובטור לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
3. דגרו את התאים למשך 6 שעות לאחר ה-IR.
   הערה: ה-IR סופק באמצעות IRRADIER ביולוגי RS-2000 שהופעל ב-160 kV ו-25.0 mA (מיקום מדף 5). התאים הוקרנו בטמפרטורת החדר במינון יחיד של 6 Gy (כ-4.8 Gy/min) והוחזרו מיד לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ לצורך התאוששות. הרדיאטור כויל באופן שגרתי לפי המלצות היצרן, וכל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות בטיחות קרינה מוסדיות. הדגירה בת 6 השעות לאחר ה-IR כבר נקבעה 15,17,22. התזמון האופטימלי עשוי להשתנות בין סוגי תאים ויש להתאים אותו לכל קו תאים.

4. קיבוע וחדירות

1. שאפו בזהירות את מדיום התרבית מהבארות מבלי להפריע לתאים.
2. תקבע את התאים באמצעות פאראפורמלדהיד 3% טרי ב-1× PBS למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.
3. שאפו בעדינות את הקיבוע ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של 1× PBS לכל באר.
4. חדירת תאים עם 0.2% טריטון X-100 ב-1× PBS למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1× PBS.
   הערה: בצעו שלבי קיבוע, חדירות ושטיפה בעדינות על ידי הוספה והסרה של תמיסות לאורך דופן כל באר כדי למזער היפרדות תאים. אלא אם צוין אחרת, השתמש ב-500 מיקרוליטר של 1× PBS בכל שטיפה.

5. חסימה

1. הכינו תמיסת חסימה על ידי המסה של 5% (עם ערך) אלבומין סרום בקר (BSA) ב-1× PBS.
2. דגרו את התאים בתמיסת חסימה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית את הקשירה לנוגדנים לא ספציפיים.

6. דגירה ראשונית של נוגדנים

1. הסר את תמיסת החסימה ושטוף את התאים שלוש פעמים עם 1× PBS.
2. הכינו נוגדנים ראשוניים בדילול מתאים בתמיסת החסימה. נעשה שימוש בנוגדנים אנטי-RAD51 פוליקלונליים של ארנב (1:1000) ונוגדנים מונוקלונליים אנטי-פוספו-היסטון H2AX (γH2AX) (1:1000), כאשר γH2AX משמש כסמן ל-DSBs ^23,24.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת לכל באר.
4. דגרו את המחסניות בטמפרטורת החדר למשך 16–18 שעות בתא לח כדי למנוע אידוי.
   הערה: שני הנוגדנים העיקריים יכולים להיות משולבים באותו תמיסה לצביעה סימולטנית.

7. דגירה משנית של נוגדנים

1. הכינו נוגדנים משניים בדילול מתאים בתמיסת החסימה. Alexa Fluor 488-conjugated נגד עכבר IgG לארנב (1:350) משמש לזיהוי RAD51, ו-Alexa Fluor 594-conjugated לעז IgG (1:350) משמש לזיהוי γH2AX.
2. שאף את תמיסת הנוגדן הראשית ושוטף את התאים שלוש פעמים עם 1× PBS.
3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית מדוללת לכל באר.
4. דגירה של מעליות למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
   הערה: ניתן לשלב את שני הנוגדנים המשניים לזיהוי בו-זמנית. מהחלק הזה ואילך, יש לבצע את כל השלבים במרחב מוגן מאור כדי למזער הלבנת פוטו.

8. צביעת נגד גרעינית והרכבה

1. הכינו את תמיסת Hoechst 33342 בדילול של 1:1,000 ב-1× PBS כדי לצבוע גרעינים.
2. שואף את תמיסת הנוגדן המשני ושוטף תאים פעם אחת עם 1× PBS.
3. דגרו תאים עם תמיסת Hoechst 33342 מדוללת למשך 90 שניות בטמפרטורת החדר.
4. שאיפת תמיסת Hoechst 33342 ושוטפת תאים שלוש פעמים עם 1× PBS.
5. הסר את ה-1× PBS ונתק את התא העליון מהמחסניות הזכוכיתיות, והוסיף כ-25 מיקרו-ליטר של חיבור אנטי-פייד לכל באר.
6. הניחו כיסויי זכוכית מעל התאים המותקנים, כדי להבטיח מגע אחיד עם המתקן.
7. הסירו בעדינות בועות אוויר ואטמו את הקצוות עם לק.
   הערה: צביעת נגד גרעינית מספקת נקודת ייחוס לגרעינים, ומקלה על מיקום וכימות מדויקים של מוקדי RAD51 ו-γH2AX גרעיניים.

9. הדמיה וכימות של מוקדי RAD51 ב-DSBs

1. שקופיות תמונה מיידיות או נשמר בטמפרטורה של 4°C בקופסת שקופיות בחושך עד לניתוח.
   הערה: כדי למזער פגיעה אפשרית באות ובהלבנת פוטו, יש לצלם תמונות בהקדם האפשרי, רצוי בתוך שבוע מההתקנה.
2. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם קווי לייזר ומסננים מתאימים: Hoechst 33342 (405 ננומטר) לגרעינים, Alexa Fluor 488 (488 ננומטר) ל-RAD51, ו-Alexa Fluor 594 (561/594 ננומטר) עבור γH2AX.
3. לבצע הדמיה קונפוקלית באמצעות אובייקטיב בהגדלה גבוהה המתאימה לפתרון מבנים תת-תאיים.
4. כמת מוקדי RAD51 ידנית על ידי ספירת מוקדי גרעין בדידים שמקבילים מיקומים עם γH2AX; יש להוציא מוקדים שאינם מוקדים במקביל ל-γH2AX.
   הערה: אימות ביצועי נוגדנים לפני ניתוח כמותי על ידי אישור מוקדי גרעין RAD51 ו-γH2AX שנגרמו על ידי IR בתאי ביקורת ואות RAD51 מופחת לאחר טיפול ב-siRNA ב-RAD51. לכמת רק מוקדי RAD51 גרעיניים בדידים שמקבילים מיקומים עם γH2AX בגרעינים עם מורפולוגיה שלמה ודפוסי צביעה ברורים; לכלול צביעות דיפוזיות או לא גרעיניות, אותות RAD51 לא קולוקליים, תאים חופפים או רב-גרעיניים, תאי מיטוזיה ותאי אפופטוטיים. שמרו על הגדרות דימות זהות בכל ניסוי והחלו קריטריונים עקביים לניקוד ידני בכל המצבים. לנתח ~50 גרעינים לכל מצב משדות ראייה מרובים עבור כל שכפול ביולוגי ולבצע לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. דווחו על מספר מוקדי RAD51/γH2AX המקומיים לכל גרעין באמצעות ניתוח סטטיסטי מתאים.

10. ניתוח סטטיסטי

1. כמת RAD51/γH2AX מוקדים מקומיים של כ-50 גרעינים לכל מצב.
2. הצג נתונים כממוצע ± SD לפחות משלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.
3. לבצע השוואות סטטיסטיות באמצעות מבחן סטטיסטי מתאים (למשל, מבחן t סטודנט דו-זנבי לא מזווג להשוואות בין שתי קבוצות או ANOVA חד-כיווני להשוואות בין קבוצות מרובות)
4. נבחן את עמוד < 0.05 כמובהק סטטיסטית.
5. בצע ניתוחים סטטיסטיים ויצירת גרפים באמצעות GraphPad Prism (גרסה 10.6.1).

תוצאות

IR גורם להיווצרות מוקדי RAD51 ב-DNA DSBs בתאי OVCAR-8
כדי להעריך פונקציונלית את פעילות הדוR, נבדק היווצרות מוקדי RAD51 בתאי סרטן שחלות OVCAR-8 בעלי מיומנים בדובי HR לאחר השראת DNA DSB על ידי IR. כדי לקבוע את הספציפיות של הבדיקה ולאשר שמוקדים נצפים מייצגים אירועי HR התלויים ב-RAD51 באמת, תאים עברו טרנפיקציה עם siRNA לוסיפראז שאינו ממוקד בקרה (siLUC) או siRNA מכוון ל-RAD51 (siRAD51). 15,16,17 לפני IR...

דיון

גילוי מבוסס אימונופלואורסצנציה של מוקדי RAD51 גרעיניים המתואר כאן מספק גישה אמינה ותפקודית להערכת פעילות הדוR בתאי סרטן שחלות מתורבתים. בניגוד לניתוחים גנומיים או טרנסקריפטומיים שמסיקים מצב HR בעקיפין, יצירת מוקדי RAD51 משקפת ישירות את יכולת התא לגייס ולהרכיב את מנגנון הליבה של HR באתרי DSBs של DNA. לכן, מבחן זה משמש כקריאה רגישה של מיומנות HR לאחר נזק ל-DNA ומתאים במיוחד למחקרים מכניים החוקרים ויסות תיקון HR או תגובה טיפולית. IR שימש בפרוטוקול זה ליצירת רמה מבוקרת וניתנת לשחזור של DSBs,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10% פולי-אציאמיד ג'ל מתכון (20 מ"ל באפר תחתון, 33.4 מ"ל ddH2O, 30% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (29:1) 26.6 מ"ל. 10% APS (טרי) 200 µL  TEMED 70 µL)	תוצרת בית	NA	ג'ל רזולוציה ל-SDS-PAGE
10% פולי-אציאמיד ג'ל מתכון (באפר עליון 10 מ"ל, ddH2O 23.6 מ"ל, 30% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (29:1) 6.4 מ"ל 10% APS (טרי) 160 µL  TEMED 40 µL)	תוצרת בית	NA	ג'ל סטאקינג ל-SDS-PAGE
100 מ"ל טריפסין EDTA 1X, 0.25% טריפסין/2.21 mM EDTA בנתרן ביקרבונט	Corning	25-053-C1	משמש לניתוק תאים דבקים במהלך העברה שגרתית ולפני זריעת התאים.
10x מאגר פוספט מלוח (PBS)	Bio-Rad	1610780	מדולל ל-1× ומשמש לשלבי שטיפה, תמיסת חסימה, דילול נוגדנים, קיבוע והחלחלות.
10X מאגר ריצה (6 ליטר) טריס 181.8 גרם +גליסין 864.0 גרם+SDS 60 גרם	תוצרת בית	NA	ריצה לדוגמי חלבון בג'ל
10X העברה (6 ליטר) טריס 181.8 גרם+ גליסין 864 גרם	תוצרת בית	NA	העברת חלבון מהג'ל לממברנה
10x מאגר טריס מלוח	Bio-Rad	1706435	מאגר
30%  (w/v)אקרילאמיד ;0.8(w/v)/ביס-אקרילאמיד פתרון מאגר (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	ל-SDS-PAGE
תאי ABTR2	מרפאת מאיו	NA	קו תאים סרטני שחלות עמידים ל-PARPi
מתכון מאגר ליזה AKT (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM נתרן פיירופוספט, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-גליצרופוספט, 10 μg/mL לופפטין, 5 μg/mL אפרוטינין, 5 μg/mL פפסטטין, ו-20 mM מיקרוציסטין-LR.	תוצרת בית	NA	מאגר ליזה תאית
אמוניום פרסולפט	Bio-Rad	16107000	ביולוגיה מולקולרית כחומר מחמצן לג'לים, משמש כחומר יזום רדיקלי חופשי
נוגדן אנטי-פוספורילציה של Histone H2A.X (Ser139), שיבוט JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	נוגדן ראשוני המשמש לזיהוי γH2AX פוקוסים. משמש בדילול 1:1000
נוגדן אנטי-Rad51 (Ab-1) ארנב pAb	Sigma-Aldrich	PC130	נוגדן ראשוני המשמש לזיהוי פוקוסי RAD51 גרעיניים כסמן לפעילות רקומבינציה הומולוגית. משמש בדילול 1:1000
אלבומין סרום בקר חופשי מפרוטאזות	GoldBio	A-420-250	משמש להכנת תמיסת חסימה (5% BSA ב-PBS) להפחתת קשירה לא ספציפית של נוגדנים במהלך צביעת אימונופלואורסצנציה.
מערכת הדמיה ChemiDoc	Bio-Rad	12003154	מערכת הדמיה
מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי	ZEISS	Zeiss LSM 780	הדמיה אימונופלואורסצנצית, ניתוח פוקוסי γH2AX, כימות פוקוסי RAD51, קריאה משותפת של חלבונים והדמיה תלת-ממדית
מונה תאים אוטומטי Countess II FL	Life Technologies	AMQAF1000	מונה תאים אוטומטי
זכוכית מכסה	Cardinal Health	M6045-10A	מונחות מעל דגימות מוצמדות להגנה על תאים מוכתמים ולאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה.
מערכת אלקטרופורציה ECM 830 Square Wave	Hbio-BTX	45-2052	מערכת אלקטרופורציה מתאימה ליישום להעברת גנים בתאים יונקים
סרום בקר עוברי	Corning	35-010-CV	מתווסף ל-RPMI-1640 (כ-8%) לתמיכה בגידול ותחייה של תאים.
גליצין	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	מאגר
נוגדן משני עכבר אל-עכבר IgG (H+L) מאוד מוצלב, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	נוגדן משני המשמש לזיהוי נוגדן ראשוני γH2AX. משמש בדילול 1:350
נוגדן משני עכבר