מאמר שיטה

תהליך עבודה חסכוני עבור אימונופלואורסצנציה đơn-ו-מולטיפלקס בתרביות תאים דו-ממדיות הדבקות על לבישי זכוכית

6 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71114

⸱

1 בספטמבר 2026

 , 
1Laboratório de Vetores Virais (LVV), Centro de Investigação Translacional em Oncologia (CTO)/LIM24, Centro de Estudos e Tecnologias Convergentes para Oncologia de Precisão (C2PO), Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (FMUSP)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה חסכונית עבור אימונופלואורסנציה (IF) חד-ערוצית ומרובת-ערוצים של תרביות תאים דו-ממדיות הדבקיות, המפחיתה את העלויות הניסיוניות באמצעות כיסויות זכוכית זולות, פלטות סטנדרטיות של 24 בארות ותנאי צביעה בנפח נמוך הממזערים את צריכת הנוגדנים, תוך אספקת גישה מייצגת לאיתור חלבונים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסנציה סטנדרטית.

תקציר

מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה (IF) היא טכניקה נפוצה להדמיה של לוקליזציית חלבונים והתפלגות משותפת ברזולוציה של תא בודד, תוך שימור המורפולוגיה התאית והארגון התת-תאי. מטרתו של פרוטוקול זה היא להציג זרימת עבודה מעשית וחסכונית לצביעת אימונופלואורסצנציה בשיטת מונו- ומולטיפלקס של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) נצמדות, תוך שימוש בחומרים סטנדרטיים למעבדה. השיטה מתבססת על גידול תאים על כיסויות זכוכית זולות המונחות בתוך פלטות 24 בארות קונבנציונליות, ומיישמת מולטיפלקס באמצעות הפרדת מיני מאכסן של נוגדנים ראשוניים, פלואורופורים בעלי ספקטרום נפרד, ותנאי בקרה חסונים, הכוללים בקרות ללא נוגדן ראשוני, ללא נוגדן כלל, צביעה בודדת ובקרות crosstalk כדי להבטיח את יכולת הפירוש של IF מולטיפלקס. שלבי צביעה בנפחים נמוכים משמשים להפחתת צריכת הרכיבים והנוגדנים מבלי לפגוע באיכות האות. זרימת עבודה זו מונעת את הצורך בפלטות הדמיה או תאי תגובה מיוחדים, והיא תואמת למיקרוסקופיית פלואורסצנציה רגילה של שדה רחב (widefield) או מיקרוסקופיה קונפוקלית. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה נגישה ומעשית לאימונופלואורסצנציה להערכה מייצגת של לוקליזציית חלבונים והתפלגות משותפת בתרביות תאים נצמדות. התאמה לסוגי תאים אחרים או לפאנלים של נוגדנים מחייבת אופטימיזציה ספציפית למטרה, כולל תיקוף נוגדנים, תנאי קיבוע וחדירות (permeabilization), בחירת פלואורופורים ותאימות למיקרוסקופ ולסטים של פילטרים.

מבוא

מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה (IF) נמצאת בשימוש נרחב להדמיה של הלוקליזציה התת-תאית, השפעות היחסית והקולוקליזציה של חלבונים בתאים מקובעים, ובכך היא מקשרת בין סממנים מולקולריים למורפולוגיה התאית ולהקשר התת-תאי1,2. בניגוד למדידות של תא population (למשל, אימונובלוטינג) או לבדיקות של תאים בודדים לאחר פירוק (למשל, ציטומטריה של זרימה), IF משמרת את הארגון המרחבי התאי והיא שימושית במיוחד להערכת הטרוגניות פנוטיפית בין תאים ושינויים בהתפלגות חלבונים תת-תאית ברזולוציית תא בודד3,4,5. ככל ששאלות ניסיוניות דורשות יותר ויותר הערכה בו-זמנית של מספר סממנים, IF מולטיפלקס מאפשרת זיהוי סימולטני של שניים או יותר מיקודים בתוך אותה דגימה, בדרך כלל על ידי שילוב של נוגדנים ראשוניים שהופקו במינים מארחים שונים עם פלואורופורים בעלי ספקטרום נפרד6 (איור 1), תוך שימוש באסטרטגיות זיהוי ישירות ו/או עקיפות (איור 2). עם זאת, מולטיפלקס מציב אתגרים טכניים מרכזיים, במיוחד תגובתיות צולבת של נוגדנים (cross-reactivity) והפרעות ספקטרליות (spectral crosstalk), העלולות לפגוע ביכולת הפרשנות אלא אם כן הן מטופלות באמצעות תכנון קפדני של הפאנל ותנאי בקרה מחמירים7,8.

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק זרימת עבודה מעשית וזולה, שניתן להחילה באופן רחב על נוגדנים המאומתים באמצעות אימונופלואורסצנציה ומותאמת לדימוג שגרתי של תרביות דו-ממדיות (2D) דבקות. ריבוי מטרות (Multiplexing) מיושם באמצעות הפרדה לפי מיני המארח, פלואורופורים נבדלים ספקטרלית, וקבוצות בקרה המאמתות את רמות הרקע ואת ביצועי הצביעה9,10. באמצעות שימוש בכיסויות זכוכית של 12 mm בתוך פלטות סטנדרטיות של 24 בארות, במקום שקופיות עם תאי הפרדה (chambered slides) ייעודיות, זרימת עבודה זו נמנעת משימוש במוצר מתכלה ייעודי ויקר יותר לטובת חומרים המהווים מלאי סטנדרטי ברוב מעבדות תרביות התאים. זרימת העבודה משתמשת גם בכמות נמוכה משמעותית של תמיסת צביעה ליחידת שטח גידול (150 µL עבור ≈1.13 cm2, או ≈133 µL/cm2) מאשר בפורמטים דומים של כיסויות עם תאי הפרדה11,12, הדורשים בדרך כלל 300–500 µL/cm2, מה שמתרגם להפחתה של פי 2 עד 4 בערך בצריכת הנוגדנים והריאגנטים ליחידת שטח. בהתאם לכך, הפרוטוקול תומך בהערכה איכותית של מספר מטרות, מיקום סממנים ופיזור משותף באמצעות מיקרוסקופים קונפוקאליים או מיקרוסקופי שדה רחב (widefield) סטנדרטיים, יחד עם צביעות נגדיות של השלד התאי והגרעין. זרימת עבודה זו מיועדת ל-IF רב-מטרתי קונבנציונלי של תאים מקובעים המבוסס על הפרדת מיני המארח והבחנה ספקטרלית, ואינה מתוכננת לגישות רב-מטרתיות איטרטיביות או רב-ממדיות גבוהות.

פרוטוקול

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או חיות ניסוי. כל הניסויים בוצעו באמצעות שורת תאי an osteosarcoma canine D17, שורת תאים מבוססת שהושגה מבנק תאים ציבורי (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). לפיכך, לא נדרש אישור אתי.

1. תחזוקת שורת תאים

  1. יש לתחזק תאים דבקים בתנאי תרבית סטנדרטיים (37 °C, 5% CO₂, אינקובטור לח) תוך שימוש במצע מלא המתאים לשורת התאים שבה נעשה שימוש.
    הערה: כדוגמה מייצגת, תאי אוסטאוסרקום של כלבים מדגם D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276) מתוחזקים ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) מועשיר ב-10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% antibiotic-antimycotic, עוברים תרבית משנית בהגעה ל-70–80% confluence באמצעות trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), ונעשה בהם שימוש בטווח מעברים מאושר (למשל, מעברים 5–20).
  2. יש לאשר היעדר מיקופלסמה לפני הניסויים באמצעות בדיקת זיהוי מיקופלסמה מאושרת.

2. הכנה של פלטה בעלת 24 בארות וכיסויי זכוכית

הערה: יש לנקות את משטחי כיסוי הזריקה על ידי טבילה ב-70% ethanol (5 דקות, חזרה 3×) לפני הסטריליזציה בכל אחת מהשיטות המתוארות להלן; לאחר הסטריליזציה, יש לאחסן את כיסויי הזריקה במיכל סגור בטמפרטורת החדר עד לשימוש.

  1. הניחו כיסויי זכוכית עגולים ונקיים בקוטר 12 מ"מ בתוך צלחת פטרי מזכוכית (או במחזיק כיסויי זכוכית) ועקרו באוטוקלאב. עקרו באוטוקלאב גם זוג פינצטות מתכת בעלות קצה דק.
  2. חלופה: נקו את לבישי הזכוכית (coverslips) ואת הפינצטות ב-70% אתנול, הניחו להם להתייבש באוויר, ובצעו חיטוי של השטח באמצעות חשיפה לעקראון על-סגול (UV) למשך 30 דקות בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית לפני השימוש. אחסנו את לבישי הזכוכית המעוקרים במיכל סגור בטמפרטורת החדר עד למועד השימוש.
  3. בתוך קבִינָה בטוחה ביולוגית (biosafety cabinet), השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר כיסוי זכוכית (coverslip) סטרילי אחד לכל באר המיועדת לקבוצות הניסוי בפלטת תרביות רקמה בעלת 24 בארות.
  4. אופציונלי: כסו את כיסיי הזריקה (coverslips) בציפויים מקדמי הידבקות בהתאם להוראות היצרן או להנחיות המעבדה המקובלות, במידה והדבר נדרש עבור סוג התאים המהוברים.
    הערה: אפשרויות הציפוי (poly-L-lysine, קולגן I או פיברונקטין) וריכוזי העבודה שלהן מפורטים ב- טבלת חומריםעבור רוב השורות של תאים נצמדים המגודלים על זכוכית, כיסויות (coverslips) סטריליות ללא ציפוי הן מספיקות; רכיבי הציפוי עשויים להיות אנטיגניים, לכן הציפוי הנבחר לא צריך להגביר תגובת הצלבה עם אף אחד מהנוגדנים בפאנל.
  5. אם כיסויות הזכוכית (coverslips) היו מצופות, שאבו את תמיסת הציפוי העודפת, שטפו פעם אחת עם סלקיין פוספטי גבורי (PBS) סטרילי, והניחו לכיסויות להתייבש באוויר בתוך מ déi הפעולה הביולוגי (biosafety cabinet) לפני זריעת התאים.

3. קבוצות ניסוי

  1. כלול פאנל של בקרות המתאימות לתכנון המולטיפלקס.
    הערה: בקרת ללא נוגדנים (ללא נוגדן ראשוני או משני) חושפת אוטופלורסצנציה אינהרית, ובקרת ללא נוגדן ראשוני (תערובת נוגדנים משניים ללא נוגדן ראשוני כלשהו) מעריכה קישור לא ספציפי של הנוגדנים המשניים ורקע בכל הערוצים בו-זמנית; מכיוון שפרוטוקול זה משתמש באופן קפדני בנוגדנים משניים בעלי ספקטרום נפרד, בקרה בודדת זו מעריכה כל נוגדן משני באופן עצמאי בערוץ הרלוונטי שלו, ובכך משמשת לאותה מטרה כבקרת נוגדן משני בלבד עבור כל פלואורופור. בקרות של צביעה בודדת, שבהן כל זוג של נוגדן ראשוני-משני מוחל באופן נפרד, מתקפות את ביצועיהם של כל הנוגדנים לפני השילוב במולטיפלקס, ובהשוואה למצב המולטיפלקס, מאפשרות להעריך crosstalk ספקטרלי עבור כל זוג פלואורופורים. במידת האפשר, נעשה שימוש בבקרת חיוביות המבטאת את האנטיגן המטרה כדי לאשר את ביצועי הבדיקה.

4. זריעת תאים (פריסה) על כיסויות זכוכית

  1. בתוך קבִינט בטיחות ביולוגית, נתקו את התאים באמצעות trypsin (או שיטת הדיסוציאציה מתאימה אחרת), נטרלו, והשעיקו מחדש במצע תרבית מלא.
  2. ספרו את התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי או המוציטומטר.
  3. דללו את התאים לריכוז של 6 × 104–1 × 105 תאים/mL.
  4. הוסיפו 0.5 mL של תרחיף תאים לכל באר (סופי: 3 × 104–5 × 104 תאים/באר).
    הערה: במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצה טיפ sterilized כדי לוודא בעדינות שהכיסוי (coverslip) מונח בצורה שטוחה בתחתית הבאר, תוך הימנעות משריטות.
  5. דגרו את התאים בתנאים סטנדרטיים (37 °C, 5% CO₂) עד שהתאים נצמדו והגיעו לרמת ההתמזגות (confluence) הרצויה או עד להגעה לנקודת הזמן הניסויית.

5. טיפול בתאים (אופציונלי)

  1. בחרו את תזמון הטיפול בהתאם לתכנון הניסויי. הטיפול עשוי לכלול תרפיה פרמקולוגית, גירוי באמצעות ציטוקינים, מניפולציה גנטית להשראה או להשקתה של ביטוי הגן המטרה, או התערבויות ניסוייות אחרות, לפי העניין.
  2. סמנו את הבארות כדי לזהות את קבוצת הביקורת ואת הקבוצות המטופלות.
  3. הדגירו למשך נקודות הזמן הנדרשות; הימנעו מצפיפות יתר (over-confluency), שכן צמיחה מוגברת מעלה את הרקע ופוגעת במורפולוגיה.
    הערה: התאים צריכים להיות דבקים לכיסוי הזכוכית (coverslip) לפני הקיבוע, אלא אם כן התכנון דורש קיבוע מיד לאחר הזריעה.
  4. עבור מטרות המופרשות במהירות (למשל, ציטוקינים), הוסיפו brefeldin A (BFA) למצע התרבית בריכוז סופי של 1–10 µg/mL (בדרך כלל 5 µg/mL) והדגירו למשך 4–6 h בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂ לפני הקיבוע.
  5. הסירו את המצע המכיל BFA והמשיכו מיד לשלב הקיבוע.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית

הערה: מהשלב של הקיבוע והלאה, אין צורך בטכניקה סטרילית; ניתן לבצע את הצביעה על משטח העבודה, תוך שימוש במכסוף כימי בכל פעם שמטפלים בריאגנט הדורש זהירות. אין להניח לדגימות להתייבש בשום שלב; בעת שאיבה, יש להשאיר שכבה דקה של באפר, ולהוסיף מיד את התמיסה הבאה.

  1. קיבוע (בחרה באחת מהאפשרויות):
    הערה: המקבע נבחר בהתאם למיקום המטרה ולרגישות האפיטופ (ראו דיון): פאראפורמאלדהיד (PFA) (פורמאלדהיד שהוכן מפאראפורמאלדהיד) מתאים לרוב המטרות ותואם לשימוש עם פאלואידין; מתנול עשוי לסייע לאפיטופים גרעיניים או זירחוניים (phospho-epitopes) מסוימים, אך פוגע בצביעת F-actin.
    1. קיבוע ב-PFA (מומלץ עבור רוב המטרות):
      1. שאבו את המצע ושטפו בעדינות פעם אחת עם תמיסת סליין עם בופר Tris (TBS) (0.5 מ"ל לבאר).
      2. הוסיפו 4% PFA ב-PBS (סליין עם בופר פוספט) (0.5 מ"ל לבאר) והדגירו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (≈25 °C).
      3. שאבו את ה-PFA ושטפו 3 פעמים× עם TBS (שאבו במהירות; אל תתנו לבארים להתייבש).
        הערה: זהירות: PFA הוא רעיל ועלול להיות מסרטן. יש לטפל בתמיסאות PFA במכסורת כימית מאושרת תוך לבישת ציוד מיגון אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים). הימנעו משאיפה וממגע עם העור, והשליכו את הפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות הכימית של המוסד.
  2. לחלופין, קיבוע במתנול (מועיל עבור חלק מהאנטיגנים הגרעיניים ואפיטופים זרחתיים מסוימים):
    1. קררו מראש מתנול 100% לטמפרטורה של −20 °C.
    2. הוסיפו מתנול קר מאוד (0.5 מ"ל לבאר) ישירות לתאים והדגירו למשך 5 דקות בטמפרטורה של −20 °C.
    3. שטיפה 3× עם TBS (יש לשאוב מיד; אין להניח לבארים להתייבש).
      הערה: לאחר קיבוע במתנול, ייתכן שחדירות נוספת לא תהיה נחוצה ויש לבצע אופטימיזציה בהתאם לנוגדן/אפיטופ. קיבוע במתנול עלול לפגוע באפיטופים של ממברנה ולהפחית את יעילות הצביעה של פאלואידין/F-actin המצומד לפלואורופור. אזהרה: מתנול הוא רעיל, נדיף ודליק מאוד. יש לטפל בחומר באזור מאוורר היטב או במכסה מנדף כימי; יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים; ויש להרחיקו מלהבות גלויות וממקורות חום. נקודת עצירה רשות: לאחר הקיבוע, יש לשמור את הדגימות ב- 4 °C ב-PBS המכיל ריכוז נמוך של מקבע (למשל, PBS + 0.1% PFA) למשך עד שבוע; יש לתקף את משך האחסון עבור כל אנטיגן.
  3. כיבוי אלדהיד (אופציונלי)
    1. דגרו עם 50 mM גליצין ב-TBS (0.5 מ"ל לבאר) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (≈25 °C).
    2. שטיפה 3× עם TBS + 0.05% polysorbate 20.
      הערה: גליסין מנטרל קבוצות אלדהיד חופשיות שנותרו לאחר קיבוע ב-PFA, ובכך מפחית פלואורסצנציה עצמית הקשורה לקיבוע ומשפר את סגוליות הצביעה בנוגדנים.
  4. חדירות (Permeabilization)
    1. אם המטרה היא חלבונים ממברנתיים, דלגו על שלב החדירה (permeabilization) ועברו לשלב 6.5.1.
    2. אם היעד הוא חלבונים תוך-תאיים או גרעיניים, בצעו פרמיאביליזציה באמצעות דטרגנט לא-יוני בריכוז של 0.1–0.3% ב-TBS (0.5 מ"ל לבאר) למשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר (≈25 °C).
    3. שטיפה 3× עם TBS + 0.05% polysorbate 20 (TBST).
      הערה: ריכוז הדטרגנט הבלתי-יוני Octylphenol ethoxylate וזמן החשיפה מותאמים למטרה; המהוּל מודרך על פי אות (signal) במדור הנכון, מורפולוגיה שנשמרה, F-actin מוגדר היטב ורקע נמוך (ראו דיון). אם נעשה שימוש ב-saponin, הוא יישמר בכל תמיסות השטיפה ותמיסות הנוגדים העוקבות. אזהרה: הדטרגנט הבלתי-יוני Octylphenol ethoxylate מזיק במקרה של שאיפה או מגע עם העור ועלול לגרום לגירוי בעיניים. יש לטיפל בכפפות ולהימנע מיצירת אירוסולים.
  5. חסימה
    1. הוסיפו 0.5 מ"ל לבאור של תמיסת חסימה (5% bovine serum albumin (BSA)) (ב-TBS) ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (≈25 °C).
    2. שאבו את תמיסת החסימה (blocking buffer).
    3. עברו ישירות לדגירה עם הנוגדן הראשוני (אין לשטוף).
  6. דגירה עם נוגדן ראשוני
    הערה: דילולי הנוגדן הראשוני והשני נקבעים באופן אמפירי באמצעות טיטול (ראו דיון).
    1. הכינו פאנלים של נוגדנים ראשוניים בודדים או מרובים (multiplex) בתמיסת Tris-buffered saline המכילה 0.05% polysorbate 20 ו-1% BSA (TBST-BSA) 1%), תוך שימוש בריכוזי נוגדנים שעברו אופטימיזציה מראש עבור כל מטרה.
    2. עבור אימונופלואורסצנציה מרובת סמנים (multiplex immunofluorescence), שלבו את כל הנוגדנים הראשוניים הבלתי מצומדים המכוונים לאנטיגנים שונים ממינים מארחים שונים (למשל, נוגדן עכבר נגד אינטרפרון-β (IFN-β( + נוגדן שפנים נגד p14ARF + נוגדן עיזים נגד אקטין) לתערובת נוגדנים אחת.
    3. הוסף 150 µL לכל באר, תוך הבטחה שכל כיסוי הזכוכית (coverslip) מכוסה במלואו על ידי תמיסת הנוגדנים.
      הערה: כדי למנוע התאיידות בנפחים נמוכים, את הפלטה מדגרירים בתא לח (למשל, קופסה אטומה עם נייר סופג לח).
    4. הדגירה תימשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (≈25 °C) או 12–16 שעות ב- 4 °C.
    5. שטיפה 3× עם TBST למשך 3 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר (≈25 °C), שאבו מיד לאחר כל שטיפה.
  7. דגירה של נוגדן שניוני (ויחידות של נוגדנים ראשוניים בצמידה ישירה, במידה ורלוונטי)
    הערה: משלב זה ואילך, יש לשמור את הדגימות מוגנות מאור כדי למנוע פוטובליצ'ינג (Photobleaching). נעשה שימוש בפלואורופורים בעלי הבחנה ספקטרלית בנוגדנים משניים ובכל נוגדן ראשוני בעל צימוד ישיר כדי למזער crosstalk, ובנוגדנים משניים ספציפיים למין שעברו ספיחה הצלבה (cross-adsorbed) גבוהה כדי למזער קישור לנוגדנים ראשוניים שאינם קוגניטיים. תכנון פאנל הפלואורופורים, כולל סמנים גרעיניים ושל השלד התאי, והתאמה בין העירור לפליטה במיקרוסקופ נדונים בחלק הדיון.
    1. דללו נוגדנים משניים בתמיסת TBST-BSA 1% תוך שימוש בריכוזים שעברו אופטימיזציה מראש. לזיהוי מרובה (multiplex), ערבבו את כל הנוגדנים המשניים התואמים למיני המארח של הנוגדנים הראשוניים שבהם נעשה שימוש (נוגדן משני אחד לכל מין מארח) לתערובת אחת.
    2. הוסף 150 µL לכל באר, תוך הבטחה שכל כיסוי הזכוכית מכוסה במלואו.
    3. הדגריו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (≈25 °C).
      הערה: אם הפאנל כולל נוגדן ראשוני אחד או יותר המצומדים באופן ישיר, הוסיפו אותם יחד עם תערובת הנוגדים המשניים והאריכו את זמן הדגירה ל-1.5 שעות בטמפרטורת החדר (בקירוב 25 °C).
    4. שטיפה 3× עם TBST למשך 3 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר (≈25 °C), תוך שאיבה מידית לאחר כל שטיפה.

7. צביעה נגדית של הגרעין וצביעת f-actin

  1. הוסיפו צבע נגדי לגרעין Hoechst 33342 (1:5000) מדולל ב-TBS והדגירה למשך 15 min בטמפרטורת החדר (≈25 °C), במיגון מאור. אם יש לסמן את ה-F-actin באמצעות פלואידין (phalloidin) במקום נוגדן אנטי-אקטין, הוסיפו פלואידין (1:400) לאותו תמיסה.
  2. שטפו 3× עם TBST, תוך שאיבה מהירה לאחר כל שטיפה (אין להניח לבארות להתייבש).
  3. הוסיפו 0.5 mL TBS לכל בארה כדי לשמור על כיסויי הזכוכית (coverslips) טבולים עד לשלב השליפה/הרכבה.

8. שליפת כיסוי הזכוכית והרכבה על זכוכית

  1. בעוד כיסויות הזכוכית טבולות ב-TBS, הכניסו את קצהו של מחט דקה או סכין מנתח (scalpel) מתחת לקצה הכיסוי והרימו אותו בעדינות עד שצד אחד יגבה חלקית. בעזרת פינצטה דקה, תפסו את הכיסוי והוציאו אותו מהבאר.
    הערה: הסרה של כיסוי זכוכית שאינו טבול עלולה לגרום לו להידבק חזק לתחתית הבאר עקב מתח פשטי, דבר המגביר את הסיכון לשבירה.
  2. החזיקו את כיסוי הזכוכית באמצעות פינצטה וסנפו בזהירות את שאריות ה-TBS מהקצוות באמצעות שואב ואקום או נייר סופג. הימנעו מ접גע במשטח המכוסה בתאים.
    הערה: יש להימנע מנוזל שיורי עודף, שכן הוא עלול לדלל את תמיסת הקיבוע (mounting medium) ולפגוע בבהירות התמונה ובניגודיות.
  3. הניחו את כיסוי הזכוכית, כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, על גבי סרטית זכוכית נקייה המכילה טיפה קטנה (≈3 µL) של תמיסת קיבוע.
    הערה: ניתן להשתמש בתמיסת antifade מסחרית בעלת ייבוש עצמי או בתמיסה ביתית המבוססת על 80% glycerol/Phosphate-buffered saline (PBS); קיבועים מבוססי גליצרין נחתמים בסבון ציפורים שקוף, ותמיסות ללא צבע גרעיני נבחרות לאחר צביעה נגדית. הנחיות לגבי מגבלות אחסון ויציבות פלואורופורים מופיעות בחלק הדיון.
  4. הניחו לסריטות להתייבש במצב אופקי למשך ≈24 h, תחת הגנה מאור, לפני רכישת התמונות.

תוצאות

פרוטוקול זה תומך בצביעה אימונופלואורסצנטית đơn- ו-multiplex של תאי גידול כלביים דבקים המגודלים על כיסויי זכוכית, ובכך מאפשר הדמיה סימולטנית של סמנים גרעיניים, ציטופלזמיים וסמני שלד התא תוך שימור המורפולוגיה התאית. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 3.

בניסויים מוצלחים, תאי אוסטאוסרקומת כלבים מסוג D17 שהונדסו להביע p14ARF ו-IFN-β של כלבים באמצעות מניפולציה גנטית (סעיף 5.1) הראו אותיות פלואורסצנטיות חזקות ומדויקות מרחבית, עם רקע נמוך וצביעה לא ספציפית מינימלית. עבור תאים המבטאים p14ARF (איור 3A), אימונופלואורסצנציה חשפה לוקליזציה גרעינית דומיננטית, העולה בקנה אחד עם ההפצה התת-תאית הידועה של p14ARF. שימוש בחומרה של 0.3% octylphenol ethoxylate nonionic detergent לצורך חדירות (permeabilization) אפשר גישה יעילה של נוגדנים לאפיטופים גרעיניים תוך שימור המורפולוגיה של הגרעין והשלמות של השלד התאי, כפי שאושר על ידי צביעת נגד גרעינית ברורה ומבני אקטין שנראו באמצעות נוגדן anti-actin (פלואורופור הפולט אור כתום).

עבור תאים המבטאים IFN-β (איור 3A), נצפה אות ציטופלזמי לאחר דגירה עם BFA לחסימת הפרשת חלבונים, מה שאיפשר הצטברות תוך-תאית וזיהוי של ציטוקין מסיס זה. בתנאים אלו, פרמיליזציה עדינה יותר הייתה מספיקה כדי לאפשר חדירת נוגדנים ללא השהייה מוגברת של תכני הציטופלזמה. צביעה מוצלחת אופיינה בفلורסצנציה ציטופלזמית נקודתית עד מפוזרת, מינימום של רעש (crosstalk) גרעיני, ומבנה אקטין שנשמר.

נצפו תוצאות תת-אופטימליות כאשר פרמטרים מרכזיים לא עברו אופטימיזציה נאותה. חדירות (permeabilization) לא מספקת הובילה לאות p14ARF גרעיני חלש או חסר, כפי שמוצג עבור תנאי אי-חדירות (0% דטרגנט לא-יוני octylphenol ethoxylate; איור 3B ו- איור משלים 1). לעומת זאת, חדירות יתרה (דטרגנט לא-יוני octylphenol ethoxylate בריכוז של ≥0.5% או זמני דגירה ממושכים) עלולה להוביל לאובדן חלקי של צביעת השלד התאי, לעלייה בفلורסצנציית הרקע ולפגיעה במורפולוגיה התאית. בניסויים עם חלבונים המופרשים במהירות (למשל IFN-β), השמטתו של BFA הובילה לעיתים קרובות לאות תוך-תאי חלש יותר, דבר המשקף הפרשה מהירה ולא כשל בפרוטוקול.

בי controls של צביעה בודדת (Supplementary Figure 2) נצפה אות רק בערוץ המתאים לכל מטרה, מה שמעיד על הסגוליות של צביעת האימונופלואורסנציה שנצפתה. תנאי ביקורת שליליים, כולל ביקורות ללא נוגדן ראשוני וללא נוגדנים כלל (Supplementary Figure 2), הראו את צביעת הגרעין הצפויה, עם אות זניח בערוצים התלויים בנוגדנים, דבר המעיד על אוטופלואורסנציה נמוכה ועל קישור לא ספציפי מינימלי של הנוגדן המשני.

יחד, תוצאות מייצגות אלו מוכיחות כי הפרוטוקול תומך בזיהוי של חלבונים בעלי לוקליזציות תת-תאיות שונות, כאשר הקיבוע, עוצמת הפרמיליזציה ואסטרטגיות ספציפיות התלויות במטרה (למשל, חסמי הפרשה) מותאמים לביולוגיה של המטרה. אופטימיזציה נכונה מובילה לפלואורסצנציה חזקה וספציפית עם רקע נמוך ומורפולוגיה תאית שמורה, בעוד שתנאים שאינם אופטימליים מובילים לאותות חלשים או רועשים יותר ולמבנה תאי משונה.

figure-results-1

איור 1: תרשים זרימה סכמטי של תהליך העבודה של אימונופלורסצנציה בשיטה בודדת (mono-) ומרובת יעדים (multiplex).שלבים עיקריים החל מתחזוקת תרביות תאים ועד לרכישת תמונות, כולל שתי נקודות החלטה הדורשות בחירה בהתאם ליעד: שיטת הקיבוע (PFA לעומת מתנול) והחדירה (permeabilization), בהתבסס על המיקום התת-תאי של היעד. טיפול ניסיוני רשות, כולל טיפול מקדים ב-brefeldin A (BFA) עבור יעדים המופרשים במהירות, מצוין כפיסוק לפני הקיבוע. שלבים אופציונליים שאינם מוצגים לצורך בהירות (למשל, כיבוי אלדהידים) מתוארים בפרוטוקול המלא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2

איור 2: ייצוג סכמטי של אסטרטגיות זיהוי פלואורסצנטי מבוססות נוגדנים. זיהוי ישיר משתמש בנוגדנים ראשוניים המצומדים לפלואורופור, בעוד שזיהוי עקיף משתמש בנוגדנים ראשוניים שאינם מצומדים, המשולבים עם נוגדנים שניוניים המצומדים לפלואורופור, שהיא האסטרטגיה שנבחרה בפרוטוקול זה. עבור יישומים מרובי ערוצים (multiplex), זיהוי עקיף דורש נוגדנים ראשוניים שאינם מצומדים שהופקו במינים מארחים שונים, מה שמאפשר לכל נוגדן שניוני לזהות באופן סלקטיבי את הנוגדן הראשוני התואם לו ללא תגובת צולבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3

איור 3: אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס של תאי אוסטאוסרקומת כלבים D17. תאי D17 (5 × 104) נזרעו על כיסויי זכוכית בלוחיות עם 24 בארות וקובעו עם 4% פאראפורמלהיד (PFA) למשך 10 דקות ב-25 °C. התאים הועמדו לאימונופלואורסצנציה מולטיפלקס באמצעות נוגדי גוף ראשוניים anti-p14ARF (1:200; פלואורופורים הפולטים אור ירוק), anti-actin (1:200; פלואורופורים הפולטים אור כתום), ו-anti-interferon-β (IFN-β) (1:200; פלואורופורים הפולטים אור אדום-רחוק), עם נוגדי גוף משניים תואמים בריכוז 1:500. הגרעינים צבעו בצביעה נגדית. לפני גילוי IFN-β, התאים טופלו ב-BFA (5 µg/mL, 4 שעות) כדי לחסום הפרשת חלבונים. (A) התאים הופרמו באמצעות 0.3% דטרגנט לא-יוני למשך 10 דקות ב-25 °C. (B) תאים שעובדו ללא הפרמה (0% דטרגנט לא-יוני). תמונות מייצגות משני שחזורים ביולוגיים עצמאיים, כאשר כל אחד בוצע בשני שחזורים טכניים. באיור זה מוצגים רק הערוצים הממוזגים; הערוצים הבודדים מופיעים באיור משלים 1. ניתן להבחין בהבדלים בסימון בין התנאים, במיוחד עבור p14ARF (A; חצים), מטרה תוך-גרעינית, שאותה אות הייתה חסרה בקבוצה שלא הופרמה (B). פאנלים A ו-B נרכשו ועובדו באמצעות הגדרות זהות (טבלה משלימה 1). בקרות שליליות ובקרות לצביעה בודדת התואמות לפאנל זה מוצגות באיור משלים 2. סרגל קנה מידה: 100 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ערוצי פלואורסצנציה בודדים התואמים לאיור 3, מאורגנים לפי סמן עם תאים חדירים (עמודה שמאלית) ותאים לא-חדירים (עמודה ימנית). התנאים מוצגים זה לצד זה: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; פלואורופורים הפולטים אור ירוק), actin (E, F; פלואורופור הפולט אור כתום), ו-IFN-β (G, H; פלואורופורים הפולטים אור באדום רחוק), לצד הפאנלים הממוזגים התואמים (I, J), התואמים לאיורים 3A ו-3B, בהתאמה. חצים מצביעים על צביעה גרעינית מייצגת של p14ARF; אליפסות מצביעות על צביעה מייצגת של actin (E) ו-IFN-β (G), בהתאמה. אובדן של האות הגרעיני של p14ARF, יחד עם סימון תת-אופטימלי של IFN-β ו-actin, ניכר בתנאים לא-חדירים. אות שארית שנצפה ב- (D; כוכבית) משקף crosstalk ספקטרלי מפלואורופורים שנמצאים יחד, דבר שאושר על ידי היעדרו בבקרות הצביעה הבודדת והבקרות של נוגדן משני בלבד התואמות (איור משלים 2). סרגל קנה מידה: 100 µm. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: בקרות אימונופלואורסצנציה משולבות המתאימות לפאנל המולטיפלקס באיור 3. עבור כל קבוצת בקרה, הערוצים הבודדים (Hoechst 33342, פלואורופורים הפולטים אור ירוק, פלואורופור הפולט אור כתום, ופלואורופורים הפולטים אור אדום רחוק) מוצגים לצד התמונה המשולבת (עמודה חמישית). (A–E) בקרת ללא נוגדנים: תאים שעובדו ללא נוגדנים ראשוניים או משניים. (F–J) בקרת נוגדן משני בלבד: תאים שדגרו עם תערובת הנוגדנים המשניים בהיעדרה של נוגדנים ראשוניים. (K–O) בקרת צביעה בודדת של p14ARF (פלואורופורים הפולטים אור ירוק). (P–T) בקרת צביעה בודדת של Actin (פלואורופור הפולט אור כתום). (U–Y) בקרת צביעה בודדת של IFN-β (פלואורופורים הפולטים אור אדום רחוק). הגדרות הרכישה והעיבוד היו זהות לאלו ששימשו באיור 3 (טבלה משלימה 1). סרגל קנה מידה: 100 µm. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

טבלה משלימה 1: מפרטי קוביות מסנני פלואורסצנציה וסדר רכישה. התמונות נרכשו באופן רצופי במיקרוסקופ פלואורסצנציה רחב-שדה הפוך (40×עדשה אובייקטיבית 0.80/) תוך שימוש בקוביית המסננים המפורטות להלן, לפי הסדר המוצג, עבור כל שדה שתועד באיור 3, באיור משלים 1 ובאיור משלים 2. התמונות נרכשו כמישורי אופטיים בודדים (ללא צבירה של מישורי Z - z-stacking).עוצמת העירור נקבעה באמצעות בקרת עוצמת הפלואורסצנציה ברמות המצוינות, כאשר דיאפרגמת השדה של האור הפוגע נשמרה בעמדה 6 עבור כל הערוצים. הגדרות המצלמה (דיגיטציה של 8 ביט, 3072×(בפורמט 2048, גמא 1.0) והגדרה קבועה של חדות דיגיטלית היו זהים עבור כל הערוצים והפאנלים, כולל תמונות הביקורת ב- איור משלים 2התאמה בודדת וליניארית של בהירות/ניגודיות הוחלה באופן זהה על כל הערוצים והלוחות לצורך התצוגה. התמונות יוצאו כקובצי TIFF. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: מדריך לפתרון בעיות עבור קשיים טכניים נפוצים בתהליך העבודה של אימונופלואורסצנציה. בעיות נפוצות, סיבות סבירות ופעולות מתקנות לאורך הפרוטוקול.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

מספר שלבים הם קריטיים לביצוע עקבי של זרימת העבודה של אימונופלורסנציה מבוססת לבישת זכוכית (coverslip). כל הפרוצדורות מבוצעות בתוך הסביבה המוגבלת של באר תרבית בעלת 24 בארות, דבר המפשט את הטיפול, מגביל את המניפולציה של הדגימה ומאפשר כיסוי מלא של לבישת הזכוכית תוך שימוש בנפחים נמוכים של ריאגנטים, ובכך מפחית את צריכת הנוגדנים לכל ניסוי. מכיוון שפתרונות בנפחים נמוכים אלה נוטים להתאייד, מומלץ לבצע את הדגראציות בתא לח, ואין לאפשר לדגימות להתייבש: אפילו התייבשות קצרה מגבירה את הפלורסנציית הרקע ופוגעת במורפולוגיה התאית. בעת שאיבה, נשאר שכבה דקה של בופר על לבישת הזכוכית, והפתרון הבא מתווסף באופן מיידי.

צפיפות זריעה נכונה של תאים ובקרת התווספות (confluency) בזמן הקיבוע חיוניות להגבלת הרקע ולשימור המורפולוגיה, שכן צמיחת יתר מגבירה את הרקע ופוגעת בארכיטקטורה התאית. באופן דומה, נדרש ביקור מדויק בזמני ובטמפרטורת האינקובציה לאורך כל התהליך, מכיוון ששניהם משפיעים על יעילות הקיבוע, על קישור הנוגדנים ועל אות הרקע5,13. כאשר התנאים הסביבתיים משתנים, שימוש באינקובטור בקרת טמפרטורה או בתנור ייבוש המכוון ל-25 °C, בשילוב עם תזמון אינקובציה עקבי בין החזרות, משפר את השחזוריות.

קיבוע הוא השלב המכריע הראשון, שכן הוא קובע את שימור האנטיגן ואת הארכיטקטורה התאית5, והקיבוע נבחר בהתאם למיקום המטרה ורגישות האפיטופ. PFA מומלץ עבור רוב המטרות הקשורות לממברנה, ציטופלזמיות, גרעיניות ושל השלד התאי, כיוון שהוא משמר את הארכיטקטורה, שומר על התפלגות האנטיגן ותואם לצביעת F-actin מבוססת פלואידין. מתנול עשוי להיות מועדף עבור אנטיגנים גרעיניים מסוימים שזוהו באופן דל לאחר קיבוע באמצעות קשירה צולבת, ובמיוחד עבור פוספו-אפיטופים או אפיטופים הרגישים לאלדהיד, אך הוא פוגע בשלמות הממברנה, מחלץ חלבונים ממיסים ופוגע בצביעת פלואידין/F-actin; יש לתקף את התאימות עבור כל מטרה 13,14,15,16. עבור ציטוקינים ממיסים וחלבונים אחרים המופרשים במהירות, קיבוע ב-PFA בשילוב עם טיפול מקדם ב-BFA שומר על האות התוך-תאי לפני הקיבוע: BFA חוסם את הובלת החלבונים מהרשת האנדופלזמית למנגנון גולג'י, ובכך מעודד הצטברות תוך-תאית של חלבונים מופרשים ומאפשר את זיהוים באמצעות אימונופלואורסצנציה. כאשר יש צורך לזהות בו-זמנית מטרות עם דרישות קיבוע סותרות, נדרשת אופטימיזציה אמפירית. גליוקסל, דיאלדהיד קטן, דווח כחלופה ל-PFA, עם קשירה צולבת מהירה יותר, שימור אנטיגן משופר ותאימות לאימונופלואורסצנציה ולמיקרוסקופיה ברזולוציה-על; אין לנו ניסיון ישיר עם קיבוע בגליוקסל ואנו מציגים אותו כאפשרות הנתמכת בספרות17,18.

בעקבות הקיבוע, פרמביליזציה מתאימה מאפשרת לנוגדנים גישה לאפיטופים תוך-תאיים וגרעיניים תוך שמירה על השלמות המבנית5. פרמביליזציה לא מספיקה מובילה בדרך כלל לאות חלש או חסר למרות מורפולוגיה שלמה, מה שמעיד על גישה מוגבלת של הנוגדנים, בעוד שפרמביליזציה מופרזת גורמת לחילוץ חלבונים מסיסים, להרס ממברנות, לאובדן של צביעת השלד התאי ולהגברת הרקע. לפיכך, סוג הדטרגנט, ריכוזו וזמן הדגירה מותאמים למטרה. ניתן להעריך פרמביליזציה נאותה לפי ארבעה קריטריונים: (i) אות ספציפי במדור התת-תאי הצפוי; (ii) מורפולוגיה שנשמרה, עם גבולות גרעין וציטופלזמה שלמים המזוהים על ידי Hoechst 33342 ופאלואידין, בהתאמה; (iii) צביעת F-actin מוגדרת היטב, שכן אות שלד תאי מפוזר או אובדן שלו מעידים על פרמביליזציה מופרזת; ו-(iv) רקע נמוך בביקורות שליליות. אם קריטריונים אלו אינם מתמלאים, ריכוז הדטרגנט הבלתי-יוני octylphenol ethoxylate ו/או זמן הדגירה מותאמים באופן אמפירי. כאשר אנטיגנים הקשורים לממברנה ואנטיגנים תוך-תאיים משולבים בפאנל אחד, תנאים מתונים יותר (ריכוז דטרגנט נמוך יותר, דגירה קצרה יותר) שומרים על אפיטופים של הממברנה תוךما שהם מאפשרים גישה תוך-תאית, ובמקרה זה שימוש בקו זמן שמתחיל ב-5 min ועולה בהדרגה הוא יעיל. אם נעשה שימוש בספונין במקום, יש להוסיף אותו לכל תמיסות הנוגדנים והשטיפה העוקבות, שכן השפעת הפרמביליזציה שלו היא הפיכה.

ריכוזי נוגדנים נקבעים באופן אמפירי באמצעות תיתוּר ולא על בסיס המלצות כלליות. גישה מעשית היא ביצוע סדרת דילול סיריאלית המקיפה לפחות 3–4 ריכוזים מעל ומתחת לדילול המומלץ על ידי היצרן (למשל, 1:50, 1:100, 1:200 ו-1:400 עבור דילול מומלץ של 1:200), המיושמים על כיסויות חזרתיות תחת תנאים זהים. כל דילול מוערך לפי עוצמת אות ספציפית בתא המצופה; יחס אות לרקע, תוך השוואת דגימות צבועות לבקרת "ללא נוגדן ראשוני" תואמת, והשוואת רקע של נוגדן שני לבקרת "ללא נוגדן"; ושימור המורפולוגיה. נבחר הריכוז הנמוך ביותר המעניק אות חזק וספציפי עם רקע מינימלי. רקע גבוה ומתמשך מופחת בדרך כלל על ידי תיתוּר נוסף, חסימה ממושכת או הגברת רמת הניקיון של השטיפות, בעוד שאות חלש עשוי לשקף קיבוע מופרז, ריכוז נוגדן לא אופטימלי, כשל של הנוגדן הראשוני בזיהוי האפיטופ של המטרה, חוסר התאמה בין הנוגדן השני לבין מין המארח של הנוגדן הראשוני (למשל, נוגדן שני anti-rabbit המיושם על נוגדן ראשוני ממקור עכבר), או אובדן אות הפלואורופור עקב דגרדציה של הנוגדן השני שנגרמה מפג תוקף או אחסון לא נכון, ובמיוחד חשיפה חוזרת לאור. אם האות חסר בכל הדילולים, מומלץ להאריך את דגירת הנוגדן הראשוני או להעבירה ללילה שלם ב-4 °C, לוודא את ביטוי האנטיגן בשורת התאים, לוודא את תאימות הנוגדן לתנאי הקיבוע והחדירה (permeabilization), לבדוק את מספר האומה (lot), האחסון ותוקף הנוגדנים הראשוניים והשניים, לוודא שלמיקרוסקופ יש מסנני עירור ופליטה מתאימים עבור הפלואורופור, ואם הבעיה נמשכת, לבחון קלון חלופי. בעת הכנת תמיסות עבודה, נפח התערובת (cocktail) הנדרש הוא מספר הבארים כפול 150 µL בתוספת כ-10% עודף כדי לפצות על אובדן בפיפטור; נפח המלאי של כל נוגדן שווה לסכום זה חלקי מקדם הדילול שלו (למשל, 825 µL ÷ 200 = 4.13 µL עבור דילול של 1:200), כאשר השאר מושלם עם TBST–BSA 1%. אותו חישוב חל על תערובת הנוגדנים השניים, עם החלפת מקדם הדילול המתאים.

ביצועי המולטיפלקס תלויים בסופו של דבר בתכנון פאנל הפלואורופורים. יש לתאם את הפלואורופורים המוקצים למטרות הראשוניות, לצביעת הנגד הגרעינית ולסמן השלד התאי, כדי למנוע חפיפה ספקטרלית או כפילות של אותות, ומערכת ההדמיה חייבת לתמוך בעירור ובגילוי של כל פלואורופור שנבחר9,10; טווחי העירור והפליטה עבור כל קוביית מסנן מפורטים ב-Supplementary Table 1, מה שמאפשר השוואה ישירה של תאימות ספקטרלית לאורך הפאנל. למשתמשים המתאימים פאנל זה לפלואורופורים אחרים מומלץ לבחור שילובים עם חפיפה מינימלית בין ערוצים סמוכים במידת האפשר, ולוודא את היעדר ה-crosstalk בביקורות של צביעה בודדת לפני שילוב המטרות, כפי שנעשה כאן. אות שיורי המיוחס לפלואורופורים הנוכחים יחד נצפה בכל הערוצים שנרכשו בפאנל המולטיפלקס (Supplementary Figure 1) אך היה חסר בביקורות התואמות של צביעה בודדת ובביקורות של נוגדן משני בלבד (Supplementary Figure 2), מה שמעיד על crosstalk ספקטרלי מסטים המסננים רחב-פס ששימשו ברכישת שדה רחב (שייתכן שניתן להפחיתו באמצעות עירור מבוסס לייזר קונפוקאלי). בהינתן ההפרדה המרחבית בין הלוקליזציה הנוקליולרית של p14ARF לבין ההפצה הפילמנטית/ציטופלזמית של actin ו-IFN-β, crosstalk זה אינו פוגע בפרשנות של לוקליזציית p14ARF בפאנל המולטיפלקס. סבב עבודה זה מסתמך על מולטיפלקס קונבנציונלי מבוסס פלואורופורים, שבו מספר המטרות שניתן להבחין ביניהן בו-זמנית מוגבל על ידי מיני בעלי החיים שמהם הופקו הנוגדנים הזמינים ועל ידי פלואורופורים בעלי הבחנה ספקטרלית. מולטיפלקס מסדר גבוה יותר ניתן להשיג באמצעות אימונופלואורסצנציה מחזורית או הדמיה ספקטרלית, המאפשרות צביעה/הבהייה חוזרת או הפרדה ליניארית (linear unmixing) של פלואורופורים חופפים, בהתאמה, אך הן דורשות ציוד ותוכנה ייחודיים שאינם נדונים כאן19,20.

תוסף ההרכבה (Mounting medium) משפיע הן על איכות התמונה והן על אורך חיי האות. ניתן להשתמש בתוסף אנטי-פייד (antifade) מסחרי בעל יכולת התקשות עצמית, או כחלופה ביתית, ב-80% glycerol ב-PBS (ללא אנטי-פייד וללא התקשות עצמית); תכריכים המבוססים על glycerol תוצרת בית נאטמים בלק שקוף לציפורניים כדי למנוע התייבשות ותזוזה של זכוכית הכיסוי, ובוחרים בתוספים ללא צבעי גרעין לאחר שבוצע צביעה נגדית של הגרעין. מומלץ לרכוש את התמונות מיד לאחר ההתקשות. כאשר צילום מיידי אינו אפשרי, ניתן לאחסן שקופיות שהתקשרו בקופסה כהה בטמפרטורה של 4 °C למשך 2–4 שבועות או ב-−20 °C למשך עד 6 חודשים, תוך לשים לב שפלואורופורים רגישים מאוד לפוטו-דיגרדציה (למשל, פלואורופורים הפולטים אור ירוק) מאבדים מהאות עם הזמן גם בתנאי אחסון אופטימליים. תוספי אנטי-פייד מסחריים מאריכים משמעותית את יציבות הפלואורופור בהשוואה לתוספי glycerol ביתיים; כאשר נעשה שימוש באחרונים, מומלץ מאוד לבצע את רכישת התמונות תוך 24–48 h. לק שקוף לציפורניים תואם למרבית הפלואורופורים ואינו משפיע באופן ניכר על שימור האות, בתנאי שמאפשרים התקשות בחושך למשך 30 min לפחות לפני האחסון.

מהשלב של הקיבוע והלאה, אין צורך עוד בטכניקה סטרילית, וניתן להמשיך בצביעה על גבי שולחן העבודה, תוך השארת מ这不是 מנדף כימי מאושר עבור כל ריאגנט המסומן כ-CAUTION. תאי D17 וקווי תאים אחרים המופקים מגידולים מטופלים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות עבור חומרים מקבוצת סיכון 1 או 2, לפי העניין. כל החומרים הבאים במגע עם תאים מתורגבים, כיסויות (coverslips), טיפים, מדיום ופסולת נוזלית עוברים דה-קונטמינציה לפני ההשלכה: פסולת נוזלית מנוטרלת באמצעות אקונומיקה לריכוז סופי של 10% למשך 30 min לפחות, ופסולת מוצקה נשלחת למכלי פסולת ביולוגית מתאימים. פסולת כימית המכילה PFA, methanol, או דטרגנט נוניוני מסוג octylphenol ethoxylate מופרדת ונשלחת להשמדה בהתאם לתקנות הבטיחות הכימית המוסדיות.

למרות שזרימת עבודה זו תוכננה להיות שימושית באופן רחב, יש לראותה ככזו שניתנת להתאמה בהתאם למטרה ולא כהליך קשיח ואוניברסלי; יישום מוצלח תלוי בהבנתו של החוקר לגבי המיקום של כל אנטיגן, מסיסותו, נגישות האפיטופ שלו ורגישותו לקיבוע ולחדירות (permeabilization). יש להדגיש שתי מגבלות. ראשית, הערכת הצביעה כאן היא איכותית, המבוססת על השוואה לבקרות שליליות ולמיקום תת-תאי צפוי, ולא על כימות פורמלי של יחס אות לרקע; בהתאם לכך, העקביות המדווחת כאן משקפת צביעה איכותית הניתנת לשחזור על פני כיסויות (coverslips) חוזרות ותנאי בקרה, ולא ביצועים מאומתים כמותית. מדריך לפתרון בעיות מאוחד המסכם בעיות נפוצות, סיבות סבירות ופעולות מתקנות מופיע ב-Supplementary Table 2. מעבדות הזקוקות לקריאות כמותיות יכולות להשתמש בתוכנה בקוד פתוח לניתוח תמונות למדידת עוצמה ממוצעת, חיסור רקע, כימות מבוסס אזור עניין (ROI) ופרופילי עוצמה21. שנית, הנתונים המייצגים נגזרים מקו תאים בודד של גידול כלבי הדבק (D17), לכן הרחבה לסוגי תאים, מינים או שילובי אנטיגנים אחרים תדרוש אופטימיזציה מחדש ספציפית למטרה של תנאי הקיבוע, החדירות והנוגדנים.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה גמיש וחסכוני עבור אימונופלורסנציה בשיטה של מונו-ומולטיפלקס בתרביות דו-ממדיות (2D) דבקות, המשלב צריכה נמוכה של ריאגנטים עם ביצועי צביעה עקביים בציוד מעבדה סטנדרטי, תוך התאמה מושכלת התלויה במטרה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים 2023/01697-7 (JL) ו-2022/15913-0 (BES) מהקרן Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). תמיכה התקבלה גם מהמועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq), כולל מענק 401811/2024-7 (BES) ומלגת מחקר 310497/2021-3 (BES).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלטות תרבית רקמה בעלות 24 בארותCorning3524זריעת תאים על כיסוי זכוכית וצביעה
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקהGibco15240062משמש למניעת זיהום חיידקי ופטריות בתרביות תאים.
תמיסת דילול לנוגדנים (TBST-BSA 1%)הוכן במעבדה—עבור 10 מ"ל: 2 מ"ל של תמיסת החסימה 5% BSA + 5 µL Tween-20 + 7.995 מ"ל TBS 1x (תמיסת עבודה) לנפח סופי של 10 מ"ל (סופי: 1% BSA, 0.05% Tween-20 ב-TBS; pH 7.6). יש להכין טרי; אם נשמר, יש לשמור ב- 4 °C יש להגן מפני זיהום ולהשתמש תוך שבוע אחד.
תמיססת חסימההוכן במעבדה—עבור 10 מ"ל: 0.5 גרם BSA המומסים ב-10 מ"ל TBS 1x (1 מ"ל תמיסת מקור TBS 10x + 9 מ"ל מים מזוקקים); pH 7.6. דגירה למשך 30 דקות ב- 25 °C; להכין טרי.
(5% BSA ב-TBS)
ברפלדין ASigma-AldrichB76515 µg/mL; טיפול מקדים של 4 שעות לחסימת הפרשת חלבונים לפני זיהוי ציטוקינים.
BSA (אלבומין מסרום בקר)Sigma-AldrichA79065% ב-TBS לחסימה; 1% ב-TBS + 0.05% Tween-20 כמדלל נוגדנים.
ריאגנט מבוסס קולגן (ציפוי כיסוי זכוכית/coverslip, אופציונלי)Corning 354231קולגן מסוג I המופק מדרמיס של בקר; מדולל ל- 50 µg/mL ב-HCl בריכוז 0.01 N; הוחל ב-5–10 µg/cm² (≈100 µL/well); דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (≈25°C); שאיפה ושטיפה ב-PBS לפני זריעת התאים.
כיסויות, זכוכית, 12 מ"מ עגולותזכוכית קניטל (Knittel Glass)100013מצע לתרבית תאיים הדבקים וצביעה.
קו תאי אוסטאוסרקומת כלבים D17בנק תאייםéדיונונים של ריו דה ז'ניירו276מודל תאי מייצג; תוחזק ב-DMEM בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה-אנטימיקוטית; תוחזק ב- 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
מים דה-יוניים/מזוקקיםהוכן במעבדה—הכנת בופר.
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco12100-046מצע מלא לתרבית תאים.
אתנולSupelco1.00983דקונטמינציה של כיסויי זכוכית/פינצטות.
סרום בקר עובריSigma-AldrichF7524תוסף במצע לתרבית תאים.
(FBS)
פיברונקטיןGibco33016015גליקופרוטאין של המטריקס החוץ-תאי; דליל לריכוז של 0.0125 mg/mL במצע גידול תאים; הוחל ב- 100 µL/well והודגרה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (≈25°C) לפני זריעת התאים.
פינצטה ממתכת בעלת קצה דקשונים—טיפול בכיסויי זכוכית (Coverslips).
מיקרוסקופ פלואורסצנציהLeica MicrosystemsDMi8מיקרוסקופ פלואורסצנציה בשדה רחב DMi8 (Leica Microsystems), HC PL FLUOTAR 40×עדשה עם מפתח מספרי (NA) של 0.80 מסוג DRY; תואמת לפלואורופורים בלוח (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
זכוכית למשטחים של מיקרוסקופשקופית ביולוגית—סמיגת זכוכית כיסוי צבועה להדמיה.
מחזיק לכלי פטרי מזכוכית או לזכוכית כיסוישונות—עיקור באוטוקלאב/אחסון של כיסויי זכוכית (Coverslips).
גליציןSigma-Aldrich8.16E+09עבור 10 מ"ל של תמיסה בריכוז 50 mM: 37.5 מ"ג גליצין מומסים ב-10 מ"ל TBS 1x; pH 7.6. למשך 5 דקות ב- 25 °C; שלב אופציונלי לכיבוי אלדהידים לאחר הקיבוע ולפני החדירה (permeabilization); להכין טרי.
Hoechst 33342InvitrogenH3570עבור 10 מ"ל תמיסת עבודה: לדלל את תמיסת המקור ביחס של 1:5000 ב-TBS. צביעה נגדית של הגרעין; להדגיר בהגנה מאור; להכין טרי.
תא לחותשונות/הוכן במעבדה—עבור דגירה של נוגנים; לחלופין, הרכיב מתוך קופסת פלסטיק אטומה עם נייר סופג לח.
ImageJקוד פתוח (NIH)—משמש לניתוח תמונות לאחר רכישה.
תוכנה לרכישת תמונותLeica Microsystems LAS X 3.7.3משמש לרכישת תמונות במכשיר Leica DMi8.
מתנולMerck1.06009קיבוע חלופי (אנטיגנים גרעיניים/פוספו-אפיטופים); קירור מוקדם ל- −20 °C, דגירה של 5 דקות; עלולה לפגוע בצביעת phalloidin/F-actin.
תושב (Mounting medium)Sigma-AldrichG2289עבור 10 מ"ל: 8 מ"ל גליצרין + 2 מ"ל PBS, pH 7.6, ערבב היטב. ללא תכונות מניעת דהייה (antifade) ואינו עובר פולימריזציה עצמית. אטום את קצוות כיסוי הזכוכית (coverslip) באמצעות לק ציפורניים כדי למנוע התייבשות/הסחפה, אחסן את השקופיות ב- 4 °C יש להגן מאור, ולצלם באופן מיידי כדי למזער פוטו-בליச்சிנג (photobleaching).
(על בסיס גליצרול)
תוסף קיבוע (ProLongTM זכוכית)InvitrogenP36984מכיל רכיבים למניעת דהייה (antifade) וממתקש (מתקשה) באופן עצמי תוך כ-24 שעות בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור, תוך써 יצירת הרכבה קבועה (אין צורך באיטום באמצעות לק ציפורניים). יש לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 2°C–8 °C, תוך הגנה מאור עד לשלב הדימות.
NaClSigma-AldrichS9888המרכיב היוני של תמי solução TBS; שומר על אוסמולריות פיזיולוגית כדי לשמר את מורפולוגיית התאים והרקמות במהלך שלבי השטיפה והדגרת הנוגדנים.
מחט (במBufferedWriter gauge דק, לדוגמה, 25G)–27G)שונות—משמש כמנוף להרמה/הפרדה עדינה של כיסוי הזכוכית (coverslip) מתחתית הבאר, מבלי לגרום נזק לשכבת התאים החד-שכבתית (cell monolayer).
פאראפורמאלדהיד (PFA)Sigma-Aldrich158127עבור 10 מ"ל: 0.4 גרם אבקת פאראפורמאלדהיד מומסת ב-8 מ"ל PBS, מחוממת ל-60–65 °C עם מספר טיפות של NaOH בריכוז 1N עד לקבלת תמיסה צלולה, קוריר, התאמת ה-pH ל-7.4, והבאה לנפח של 10 מ"ל עם PBS; סינון דרך 0.2 µm סנן לפני השימוש. הכן תמיסה טרייה או חלק אותה למנות ואחסן ב- −20 °Cתוך הימנעות ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.
פאלואידין, מצומד לפלואורופור.Invitrogenבהתאם לחוצנית הפלואורסצנציה שנבחרה.עבור 10 מ"ל תמיסת עבודה: לדלל את תמיסת המקור ביחס של 1:400 ב-TBS, pH 7.6, בהתאם להוראות היצרן. סימון חלופי לשלד התא/F-actin; יש להכין טרי ולהגן מאור.
סלוציית סליין עם בופר פוספט (PBS)Sigma-AldrichP4474-1Lבופר פוספט איזוטוני (pH 7.4); שומר על אוסמולריות פיזיולוגית כדי לשמר את המורפולוגיה התאית במהלך שלבי הקיבוע והשטיפה.
(PBS)
Poly-L-lysine (ציפוי לזכוכית כיסוי, רשות)Sigma-AldrichP8920ריאגנט סינתטי לציפוי פוליקטיוני המשפר היצמדות אלקטרוסטטית של תאים; נעשה בו שימוש בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים; נפח מספיק כדי לכסות את פני הזכוכית (coverslip); להדגיר במשך 30 דקות ב- 25 °C לפני זריעת התאים.
נוגדן ראשוני, anti-actin (מארח עיזים)Santa Cruz BiotechnologySC-1615נוגדן אנטי-אקטין; פוליקלונלי, לא מצומד, מזוהה באמצעות נוגדן משני אנטי-עז. בשימוש בדילול עבודה של 1:200.
נוגדן ראשוני, anti-IFN-β (מאכסן עכבר)Aviva Systems BiologyOAPB00536Anti-IFN-β נוגדן; פוליקלונלי, לא מצומד, שזוהה באמצעות נוגדן משני אנטי-עכבר. נעשה בו שימוש בדילול עבודה של 1:200.
נוגדן ראשוני, anti-p14ARF (מארח ארנב)CalbiochemPC409נוגדן Anti-p14ARF; פוליקלונלי, לא מצומד, מזוהה באמצעות נוגדן משני נגד ארנב. מוצר זה הופסק, יהיה צורך לתקף נוגדן חדש אם מתוכננת עבודה על יעד זה. נעשה בו שימוש בדילול עבודה של 1:200.
נוגדן שני, אנטי-ארנב, מצומד ל-Alexa Fluor 488Thermo Fischer ScientificA32731TRנוגדן אנטי-ארנב המשורשר ל-AF488. בשימוש בדילול עבודה של 1:500.
נוגדן משני, אנטי-goat, מצומד ל-Alexa Fluor 555Thermo Fischer Scientific A-21432נוגדן אנטי-עיז מצומד ל-AF555. נעשה בו שימוש בדילול עבודה של 1:500.
נוגדן שני, אנטי-עכבר, מצומד ל-Alexa Fluor 647Thermo Fischer ScientificA-21235נוגדן אנטי-עכבר המשורשר ל-AF647. בשימוש בדילול עבודה של 1:500.
מלח Tris-buffered saline (TBS), תמיסת מלאי 10xהוכן במעבדה—עבור 100 מ"ל: המיסו 6.06 גרם Tris base ו-8.77 גרם NaCl ב-80 מ"ל מים מזוקקים; כוונותו את ה-pH ל-7.6 באמצעות HCl מרוכז; השלימו לנפח סופי של 100 מ"ל; עקרו באוטוקלאב. לדללו 1:10 במים מזוקקים לקבלת תמיסת עבודה (TBS 1x) (סופי: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6); אחסנו בטמפרטורת החדר או 4 °C למשך עד 3 חודשים.
TBST (TBS + 0.05% Tween-20)הוכן במעבדה—עבור 10 מ"ל: 1 מ"ל תמיסת מלאי TBS בריכוז 10x + 8.995 מ"ל מים מזוקקים + 5 µL Tween-20 (0.05% v/v); pH 7.6. בופר שטיפה בין שלבי הצביעה; יש להכין טרי, להשתמש בתוך כ-שבוע ב- 4 °C.
Tris BaseSigma-Aldrich252859חומר חוצץ המשמש להכנת תמיסת אם של TBS; שומר על יציבות ה-pH בטווח פיזיולוגי (pH 7.6) עבור תמיסות שטיפה ודילול באימונופלואורסצנציה.
Triton X-100 (חומר דetergent לא-יוני, octylphenol ethoxylate)Sigma-AldrichX100עבור 10 מ"ל: 10 µL Triton X-100 ב-9.99 מ"ל של TBS 1x עבור TX100 0.1%; 30 µL ב-9.97 מ"ל TBS 1x עבור TX100 בריכוז 0.3% (תלוי במטרה; מטרות גרעיניות דורשות ריכוזים גבוהים יותר).
טריפסין-EDTAGibco25200056משמש לניתוק תאים.
Tween-20Sigma-AldrichP9416משמש ב-TBS כבופר שטיפה (TBST) וכמדלל נוגדנים (TBST-BSA 1%).

מקורות

  1. Yoshida SR, Maity BK, Chong S. Visualizing protein localizations in fixed cells: caveats and the underlying mechanisms. J Phys Chem B. 2023;127:4165-73.
  2. Stadler C, et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nat Methods. 2013;10:315-23.
  3. Sule RO, Rivera G, Gomes AV. Western blotting (immunoblotting): history, theory, uses, protocol and problems. Biotechniques. 2023;75:99-114.
  4. Han Y, Gu Y, Zhang AC, Lo YH. Review: imaging technologies for flow cytometry. Lab Chip. 2016;16:4639-47.
  5. Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. An introduction to performing immunofluorescence staining. In: Yong WH, editor. Biobanking: methods and protocols. New York: Humana Press; 2019. p. 299-311.
  6. Francisco-Cruz A, Parra ER, Tetzlaff MT, Wistuba II. Multiplex immunofluorescence assays. In: Thurin M, Cesano A, Marincola FM, editors. Biomarkers for immunotherapy of cancer: methods and protocols. New York: Humana Press; 2020. p. 467-95.
  7. Harms PW, et al. Multiplex immunohistochemistry and immunofluorescence: a practical update for pathologists. Mod Pathol. 2023;36:100197. doi:10.1016/j.modpat.2023.100197.
  8. Paul I, White C, Turcinovic I, Emili A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. FEBS J. 2021;288:6990-7001.
  9. Radtke AJ, et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 2022;17:378-401.
  10. Gupta V, et al. Protocol for antibody optimization and panel design in high-dimensional multiplexed immunofluorescence imaging. STAR Protoc. 2025;6:104236. doi:10.1016/j.xpro.2025.104236.
  11. ibidi GmbH. µ-Slide 8 Well: instruction manual. Version 4.6. Gräfelfing: ibidi GmbH; 2026:https://ibidi.com/img/cms/downloads/in/IN_8082X_8well.pdf
  12. Thermo Fisher Scientific. Coating Nunc Lab-Tek and Lab-Tek II chamber slides and chambered coverglasses [protocol]. Waltham, MA: Thermo Fisher Scientific; 2017:https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LCD/Instructions/ECM-Coating-Protocol-for-Lab-Tek-and-Lab-Tek-II.pdf
  13. Schnell U, Dijk F, Sjollema KA, Giepmans BNG. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 2012;9:152-8.
  14. Piña R, et al. Ten approaches that improve immunostaining: a review of the latest advances for the optimization of immunofluorescence. Int J Mol Sci. 2022;23:1426. doi:10.3390/ijms23031426.
  15. Lopata A, et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Sci Rep. 2018;8:6572. doi:10.1038/s41598-018-24953-4.
  16. Yamanushi TT, et al. Comparison of formaldehyde and methanol fixatives used in the detection of ion channel proteins in isolated rat ventricular myocytes by immunofluorescence labeling and confocal microscopy. Folia Morphol (Warsz). 2015;74:258-61.
  17. Richter KN, et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 2018;37:139-59.
  18. Konno K, Yamasaki M, Miyazaki T, Watanabe M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problems in neuroscience research. Sci Adv. 2023;9:eadf7084. doi:10.1126/sciadv.adf7084.
  19. Lin JR, et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. Elife. 2018;7:e31657. doi:10.7554/eLife.31657.
  20. Goltsev Y, et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 2018;174:968–81.e15.
  21. Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9:676-82.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Cancer ResearchimmunofluorescenceMicroscopyFluorescenceAntibodiesCell Culture TechniquesCellsCulturedCoverslipsStaining and LabelingMultiplex Imagingconfocal microscopyimage analysis
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.