מאמר שיטה

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקרים גנטיים קדמיים משמשים באופן שגרתי להפרעה לאלפי אלמנטים גנטיים באופן משותף במטרה ליצור מפות גנוטיפ לפנוטיפ בקנה מידה גדול. למרות שלעיתים קרובות מתבצעת במערכות תרביות תאים, מצטברות ראיות תומכות בכך שמסכי in vivo יכולים לחשוף ביולוגיה חדשה שלא ניתן לשחזר במבחנה. עם זאת, היישום הנרחב של גישה זו הוגבל על ידי שני אתגרים עיקריים: התמקדות דומיננטית בהפרעות אובדן תפקוד במקום בהפעלה גנטית, והמכשולים הטכניים המשמעותיים בהעברת ספריות גנטיות מורכבות לרקמות ספציפיות ב-vivo. כדי להתגבר על אתגרים אלו, אנו מתארים אסטרטגיית הזרקה תוך-צינורית פשוטה ורב-תכליתית המאפשרת סקר גנומי פונקציונלי יעיל ומהיר בבלוטת החלב של העכבר, על ידי יצירת עשרות אלפי שיבוטים אפיתליים בדידים. בנוסף, אנו מספקים את כל הפרטים הנדרשים ליצירת ספריות, הזרקה תוך-דוקטלית, דה-קונבולוציה של מסכים וניתוח ספריות CRISPR-Knockout ו-Activation לצורך מסכים מקיפים . באמצעות כלים אלו, שכינינו CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay), זיהינו מדכאי גידולים ואונקוגנים חדשים בגנום המקודד והלא-מקודד בספריות מאוחדות הנעות מ-46 מקומות ועד חמישית מהגנום. חשוב לציין, גישה וניתוח זה יכולים להיות מיושמים על איברים אחרים כדי לחקור את התפקוד הביולוגי של כל גן במהלך הומאוסטזיס או מחלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקרים של גנומיקה פונקציונלית מספקים מסגרת עוצמתית לחקירת תפקוד גנים בקנה מידה1. פיתוח טכנולוגיות עריכת גנים CRISPR-Cas אפשר הפרעה שיטתית של מאות עד אלפי גנים במקביל, ומסכים מבוססי CRISPR בקווי תאים יונקים הפכו לאבן יסוד במחקר הביולוגיה המודרנית של סרטן2. גישות אלו במבחנה זיהו גנים חיוניים3, מדכאי גידולים4, ואינטראקציות קטלניות סינתטיות5 בהקשרים מגוונים של סרטן. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת היא חוסר היכולת ללכוד את התכונות הביולוגיות המורכבות של הגידולים ב-vivo, כולל אינטראקציות עם מערכת החיסון והסטרומה, גרדיאנטים של חומרים מזינים וארכיטקטורת רקמה בתוך המיקרו-סביבה2. בהתאם למגבלה זו, מחקרים עדכניים הראו שרבים מהגנים המובילים לסרטן אינם מפעילים השפעות מדידות במבחנה, במיוחד כאשר תפקידם תלוי ברמזים מיקרוסביבתיים שאינם קיימים בתרבות תאים 6,7,8,9,10.

בלוטת החלב של העכבר מספקת הקשר רקמתי ייחודי ויעיל לסינון גנומיקה פונקציונלית בתוך החיים. תאי אפיתל חזה הם בעלי התחדשות גבוהה, עוברים סבבים של התרחבות קלונית במהלך מחזור האסטרוס, ומאורגנים לרשת צינורות מסועפת שניתן לגשת אליה בקלות ולמניפולציה גנטית 11,12,13. תכונות אלו תמכו בעשורים של ניתוחים גנטיים של פסיפס וניסויי מעקב שושלת, וקובעים את בלוטת החלב כמערכת ניתנת לפתרון לבחינת תפקוד גנים פנימי ותלויי מיקרוסביבה במהלך הומאוסטזיס רקמתי ומחלות 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. חשוב לציין, ניתן להגביל הפרעות גנטיות לתחום האפיתל בלבד, מה שמאפשר לימוד ישיר של מניעים ספציפיים לשינוי האופטל, תחרות תאים, נאמנות שושלת והתקדמות הגידול בהקשר רקמתי שלם.

בעוד שפותחו מספר אסטרטגיות להעברת הפרעות גנטיות ישירות לבלוטת החלב הבוגרת במקום, עדיין קיימים מכשולים טכניים משמעותיים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. העברת Cre recombinase בתיווך אדנו-וירוס שימשה באופן נרחב ליצירת רקומבינציה סומטית של אללים מותנים בבלוטת החלב הבוגרת 34,35,36,37, ומציעה דרך יעילה למניפולציה של תפקוד גנים ללא רבייה מורכבת של קווי נבט הנדרשים למודלים מסורתיים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs). בעוד שאדנווירוס בעל טיטר גבוה יכול גם להעביר רכיבי CRISPR-Cas9 לתאים תושבי רקמה, וקטורים אלו אינם משתלבים בגנום המארח 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. דבר זה מגביל מאוד את קנה המידה של הסקרים ל-~10–55 גנים, שכן כל אתר יעד של gRNA חייב להיות מסומן בנפרד באמצעות גלאי היפוך מולקולרי 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . יתרה מזאת, שיטות ההולכה תוך הדוקטליות הקיימות מאפשרות גישה ישירה למערכת הצינורות של השד אך דורשות חשיפה כירורגית פולשנית של בלוטת החלב50 או להסתמך על שימוש במזרקי המילטון גדולים יחסית שהם מסורבלים51. למרות שהן יעילות להעברה מקומית של וירוס, גישות אלו הן יחסית פולשניות, מאתגרות טכנית, ואינן מותאמות להפצה ניתנת להרחבה של ספריות לנטי-ויראליות מאוחדות. יחד, מחקרים אלו מראים כי הפרעות ויראליות בשטח הן אפשריות, אך הכלים הנוכחיים אינם תומכים בהפרעות יציבות, מאוחדות וניתנות לשחזור רצפים הנדרשות לסקר CRISPR בקצב גבוה ב-vivo בתחום.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, אנחנו ואחרים פנינו לשילוב וקטורים לנטיויראליים, שמאפשרים שינויים גנטיים יציבים ותורשתיים. בניגוד למערכות תרביות תאים, רקמות in vivo מטילות מגבלות חמורות על מספר התאים המופרעים שניתן ליצור בתוך איבר אחד, מה שהופך את הסינון הגנומי לבלתי מעשי. כתוצאה מכך, מסכי CRISPR ב-vivo מחייבים תכנון של ספריות ממוקדות ומבוססות ביולוגית, שמאזנות בין כיסוי לכדאיות. יתרה מזאת, רוב מסכי CRISPR במצב חי, שנבדקו כאן2, התמקדו כמעט אך ורק בהפרעות אובדן תפקוד של לנטיוויראל, למרות עדויות גוברות לכך שהפעלת גנים יכולה לחשוף תובנות ביולוגיות משלימות ולא חופפות 52,53,54,55. אנחנו ואחרים הראינו בעבר כי שילוב הפרעות CRISPR לנטיוויראליות באפיתל השד הבוגר מאפשר שינוי גנטי יציב ותורשתי במקום, וניתן לשחזר ולכמת אותם מ-DNA גנומי 36,55,56,57,58. באמצעות גישה זו, ביצענו סקרים משותפים של CRISPR ב-in vivo שזיהו גורמים חדשים לשינוי אונקוגני 36,55, והוכיחו הן את ההיתכנות והן את הרלוונטיות הביולוגית של מתן לנטיוויראלים וסקר CRISPR. עם זאת, מחקרים אלו גם הדגישו את הצורך בפרוטוקול פשוט, סטנדרטי וניתן להרחבה, שיכלול מודלים של סינון אובדן ותפקוד באותה בלוטה.

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית הזרקה תוך-דוקוקטלית פשוטה ורב-תכליתית המאפשרת סקר מקביל ב-vivo של ספריות CRISPR-knockout והפעלה, הנקראות CRISPR-KOALA, בתוך בלוטת החלב של העכבר הבוגר55. CRISPR-KOALA משתמש או ב-RNA קונבנציונלי של 20-21 bp 'מדריך יחיד' (sg) ליכולות CRISPR-KO או ב-RNA 'dead-guide' (dg)RNA של 14 bp עבור CRISPR-A. ה-dgRNA מכוון ביעילות את Cas9 לאתר היעד אך מונע פעילות אנדונוקלאזב-Cas9 59,60,61, וכך מאפשר שימוש בעכבר יחיד המבטא Cas9 פעיל הן להן במודאליות של knockout והן להפעלה. הכנסת שני סיכות שיער PP7 ל-dgRNA trcr מאפשרת גיוס של טרנסאקטיבטור PP7 Coat Protein:P65:HSF162 ומובילה לביטוי יתר יעיל של גנים ב-vivo55 (איור 1). על ידי שילוב של עיצוב ספריית gRNA ממוקדת עם ייצור לנטיויראלי בדרגת טיטר גבוהה והעברה תוך-צינורית לא ניתוחית באמצעות מיקרו-נימי זכוכית, גישה זו מייצרת עשרות אלפי שיבוטים אפיתליים בדידים מרחביים תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמה ואינטראקציות מיקרו-סביבתיות. חשוב לציין כי אינטגרציה של לנטיווירוס בגנום המארח מאפשרת התאוששות וכימות של gRNA באמצעות ריצוף בתפוקה גבוהה, ומאפשרת סקרים גנומיים פונקציונליים משותפים ב-vivo. ביחד, זה מאפשר הפרעות מקבילות או סימולטניות (באותו תא) של CRISPR-KO ו-CRISPR-A בתוך אותה בלוטת חזה של עכבר המביע Cas9.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב הכולל עיצוב ספריית gRNA, ייצור וריכוז לנטיויראל, מתן תוך-צינורית, דה-קונבולוציה בספרייה וניתוח נתונים (איור 1). ביחד, שיטה זו מספקת מסגרת מעשית וניתנת להרחבה לסריקת CRISPR in-vivo ו/או הפעלה בבלוטת החלב של העכבר, וניתן להתאים אותה לחקר תפקוד הגנים במהלך הומאוסטזיס רקמה, הקשרים שונים של מחלה, רקמות אחרות ומינים אחרים כמו העכברוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של המרכז לפנוגנומיה (פרוטוקול 26-0272H).

1. שיבוט ספריית CRISPR

הערה: סעיף זה מתאר שיבוט משולב של ספריות CRISPR knockout והפעלה של CRISPR מאוליגונוקלאוטידים מסונתזים במערכים אל עמודי השדרה של לנטיוויראלים. אנו מייצרים באופן שגרתי ספריות המכילות עד 4,000 gRNA, שניתן לסרוק אותן בכיסוי של 400X-1,000X ב-8-20 עכברים. מספר ה-gRNA והכיסוי ניתן להתאמה לפי הצורך, מה שישפיע על מספר העכברים הנדרשים לשמירה על עוצמה סטטיסטית. אנו ממליצים לשמור על כיסוי מינימלי של 400X, שיכול להספיק לפנוטיפים חזקים של רווח תפקוד.

  1. מדריך עיצוב ספריית RNA
    1. הרכיבו רשימה של כל הגנים של העכברים שיבדקו בניסוי אחד לתכנון ספריית CRISPR במורד הזרם, תוך שמירה על רשימות יעד נפרדות לספריות CRISPR knockout (CRISPR-KO) והפעלת CRISPR (CRISPR-A).
      הערה: ספריות CRISPR-KO ו-CRISPR-A נוצרות בנפרד וניתן לשלב אותן בשלב הטרנסדוקציה לנטיוויראלית לצורך סינון סימולטני.
    2. עבור ספריות CRISPR-KO, בחרו ארבעה עד חמישה RNA מדריך יחיד (sgRNA) לכל גן באמצעות אלגוריתמים לחיזוי בעלי ניקוד גבוה כגון CRISPick 62,63, CHOPCHOP64 או VBC Score65.
      הערה: ציון VBC מניב יעילות גבוהה מאוד ופעילות מדויקת66. ללא קשר לכלי, תעדף מדריכים עם פעילות גבוהה חזויה במטרה, פוטנציאל נמוך מחוץ למטרה ואקסוני קידוד מיקוד.
    3. לספריות CRISPR-A, בחרו שמונה עד עשרה מדריכים לכל גן באמצעות CRISPick62,63 או CHOPCHOP64. לכלים שמאפשרים אורך מדריך שנקבע על ידי המשתמש (כמו CHOPCHOP), הגדר את אורך המדריך ל-14 בסיסים לפני יצירת המדריך. אם משתמשים בכלי שמייצר רק מדריכים של 20 bp, המרו רצפים אלה ל-RNA מנחים מתים (dgRNA) על ידי שמירת רצף 14 bp מיד 5' של המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר, שמכוונים לאזורי פרומוטר בגנים.
      הערה: dgRNAs הם רצפי הנחיה מקוצרים שנועדו לאפשר הפעלה שעתוקית מבוססת CRISPR ביעילות של כ-50-85% מהיעילות של sgRNA באורךמלא 55, מבלי לגרום לפיצול DNA 59,60,61.
    4. איחד את כל ה-sgRNA או dgRNA המתאימים לניסוי אחד לרשימות נפרדות כדי לאפשר שיבוט אחיד, ייצור ויראלי וסקר בחיים (in vivo ).
      הערה: sgRNA ו-dgRNA שייבדקו יחד יחדדו לאחר הייצור הוויראלי.
    5. יצירת ספריות בקרה שלילית משותפות למסכי CRISPR-KO ו-CRISPR-A, כולל רצפיgRNA לא ממוקדים 55,67 ורצפי gRNA לא גנטיים68, כפי שתואר קודם, כדי לשלוט בהשפעות רקע עצמאיות מהפרעה או הפעלה של הגנים.
      הערה: אם רוצים, ניתן ליצור ספריות נפרדות של gRNAs לא-מטרה ולא-גניים ליצירת שתי ספריות בקרה שלילית עצמאית.
  2. עיצוב והגברה של בריכות אוליגונוקלאוטידים
    1. תכנן אוחד אוליגונוקלאוטידים כך שכל gRNA מכיל את רצף המטרה, חריגות אנזימי הגבלה התואמות לעמוד השדרה של הלנטיוויראלי היעד, ורצפי פריימר ספציפיים לספרייה כדי לאפשר הגברה סלקטיבית ממאגר אוליגונוקלאוטידים מורכב (איור 1, טבלה 1).
    2. הקצה זוג פריימר ייחודי לכל ספריית gRNA כדי לאפשר הגברה עצמאית של ספריות בודדות מתוך מאגר אוליגונוקלאוטידים משותף. זוגות פריימר ייחודיים מפורטים בטבלה 1.
    3. הזמנת ספריות אוליגונוקלאוטידים מאגדות מפלטפורמת סינתזת מערך מסחרית, תוך הבטחת ייצוג אקווימולר של כל gRNAs בכל מאגר.
    4. הגבירו ספריות gRNA בודדות מתוך תבנית האוליגונוקלאוטיד המאגדת באמצעות פריימרים ספציפיים לספרייה בתערובת התגובה הבאה. ניתן לשנות את התגובה כדי להיצמד להרכב המומלץ של הפולימראז הספציפי. הכן שלוש תגובות עם תבנית אוליגונוקלאוטידית מאוחדת ותגובה שלילית אחת ללא תבנית.
      4 ng תבנית אוליגונוקלאוטיד מאוחדת
      2.5 מיקרוליטר 10 מיקרומום פריימר ספציפי לספרייה קדימה
      2.5 מיקרוליטר 10 מיקרומולר פריימר הפוך ייעודי לספרייה
      10 מיקרוליטר 5x בופר תגובה
      0.5 מיקרוליטר פולימראז DNA באיכות גבוהה
      X μL מים ללא נוקלאז
      נפח כולל של 50 מיקרוליטר
    5. בצע הגברת PCR באמצעות תנאי המחזור הבאים, תוך התאמת טמפרטורת החישוש בהתבסס על טמפרטורת ההתכה של פריימר ספציפי לספרייה:
      מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
      18 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, 62–65 מעלות צלזיוס ל-20 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-3 שניות
      מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
      הערה: אל תעלה על 18–19 מחזורי הגברה כדי לשמור על ייצוג gRNA שווה בתוך הספרייה.
    6. לפרק מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 2.5% ב-120 וולט למשך כ-45 דקות ולהסיר את הרצועה התואמת לגודל ההכנסת ה-gRNA הצפוי (כ-100 bp, תלוי בעיצוב הפריימר; איור 2A).
    7. מוצרי PCR מטהרים באמצעות ערכת חילוץ ג'ל והשתלבו ב-20 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים במהלך שלב הסלילה הסופי.
      הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן תוספות gRNA מטוהרות בטמפרטורה של מינוס 20°C לפני השיבוט.
  3. הכנה ועיכול של עמודי שדרה לנטיויראליים
    1. הכינו פלסמידים של עמוד שדרה לנטיויראלי המכילים רצף חומר נשלף לשיבוט הכנסות gRNA. לספריות CRISPR-KO ו-CRISPR-A ב-vivo משתמשות ב-pLKO-Cre (Addgene Plasmid #158032 או 256774) וב-pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plasmid #256776), בהתאמה.
    2. לעכל 5–10 מיקרוגרם של DNA עמוד שדרה לנטיוויראלי בנפח תגובה כולל של 200 מיקרוליטר באמצעות האנזים והבופר המתאימים. השתמש ב-Esp3I עבור עמוד השדרה pLKO-Cre CRISPR-KO וב-SapI עבור עמוד השדרה pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      פלסמיד עמוד שדרה 5–10 מיקרוגרם
      20 מיקרוליטר 10x בופר אנזימים
      אנזים הגבלה של 5 מיקרוליטר
      X μL מים נטולי נוקלאז
      נפח כולל של 200 מיקרוליטר
    3. דגרו תגובות עיכול למשך 2–3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 2 מיקרוליטר של פוספטאז אלקליני רקומביננטי לכל תגובת עיכול ודגר במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לדפוספורילט את עמוד השדרה המעכל.
    5. הפרסו תוצרים מעוכלים על ג'ל אגרוז 1% והסרו את הרצועה המתאימה לעמוד השדרה הלינארי (איור 2B,C)
      הערה: בשני עמודי השדרה, שבר הסטופר נראה כרצועה נפרדת בכ-2000-2500 bp, תלוי בווקטור.
    6. טיהר את ה-DNA שדרה שנלקח באמצעות ערכת חילוץ ג'ל ושחרר בנפח מינימלי של מים אולטרה-טהורים לשמירה על ריכוז DNA גבוה (בדרך כלל 20 מיקרוליטר).
      הערה: (נקודת הפסקה) עמודי השדרה המטוהרים שעוכלו עשויים להישמר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני הקשירה.
  4. עיכול וקשירת ספריות gRNA
    1. הקמים תגובות עיכול-קשירת הכל באמצעות 750 ng של DNA עמוד שדרה לנטיוויראלי מטוהר, 43 ng של DNA מוקלט בספריית gRNA, 3 מיקרוליטר של אנזים רקרקציה, 7.5 מיקרוליטר של ליגאז DNA T4, 15 מיקרוליטר של 10 mM ATP, וכמות מתאימה של בופר תגובה ומים מזוקקים סטריליים כדי להגיע לנפח תגובה כולל של 150 מיקרוליטר.
      הערה: השתמש באותו אנזים הגבלה ששימש בתחילה בשלב העיכול של עמוד השדרה של הפלסמיד. יחס של 750 ng של עמוד שדרה לנטיוויראלי מטוהר ל-43 ng של DNA מוכנס לספרייה מניב יחס מולרי משוער של 1:7 כאשר משתמשים בעמודי השדרה המומלצים.
    2. חלק כל תערובת ליגציה לשלושה אליקווטים שווים כדי להגדיל את יעילות הטרנספורמציה ומורכבות הספרייה.
    3. הכינו תגובת בקרה שלילית אחת המכילה DNA עמוד שדרה אך ללא הכנסות gRNA להערכת קשירת רקע.
    4. דגרו תגובות עיכול-קשירה במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    5. למחרת בבוקר, הוסיפו 1 מיקרוליטר של אנזים ההגבלה המתאים לכל תגובה, ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להוביל להשלמת עיכול עמוד השדרה.
    6. מוסיפים 2 מיקרוליטר של 10 מ"מ ATP ו-2 מיקרוליטר ליגאז DNA של T4 לכל תגובה ולדוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 2–3 שעות להשלמת הליגציה.
    7. איחד את שלוש תגובות העיכול-קשירה הבודדות בכל ספרייה, טיהר את התגובות באמצעות שיטת ניקוי אוליגונוקלאוטידים מבוססת עמודה, ומשחרר כל אחת מהן ב-21 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים וטהורים במיוחד. שחרר את תגובת הבקרה השלילית המטוהרת היחידה ב-7 מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים וטהורים במיוחד.
      הערה: אין לשחרר מוצרי קשירה בבופרים המכילים מלח או EDTA, שכן הם מפחיתים משמעותית את יעילות האלקטרופורציה של החיידקים. (נקודת הפסקה) מוצרי קישור מטוהרים עשויים להיאחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C לפני האלקטרופורציה.
  5. אלקטרופורציה והרחבה של ספרייה
    1. קובטות אלקטרופורציה בקוטר 0.1 ס"מ לפני קירור, צינורות מיקרוצנטריפוגה המכילות 2 מיקרו ליטר של מוצרי קשירה מטוהרים, וצינורות תרבית פוליפרופילן עגולים במשקל 14 מ"ל על קרח למשך לפחות 20 דקות לפני האלקטרופורציה.
    2. הפשרה של תאי חיידקים בעלי יכולת אלקטרוכטרית על קרח וערבבה עדינה של 25 מיקרוליטר תאים עם 2 מיקרוליטר של מוצר קישור מטוהר בצינור המיקרוצנטריפוגה המקורר מראש באמצעות פיפטינג.
    3. העבר את תערובת התא-DNA לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש בקוטר 0.1 ס"מ ואלקטרופורט ב-1.8 קילו-וולט, 25 מיקרו-פרנהייט ו-200–600 Ω.
      הערה: אלקטרופורציה מוצלחת בדרך כלל מניבה קבוע זמן בין 4.6 מילישניות ל-4.9 מילישניות.
    4. מיד הוסיפו 1 מ"ל מדיום התאוששות מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, המסופק עם התאים האלקטרוכפיטיביים לקובט, החזירו בעדינות את התאים, והעבירו את המתלה לצינור פוליפרופילן עגול בתחתית של 14 מ"ל.
    5. דגרו את התאים שהוחזרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-180 סל"ד למשך 90 דקות.
    6. צלחת 10 מיקרוליטר של התאים שהוחזרו מדוללת ב-90 מיקרוליטר של ציר LB על צלחות LB-אגר המכילות אמפיצילין ודגירה במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס להערכת יעילות הטרנספורמציה וקשירת רקע.
      הערה: שיבוט מוצלח אמור להביא למאות מושבות על הלוח עם החדרה ומעט (>-30) מושבות על לוח הבקרה השלילי שרק בעמוד השדרה (איור 3).
    7. אימות נוסף של הספרייה על ידי בחירת ~10 מושבות למיני-פרפ ורצף סנגר קדימה מהפרומוטר של U6. ספריות ששוכפלות בהצלחה יכילו < 90% מהמיני-פרפים עם ריצוף ברור של gRNA, ללא מדריכים חוזרים על פני 10 המיני-פרפים. בנוסף, אנזימי הגבלה מעכלים את המיני-פרפס ואת ספריית הפלסמידים המאגדת (שלב 1.5.10) ומריצים על ג'ל אגרוז כדי לבדוק את גודל הרצועות ולוודא שמבני הלנטיויראליים לא עברו רקומבינציה חריגה.
      הערה: ניתן להעריך ייצוג בספרייה על ידי השוואת ספירת המושבות מפלטות דילול למספר הכולל של gRNA בספרייה, תוך יעד לכיסוי פי 1,000. ניתן להשתמש במספר דילול סדרתי כדי לסייע בחישוב זה.
    8. אם יעילות הטרנספורמציה מספיקה, יש להניח את התאים שנותרו ללוחות LB-אגר בגודל 15 ס"מ המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה, ולדגור אותו במהלך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ליצירת מדשאה צפופה של מושבות.
      הערה: פלטה של 100 מיקרוליטר של תאים ששוחזרו על כל אחד מעשר לוחות אגר בעובי 15 ס"מ לשיבוש מספיק מושבות.
    9. ביום הבא, השתמשו במגרד תאים כדי לגרד מושבות חיידקים לתוך 500 מ"ל מרק LB עם אמפיצילין כדי ליצור תרבית חיידקים אחת המייצגת את ספריית ה-gRNA המשובלת.
    10. הרחבו את תרבית החיידקים המצטברת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור של כ-3 שעות ובודדו DNA פלסמיד באמצעות ערכת מקסיפרפ.

2. הפקה לנטי-ויראלית לצפייה ב-in vivo

הערה: לצורך מתן תוך-צינור וסקר משולב ב-in vivo , יש לרכז את ההכנות הלנטיויראליות כדי להשיג טיטרים גבוהים (רצוי בין 1 x 108 pfu/mL ל-1 x 109 pfu/mL) כדי להבטיח העברה יעילה של תאי אפיתל חזה. הפרוטוקול הבא מתאר ייצור ויראלי לנטי-ויראלי עם טיטר גבוה, מותאם לשימוש ב-vivo .

  1. הכנת תאים המייצרים לנטיוויראלים
    1. לשמור על HEK293TN תאים במדיום Eagle (DMEM) המותאם של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ותאי תרבית בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2.
    2. תאי מעבר כל 2–3 ימים לשמירה על גדילה לוגריתמית ולהבטיח שהתאים לא יעלו על 90% מהקונגליתם. השתמש בתאים במעברים <20 לייצור ויראלי מיטבי.
    3. יום אחד לפני הטרנספקציה, ציפוי לוחות תרבית רקמה באורך 15 ס"מ בפולי-L-ליזין (0.02 מ"ג/מ"ל) למשך שעה בטמפרטורת החדר. הכינו תשע צלחות למשלוח אחד של הכנה ויראלית.
    4. הסר את תמיסת פולי-אל-ליזין ושוטף צלחות פעמיים עם תמיסת מלח עם בופר פוספט.
    5. זרעים 1.1 x10 7 HEK293TN תאי רקמה על כל אחד מתשעה לוחות תרבית רקמה מצופים פולי-אל-ליזין בקוטר 15 ס"מ, כדי להבטיח שהתאים יגיעו ל-~90% מפגש בזמן ההעברה.
      הערה: ביישומים שאינם דורשים טיטרים ויראליים מקסימליים, ניתן לצמצם את ייצור הלנטיווירוס לפחות לוחות (למשל, שלוש או שש פלטות) עם תפוקה מופחתת באופן יחסי. הקטן את החומרים (DNA פלסמיד, PEI ו-DMEM) לצורך טרנספקטציה בהתאם.
  2. טרנספקציה לנטיוויראלית מבוססת PEI
    1. הכינו DNA של פלסמיד לייצור לנטיווירוס באמצעות מערכת תלת-פלסמידית הכוללת 95 מיקרוגרם של פלסמיד ספריית gRNA, 95 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה psPAX2 (Addgene Plasmid #12260), ו-65 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפת VSV-G pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
    2. משלבים את שלושת הפלסמידים לייצור לנטיווירוס ב-10.8 מ"ל DMEM ללא סרום ומערבבים היטב על ידי מערבולת למשך כ-10 שניות.
    3. הוסיפו 366 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל פוליאתילנימין (PEI) טיפה לתמיסת ה-DNA המדוללת, ערבבו היטב על ידי מערבובת למשך כ-10 שניות, ודגרו את קומפלקסי ה-DNA-PEI בטמפרטורת החדר למשך 10–30 דקות.
    4. במהלך היווצרות מורכבת, יש לשאוב מדיום תרבית מהלוחות HEK293TN ולהוסיף 14 מ"ל DMEM ללא סרום.
      הערה: סרום בקר עוברי יכול לעכב ספיגת פלסמיד על ידי התאים.
    5. פזר 1.2 מ"ל של קומפלקס DNA-PEI בירידה לאורך הלוח, והסלע כדי להבטיח פיזור אחיד.
    6. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 6–8 שעות.
    7. החלף את המדיום בכל צלחת ב-20 מ"ל DMEM מחומם מראש בתוספת 10% סרום בקר עוברי (ללא 1% פניצילין-סטרפטומיצין) והמשך בתרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
      הערה: טרנספקציה בלילה, שכן חשיפה ממושכת ל-PEI וחוסר בסרום מפחיתה את תפוקת הווירוסים.
  3. קציר ויראלי ואולטרה צנטריפוגציה
    1. הכינו 200 מ"ל של תמיסת כרית סוכרוז על ידי שילוב של 40 גרם סוכרוז, 11.7 גרם כלוריד נתרן, 4 מ"ל של 1 מ' HEPES (pH 7.4) ו-1 מ"ל של 0.5 מ' EDTA (pH 7.9) בנפח מתאים של מים מזוקקים סטריליים, והסינון באמצעות יחידת סינון פוליאתרסולפון בקושרת חלבון נמוכה של 0.45 מיקרון. תמיסה זו יכולה להיאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
    2. אספו את הסופרנטנט הלנטיוויראלי 48–72 שעות לאחר הטרנספקציה.
    3. העבר 10 מ"ל DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי דרך יחידת סינון פוליאתרסולפון בקוטר 0.45 מיקרון ובעלת קשר חלבון נמוך ונמוכה. זרוק את הזרימה דרך. טען את הסופרנטנט על המסנן ומרח את השואב.
      הערה: אם לא ניתן לבצע ריכוז מיידי, יש לאחסן את הסופרנטנט הוויראלי המזוהה בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
    4. הוסיפו 30 מ"ל של סופרנטנט ויראלי מנוקה לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
    5. הנח בהדרגה את הסופרנטנט הוויראלי המונק עם 4 מ"ל תמיסת כרית סוכרוז.
    6. מקם את צינור הצנטריפוגה האולטרה-צנטריפוגה במתאם תואם לרוטור דלי מתנדנד ולאזן את הצינורות במדויק.
    7. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 104,000 × גרם למשך לפחות שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: נדרשת רוטור דלי מתנדנד, כמו רוטור Beckman JS24.38, כדי לשחרר את הווירוס כראוי דרך כרית הסוכרוז.
    8. יש לנקן בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור הוויראלי, שעשוי להיראות כשכבה לבנה או שקופה חלשה בתחתית הצינור.
    9. אפשר לצינורות להתייבש באוויר לפחות 10 דקות ולהשתמש במגבון מעבדה כדי להסיר כמה שיותר נוזל שנותר מתוך הצינור מבלי להפריע לכדור.
      הערה: ייבוש נכון של הצינור קריטי להשגת ריכוזי ויראליים גבוהים, שכן הוא מפחית את נפח ההתאוששות הסופי.
    10. החזירו את הכדורים הוויראליים ב-20 מיקרול של מלח קר עם בופר פוספט והפיפטה בזהירות למעלה ולמטה, תוך שמירה על הימנעות מבועות אוויר.
    11. דגרו את הצינורות על קרח במשך שעתיים עם ערבוב עדין כדי להחזיר לחלוטין את הכדורים הוויראליים.
    12. העבר את הווירוס המרוכז לצינור מיקרופוגה נקי וניקוי התמיסה בצנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הסיבוב הזה מסיר פסולת וחלקיקים שנותרים שסתומים את מחט ההזרקה במהלך הניתוח.
    13. אליקווט את הווירוס המרוכז לנפחים חד-פעמיים כדי להימנע מהקפאה-הפשרה ונשנות ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C.
  4. טיטרציה לנטיויראלית באמצעות LSL-tdTomato פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs)
    1. צלחת 100,000 LSL-tdTomato MEF (שמקורם ב-Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) בצלחת עם 6 בארות יום אחד לפני ההדבקה ב-DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ותרבות התאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2. לוחן באר נוספת לספירת תאים.
      הערה: LSL-tdTomato MEFs משמשים ככתבים עבור Cre במסגרת הלנטיווירוס. ניתן להשתמש בכל מערכת דיווח מתאימה למדידת ויראליים של עמודי שדרה אחרים.
    2. ביום הבא, ספרו את מספר ה-LSL-tdTomato MEF מבאר נוספת כדי לכמת את מספר התאים הנמצאים בזמן ההדבקה.
    3. הכינו דילול סדרתי של לנטיווירוס מרוכז המקודד Cre recombinase בסך הכל 2 מ"ל מדיום Eagle מותאם של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי. באופן כללי, 0.4 מיקרוליטר, 0.1 מיקרוליטר ו-0.025 מיקרוליטר של וירוס מרוכז יוצרים טווח דינמי ליניארי נקי (איור 4A–D).
    4. הוסיפו 2 מ"ל של דילול ויראלי לכל באר של LSL-tdTomato MEF והוסיפו 2 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל פוליברן לכל באר.
    5. הדביק MEFs על ידי סיבוב ב-400 × גרם למשך 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    6. החלפת מדיה ויראלית ב-2 מ"ל DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ותרבת התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48–72 שעות.
    7. כימות את התאים החיוביים לעגבנייה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה או ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את שיעור התאים הנגועים בכל דילול.
    8. חשב את הטיטר התפקודי בהתבסס על שיעור התאים הנגועים ומספר התאים הנמצאים בזמן ההדבקה.
      הערה: וירוסים של CRISPR-KO ו-CRISPR-A מיוצרים, מרוכזים ומוערכים בנפרד. תפקודית, טיטרים שנקבעים באמצעות LSL-tdTomato MEFs משמשים לערבוב וירוסי CRISPR-KO ו-CRISPR-A ביחס מוגדר לפני ההזרקה התוך-צינורית.
  5. הערכת איכות של ספריות פלסמיד ולנטיווירוס
    1. כדי לוודא שספריות ה-gRNA משוכפלות עם עומק/כיסוי מספק ושכל ה-gRNA נשמרים במהלך השיבוט וייצור הווירוסים, מומלץ מאוד לרצף את מאגר הפלסמידים וכן את ה-MEFים המועברים.
    2. כדי להעריך את כיסוי הלנטיויראלי, יש להעביר MEFs עם לנטיווירוס בכיסוי >1000× בהתבסס על טיטר ויראלי מחושב. אין צורך להבטיח זיהום יחיד של תאים בשלב זה.
    3. לאחר 48–72 שעות, מנתקים תאים באמצעות טריפסין או מגרדת תאים ומשחררים את התאים. חלץ את ה-DNA באמצעות ערכת חילוץ gDNA מסחרית.
    4. רצף של 1 מיקרוגרם פלסמיד ו-3 מיקרוגרם DNA MEF שהופק לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 5. רצף עמוק של 5 מיליון קריאות מספיק לרוב הספריות המותאמות עם <5000 gRNA.
      הערה: מתאם חזק (R2> 0.6) בין קריאות מאגר הפלסמידים לבין ייצוג יחסית שווה של מדריכים (>70% מהמדריכים בתוך עשור לוגריתם) ללא מדריך בודד השולט בספירת הספרייה מעיד על איכות טובה (איור 4E).

3. הזרקה לנטיויראלית תוך-דוקטלית לבלוטת השד של העכבר

  1. דילול מחטים ווירוסים
    1. משוך מחטים מיקרו-קפילריות מזכוכית באמצעות מושך מחט מיקרופיפטות ליצירת נימים דקים המתאימות להזרקה תוך-דוקקטלית בנפח של 9–10 מיקרו-ליטר. השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי לשבור את קצה המחט.
      הערה: המיקום האופטימלי יוצר גודל מחט שגדול מספיק כדי להעמיס אותו בנוזל אך דק מספיק כדי להיכנס בקלות לפתח הפטמה.
    2. דילל תכשירים לנטיויראליים לריכוז סופי של 1 × 107 pfu/mL במי מלח סטריליים עם בופר פוספט, בתוספת צבע Fast Green FCF של 0.05% (ללא צבע).
    3. אם מערבבים וירוסים של CRISPR-KO ו-CRISPR-A כדי לסנן אותם באותו מאגר מורכב, מתאימים את שתי הספריות לטיטר וירוסי שווה עם מלח סטרילי מפופר פוספט ומערבבים אותם ביחס כדי להבטיח ייצוג שווה של gRNA בשתי הספריות.
  2. הכנת עכברים להזרקה תוך-דוקטלית
    1. הרדימו עכבר בוגר (בגיל 8–20 שבועות) מתחת ל-4% איזופלורן עם 1 ליטר לדקה ומרחו חומר סיכה עיני סטרילי על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית במהלך ההליך.
      הערה: הזרקה תוך-צינורית היא הליך לא פולשני ואינו דורש הקלה בכאבים. השתמש בעכברים Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9, או Rosa-LSL-tdTomato לניסויים אלה.
    2. אבטחו את העכבר במצב שכיבה על כרית חימום מכוסה על טמפרטורה נמוכה לשמירה על טמפרטורת גוף, ושמרו על הרדמה באמצעות 2% איזופלוראן עם 1 ליטר חמצן לדקה דרך חרוט האף לאורך כל ההליך.
    3. הסר פרווה סביב הפטמות השלישיות של החזה והרביעית בבטן באמצעות קרם הסרת שיער באמצעות מטוש כותנה סטרילי באזור עגול של כ-0.5 ס"מ ברדיוס למשך 10–15 שניות. הסר מיד את הקרם עם גזה סטרילית ומים סטריליים כדי למנוע גירוי בעור.
      הערה: בלוטות החלב השלישית והרביעית הן בדרך כלל הקלות ביותר להזרקה. לחילופין, ניתן להכין את הבלוטות השנייה והחמישית להזרקה באותו אופן.
    4. חטא את העור שמסביב לכל פטמה על ידי ניקוי רציף עם אלכוהול איזופרופיל 70% ויוד באמצעות גזה סטרילית.
    5. הנח את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לאפשר ראייה ברורה של הפטמות.
    6. באמצעות מלקחיים עדינים מנוקים ב-70% אתנול, הסירו בעדינות כל עור מת שמכסה את הפטמה כדי לחשוף את פתח הצינור (ductal).
      הערה: שכבה קרטינית מתה זו מחוברת ברפיון ועלולה לחסום את כניסת המחט. ההסרה לא אמורה לפגוע בעור בריא או ברקמות שמתחת.
  3. הזרקה תוך-דוקטלית
    1. טעין 8 מיקרוליטר של הווירוס המדולל למיקרו-קפילריה מזכוכית נמשכת.
    2. החזק את אזור הפטמה עם מלקחיים דקים, והכנס בעדינות את קצה המחט לפתח הפטמה (איור 5A). מחט ממוקמת נכון תיכנס לתעלה עם התנגדות מינימלית. משחרר לאט את ההוספנס הוויראלי לתעלה של השד במשך 5–10 שניות.
      הערה: 8 מיקרוליטר של לנטיווירוס 1 × 107 pfu/mL יניבו כ-30% זיהום של תאי האפיתל של החלב הלומינלי וכ-5% זיהום לתאי האפיתל הבסיסיים, עם זיהום זניח (< 0.5%) של הסטרומה36. ניתן להתאים את הטיטר הוויראלי להשגת זיהום גבוה או נמוך יותר.
    3. עקוב אחרי התפשטות צבע Fast Green במהלך ההזרקה דרך מיקרוסקופ הניתוח. אשר הצלחה במתן תוך-צינורית על ידי התבוננות בפיזור הצבע ברשת הצינורות מתחת לעור (איור 5B).
    4. זהה הזריקות שנכשלו על ידי הצטברות צבע בתוך כרית השומן של השד הסמוכה לפטמה במקום לאורך עץ הצינור (איור 5C).
    5. חזרו על הליך ההזרקה עבור בלוטות החזה השלישית והרביעית של הבטן משני הצדדים, תוך הזרקת ארבע בלוטות בסך הכל לכל עכבר.
      הערה: עם ניסיון, לידה תוך-תוך-צינורית מוצלחת מושגת ב->95% מההזרקות. הזרקות כושלות המוגבלות לכרית השומן אינן קשורות לתופעות לוואי, ועדיין ניתן להשתמש בבלוטות שנותרו. ניתן לבצע אימות נוסף של ההזרקות באמצעות אימונוהיסטוכימיה וציטומטריית זרימה (איור 5D,E).
    6. הפסק את ההרדמה והעבר את העכבר לכלוב התאוששות נקי.
    7. פקחו על העכבר עד שהוא יוצא להליכה מלאה והחזירו אותו לבית הבטיחות הביולוגית המיועד לאחר שנצפתה התנהגות תקינה.
    8. שלושה ימים לאחר ההזרקה, בצע החלפת כלוב מלאה, השלכת כל מארז ומיטה כפסולת ויראלית, והעבר את העכבר לכלוב נקי שניתן להחזירו לבית הרגיל.

4. בידוד DNA גנומי מבלוטות חלב וגידולים

הערה: הורד עכברים באמצעות חשיפהל-CO2 או מנת יתר של חומרי הרדמה, ואחריה פריקת צוואר הרחם, בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים. קצור בלוטות החלב או גידולי החלב בנקודות הזמן הרצויות או בנקודת סיום הומנית בהתאם להנחיות רגולטוריות. תאים נגועים נקטפו כבר 48 שעות לאחר זיהום לנטיויראלי36.55 או עד 5+ חודשים לאחר ההזרקה בעכברי טבע36, או >24 חודשים ברקע אונקוגני55. השלבים הבאים צריכים להתבצע בחלל המנוקה עם מחיקת DNA ועם ציוד נקי מפלסמידים המכילים קלטות sgRNA/dgRNA. אפילו כמויות זעירות של DNA פלסמיד מספיקות כדי לגרום לזיהום דגימות רקמה, ולכן יש לבצע PCR לריצוף עמוק ובדיקות שליליות (ללא רקמה) כדי להבטיח הכנה נקייה.

  1. דיסוציאציה של רקמות
    1. לטובת בלוטות החלב, עכלו כל בלוטת שד ב-2 מ"ל של מדיום אפיקולט-B מלא (עכבר) בתוספת 0.2 מ"ל קולגנאז/היאלורונידאז עדין בצינור קוני של 15 מ"ל, ודגרו כל בלוטת שד בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. פלט פירק תאים ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. העבר בזהירות את שכבת השומן העליונה באמצעות קצה פיפטה מצופה אלבומין בסרום בקר לצינור קוני חדש בנפח 15 מ"ל והשליך את הסופרנטנט שנותר.
      הערה: השכבה השומנית העליונה בשלב זה מכילה לעיתים שאריות אורגנואידים אפיתליאליים שלא הופרדו ונשארים קשורים לרקמת השומן. עיבוד החלק הזה בצינור נפרד מעלה משמעותית את התאוששות תאי האפיתל.
    4. שטפו גם את החלק השומני וגם את כדור התא פעם אחת עם 5 מ"ל מלח מפוזר פוספט, צנטריפוגות ב-450 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנטים.
    5. משלבים את החלק השומני השטוף ואת כדור התא מאותה בלוטת שד לצינור קוני יחיד בנפח 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מלח מפופר בפוספט.
    6. הגריל את החומר המשולב ב-450 × גרם למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
    7. לגבי גידולי חזה, יש לקצוץ רקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטריליים או סכין מנתח ולהעביר ישירות לצינור מיקרופוג' בנפח 2 מ"ל.
  2. בידוד DNA גנומי
    הערה: ניתן לבצע חילוץ DNA גנומי באמצעות ערכת הדם והרקמה Qiagen DNEasy בהתאם להוראות היצרן או באמצעות פרוטוקול פנול-כלורופורם הבא.
    1. הכינו בופר ליזיס DNA על ידי שילוב של 5 מ"ל של 1 מטר טריס-HCl (pH 8.0), 1 מ"ל EDTA (pH 8.0), 25 מ"ל של 5 מ' NaCl, ו-50 מ"ל של 10% SDS, והביאו את הנפח הסופי ל-500 מ"ל עם מים מזוקקים סטריליים.
    2. הוסף 1 מ"ל של בופר ליזיס DNA ו-10 מיקרוליטר פרוטינאז K (20 מ"ג/מ"ל) לכל דגימה וערבב היטב באמצעות היפוך.
    3. דגרו דגימות בטמפרטורה של 56°C במהלך הלילה כדי לאפשר פירוק מלא.
    4. הצנטריפוגה מתלוזת ב-16,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפרוק פסולת בלתי מסיסה.
    5. העבר את הסופרנטנט המובהק לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 2 מ"ל.
      אזהרה: פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול הוא רעיל ומקורוזיבי. בצע את כל השלבים עם ממסים אורגניים בתוך קפוצ'ון אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    6. הוסיפו נפח שווה של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל וערבבו בעוצמה על ידי מערבולת במשך כ-15 שניות עד שנוצרת תערובת הומוגנית.
    7. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להפרדת השלבים האורגניים והלא אורגניים.
    8. העבר בזהירות את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש מבלי להפריע לאינטרפאזה.
      הערה: הימנעו משאיפת חומר מהשלב הלבן כדי למזער זיהום חלבון ו-RNA.
    9. הוסיפו 0.7 נפחים של איזופרופנול לשלב המימי שהוחזר וערבבו בעוצמה על ידי מערבולת למשך כ-15 שניות.
    10. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    11. השליכו בזהירות את הסופרנטנט ושוטפים את כדור ה-DNA ב-500 מיקרוליטר של 70% אתנול.
    12. צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסרת האתנול לחלוטין.
    13. ייבשו את כדור ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    14. החזירו את כדור ה-DNA ל-50 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים.
    15. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת או ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי לאפשר השעיה מלאה של DNA גנומי.
    16. מדוד את ריכוז ה-DNA וטוהר באמצעות כימות ננו-טיפה או פלואורומטרית.

5. רצף מהדור הבא של ספריות CRISPR


הערה: יצר דגימת ייחוס כדי לאפשר חישוב שינויים בקיפול gRNA לאורך זמן. MEFs מועברים (סעיף 2) או בלוטות החלב (סעיף 4) שנקטפו 3 ימים לאחר ההדבקה, כמו גם הפלסמיד מקסיפרפ המקורי, יכולים לשמש לקביעת ייצוג המדריך בספריית ההתחלה ובמאגר הוויראלי.

  1. הגברת PCR של קלטות gRNA מ-DNA גנומי
    1. השתמש בזוגות פריימרים המפורטים בטבלה 2 כדי לאנדקס דגימות באופן ייחודי, מה שמאפשר ריבוב ודמולטיפלקסינג של עד 306 דגימות לאחר ריצוף.
    2. הכינו תגובות PCR באמצעות 1 מיקרוגרם DNA גנומי כתבנית בנפח תגובה כולל של 50 מיקרוליטר, הכוללים 25 מיקרוליטר של 2x Q5 Master Mix, 2.5 מיקרוליטר של 10 מיקרומום פריימר קדמי ו-2.5 מיקרוליטר של 10 מיקרומום פריימר הפוך.
    3. כלול תגובת בקרה ללא תבנית במקביל למעקב אחר זיהום.
    4. בצע הגברת PCR באמצעות תנאי המחזור הבאים, תוך התאמת טמפרטורת החישוש בהתבסס על טמפרטורת ההתכה של פריימר ספציפי לספרייה:
      מחזור אחד של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות
      5 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, 68 מעלות צלזיוס (-1 מעלות צלזיוס למחזור) ל-10 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-15 שניות
      20 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, 63 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-15 שניות
      מחזור אחד של 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות
    5. פרוס מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 2.5% כדי לוודא את גודל האמפליקון הנכון.
    6. אשר את נוכחות הפסים בכ-306 bp עבור ספריות sgRNA מבוססות pLKO ו-430 bp עבור ספריות dgRNA מבוססות pXPR502 (איור 6).
      הערה: בקרה ברורה ללא תבנית מבטיחה את טוהר החומרים ומאשרת שהבדיקה נקייה מזיהום צולב.
    7. מטהר מוצרי PCR באמצעות שיטת טיהור DNA מתאימה וכימות ריכוז DNA באמצעות כימות פלואורומטרית.
  2. רצף מהדור הבא
    1. קבעו את עומק הריצוף הנדרש בהתבסס על מורכבות הספרייה הצפויה וקלונליות הדגימה.
      הערה: עבור גידולים החשודים כשיבוטיים, כ-1 מיליון קריאות לכל דגימה מספיקות לכימות מדויק של ייצוג מדריך. כדי לחשב עומק ריצוף מבלוטות החלב, הכפל את מספר המדריכים בספרייה בכיסוי פי 1,000, ואז הכפיל ב-6 pg של DNA גנומי/תא כדי לחשב את המסה הכוללת של DNA גנומי לכל דגימה שיש להגביר PCR. מספר הקריאות הכולל הנדרש לרצף שווה למספר המדריכים בספרייה כפול 1,000.
    2. אסוף ספריות מטוהרות מדגימות שונות בריכוזים אקווימולריים.
    3. ספריות Sequence Pooled באמצעות פלטפורמת ריצוף Illumina לקריאה קצרה.
  3. ניתוח נתונים
    1. Demultiplex ריצוף גולמי של קבצי FASTQ באמצעות אינדקסים ספציפיים לדגימה.
    2. Trim קורא לרצף הפרוטוספייסר gRNA באמצעות Trimmomatic69. בדגימות CRISPR-A, הטרימינג מגיע ל-14 בסיסים, וב-CRISPR-KO, הטרימינג מגיע ל-20 בסיסים מקצה הפריימר הקדמי.
    3. יישור קריאות חיתוך לספריית ה-gRNA המתאימה באמצעות Bowtie70. השתמשו בפרמטרי יישור של -v 2 ו-m 1 עבור CRISPR-KO ו-v 2 ו-m 2 עבור CRISPR-A ובריכות מעורבות.
      הערה: בדרך כלל, מעל 90% מהקריאות מיושרות בהצלחה. יישור נמוך נובע בדרך כלל משגיאות חיתוך, עיצוב שגוי של קבצי הקלט, או זיהום דגימות במהלך PCR.
    4. כמת קריאות מיושרות לכל gRNA באמצעות פונקציית הספירה ב-MAGeCK72 ליצירת טבלאות ספירת gRNA סופיות לניתוח במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לסקר CRISPR משולב בתוך ה-vivo בבלוטת השד של העכבר. צינור זה יכול לשמש מקצה לקצה לתכנון והגברה של ספריות gRNA מאוחדות ממערכי אוליגונוקלאוטידים, לשכפל את ספריות ה-gRNA לעמודי שדרה של לנטיויראל, לייצר לנטיווירוס בעל טיטר גבוה, לבצע אספקה תוך-דוקטלית של ספריות לנטיויראליות מאוחדות לבלוטת השד הבוגרת, ולשחזר gRNA לצורך דה-קונבולוציה מבוססת ריצוף של ייצוג ספרייה (איור 1).

הגברה ושיבוט מוצלחים של ספריות g...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיקול מרכזי בסקר CRISPR משולב ב-vivo הוא השגת כיסוי ספרייה מספק תוך שמירה על טרנסדוקציה דלילה בתא יחיד לשימור רזולוציית שיבוט2. בבלוטת החלב של העכבר, מחלקת האפיתל מורכבת באופן שמרני מכ-3.5 ×-10-5 תאים לכל בלוטה36. בקצב העברה ממוצע של 15%, שמפחית את תדירות ההדבקות המרובות לתא, המשלוח התוך-תכולית מביא לכ-5 ×-10-4 תאי אפיתל מועברים לבלוטה36.55. הזרקה דו-צ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד.ס. הוא יועץ ומייסד של ViVerita Therapeutics, והמעבדה שלו חסתה על הסכמי מחקר והסכמי שירות עם ViVerita Therapeutics.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על הערות ודיונים מועילים הקשורים לעבודה זו. אנו גם מודים ומודים למרכז הפנוגנומיקה על כל העזרה והמומחיות בעבודת העכברים במכון לוננפלד-טננבאום למחקר (LTRI), טורונטו, קנדה. מחקר זה נתמך על ידי מענק פרויקט מהמכון הקנדי למחקר בריאות (PJT462506) ומענק פרויקטים של מכון המחקר טרי פוקס ל-D.S. (TFRI PROJECT #1107) ל-D.S. ועל ידי קרן משפחת ניקול. E.R.L. נתמך על ידי פרס ההכשרה למחקר של האגודה הקנדית לסרטן וקרן הזיכרון לפרנק פלטשר. K.N.A. נתמך על ידי פרס פוסט-דוקטורט של ה.ל. הולמס ומענקים 1318698 ו-26089 מאגודת מחקר הסרטן. J.N. נתמך על ידי מלגת תואר שני של המכון הקנדי למחקר בריאות קנדה ופרס דוקטורט למחקר (#193389). Y.L נתמך על ידי מלגת מצוינות מחקרית, גיוון ועצמאות של המכונים הקנדיים למחקר בריאות (#ED6-190718).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 מיקרון פילטרSigmaS2HVU02RE
12k או 92k אוליגו צ'יפCustomarray Inc. (Genscript)
צלחות תרבית תאים 15 ס"מCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
אלקלין פוספטאזNEBM0290L
אמפיציליןFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
חיץ CutsmartNEBB6004S
רצף עמוק (Next-Seq או Hi-Seq)Illumina
ערכת חילוץ DNA מדם ורקמות DNAesyQiagen69506
מדיום Eagle שונה של Dulbecco’Wisent319-015-CL
תאי Endura אלקטרוקומפטנטיםLucigen60242-1
ערכת מדיום EpiCult-B עכברStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
סרום בקר עובריWisent090-150
ערכת ניקוי DNA ג'לZymo ResearchD4008
מכלי אלקטרופורציה Gene Pulser/MicroPulserBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
צנטריפוגה במהירות גבוההBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
משיכה למיקרופיפטהSutter InstrumentP97
ערכת פלסמיד Mini-prepFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (חיץ עבור BsmBI)NEBR0580L
ניקוי אוליגו ועיבויZymo ResearchD4061
ערכת ניקוי אוליגוZymo researchD4060
פריימר רצף illumina מטוהר ב-PAGEIDT DNA
מיקרופיפטות PCRDrummond5-000-1001-X10
PEI (פוליאתילנאימין)Sigma408727-100ML
פניצילין וסטרפטומיציןWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
תערובת Q5 פולימראז 2x MasterNEBM0494L
כימות פלואורומטרי QubitInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
עכברים R26-LSL-TdTomatoJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
ליגאז DNA T4NEBM0202L
צינורות צנטריפוגה אולטרהBeckman Coulter344058
יחידות מסנן ואקוםFisher ScientificSCHVU02RE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים