הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי והקצאת קולות אולטרסוניים לעכברים בודדים במהלך אינטראקציות חברתיות

200 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71121

⸱

7 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקלטת נתוני וידאו ואודיו מסונכרנים במהלך אינטראקציות חברתיות מרובות עכברים. השיטה משתמשת במערך מיקרופונים ובמיקום מקורות קול כדי להקצות קולות אולטרסוניים (USVs) לעכברים בודדים, ומאפשרת ניתוח כמותי של התנהגות קולית בין בעלי חיים והקשרים חברתיים.

תקציר

עכברים (Mus musculus) מתקשרים באמצעות קולות אולטרסוניים (USVs) במהלך אינטראקציות חברתיות. עם זאת, מכיוון ש-USVs בעכברים אינם קשורים לסימנים חזותיים ברורים ומתרחשים בתדרים שמחוץ לטווח השמיעה האנושי, עדיין קשה לזהות עכברים בודדים עם קולות בתוך קבוצה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להקליט נתוני וידאו ואודיו אולטרסוני מסונכרנים במהלך אינטראקציות חברתיות רב-חיות, ומאפשר ללכוד בו זמנית התנהגות ופעילות קולית. מתוכנן צינור חישובי המשלב מעקב של בעלי חיים מרובים, זיהוי קולות, מיקום מקורות קול והקצאת קולות לבעלי חיים בודדים. נהלי האימות המשמשים להערכת דיוק המעקב, חילוץ הקול, דיוק המיקום וביטחון ההקצאה בכל שלב בצינור מתוארים בהרחבה. יישום פרוטוקול זה על מאגר נתונים להדגמה של ארבע בעלי חיים מניב מעקב קולי בנפרד, הערכות מקורות קול מדויקות במרחב, ומדידות כמותיות של פלט קולי ותכונות אקוסטיות. ביחד, גישות אלו מספקות מסגרת איתנה לקישור תקשורת קולית להתנהגות אישית ומאפשרות ניתוחים בהמשך של הבדלים במיני, שונות אישית ותקשורת חברתית בעכברים הפועלים בחופשיות.

מבוא

תקשורת חברתית ברחבי ממלכת החי היא מרכיב חיוני בדינמיקה ההתנהגותית, המסייעת בתהליכים כמו הישרדות ורבייה 1,2. בקרב יונקים, עכברים מתקשרים אקוסטית באמצעות USV, שתדרים משתרעים בין 35 ל-110 קילוהרץ3. ל-USVs יש תכונות מורכבות, שמעבירים מידע בהתאם להקשר ההתנהגותי4. נקבות עכברים מעדיפות עכברים זכרים ל-USVs 5,6, ועכברים זכרים ונקבות מתקשרים בקול במהלך התנהגויות חיזור7, מה שמעיד ש-USVs משמשים כאותות חברתיים מרכזיים. מכיוון שמאפיינים מסוימים של USV קשורים למצבי התנהגות שוניםבעכברים 8, הקצאת קולות מדויקים לפרטים היא חיונית להבנת אינטראקציות חברתיות.

למרות מאמצים נרחבים להבהיר את תפקידי ה-USV ואת יחסם להתנהגות חברתית8, אתגר מתמשך בתחום הוא להקצות USVs לעכברים בודדים במהלך אינטראקציות קבוצתיות. קשיים נוצרים הן בשל חוסר תנועות פה נראות לעין במהלך ייצור USV4 וגם בשל טווח התדרים של USVs שאינו נשמע לאוזןהאנושית 3. כתוצאה מכך, מחקרים קודמים על הקשר בין USVs להתנהגות חברתית הוגבלו לבדיקות פשוטות יותר או לסביבות מוגבלות שמגבילות את טווח ההתנהגויות הקבוצתיות הנראות9, ומספקות רק תובנה חלקית לגבי אופן התפתחות התנהגות קולית בבעלי חיים הפועלים בחופשיות.

כדי לחדד את ההבנה של הקשר בין תקשורת שמיעתית להתנהגות חברתית, יש צורך ללכוד טווח מלא של התנהגויות עכברים ולהקצות קולות לפרטים בקבוצה. פתרון זהויות הקול חיוני לקביעת טווחי קול תלויי מין והקשר בין יחידים8, בדיקת השערות סיבתיות לגבי האופן שבו תכונות קוליות ספציפיות מניעות התנהגות חד-משמעית 10,11,12, וכאשר רלוונטי, לקשר בין פלט קולי לאותות מוח שנמדדו בו-זמנית (למשל, אלקטרופיזיולוגיה)13. היסטורית, האמינו שעכברים זכרים הם המפיקים הקולניים היחידים; עם זאת, מיקום מקורות הקול גילה שנקבות עכברים גם מייצרות זנבות יוצאי דם בהגדרות קבוצתיות7 או כאשר הן משולבות עם זכר14. ללא קביעת איזו בעל חיים פלט USV, קישור תכונות קוליות להתנהגות אישית ולתוצאות חברתיות בקבוצות הפועלות בחופשיות נשאר מוגבל. לכן, שימוש במערכת לוקליזציה שמאפשרת הקצאת קולות לבעלי חיים בודדים תוך שמירה על דינמיקת אינטראקציה טבעית הוא חיוני.

מערכת מיקום מקורות הקול במערך המיקרופונים המתוארת כאן, שפורסמה קודםלכן 7,15, מעריכה את המקור המרחבי של ה-USVs בזירה ועוקבת אחר מיקומי כל בעלי החיים הנמצאים בזמן ההשמעה, ומאפשרת להקצות קולות למפלט. הערכות מקור קול ומיקומי בעלי חיים שנעקבו משולבים באמצעות מדד מבוסס הסתברות לתמיכה בהקצאת ה-USVs לבעלי חיים בודדים. הקצאת קולות ממירה הקלטות קוליות קבוצתיות שהיו בעבר עמומות לנתוני קול בעלי חיים מתויגים 7,15, ומאפשרת ניתוחים כמותיים המקשרים בין סוג הקול והתזמון להתנהגות ולפעולה משותפת לאחר מכן. מטרת העבודה הנוכחית היא לספק פרוטוקול מפורט ליישום שיטה זו, אשר קודם לכן נמדד ואומת15. הפרוטוקול הבא מפרט את ההקמה, הכיול והיישום של מערכת זו, כולל גיאומטריית מערך מיקרופונים, סנכרון אודיו-וידאו, זיהוי קול אוטומטי והערכת מקור הסתברותית, מעקב מיקום רב-חיות, והליך ההקצאה המשמש לייחוס ויצירות USV לחיה הפולטת 7,15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דלאוור (מספר פרוטוקול: 1275) ובוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בניית מערכת הלוקליזציה של מקור הקול

  1. הכינו את תא ההקלטה.
    1. הרכיבו מסגרת קובייתית (76.2 ס"מ × 76.2 ס"מ × 61 ס"מ; רוחב × אורך × גובה), המשמשת כזירת ההקלטה, והניחו אותה במארז מחליש קול.
    2. השתמשו ברשת ניילון ליצירת הקירות וריפדו את החלק החיצוני של המתחם בקצף אקוסטי כדי להפחית השתקפויות קול.
    3. הניחו מדחום בחוץ, אך קרוב לתא ההקלטה, כדי לעקוב אחרי טמפרטורת הסביבה במהלך ההקלטות.
    4. בצע את כל ההקלטות בתנאים חשוכים.
      הערה: שמרו על תנאי סביבה יציבים לאורך כל מפגשי ההקלטה, ורשמו פרמטרים סביבתיים.
  2. הגדר את מערכות ההקלטה הווידאו והקול.
    1. התקן תאורה אינפרא-אדומה מעל האולם כדי לאפשר הקלטת וידאו בחושך.
    2. מקם מצלמת וידאו מעל הזירה והגדר אותה להקליט ברציפות ב-30 הרץ.
    3. הגדר את מערכת רכישת האודיו להקליט אותות אולטרסוניים ממערך מיקרופונים בעל שמונה ערוצים בקצב דגימה של 250 קילוהרץ.
      הערה: במערכת זו נעשה שימוש בשמונה מיקרופונים, אך ניתן לכוונן את מספר המיקרופונים בהתאם לצרכים ניסיוניים.
    4. סנכרן את הקלטות הווידאו והאודיו באמצעות טריגר חיצוני משותף כדי להבטיח יישור זמני.
    5. וודא שנתוני וידאו ואודיו מוקלטים במקביל ומאוחסנים לכל מפגש.
      הערה: חומרה ותוכנת רכישה מופיעות בטבלת החומרים ובטבלה 1, בהתאמה.
  3. סדר את המיקרופונים והאולם.
    1. מרווחים באופן שווה את המיקרופונים לאורך קירות האולם (שניים לכל קיר).
    2. מקם את מרכזי המיקרופון במרחק 38.1 ס"מ זה מזה, 19.05 ס"מ מכל פינה, ו-10.8 ס"מ מעל רצפת האולם.
    3. סמנו את מיקומי המיקרופון באופן חזותי כדי לאפשר כיול ואימות מאוחר יותר.
      הערה: ניתן להשתמש בנורות LED לסימון מיקומי מיקרופון.

2. הכנות לתיעוד התנהגות חברתית

  1. הכינו את חיות הניסוי.
    1. בחר את העכברים שיועדו. כאן השתמשו בקבוצות של 2 עכברים זכרים ו-2 נקבות C57BL/6J בגילאי 8 עד 12 שבועות בזמן הרישום.
      הערה: הזן, יחס המין, טווח הגילאים של העכברים ומספר ימי ההקלטה בפרדיגמה הניסויית הנוכחית ניתנים להתאמה למטרות ניסוי שונות. להדגמת שיטה זו, נעשה שימוש חוזר בתת-קבוצה של עכברים ניסיוניים במשך שני ימי הקלטה. עכברי C57BL/6J מעל 12 שבועות עשויים להראות רגישות מופחתת לצלילים בתדר גבוה16.
  2. לאכסן את החיות.
    1. שים כל עכבר בנפרד למשך 14 ימים לפני ההקלטה.
      הערה: דיור פרטני מפחית את ההשפעה של ניסיון חברתי קודם על אינטראקציות קבוצתיות.
    2. לספק לכל כלוב מצעים, העשרה וגישה חופשית למזון ולמים.
  3. סמן את החיות לזיהוי ויזואלי.
    1. יומיים לפני ההקלטה, יש להרדים כל עכבר באמצעות 2.5% איזופלורן בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה באמצעות אידוי מדויק בתא אטום. לאחר שכל עכבר מורדם, העבירו אותו החוצה מהתא, לשכב שטוח עם גבו נגיש, ולקבל את ההרדמה מקונוס האף למשך הליך הסימון.
      הערה: פרוטוקול ההרדמה המתואר בפרדיגמה הניסויית הנוכחית מאושר בפרוטוקול בעלי החיים שלנו והופעל על כל עכבר בסדרה סידורית, אך ניתן להתאמה לבעלי חיים שונים או למטרות ניסוי שונות.
    2. בזמן שכל עכבר בהרדמה, יש להניח דפוס ייחודי על גבו באמצעות צבע שיער לא רעיל כדי לאפשר זיהוי חזותי במהלך המעקב.
    3. עוקבים אחרי כל בעל חיים ברציפות בזמן שהצבע מתייצב, תוך שמירה על ההרדמה למשך כ-15 דקות, ורשמו את משך ההרדמה.
    4. שטוף ומניח כל עכבר בכלוב התאוששות מחומם עד שהוא יוכל ללכת במלואו.
    5. החזירו כל עכבר לכלוב נקי בנפרד עם מצעים, העשרה וגישה למזון ומים.
      הערה: יש להניח סימונים על עכברים נקבות לפני הזכרים כדי למזער את העברת רמזי הריח הזכריים שעלולים להשפיע על התנהגות עתידית.
  4. בצע חשיפה למין הנגדי.
    1. יום לפני ההקלטה, הכינו כלובים נקיים ללא מיטה.
    2. לכל עכבר ניסיוני, שים את החיה בכלוב ואחריו עכבר מהמין השני.
    3. אפשר לבעלי חיים ליצור אינטראקציה במשך 10 דקות.
    4. צפה באינטראקציות ותעד באופן ידני אירועים התנהגותיים.
    5. לאחר החשיפה, יש להחזיר את בעלי החיים הניסיוניים למגורים אישיים לאחר החשיפה.
      הערה: חשיפה למין שונה היא ייחודית לפרדיגמה הניסויית הנוכחית, שכן היא מעלה את הסבירות להתנהגות קולית במהלך הקלטות קבוצתיות מאוחרות יותר17; עם זאת, הוא אינו מרכיב חובה בשיטות המתוארות. הפרדו בעלי חיים אם נצפים התנהגות מזדווגת.
  5. קבעו את מצבי היריבה של עכברים נקבות.
    1. כ-שעתיים לפני ההקלטה, יש להעריך את מצב היסטורס של כל עכבר נקבה (אם מדובר בנקבות).
    2. בצע שטיפה בנרתיק באמצעות 30 מיקרול של מי מלח עם בופר פוספט.
    3. העבר את דגימת השטיפה לזכוכית מיקרוסקופ נקייה, ומרח באופן אחיד.
    4. תן למחסניות להתייבש לגמרי.
    5. מרחו כתם קריסטל סגול על כל שקופה, והשתמשו בפיפטה לשטיפה עדינה במים.
    6. בדוק שקופיות תחת מיקרוסקופ אור.
    7. סווג מצב אסטרוס על פי היחסים היחסיים של תאי אפיתל גרעיניים, תאי אפיתל קורנפיידיים ולויקוציטים18.
    8. רשמו את מצב היריבה של כל נקבה.
      הערה: מכיוון ש-USVs עשויים להשפיע על קליטת הנשים במהלך היסטרוס 19,20, קביעת מצב האסטרוס היא ייחודית לפרדיגמה הניסויית הנוכחית; עם זאת, הוא אינו מרכיב חובה בשיטות המתוארות.

3. הקלטות אינטראקציה חברתית

  1. הכינו את זירת ההקלטות.
    1. הוסיפו מצעים מבוססי נייר לבן לרצפת הזירה לעומק אחיד של כ-1.25 ס"מ.
    2. ודא שהמצע מכסה את כל הפינות באופן שווה.
    3. ודאו שכל המיקרופונים מיושרים, ללא הפרעה ומכוונים לכיוון הזירה.
    4. לפני הקלטות ניסיוניות, יש למקם סרגל ואובייקט בעל ניגודיות גבוהה במרכז הזירה כדי לאמת את פוקוס המצלמה ולקבוע קנה מידה מרחבי.
    5. הסר את אובייקטי הכיול לפני שמתחילות הקלטות התנהגותיות.
      הערה: מצעי הנייר הלבן מספקים ניגודיות לבעלי חיים בעלי פרווה כהה, ומסייעים למעקב. אם משתמשים בבעלי חיים עם פרווה בהירה, מצעים שחורים על בסיס נייר יעזרו במעקב. אם משך ההקלטה מוארך, הוסף אוכל ומים לזירה. הוספת סימני כיוון צפון/דרום ומזרח/מערב לסרגל מאפשרת זיהוי שמונת המיקרופונים.
  2. בצע הקלטות קדם-התנהגות של מערכת ההתנהגות.
    1. מיד לפני הקלטות התנהגותיות, הקליטו 15 שניות של רעש רקע עם אורות אינפרא-אדום דולקים.
    2. הקלט 15 שניות של בדיקת מיקום מיקרופון עם אורות אינפרא-אדום כבויים ואורות המיקרופון דלוקים.
    3. שמור את כל ההקלטות לפני ההתנהגות לאימות מאוחר יותר של ביצועי המערכת.
      הערה: הקלטות אלו משמשות לאימות תפקוד המיקרופון ורמות הרעש הבסיסיות. סקריפטים המשמשים להקלטה זמינים במאגר הקוד המשויך.
  3. תעד התנהגות חברתית קבוצתית.
    1. הכינו מראש את כל הגדרות ההקלטה כדי למזער אינטראקציה עם בעלי חיים לפני איסוף הנתונים.
    2. הניחו את העכברים הנקביים בזירה.
    3. הניחו את העכברים הזכרים בזירה.
      הערה: אם אתה מקליט מספר בעלי חיים מאותו מין, מקם את שתי החיות בו זמנית.
    4. סגור את המתקן והתחל להקליט.
    5. להקליט התנהגות חברתית קבוצתית ברצף במשך 10 דקות.
      הערה: משך ההקלטה ניתן להתאמה.
    6. וודא שקבצי וידאו ואודיו קריאים וללא פגמים לפני העיבוד המוקדם.
    7. בסיום ההקלטה, להסיר את כל בעלי החיים למעט אחד.
  4. לתעד בעלי חיים בודדים.
    1. הקליטו את העכבר הנותר לבד בזירה למשך 10 דקות.
    2. חזור על הקלטות בודדות עבור כל אחד מהעכברים שנותרו.
    3. שקלו כל עכבר מיד לאחר ההקלטות האישיות.
      הערה: הקלטות בודדות משמשות לאימון ואימות מעקב של בעלי חיים מרובים. תעד את הטמפרטורה בתוך המערכת לפני כל סשן הקלטה, שכן הטמפרטורה משפיעה על הפצת הקול. חזור על סשן ההקלטה אם קבצי וידאו או אודיו פגומים או לא שלמים.

4. קדם-עיבוד וידאו

  1. הכן את קבצי הווידאו.
    1. וודא שכל הקלטות הווידאו מאוחסנות בתיקייה אחת הקשורה לניסוי.
  2. כוון את עוצמת הווידאו למעקב.
    1. במידת הצורך, יש להחיל התאמת בהירות אחידה על כל פריימים של וידאו על ידי הוספת ערך קבוע (brightness_adjustment x 255) לכל פיקסל, כאשר brightness_adjustment הוא סקלר הנע בדרך כלל בין 0.1 ל-0.6 בהתאם לתנאי האור.
    2. אם יש צורך, יש לבצע התאמת ניגודיות גלובלית באמצעות מיפוי עוצמה מחדש (למשל, פונקציית ה-imadjust של MATLAB) עם טווח קלט מוגדר (למשל, [0.2, 0.8]), שממפה עוצמות פיקסלים ב-20% מהמקסימום לשחור ו-80% מהמקסימום ללבן וערכים בינוניים ליניאריים. שלב זה נעשה כדי להגדיל את ההפרדה בין סימוני זיהוי בהירים לבין הרקע.
    3. עוצמות פיקסל הקליפ לטווח הנכון לעומק ביט הווידאו (כלומר, 0 עד 255 עבור וידאו 8 ביט).
      הערה: יש להחיל פרמטרי קדם-עיבוד זהים על כל הפריימים בתוך ההקלטה ובין ההקלטות כדי להבטיח עקביות. התאמות אלו הן אופציונליות ותלויות בתנאי ההקלטה. עבור הנתונים המייצגים שהוצגו כאן, לא בוצעו התאמות בהירות או ניגודיות. כאשר נדרשים התאמות, המשתמשים צריכים לצפות בפריים הראשון המעובד כדי לוודא ניגודיות מספקת בין בעלי החיים לזירה לפני עיבוד כל הווידאו.
  3. ייצא את הסרטונים המעובדים.
    1. שמור את קבצי הווידאו המעובדים מראש עם אותו קצב פריימים ויישור זמן כמו ההקלטות המקוריות.
    2. שמור את קבצי הווידאו המקוריים לצורך עיון ואימות.
      הערה: סקריפטים המשמשים לעיבוד מוקדם של וידאו וערכי הפרמטרים הספציפיים שמיושמים זמינים במאגר הקוד המשויך.

5. מעקב בין בעלי חיים מרובים

  1. הכינו את תוכנת המעקב והנתונים שלכם.
    1. התקן תוכנת מעקב עם כמה בעלי חיים וכל התלות הנדרשת. מחקר זה השתמש ב-MOuse TRacker (MoTR; טבלה 1) כי פורמט הפלט תואם ל-Muse (טבלה 1), תוכנה נוספת בצינור שלנו המשמשת לחישובי לוקליזציה של מקורות קול21.
      הערה: תוכנות מעקב אוטומטיות נוספות, כמו Social LEAP Estimates Animal Positions (SLEAP)22 או DeepLabCut23, יכולות לשמש למעקב אחר בעלי חיים, כל עוד נוצרים מיקום החיה, כיוון הכיוון ומיקום האף.
    2. ארגן קבצי וידאו מעובדים מראש כך שהקלטות של בעל חיים בודד והקלטות של כמה בעלי חיים יהיו מופרדות בבירור.
    3. ודאו שכל קבצי הווידאו בעלי קצב פריימים ורזולוציות מרחביות אחידות.
      הערה: הוראות התקנת תוכנה ודרישות תלות מסופקות במאגר הקוד המשויך.
  2. תאמן את מודלי החיה היחידה.
    1. בחרו הקלטות של בעל חיים בודד המתאימות לכל נבדק ניסוי.
    2. למד מסווג זהות נפרד לכל בעל חיים באמצעות תכונות שהופקו מההקלטה של בעל חיים בודד. במהלך הקלטות קבוצתיות, פלטי מסווג לכל חיה משולבים עם מידע מסלול על פני מסגרות כדי לשמור על זהות בעלי החיים.
    3. ודאו שההכשרה הסתיימה בהצלחה לפני הממשיכים.
      הערה: הקלטות של בעל חיים בודדים משמשות לאתחול מעקב ייחודי לזהות במפגשים עם מספר בעלי חיים.
  3. העקוב אחרי הקלטות של כמה חיות.
    1. יישמו את מודל המעקב המאומן על הקלטות אינטראקציה חברתית בין בעלי חיים מרובים.
    2. הפכו הערכות פריים אחר פריים של מיקום, כיוון וצורת גוף של בעל חיים לכל נבדק.
    3. שמור פלטי מעקב לניתוחים בהמשך.

6. סגמנטציה אקוסטית

  1. הכינו את נתוני האודיו.
    1. ודאו שכל הקלטות האודיו מערוצי מיקרופון בודדים קיימות ונגישות.
  2. לזהות קולות.
    1. הרץ את תוכנת הסגמנטציה האקוסטית, Ax (טבלה 1), על כל הקלטה כדי לזהות USV.
    2. הגדר פרמטרים של זמן-תדר שהוגדרו בקובץ קלט שנבחן על ידי Ax. תדר דגימת המיקרופון הוגדר ל-250 קילוהרץ.
      הערה: נשקלו שלושה גדלי חלונות לטרנספורם פורייה מהיר לא אחיד, כולל 64, 128 ו-256 דגמים. הוחל מכפלת זמן-רוחב פס רב-צדדי של 3 עם 5 מצומצמים, יחד עם סף מובהקות של 0.05. נעשה שימוש במשך מינימלי של 0 דגימות, עם חיתוך בתדר נמוך של 30 קילוהרץ וחיתוך בתדר גבוה של 110 קילוהרץ. גודל הקונבולוציה נקבע לכסות 1001 הרץ על 0.001 שניות. נצרף דגל למיזוג אותות הרמוניים. לפרטים ספציפיים, ראו Neunuebel ואחרים.
    3. חלצו USVs מועמדים בהתבסס על תכונות זמן-תדירות אלו.
    4. שמור את פלטי הסגמנטציה כגיליון אלקטרוני לכל הקלטה.
      הערה: הוראות התקנת תוכנה, סקריפטים והגדרות פרמטרים מסופקים במאגר הקודהמתאים 7.
  3. רכיב את פלטי הסגמנטציה.
    1. יצר רשימה מאוחדת של אירועי קול מזוהים הכוללים זמני התחלה, זמני הזזה וגבולות תדרים.
    2. שמור קבצי קול מאוחדים לניתוחי לוקליזציה בהמשך.

7. לוקליזציה של מקורות קול

  1. הכינו את הקלטים ללוקליזציה.
    1. ודאו שפלטי סגמנטציה אקוסטית ותוצאות מעקב של בעלי חיים מרובים זמינים לכל הקלטה.
    2. ארגן קלטי לוקליזציה כך שנתוני אודיו, נתוני מעקב ומידע גאומטריית הזירה יהיו נגישים לתוכנת הלוקליזציה.
      הערה: סקריפטים המשמשים לסידור קבצי קלט, הגדרת מבני תיקיות נדרשים ואיסוף מידע גאומטריה של הזירה מסופקים במאגר הקוד הרלוונטי.
  2. הערך את מיקומי מקור הקול.
    1. החלו את אלגוריתם לוקליזציית מקור הקול, MUSE (טבלה 1), על כל ווקאליזציהזוהתה 7.
    2. באמצעות הקלטות מערך מיקרופונים, העריך את המקור המרחבי של כל קול בזירה.
    3. לכל קול, הערך את מיקום מקור הקול באמצעות דגימת ג'קנייף על ידי חזרה על הליך הלוקליזציה שמונה פעמים, בכל פעם השמטת מיקרופון אחד כך שכל הערכה מבוססת על שבעת המיקרופונים הנותרים. זה מייצר שמונה הערכות לכל קול.
      הערה: הבדלים בזמן ההגעה בין מיקרופונים הם קריטיים להערכת מיקום מקור הקול. דגימה מחדש של Jackknife משמשת להערכת אמינות הלוקליזציה ולהפחתת הרגישות לערוצי מיקרופון בודדים. סקריפטים המשמשים להערכת מיקום מקור הקול מסופקים במאגר הקודהמתאים 7.
  3. חשב את התפלגויות ההסתברות של מיקום מקור הקול.
    1. לכל קול, חשב מטריצת קווריאנטיות24, והשתמש בה ובהערכות נקודות הג'קנייף הממוצעות כדי לחשב את צפיפות ההסתברות על רחבת האולם.
  4. שלבו לוקליזציה עם מיקומי בעלי חיים.
    1. להפיק את מיקום הראש או האף המעקב של כל בעלי החיים בזמן כל קול.
    2. לכל קול, הערך את צפיפות ההסתברות של המיקום במיקום האף של כל בעל חיים.
    3. לכל קול, חשב מדד ביטחון הקצאה לכל בעל חיים בהתבסס על ערכי ההסתברות. מדד הביטחון של ההקצאה מחושב עבור כל בעל חיים כערך הצפיפות באף של אותו בעל חיים חלקי סכום ערכי הצפיפות של כל בעלי החיים. אנו מתייחסים למדד זה כאינדקס ההסתברות של העכבר (MPI)15.
  5. הקצה קולות.
    1. אם מדד הביטחון של ההקצאה עבור עכבר אחד עולה על 0.95, האות מוקצה לעכבר 7,15.
    2. תווים קולות שאינם עומדים בקריטריוני ההקצאה כלא מוקצים.
    3. שמור את פלטי הלוקליזציה וההקצאה לאימות וניתוח במורד הזרם.
      הערה: ספי הקצאה, קריטריוני ביטחון וקוד מסופקים בסקריפטי הניתוח הנלווים.

8. אימות תוצאות

  1. אימות מעקב בין בעלי חיים מרובים.
    1. טען את יציאות המעקב הסופיות לכל הקלטה.
    2. הונחו על פני פריימים תואמים של מצבים של בעלי חיים וצורת גוף.
    3. בדוק ויזואלית תוצאות מעקב כדי לאשר מיקום עכבר מדויק והקצאת זהות עקבית בין פריימים שונים.
      הערה: תוצאות המעקב כוללות אליפסות צבעוניות המצביעות על כיוון הראש על כל עכבר בכל פריים וידאו. גודל האליפסה וכיוון הגוף צריכים להתאים לגודל וכיוון העכבר, בהתאמה, בכל פריים. צבע האליפסה צריך להיות עקבי לכל עכבר לאורך ההקלטה.
    4. זיהוי ותיקון שגיאות מעקב.
      שמור פלטי מעקב מתוקנים לניתוחים במורד הזרם.
      הערה: שגיאות מעקב נפוצות מתרחשות במהלך אינטראקציות חברתיות קרובות או בקרבת גבולות הזירה. תקן את כל המקרים של היפוך ראש-זנב, מתגי זהות, וקפיצות ודריפטים באליפסה.
      הערה: תוכנות לצפייה בפלט מעקב ותיקון שגיאות מסופקות במאגר הקוד.
  2. אימות חילוץ קול.
    1. טען את פלטי הסגמנטציה האקוסטית עבור כל הקלטה.
    2. יצר ספקטרוגרמות מנתוני אודיו גולמיים עבור חלונות זמן מייצגים.
    3. שכבת אירועי קול מזוהים, כולל זמן קול אישי וטווחי תדרים, על ספקטרוגרמות.
    4. אשר חזותית התאמה בין אירועים שזוהו לבין קולות שנצפו בספקטרוגרמות.
    5. אם נצפו שגיאות שיטתיות, יש להתאים את פרמטרי הפיצול לפני ביצוע שלבי חילוץ ולוקליזציה מחדש, או להתאים ידנית כל מקרה של שגיאות סגמנטציה (כלומר, זיהוי שגוי של זמן הקול או טווח התדרים).
  3. אמת את משימת הקול.
    1. טעין לוקליזציה ויציאות של מקור קול.
    2. לכל קול, יש לדמיין הערכות לוקליזציה, התפלגויות הסתברות מרחביות ומיקומי בעלי חיים המונחים על פריימים של וידאו.
    3. אשר שצפיפויות הסתברות של מיקום ממוקמות בקרבת ראש החיה שהוקצתה ומופרדות בבירור מבעלי חיים אחרים.
    4. ודאו שקולים שאינם בקריטריוני הקצאה מסומנים כלא מוקצים.
      הערה: בדיקות לפלט הקצאה כוללות אימות שכל הפלטים הצפויים נוצרו ושהמפה ההסתברותית לכל קול ממוקמת בתוך גבולות הזירה ומקיפה את העכבר שהוקצה לווקאליזציה.
    5. שמור את תוצאות ההקצאה המאומתות לניתוחים במורד הזרם.
      הערה: ספי ביטחון להקצאה וקריטריוני אימות מוגדרים בתסריטי הניתוח הנלווים.

9. ניתוחי נתונים

  1. המחישו את הלוקליזציה של מקור הקול.
    1. למפגשי הקלטה של בעלי חיים בודדים או מרובים, בחרו פריימים וידאו שבהם זוהו קולות.
    2. יצר ייצוגים סכמטיים של פריימים של הווידאו הנבחרים.
    3. יצר סכמטיקה מרחבית מהפלט של MUSE על ידי שרטוט מיקומי כל המיקרופונים, הערכות נקודות מקור הקול הבודדות, מיקום מקור הקול המשוער, התפלגות ההסתברות המרחבית, מיקום העכבר, זהות הקול המוסקת וסרגל סולם.
    4. יצר ספקטרוגרמות של הקול המתאים כפי שהוקלט על ידי כל ערוץ מיקרופון.
      הערה: ויזואליזציות אלו מועיבות להערכה איכותית של ביצועי לוקליזציה הן בהקשרים אישיים והן בהקשרים קבוצתיים.
  2. כמת את שגיאת הלוקליזציה והדיוק.
    1. חשב את המרחק בין מיקום מקור הקול המשוער למיקום החיה המתועדת כדי לכמת את שגיאת הלוקליזציה. השתמש בהקלטות עכבר בודד לחישובים אלו, שכן יש רק פולט אחד והמקור ידוע.
    2. כדי להעריך את דיוק ההקצאה, הפוך את הערכות מקור הקול ואת מיקומי בעלי החיים המתאימים למסגרת ייחוס הממוקדת בבעל החיים הקולני.
    3. המחישו את ההתפלגות המרחבית של הערכות מקור הקול ביחס למיקום החיה המרוכז.
  3. יצר ספקטרוגרמות כדי להמחיש קולות.
    1. זהה פרקי ווקאליזציה מעניינים באמצעות פלטים של חילוץ קולי הכוללים את זהות הווקלייזר, זמני התחלה והזזות קוליות, וגבולות תדרים גבוהים ונמוכים.
    2. בחר חלונות זמן הנפרעים מלפני תחילת הקול הראשון ועד לאחר ההזזה האחרונה בכל קרב.
    3. חלץ עקבות מתח מקבצי ערוץ האודיו עבור חלונות הזמן שנבחרו.
    4. יצירת ספקטרוגרמות על ידי המרת עקבות המתח שהופקו מדומיין הזמן לתחום התדר.
    5. סמן נקודות זמן המתאימות לקולות שהוקצו ולא מוקצים באמצעות צבעים מובחנים על הספקטרוגרמה.
    6. במפגשי אינטראקציה חברתית, זהה התקפי קול שנוצרו על ידי אנשים שונים, ויצר ספקטרוגרמות עם זהויות ווקאלייזר המסומנות בצבעים ייחודיים לזהות.
  4. כמת את הפלט הקולי לפי אדם.
    1. השתמש בפלט של קוד לוקליזציה של מקור הקול כדי להקצות לכל קול תווית זהות, כך שזהויות לא מקומיות, מקומיות-אך-לא-מוקצות, ובעלי חיים בודדים מקודדים מספרית.
    2. סכם את מספר הקולות שכל בעל חיים מייצר.
    3. השווה את ספירות הקול בין יחידים ובין המינים.
  5. נתח את מאפייני הקול.
    1. הוצא קווי מתאר תדרים לכל קול.
    2. כמת פרמטרים קוליים כגון תדר מקסימלי, תדר מינימלי, תדר ממוצע, רוחב פס ומשך הקול.
    3. השווה פרמטרים קוליים בין המינים.
    4. לבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים המבוססים על תכונות התפלגות של הנתונים.
      הערה: בחר שיטות סטטיסטיות שיתאימו לתכונות הפרמטריות של המשתנים הנמדדים. כאן, מספר הנבדקים נמוך מדי להשוואות סטטיסטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות המוצגות במאמר זה הן מהקלטות שנערכו במשך יומיים ומטרתן להמחיש את תוצאת הפרוטוקול, שפורסם במקור ב-Warren et al.15. נתונים אלו אינם מיועדים לתמוך בהסקה סטטיסטית או במסקנות כלליות.

חילוץ והקצאת אוניות USV
ה-USV הוקלטו במהלך מפגשי אינטראקציה חברתית אישית וקבוצתית באמצעות מערכת מיקום מערך המיקרופונים. בכל מפגש אינטראקציה חברתית, נרשמו שני זכרים ושתי נקבות. בסך הכל, ההקלטות נערכו במשך יומיים, וזהויותיהם של בעלי החיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ייחוס אמין של זירויות USV לבעלי חיים בודדים במהלך אינטראקציות קבוצתיות היה מגבלה טכנית מרכזית בחקר התקשורת הקולית בין עכברים. למרות שעכברים משמשים באופן נרחב לחקר תקשורת חברתית, חוסר היכולת להקצות קולות לפרטים ספציפיים מנתח כמותי מוגבל של התנהגות קולית בהקשרים חברתיים טבעיים. שיטה שמאפשרת מעקב קולי ייחודי של בעלי חיים במהלך אינטראקציות חברתיות היא לכן חיונית לחקר ייצור קול בעכברים הפועלים בחופשיות.

מאמר זה מציג פרוטוקול המספק מסגרת שיטתית ומאומתת למעקב אחר בעל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לצוות מתקן המחקר של אוניברסיטת דלאוור על טיפול בבעלי חיים, לג'ים פארמר וג'יימי קוויסנברי על סיוע בבניית ציוד מעבדה, ולקבוצת המחשוב הביצועי הגבוה של אוניברסיטת דלאוור על התמיכה בתחזוקת אשכול המחשוב. אנו מודים לאנדרה ייצ'ונג מה על הסיוע באיסוף הנתונים. העבודה מומנה על ידי NIH, מספרי מענקים R01MH122752 ו-T32GM142603.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-driנחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Aluminum Extrusion8020Custom built to match recording arenaנחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
BNC-2110National Instruments777643-01נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Clear Acrylic PanelHome DepotMC-24נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
ComputerHewlett–PackardZ620נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-Cנחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
IR lightsGANZIR-LT30נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
NI PXIe-1073National Instruments781161-01נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
NI PXIe-6356National Instruments781053-01נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Nylon mesh for cage wallsMcMaster-Carr9318T25נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Power CordNational Instruments763000-01נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול
Sonex foamPinta AcousticVLW-35נחוץ למערכת לוקליזציה של מקור קול

מקורות

  1. Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
  2. Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
  3. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
  4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  5. Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
  6. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  7. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
  8. Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
  9. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
  10. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  11. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  12. Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
  13. Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
  14. Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
  15. Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
  16. Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
  17. Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
  18. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  19. Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
  20. McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
  21. Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
  22. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  23. Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  24. Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
  25. Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
  26. Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233233JoVE
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.