שיטת הקולורימטריה של Anthrone לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדה

Meng Zhu; Wenxian Chen; Yangyang Li; Zejian Liu; Yu Liu

doi:10.3791/71134

מאמר שיטה

שיטת הקולורימטריה של Anthrone לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדה

DOI:

10.3791/71134

⸱

12 ביוני 2026

Meng Zhu^*¹^,² , Wenxian Chen^*¹^,² , Yangyang Li¹ , Zejian Liu² , Yu Liu¹

¹Department of Endocrinology, Sir Run Run Hospital, Nanjing Medical University, ²Jiangsu Key Laboratory of Molecular Targets and Intervention for Metabolic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה קולורימטרית מסוג אנתרון לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדה במצבים מטבוליים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוגן הוא מאגר גלוקוז תוך-תאי עיקרי בכבד ובשריר השלד ומשחק תפקיד מרכזי במטבוליזם הפחמימות. גליקוגן כבדי חיוני לשימור הומאוסטזיס גליקמי מערכתית, בעוד שגליקוגן שריר השלד תומך בפעילות גופנית ובביצועי פעילות גופנית. לכן, כימות מדויק של גליקוגן רקמתי הוא קריטי למחקרים שבהם מטבוליזם הגליקוגן מווסת דינמית או משתנה פתולוגית. כאן אנו מתארים שיטה קולורימטרית אמינה ורגישה של אנתרון לכימות תכולת הגליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדות. הפרוטוקול מורכב משלבים עוקבים, כולל עיכול אלקליני, דה-חלבון, הפקעת גליקוגן, שטיפת אלכוהול ופיתוח צבע באמצעות תגובת אנתרון. היישום של שיטה זו מודגם בחולדות שעברו שלושה מצבים פיזיולוגיים רלוונטיים: האכלה אד ליביטום , צום לילה והאכלה חוזרת לטווח קצר. פרדיגמות ניסיוניות אלו לוכדות מצבים מטבוליים מרכזיים הקשורים לאגירת גליקוגן, דלדול וסינתזה מחדש. ניתוח כתם מערבי אורתוגונלי של אנזימים מרכזיים, גליקוגן סינתאז וגליקוגן פוספורילאז, מספק תמיכה מכנית לשינויים המטבוליים שנצפו. היישום של שיטה זו מודגם עוד יותר בבעלי חיים שטופלו באפינפרין כדי למודל פירוק גליקוגן שנגרם מלחץ. ביחד, שיטה זו מספקת טווח דינמי רחב ורגישות מספקת לכימות גליקוגן רקמתי במצבים פיזיולוגיים שונים באופן בולט. הוא מציע כלי אמין לחקר חילוף חומרים של גליקוגן ב-vivo וניתן ליישמו גם על מודלים של תרביות תאים במבחנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוגן הוא פוליסכריד מסועף מאוד, המשמש כמאגר אנרגיה עיקרי בשריר השלד ובכבד של יונקים, ובמידה פחותה באיברים אחרים כמו המוח, הכליה, הלב ורקמת השומן¹. במהלך האכלה, גלוקוז עודף עובר פולימריזציה או ליפוגנזה דה נובו , ונאגר כגליקוגן או ליפידים. עם זאת, במהלך צום או מאמץ פיזי, הגליקוגן עובר פירוק אנזימטי, מה שמבטיח אספקה מתמדת ומהירה של גלוקוז למילוי דרישות האנרגיה. יכולת הבופר הזו של הגליקוגן חיונית לשמירה על הומאוסטזיס גליקמי במהלך מחזורי צום והזנה פיזיולוגיים².

סינתזת גליקוגן מופעלת על ידי גליקוגן סינתאז (GYS), הקיים בשני איזופורמים יונקים: GYS1 ו-GYS2. GYS1 מתבטא בעיקר בשריר השלד, בעוד ש-GYS2 הוא האיזופורם של הכבד. הפעילות הקטליטית של GYS מדוכאת על ידי פוספורילציה באתרים רבים, כולל Ser641, בתנאי צום, בעוד שפעילותו מגובה בדפוספורילציה בתנאי הזנה. פירוק הגליקוגן מזורז על ידי גליקוגן פוספורילאז. איזופורם הכבד הוא PYGL, והאיזופורם של השריר הוא PYGM. בניגוד ל-GYS, הפעילות הקטליטית שלהם מעוררת בזרחון ב-Ser15 במהלך צום ומדוכאת עם דה-פוספורילציה לאחר האכלה³.

ויסות נכון של חילוף החומרים של גליקוגן הוא יסודי לתהליכים ביולוגיים רבים, ומטבוליזם גליקוגן לא מאוזן זוהה כגורם סיבתי במחלות רבות. בפרט, שינוי במטבוליזם הגליקוגן בכבד קשור להפרעות מטבוליות שונות, כולל מחלות אגירת גליקוגן⁴, סוכרת סוג^{2 5}, מחלת כבד סטאטוטי הקשורה לתפקוד מטבולי ^6,7 ותגובה נגד-רגולטורית לקויה להיפוגליקמיה⁸. בנוסף, גליקוגן מוחי חיוני ליצירת זיכרון לטווח ארוך⁹, בעוד שגליקוגן שריר השלד הוא רגולטור מרכזי של קיבולת הסיבולת¹⁰. לכן, כימות מדויק של גליקוגן ברקמה הוא קריטי למחקרים שבהם המטבוליזם של הגליקוגן מווסת דינמית או משתנה פתולוגית, מה שמאפשר חקירה של מנגנוני מחלה והערכת התערבויות המווסתות גליקוגן.

דווחו מספר שיטות לכימות גליקוגן, כולל שיטת אנתרון^11,12, שיטת אמילולוקוזידאז¹³, שיטת חומצה פנולית-גופרתית¹⁴ וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לא פולשנית (MRS)¹⁵, כאשר לכל שיטה יתרונות ומגבלות מסוימים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת הקולורימטריה של אנתרון לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדות (איור 1). פרוטוקול זה כולל שלבים עוקבים של עיכול אלקלי, דה-פרוטניזציה, שקיעת גליקוגן, שטיפת אלכוהול והתפתחות צבע באמצעות תגובת אנתרון. שיטה זו פשוטה, חסכונית ודורשת מינימום כלים מיוחדים. כדי להדגים את רגישותו ויכולת השחזור שלו, חישבנו את גבול הגילוי (LOD), את גבול הכימות (LOQ), וכן את מקדם השונות התוך-מבחן ובין הבדיקות (CV%), באמצעות סדרת תקני גליקוגן. כדי להוכיח את יישומותו, רמות הגליקוגן בכבד ובשריר השלד הוערכו בשלושה תנאים פיזיולוגיים רלוונטיים: האכלה אד ליביטום, צום לילה של 16 שעות, והאכלה חוזרת קצרה טווח. בנוסף, השיטה הודגמה באמצעות בעלי חיים שטופלו באפינפרין למידול פירוק גליקוגן חריף שנגרם מלחץ. בוצע ניתוח ווסטרן בלוט אורתוגונלי של אנזימים מרכזיים המעורבים במטבוליזם גליקוגן כדי לאמת את השינויים המטבוליים שנצפו.

איור 1: סקירה של תהליך הכימות של גליקוגן. ייצוג סכמטי של תהליך הניסוי לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד. ההליך כולל איסוף רקמות, עיכול אלקלי, משקעי חלבונים, בידוד גליקוגן וזיהוי קולורימטרי מבוסס אנתרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC; #1905019) באוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה.

1. הכנת ריאגנטים

עיין בטבלת החומרים לכל החומרים ששימשו במחקר זה.
הכינו את כל הפתרונות לפני תחילת הניסויים.
הגדל את נפחי התמיסה לפי הצורך.
הכינו תמיסת נתרן הידרוקסיד (NaOH) של 1 מיליון
1. שקלו 40 גרם של כדורי NaOH.
2. הוסף את כדורי ה-NaOH למים מזוקקים של 800 מ"ל.
3. ערבבו את התמיסה עם מוט זכוכית עד שלא יישארו חלקיקים לא מומסים בבסיס הכלי.
4. העבר את התמיסה לבקבוק נפחי בנפח 1 ליטר.
5. העלה את הנפח בדיוק ל-1 ליטר עם מים מזוקקים.
6. אחסן את התמיסה בבקבוק סגור היטב בטמפרטורת החדר (RT; 18°C–23°C).
  אזהרה: NaOH הוא קורוזיבי. הלבשו משקפי מגן, כפפות וחלוק מעבדה. כדורי NaOH מסחריים אינם טהורים ב-100% וסופגים מים. הימנעו מחשיפה ממושכת של כדורים לאוויר.
הכינו תמיסת ציר 20% ליתיום כלוריד (LiCl)
1. שקלו 20 גרם אבקת LiCl חסרת מים.
2. הוסף את אבקת LiCl למים מזוקקים של 80 מ"ל.
3. ערבבו את התמיסה עד שלא נשארו חלקיקים לא מומסים בבסיס הכלי.
4. העבר את התמיסה לבקבוק נפחי של 100 מ"ל.
5. הביאו את הנפח בדיוק ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים.
6. אחסן את התמיסה בבקבוק סגור היטב ב-RT.
  הערה: LiCl עלול לגרות את העור, העיניים ודרכי הנשימה. הלבשו משקפי מגן, כפפות וחלוק מעבדה. LiCl הוא מאוד היגרוסקופי. למזער חשיפה לאוויר כדי למנוע ספיגת מים.
הכינו תמיסת תגובת אנתרון
1. שים 28 מ"ל מים מזוקקים בכוס של 1 ליטר.
2. הוסף למים 72 מ"ל חומצה גופרתית מרוכזת בטוהר גבוה (98%) (H₂SO₄).
3. תן לתערובת להתקרר עד ל-RT.
4. הוסף 50 מ"ג אנתרון לתמיסה.
5. ערבבו עד שהאנתרון נמס.
6. הוסיפו 3 גרם תיוראה לתמיסה.
7. ערבבו עד שהתיוראה נמסה.
8. העבר את התמיסה לבקבוק זכוכית ענבר או עטוף בנייר כסף.
9. יש לאחסן את התמיסה במקרר (2°C–8°C) למשך מקסימום של שבוע.
  אזהרה: חומצה גופרתית היא מאוד קורוזיבית, גורמת לכוויות כימיות קשות, ומגיבה באלימות עם מים. לבשו חלוק מעבדה, כפפות עמידות לכימיקלים ומגן פנים. בצע את כל השלבים עם מכסה אדים כימי מוסמך. דילול יוצר חום עז. תמיד הוסיפו חומצה למים.
הכינו 95% אתנול שמכיל 0.1% LiCl
1. הוסף 95 מ"ל אתנול מוחלט לבקבוק זכוכית.
2. הוסיפו 4.5 מ"ל מים מזוקקים.
3. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת LiCl 20%.
4. ערבב היטב.
הכינו 80% מתנול המכיל 0.1% LiCl
1. הוסף 80 מ"ל מתנול מוחלט לבקבוק זכוכית.
2. הוסף 19.5 מ"ל מים מזוקקים.
3. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת LiCl 20%.
4. ערבב היטב.
הכינו תמיסה של 100% (עם חומצה טריכלורואצטית) (TCA)
1. משקל 100 גרם אבקת TCA.
2. הוסף את אבקת TCA למים מזוקקים של 80 מ"ל.
3. ערבבו עד שהן נמסות.
4. העבר את התמיסה לבקבוק נפחי של 100 מ"ל.
5. הביאו את הנפח בדיוק ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים.
6. אחסן את התמיסה בבקבוק זכוכית סגור היטב ב-RT.
הכינו תמיסה לחומצה בנזואית רוויה
1. הוסיפו 0.5 גרם גבישי חומצה בנזואית ל-100 מ"ל מים מזוקקים בכוס זכוכית בנפח 250 מ"ל.
2. חממו את התערובת ל-90°C על פלטה חמה עם ערבוב מגנטי רציף.
3. המשיכו לחמם עד שלא נשארו חלקיקים בלתי מומסים בבסיס הכלי.
4. תן לפתרון להתקרר ל-RT.
5. שאפו את הסופרנטנט השקוף, החופשי מחלקיקים גלויים.
6. אחסן את התמיסה בבקבוק זכוכית אטום היטב ב-RT.
הכין תקני גלוקוז
1. המיס אבקת גלוקוז של 50 מ"ג בתמיסת חומצה בנזואית רוויה של 50 מ"ל להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל.
2. הכינו תקני גלוקוז (0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ו-1 מ״ג/מ״ל) בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ״ל באמצעות דילול סדרתי עם חומצה בנזואית רוויה כדלקמן.
  1. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת מאגר 1 מ"ג/מ"ל לצינור 1 כדי להכין את תקן 1 מ"ג/מ"ל.
  2. הוסף 250 מיקרוליטר תמיסת מקור ו-250 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 2 כדי להכין את תקן 0.5 מ"ג/מ"ל.
  3. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צינור 2 ו-300 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 3 כדי להכין את תקן 0.2 מ"ג/מ"ל.
  4. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת צינור 3 ו-250 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 4 כדי להכין את תקן 0.1 מ"ג/מ"ל.
  5. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת צינור 4 ו-250 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 5 כדי להכין את תקן 0.05 מ"ג/מ"ל.
  6. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צינור 5 ו-300 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 6 כדי להכין את תקן 0.02 מ"ג/מ"ל.
  7. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת צינור 6 ו-250 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור 7 כדי להכין את תקן 0.01 מ"ג/מ"ל.
  8. הוסף 500 מיקרוליטר חומצה בנזואית רוויה לצינור נפרד להכנת הריק (0 מ"ג/מ"ל).
3. סגור כל צינור ומערבולת לזמן קצר למשך 10 שניות כדי לערבב היטב.

2. טיפול בבעלי חיים

גידול כללי
1. עכברי Sprague–Dawley זכרים (230–270 גרם) במתקן בעלי חיים בתנאים מסוימים ללא פתוגנים (VAF/Plus, מעבדות צ'ארלס ריבר), מאושרים נקיים מפתוגנים נפוצים של מכרסמים כולל וירוס סנדאי, מיקופלזמה פולמוניס ופרוווירוסים של חולדות.
2. ספק דיאטת צ'או סטנדרטית ואפשר גישה חופשית למים.
3. לשמור על בעלי חיים במחזור אור/חושך של 12 שעות (אורות דלוקים ב-08:00 ואורות כבויים ב-20:00).
4. שמרו על RT ב-22°C–23°C.
5. שמרו על לחות יחסית של 30%–70%.
צום לילה
1. העבר חולדות לכלובים רגילים.
2. הסר את האוכל וספק גישה חופשית למים.
3. שמרו על צום במשך 16 שעות מ-16:30 עד 08:30 בבוקר למחרת.
הזנה מחדש
1. ספק אוכל צ'או רגיל (200 גרם) לעכברים בצום לילה.
2. אפשר לבעלי חיים להאכיל בחופשיות במשך שעתיים.
אתגר האפינפרין
1. הכינו תמיסת אפינפרין הידרוכלוריד.
  1. שקלו אבקת 5 מ"ג אפינפרין הידרוכלוריד באמצעות איזון אנליטי מכויל.
  2. העבר את האבקה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסיף 10 מ"ל מלח.
  3. סגור את הצינור והפוך 10 פעמים כדי להכין תמיסה מקורת של 0.5 מ"ג/מ"ל.
2. הזריק לחולדות שאינן בצום תוך-פריטונית בתמיסת אפינפרין הידרוכלוריד בנפח של 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף (0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף)³.
  1. החזק את החיה במצב ראש כלפי מטה כדי לאפשר לתכולת הבטן לזוז בראש.
  2. הכנס מחט 25 לתוך הרבע הימני התחתון של הבטן בזווית של 45°.
  3. שאיפת דם לאישור היעדר דם או תכולת מעיים לפני ההזרקה.
3. הזרקו לבעלי חיים ביקורתיים תוך-פריטונית תמיסת מלח בנפח של 1 מ"ל/ק"ג.
4. אסוף דגימות דם מהוריד הזנב.
  1. תחזיק את העכבר כדי לחשוף את הזנב.
  2. דחסו וחממו את הזנב במשך 10 שניות כדי להקל על זרימת הדם.
  3. דקור את וריד הזנב הלטרלי במרחק 3 ס"מ מהקצה באמצעות מחט סטרילית בקוטר 25.
  4. השליכו את הטיפה הראשונה של הדם באמצעות גזה נקייה כדי למנוע זיהום בנוזל רקמה.
  5. אסוף את הטיפה השנייה של הדם למדידת סוכר.
5. מדדו את רמת הסוכר בדם באמצעות מד סוכר כל 15 דקות למשך 60 דקות.
  1. כיולו את מד הסוכר לפי הוראות היצרן.
  2. בדוק את דיוק הסוכר מדי חודש באמצעות פתרונות בקרה.
  3. אחסן רצועות בדיקה במיכל המקורי שלהן כדי למנוע חשיפה ללחות.
  4. השתמש ברצועות בדיקה מיד לאחר ההוצאה מהמיכל.
  5. הכנס רצועת בדיקה למד הסוכר כדי להפעיל את המד אוטומטית.
  6. אפשר לדגימת הדם להיכנס לרצועה באמצעות פעולה קפילרית.
  7. רשום את ערך הסוכר המוצג.

3. קציר רקמות

המתת חסד והכנות
1. המית בעלי חיים באמצעות מנת יתר של איזופלורן. הניחו בעלי חיים בתא השראה וחשפו אותם ל-5% איזופלוראן המסופק ב-100% חמצן בקצב של 2 ליטר לדקה למשך לפחות 3 דקות.
2. אמת מוות על ידי אישור הפסקת הנשימה.
3. אשר אובדן רפלקס הקרנית ורפלקס צביטת האצבעות.
  1. נגעו בעדינות בקרנית באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה סטרילי כדי לאשר את היעדר תגובה של מצמוץ.
  2. לחץ חזק על הרשתות בין אצבעות כף רגל אחורית באמצעות מלקחיים קהים כדי לוודא היעדר תגובה מוטורית.
4. הנח את הצד הגחוני של העכברוש כלפי מעלה על מגש ניתוח.
5. הרטיב את עור הבטן עם 75% אתנול באמצעות בקבוק תרסיס.
  הערה: יש למזער את הזמן בין המתת חסד לשימור רקמות כדי להפחית את התדרדרות הגליקוגן הנגרמת מאיסכמיה לאחר המוות.
ניתוח כבד
1. יש ליצור חתך קטן בעור באורך של כ-1 ס"מ זנב לתהליך הזיפואיד.
2. הארכי את החתך לכיוון עצם החזה.
3. הפרד את העור מהשריר שמתחת.
4. לבצע לפרוטומיה רוחבית דו-צדדית על ידי חתך אופקי של 4 ס"מ, בערך 1 ס"מ זנב לתהליך הזיקפואיד, והארכה לרוחב לכיוון השוליים התת-צלעיים השמאליים והימניים כדי לחשוף את חלל הבטן במלואו.
5. זהה את הכבד.
6. כריתת האונה האמצעית הימנית (איור 2A).
7. שקלו את הרקמה תוך דקה.
8. הניחו את הרקמה במיכל פלסטיק מפוליפרופילן.
9. הקפיאו את הרקמה בקרח יבש.
כריתת שריר השלד
1. השתמשו בשריר הגסטרוקנמיוס כדגימה מייצגת משום שהוא מכיל אוכלוסייה מעורבת של סיבים מהירים ואיטיים המשקפים את התכונות המטבוליות והכיווציות של הגפה האחורית¹⁶.
2. מקם את העכברוש על הבטן.
3. בצע חתך עור לאורך החלק האחורי של הגפה האחורית מהפוסה הפופליטיאלית ועד לבליטה הקלקנית.
4. הפרד את העור.
5. זהה ומשקף את שרירי הבייספס הפמוריס והסמיטנדינוסוס.
  1. זהה את שריר הבייספס פמוריס כשריר גדול שממוקם לרוחב המכסה את החלק העליון של הירך האחורית.
  2. זהה את הסמיטנדינוזוס כשריר צר דמוי רצועה שרץ מדיאלית לאורך הירך האחורית ומוכנס קרוב לברך.
6. חשפו את שריר הגסטרוקנמיוס.
7. חתכו את גיד האכילס בהחדרה הדיסטלית על הקלקניאוס באמצעות מספריים כירורגיים עדינים.
8. הפרד את שריר הסוליאוס.
9. שחרר את החיבור הפרוקסימלי של שריר הגסטרוקנמיוס באפיקונדילים המדיאליים והצידיים של הירך.
10. הסר את כל שריר הגסטרוקנמיוס (איור 2B).
11. שקלו את הרקמה תוך דקה.
12. הניחו את הרקמה במיכל פלסטיק מפוליפרופילן.
13. הקפיאו את הרקמה בקרח יבש.

איור 2: הליכי כריתת רקמות לשריר כבד ושלד. (א) שלבים עוקבים לחשיפת חלל הבטן ולקצירת רקמת הכבד, כולל חתך עור, הארכת חתך, הפרדת עור מהשריר התחתון, ולפרוטומיה רוחבית. (ב) שלבים עוקבים לבידוד שריר גסטרוקנמיוס, כולל חתך אורכי, השתקפות שרירים מעל, זיהוי מבנים אנטומיים וכריתת השריר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. מבחן קולורימטרי גליקוגן

יום 1: עיכול אלקלי
1. הוסיפו 0.4 גרם רקמה לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל. סבילות של ± 0.1 גרם מותרת כדי להבטיח עיבוד מהיר ולהפחית את התדרדרות הרקמות.
2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת NaOH של 1 M לצינור.
3. טחנו את הרקמה באמצעות להבים סטריליים או מספריים עד שקטעי הרקמה מגיעים לגודל של כ-1–2 מ"מ.
4. הנח את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 95°C ±-5°C.
5. תדגור 30 דקות.
6. סחרור את הדגימה במהירות 2,500 סל"ד למשך 10 שניות כל 10 דקות במהלך הדגירה.
7. הוציאו את הצינור מאמבט המים.
8. תן לדגימה להתקרר ל-RT.
הכנת ליזאט לבדיקת חלבון
1. העבר 1 מ"ל ליזאט אלקליני לצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטור P1000 מכויל.
2. צנטריפוגה ב-8,000 × גרם למשך 10 דקות.
3. אסוף את הסופרנטנט.
4. שמור את הסופרנטנט לבדיקת חלבון BCA.
דה-פרוטניזציה בתיווך TCA
1. העבר 3 מ"ל ליזאט אלקליני לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת TCA של 100% (ללא וולט).
3. הוסף 6 מ"ל מים מזוקקים כדי להגיע לנפח הכולל ל-10 מ"ל.
4. מערבל את התערובת ב-2,500 סל"ד למשך 10 שניות.
5. הנח את הצינור על קרח (0°C–4°C).
6. דגרו במשך שעה אחת כדי להשקיע חלבונים.
אוסף של סופרנטנט דה-חלבוני
1. העבר 1 מ"ל מהתערובת לצינור מיקרוצנטריפוגה.
2. צנטריפוגה ב-8,000 × גרם למשך 10 דקות ב-RT.
3. שמרו את הסופרנטנט.
משקעי גליקוגן
1. העבר 0.4 מ"ל מהסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
2. הוסף 0.8 מ"ל של 95% אתנול המכיל 0.1% LiCl.
3. מערבל את התערובת היטב.
4. תדגר ב-RT במשך 16 שעות.
יום 2: פלטת גליקוגן
1. צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 1,000 × גרם למשך 15 דקות ב-RT כדי להניב כדור גליקוגן לבן מוצק וחצי-שקוף (איור 3A ואיור 3B).
2. זרוק את הסופרנטנט.
שטיפת גליקוגן ראשונה
1. הוסף 1.5 מ"ל של 80% מתנול המכיל 0.1% LiCl לכדור.
2. סחרור את הדגימה במהירות 2,500 סל"ד למשך 10 שניות.
צנטריפוגציה לאחר שטיפה
1. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם ל-5 דקות ב-RT.
2. זרוק את הסופרנטנט.
שטיפת גליקוגן שנייה
1. חזור על שלב הכביסה פעם אחת.
2. הסר כל נוזל שנותר על ידי שאיפה זהירה באמצעות פיפטור P200 עם קצה דק כדי להבטיח שהכדור הגליקוגן יישאר ללא הפרעה.
התמוססות גליקוגן
1. הוסף 0.8 מ"ל מים מזוקקים לכדור.
2. מערבולת במהירות 2,500 סל"ד עד להשגת תמיסה ברורה והומוגנית ללא חלקיקים נראים לעין.
הכנת תקנים ודוגמאות
1. הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לתקני גלוקוז, דגימות ריקות ובלתי ידועות בשלושה עותקים.
  הערה: הוסיפו תגובות לכל צינור לפי טבלה 1.
2. הוסף 50 מיקרוליטר מכל תקן גלוקוז לצינורות המיועדים.
3. הוסיפו 50 מיקרוליטר מים מזוקקים לצינור הריק.
4. הוסיפו דגימת גליקוגן של 50 מיקרו-ליטר לכל צינור דגימה לא ידוע.
5. הוסף 200 מיקרוליטר תמיסת תגובה של אנתרון לכל צינור.
התפתחות צבע אנתרון ומדידת ספיגה
1. סחרור את כל הצינורות ביסודיות.
2. הניחו את הצינורות באמבט מים בטמפרטורה של 95°C ±-5°C.
3. דגרה ל-15 דקות.
4. הסר את הצינורות ותן להם להתקרר ל-RT.
5. העבר 200 מיקרוליטר מכל צינור ללוח עם 96 בארות.
6. מדדו את הספיגה ב-620 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט (מצב קצה, 25°C) עם תיקון אוטומטי של אורך המסלול עד 1 ס"מ.
7. העקומה הסטנדרטית צריכה להיות בעלת מקדם קביעה (R²) של ≥0.995, כפי שנקבע על ידי רגרסיה ליניארית, כדי להיחשב מקובלת.
8. כל תקן או דגם בודד שכפול עם אחוז CV% של >20% בין מדידות משולשות צריך להיחשב כלא אמין ולהריץ אותו שוב.

איור 3: בידוד וכימות גליקוגן במצבים תזונתיים שונים. (א) תמונה מייצגת של כדורי גליקוגן שוקעים מדגימות כבד בתנאי האכלה, צום ומזוקק. (B) תמונה מייצגת של כדורי גליקוגן שוקעים מדגימות שריר שלד בתנאים מוזנים, צומים ומזוקנים. (C) עקומה סטנדרטית שנוצרה מתקני גלוקוז המראה את הקשר הליניארי בין ספיגה ב-620 ננומטר לריכוז גלוקוז. (ד) רמות הסוכר בדם בתנאים של אוכל, צום ורפיד. (ה) תכולת הגליקוגן בכבד בתנאים של אוכל, צום ומזוקק. (F) תכולת גליקוגן בשריר השלד בתנאים של אוכל, צום וריפר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 6 לקבוצה). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח חד-כיווני רגיל של שונות (ANOVA) עם השוואות מרובות שתוקנו בשיטת בנג'מיני–הוכברג. **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001, NS: לא משמעותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ריאגנטים	0 מ"ג/מ"ל	0.01 מ"ג/מ"ל	0.02 מ"ג/מ"ל	0.05 מ"ג/מ"ל	0.1 מ"ג/מ"ל	0.2 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ג/מ"ל	1 מ"ג/מ"ל	Blank	דגימה לא ידועה
תמיסת תקן גלוקוז	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	50 מיקרוליטר	–	–
מים מזוקקים (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 מיקרוליטר	–
דגימת גליקוגן	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 מיקרוליטר
פתרון תגובת אנתרון	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר	200 מיקרוליטר

טבלה 1: הגדרת תגובה לבדיקת קולורימטריה בגליקוגן. הכנת תגובה לתקני גלוקוז, דגימות גליקוגן ריקות ובלתי ידועות בשימוש במבחן הקולורמטרי של אנתרון. נפחים מוגדרים של דגימות תקני גלוקוז, מים מזוקקים או דגימות גליקוגן שולבו עם תמיסת תגובת אנתרון לפני הדגירה ומדידת הספיגה.

5. חישוב תכולת הגליקוגן ברקמה

הערה: נרמול הגליקוגן הנמדד למשקל רטוב ברקמה או למסת חלבון כוללת.

קביעת עקומה סטנדרטית וריכוז
1. השתמש בקריאות ספיגה משמונת צינורות הגלוקוז הסטנדרטיים.
2. הפחת ערכים ריקים מקריאות הספיגה לפני שמציבים אותם מול ריכוזי הגלוקוז.
3. התאמת עקומת רגרסיה ליניארית באמצעות רגרסיה של ריבועים מינימליים רגילים באקסל (איור 3C).
4. חישבו את ריכוז הגלוקוז בכל דגימת גליקוגן לא ידועה (C_{לא ידוע}) על ידי אינטרפולציה של הספיגה החסרת ריק על העקומה הסטנדרטית הליניארית באמצעות משוואת הרגרסיה שהתקבלה בשלב 5.1.3.
נרמול למשקל רטוב ברקמה
1. חשב את תכולת הגליקוגן באמצעות המשוואה הבאה:
2. הגדר C_{לא ידוע} כרכוז הגלוקוז (mg/mL) בדגימת הגליקוגן הלא ידועה שנקבע בשלב 5.1.4.
3. הגדר 0.8 כנפח דגימת הגליקוגן המומסת (mL) בשלב 4.10.1.
4. הגדר 0.9 כגורם המשמש להמרת ערך הגלוקוז לערך גליקוגן.
5. הגדר 2.5 כמקדם הדילול שהוכנס במהלך שקיעת גליקוגן בשלב 4.5.
6. הגדר 10 כמקדם דילול שמסביר את 1 מ"ל אליקווט שנותח מתוך התערובת הכוללת של 10 מ"ל שהוכנה בשלב 4.3.3.
7. הגדר 10/3 כמקדם דילול שמסביר את 3 מ"ל אליקווט ששימש מתוך סך העיכול האלקליני של 10 מ"ל שהוכנה בשלב 4.1.2.
נרמול למסת החלבון הכוללת
1. חשב את תכולת הגליקוגן באמצעות המשוואה הבאה:
2. הגדר C_{לא ידוע} כרכוז הגלוקוז (mg/mL) בדגימת הגליקוגן הלא ידועה שנקבע בשלב 5.1.4.
3. הגדר 0.8 כנפח דגימת הגליקוגן המומסת (mL) בשלב 4.10.1.
4. הגדר 0.9 כגורם המשמש להמרת ערך הגלוקוז לערך גליקוגן.
5. הגדר 2.5 כמקדם הדילול שהוכנס במהלך שקיעת גליקוגן בשלב 4.5.
6. הגדר 10 כמקדם דילול שמסביר את 1 מ"ל אליקווט שנותח מתוך התערובת הכוללת של 10 מ"ל שהוכנה בשלב 4.3.3.
7. הגדר 1/3 כגורם התיקון שמסביר את 3 מ"ל אליקו ששימש מהעיכול האלקליין בשלב 4.3.1.
8. הגדר ריכוז חלבון כרכוז החלבון הכולל (mg/mL) בעיכול הבסיסי שנקבע על ידי בדיקת BCA בשלב 4.2.4.

6. כתם מערבי של אנזימים מרכזיים המזרזים את מטבוליזם הגליקוגן

שיקולים כלליים
1. עיין בפרוטוקולים שתוארו קודם לכן לפרוצדורות Western Blot^{סטנדרטיות 17,18}.
הפקת חלבון
1. שוקלת 75 מ"ג של רקמה קפואה ב-Snap. סבילות של ± 25 מ"ג מותרת כדי להבטיח עיבוד מהיר ולהפחית הפשרת רקמות.
2. הוסיפו 1 מ"ל בופר ליזיס קר של RIPA (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 1% טריטון X-100; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 0.1% SDS; ו-1 מ"מ EDTA) בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
3. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגניזר רוטור-סטטור ידני.
הכנת ליזאט
1. לדגור את ההומוגננט על הקרח למשך 30 דקות.
2. סחרור את הדגימות במהירות 2,500 סל"ד למשך 10 שניות כל 10 דקות במהלך הדגירה.
3. צנטריפוגה ב-10,000 × גרם באמצעות רוטור בזווית קבועה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C.
כימות חלבונים
1. אסוף את הסופרנטנט כחלבון ליזאט מלא.
2. בצע בדיקת BCA כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
3. הכינו תקני BSA של 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 ו-1 mg/mL מדוללים בבופר RIPA לlysisis.
4. במיקרופלטת 96 בארות, טעין 20 מיקרוליטר מכל דגימה סטנדרטית או לא ידועה לבארות בודדות.
5. הוסף 200 מיקרוליטר של תגובת BCA (שהוכנה על ידי ערבוב 50 חלקים של תגובת A עם חלק אחד של תגובת B) לכל באר.
6. דגרו את לוח התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
7. לאחר קירור ל-RT (18°C–23°C), יש למדוד את הספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט (מצב קצה, 25°C) עם תיקון אוטומטי של אורך המסלול עד 1 ס"מ.
SDS-PAGE
1. מערבבים 15 מיקרוגרם חלבון עם בופר טעינה SDS-PAGE.
2. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות.
3. קרר את הדגימות על הקרח.
4. טעין את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE של 10%.
5. פירוק חלבונים באמצעות אלקטרופורזה בבופר רץ (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, ו-0.1% SDS).
6. הרצים את הג'ל בעוצמה קבועה של 100 וולט עד שהחזית של צבע הברומופנול הכחול מגיעה לתחתית הג'ל.
העברת וחסימת חלבון
1. העבר חלבונים לממברנת ניטרוצלולוזה או PVDF.
2. לממברנות ניטרוצלולוז, איזון את הממברנה בבופר העברה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, 20% מתנול, pH 8.3) למשך 10 דקות.
3. לממברנות PVDF, הפעל את הממברנה על ידי טבילה ב-100% מתנול למשך 30 שניות, ואז מאוזן בבופר העברה למשך 10 דקות.
4. הרכיבו את סנדוויץ' ההעברה בסדר הבא: ספוג, נייר סינון, ג'ל, ממברנה, נייר סינון, ספוג.
5. בצע העברת חלבון בזרם קבוע של 200 mA למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4°C.
6. הכן 3% (בלי v) BSA ב-TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; ו-0.1% Tween-20).
7. חסום את הממברנה ב-RT למשך שעה עם נדנוד קבוע.
  הערה: השתמש ב-BSA במקום חלב דל שומן בעת זיהוי חלבונים מזורחנים.
דגירה ראשונית של נוגדנים
1. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית בבופר חוסם בדילול של 1:1,000.
2. דגרו את הממברנה עם נוגדן ראשוני בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה עם נדנוד מתמיד.
כביסה
1. שטוף את הממברנה עם TBST.
2. חזור על הכביסה שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
דגירה משנית של נוגדנים
1. הכינו נוגדן משני מצומד HRP בבופר חוסם בדילול של 1:10,000.
2. דגרו את הממברנה ב-RT במשך שעה עם נדנוד קבוע.
כביסה
1. שטוף את הממברנה עם TBST.
2. חזור על הכביסה שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
גילוי כימילומינסצנטי
1. הכינו מצע כימילומינצנטי על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסות הלומינול/המגבר ופרוקסיד היציבות.
2. מרחו את המצע בנפח של 0.1 מ"ל/ס"מ^{בשטח פנים של 2} ממברנה ודגרו במשך 2 דקות ב-RT על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).
3. ללכוד אותות באמצעות מצלם כימילומינסנטי.
4. בדוק זמני חשיפה בטווח של 10 עד 300 שניות ובחר חשיפה בטווח הזיהוי הליניארי לכל כתם (כתם כזה).
5. אמת את ליניאריות האות על ידי אישור היעדר רוויית פיקסלים באמצעות התוכנה המובנית של הכלי.
ניתוח תמונה
1. נתחו את עוצמת הרצועות באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.51, NIH).
2. המרו תמונות לגווני אפור של 8 ביט והחלו חיסור רקע גלגול ברדיוס של 50 פיקסלים.
3. הגדר כל רצועה באמצעות אזור מלבני שממדים זהים והפחתת רקע מקומי משטח ריק סמוך כדי לקבל ערכי צפיפות משולבים גולמיים.
צביעת חלבון כוללת
1. הדגר את הממברנה בתמיסת דיו הודית 0.1% ב-TBST ב-RT למשך שעה עם נדנוד קבוע.
2. שטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם TBST.
3. כמת רצועות מוכתמות מרובות כבקרות טעינה כדי לנרמל אותות אימונובלוטינג.
  הערה: השתמש בצביעת חלבון מלאה במקום בגנים לניקיון (HKGs), שכן ביטוי HKG עשוי להשתנות בתנאים ניסיוניים שונים¹⁹.

7. רגישות ושחזוריות של השיטה

הכנת תקני גליקוגן
1. הכינו תמיסת גליקוגן של 20 מ"ג/מ"ל ב-1 מיליון NaOH.
2. הכינו סדרת תקני גליקוגן (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ו-1 מ״ג/מ״ל) בצינורות צנטריפוגה של 15 מ״ל באמצעות דילול מדורג עם 1 מיליון NaOH כפי שמתואר להלן.
  1. הכינו את שפופרת 1 (1 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 500 מיקרוליטר עם 9.5 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  2. הכינו את צינור 2 (0.5 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 250 מיקרוליטר עם 9.75 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  3. הכינו את שפופרת 3 (0.2 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 100 מיקרוליטר עם 9.9 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  4. הכינו את צינור 4 (0.1 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 50 מיקרוליטר עם 9.95 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  5. הכינו את שפופרת 5 (0.05 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 25 מיקרוליטר עם 9.975 מ"ל של 1 מיליון NaOH.
  6. הכינו את צינור 6 (0.02 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב תמיסת גליקוגן של 10 מיקרוליטר עם 9.99 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  7. הכינו את צינור 7 (0.01 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב 100 מיקרוליטר של תמיסת צינור 1 עם 9.9 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  8. הכינו את צינור 8 (0.005 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב 50 מיקרוליטר של תמיסת שפופרת 1 עם 9.95 מ"ל של 1 מטר NaOH.
  9. הכינו את הריק (0 מ"ג/מ"ל) על ידי הוספת 10 מ"ל של 1 מטר NaOH לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
3. סגור כל צינור ומערבולת ל-2,500 סל"ד ל-10 שניות לערבוב.
מבחן קולורימטרי אנתרוני
1. להפיק גליקוגן ולבצע את מבחן הקולורימיטרי של אנתרון לפי שלבים 4.1.4–4.12.6.
2. רשמתי קריאות ספיגה ב-620 ננומטר (A₆₂₀).
חישוב ריכוז הגליקוגן
1. יצר את עקומת תקן הגלוקוז וחשב את ריכוז הגלוקוז בכל דגימה סטנדרטית (_תקן C) כפי שמוגדר בשלב 5.1.
2. חשב את ריכוז הגליקוגן בכל צינור סטנדרטי באמצעות המשוואה הבאה:
3. הגדר_תקן C כרכוז הגלוקוז (mg/mL) שנקבע בכל דגימה סטנדרטית.
4. הגדר 0.8 כנפח דגימת הגליקוגן (mL).
5. הגדר 0.9 כגורם להמרת ערך גלוקוז לערך גליקוגן.
6. הגדר 2.5 כגורם דילול.
7. הגדר 10 כמקדם דילול שמסביר את 1 מ"ל אליקווט שנותח מתוך התערובת הכוללת של 10 מ"ל שהוכנה בשלב 4.3.3.
8. הגדר 1/3 כגורם התיקון שמסביר את 3 מ"ל אליקו ששימש מהעיכול האלקליין בשלב 4.3.1.
9. חזור על ההליך המלא שלוש פעמים נוספות ביום אחד, לסך של ארבע ריצות.
10. חזור על ארבע הריצות לאורך ארבעה ימים, לסך הכל 16 ריצות.
חישוב LOD ו-LOQ
1. צייר את כל 16 קריאות הספיגה בציר y מול כל ריכוז גליקוגן סטנדרטי בציר ה-x.
2. חשב את עקומת הרגרסיה הליניארית ו-R². רגרסיה ליניארית עם R² של ≥0.995 נחשבת מקובלת.
3. חשב את LOD ו-LOQ באמצעות המשוואות הבאות:
4. הגדר σ כשגיאת התקן של התגובה (יירוט y).
5. הגדר S כשיפוע עקומת הרגרסיה הליניארית.
חישוב CV% תוך-מבחן ובין הבדיקה
1. לכל תקן גליקוגן, יש לחשב את ה-CV% של הערכים המחושבים מתוך ארבע הריצות ביום הראשון באמצעות המשוואה הבאה:
2. מגדירים סעיף₁ כסטיית התקן של ערכים מארבעת הריצות ביום הראשון.
3. הגדר כערך הממוצע מארבע הריצות ביום הראשון.
4. חזור על חישוב זה ביום 2, יום 3 ויום 4 כדי לקבל את CV₂,_{CV 3} _{ו-CV 4}.
5. חשב את ה-CV% הסופי בתוך הבדיקה באמצעות המשוואה הבאה:
6. חשב את אחוז ה-CV% הבין-מבחן באמצעות המשוואה הבאה:
7. מגדיר s_אינטר כסטיית התקן של CV₁,_{CV 2},_{CV 3} ו-CV₄.
8. הגדר כערך הממוצע של CV₁,_{CV 2},_{CV 3} _{ו-CV 4}.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות גליקוגן בשרירי הכבד והשלד במצבים תזונתיים שונים

צום לילי ירד משמעותית את רמות הסוכר בדם (ממוצע ± שגיאת תקן ממוצעת [SEM]) מ-7.9 ± 0.4 מ"מ בעכברים שהוזנו ב-ad libitum ל-5.4 ± 0.3 מ"מ. רמות הסוכר בדם שוחזרו ל-8.3 ±-0.1 מ"מ לאחר שעתיים של הזנה מחדש (איור 3D). בהתאם לשינויים אלו, רמות הגליקוגן בכבד (ממוצע ± SEM) היו 45.05 ± 3.85 מ"ג/גרם רקמה בתנאי הזנה, ירדו משמעותית ל-0.63 ±-0.13 מ"ג/גרם רקמה לאחר צום לילה, ועלו ל-13.29 ±-0.73 מ"ג/גרם רק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים שיטת אנתרון קולורימטרית מותאמת לכימות גליקוגן ברקמות בעלי חיים. בנוסף לשלבים הסדרתיים הקונבנציונליים של קצירת רקמות, עיכול בסיסי, השקעת גליקוגן, שטיפת אלכוהול ופיתוח צבע מבוסס אנתרון, שילבנו שלב דה-פרוטניזציה להפחתת הפרעות רקע (איור 1). לאחר מכן השתמשנו בשיטה זו להערכת שינויים בתכולת הגליקוגן בכבד ובשריר הגסטרוקנמיוס בתנאים פיזיולוגיים שונים, והדגמנו את יכולתה לזהות שינויים פיזיולוגיים רלוונטיים במטבוליזם הגליקוגן. ניתוח Western Blot אורת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFA0806103) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82270871).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	משמש לעיבוד דגימות והגדרת תגובה
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	משמש לטיפול בליזט ולשלבי משקע
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	מאגר לשטיפת ממברנה ב-western blot
37 ^oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	דגירה של צלחת BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	משמש לעיכול רקמות ותמצית
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	מדידת ספיגה מבוססת צלחת
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	שקילה של אבקות כימיות
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	ריאגנט לגילוי צבעוני של גליקוגן
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	גילוי של גליקוגן סינתאז 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	גילוי של גליקוגן סינתאז 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	גילוי של GYS מפוספט
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	גילוי של פוספט גליקוגן פוספורילז
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	גילוי של פוספורילז גליקוגן בכבד
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	גילוי של פוספורילז גליקוגן בשרירים
BCA assay kit	Beyotime	P0012	כימות חלבון
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	הכנת תמיסה רווייה לסטנדרטים
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	צביטת אצבעות; ניתוח רקמות
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	חומר חוסם ב-western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	גילוי אותות ב-western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	פיתוח אותות ב-western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	ממס להכנת ריאגנטים
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	גירוי פירוק גליקוגן in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	משקע גליקוגן ושטיפה
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	ניתוח רקמות
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	צנטריפוגה של דגימות
Glucometer	i-SENS	CareSens N	מדידת רמת גלוקוז בדם
Glucometer	i-SENS	CareSens N	מדידת רמת גלוקוז בדם בוריד הזנב
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	מדידת רמת גלוקוז בדם בוריד הזנב
Glucose	Macklin	G6172	הכנת עקומת סטנדרט
Glycogen stock	Beyotime	D0812	הכנת סדרת סטנדרטים של גליקוגן
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	גילוי של נוגדנים ראשוניים
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	הומוגניזציה של רקמות
India ink	Sigma-Aldrich	198285	צביעת חלבון סה"כ לנורמליזציה
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	המתת בעלי חיים
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	חימום דגימות במהלך בדיקות
Lithium chloride	Macklin	767397	מגביר את משקע הגליקוגן
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	שלב שטיפת גליקוגן
Microplate reader	BioTek	ELx800	מדידת ספיגה ב-620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	ממברנת העברת חלבון
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	דגירה של ריאגנט צבעוני
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	העברת תמיסה
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	הסרת נוזל שנותר
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	שימור זרחון חלבון
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	אחסון של רקמות שנאספו
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	מניעת פירוק חלבון
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	חילוץ חלבון
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	הפרדת חלבון
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	ערבוב עם דגימות חלבון לפני טעינה לתוך בארות SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	אלקטרופורזה של SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

שיטת הקולורימטריה של Anthrone לכימות גליקוגן בכבד ובשריר השלד של חולדה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים