מודלים קלינית רלוונטיים להשתלה של גידולים לחקר סרטן שחלות גרורתי ותגובה טיפולית בעכברים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לקביעת מודלים תוך-פריטוניאליים ותוך-בורסליים לחקר התקדמות סרטן השחלה, מטסאציס ותגובה טיפולית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בהדמיה לא פולשנית מבוססת לוסיפראז במודלים אלו כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול בעכבר.

תקציר

סרטן שחלות גרורתי הוא ממאירות גינקולוגית קטלנית במיוחד שחסרה אפשרויות טיפול יעילות. פיתוח גישות טיפוליות ניתנות לתרגום קליני עבור חולי סרטן השחלות תלוי בהבנת הגורמים המניעים את גרורות סרטן השחלות. בעוד שרוב הגידולים המוצקים מציגים גרורות המטוגניות, תאי סרטן השחלה מתפשטים בעיקר דרך המסלול התוך-מצוק. תהליך זה כולל ניתוק והשלכת תאי סרטן מהגידול הראשוני אל חלל הפריטונאלי, אשר מקבלים תכונות שמאפשרות להם לעמוד בפני אנואיקים וליצור אגרגטים רב-תאיים. האגרגטים התאים הללו מתחברים ופולשים לריריית המזותליאל של הפריטונאום, ויוצרים נגעים גרורתיים. מודלים בעלי רלוונטיות קלינית ב-vivo חיוניים להבנת האופן שבו גורמים תאיים ומיקרו-סביבת הגידול משפיעים על השלבים השונים בתהליך הגרורות ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות חדשות. שני מודלים של גידולי עכברים מושתלים המשמשים רבות לחקר גרורות סרטן השחלות ותגובתן טיפולית הם מודלים תוך-פריטוניאליים ותוך-בורסליים. בדוח זה אנו מתארים את המתודולוגיה שלב אחר שלב להקמת מודלים אלו ומדגישים את היתרונות והמגבלות שלהם. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בהדמיה ביולומינצנטית לניטור לא פולשני של התקדמות הגידול באמצעות מודלים אלו.

מבוא

למרות התקדמות משמעותית בהבנתנו את הגורמים המניעים את התקדמות סרטן השחלות, סרטן השחלות נותר הממאירות הגינקולוגית השנייה הקטלנית ביותר^{בארצות הברית}. עקב היעדר תסמינים ברורים והיעדר סמנים אבחנתיים מוקדמים אמינים, מעל 70 אחוז מחולות סרטן השחלות סובלים ממחלה גרורתית מתקדמת באבחון ^2,3. הטיפולים הנוכחיים אינם יעילים בטיפול בסרטן שחלות גרורתי, ולכן שיעורי ההישרדות של 5 שנים עבור חולים עם מחלה מתקדמת נשארים פחות מ-30^אחוז. סיבה מרכזית לחוסר ההצלחה הטיפולית היא הופעת כימורזיסטנס⁵. לכן, יש צורך דחוף לזהות גורמים שמניעים גרורות סרטן השחלות והתנגדות לכימולוגיה. התמודדות עם פער הידע הזה תהיה קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר למיקוד במחלה זו. כדי להשיג מטרות אלו, אנו זקוקים למודלים in vivo שמחקים במדויק את השלבים המרכזיים של התקדמות סרטן השחלות.

בעוד שקווי תאי סרטן השחלות ומודלים תלת-ממדיים במבחנה תרמו רבות להבנתנו את הגורמים המשפיעים על גרורות ותגובה טיפולית, למודלים אלו יש מספר מגבלות ^6,7,8. לדוגמה, מודלים אלה אינם מתחשבים בתאים הלא-סרטניים השונים שהם חלק מהמיקרו-סביבה של הגידול, ואינם לוכדים את האינטראקציות המורכבות שמתרחשות בתוך מיקרו-סביבת הגידול ^6,7,8. יתרה מזאת, קשה מאוד לחקור גורמים מערכתיים והשפעתם על התקדמות הגידול ותגובת התרופות באמצעות מודלים במבחנה ^6,7,8. מגבלות אלו של מודלים במבחנה מדגישות את הצורך במודלים in vivo המדמים במדויק את השלבים השונים בגרורות סרטן השחלות, כולל אינטראקציות מורכבות עם סוגי תאים אחרים וגורמים בתוך המיקרו-סביבה.

מודלים מהונדסים גנטית של עכברים (GEMMs) מציעים פלטפורמה in vivo שבה גידולים נוצרים באופן ספונטני בסביבה מיקרו-טבעית^{עם מערכת} חיסון שלמה. עם זאת, הן גוזלות זמן, מאתגרות ויקרות לייצור ותחזוקה^{של 10}. לרוב ה-GEMMs של סרטן השחלות יש גם תקופת השהיה ארוכה להתפתחות גידול, מה שהופך את העבודה איתם לגוזלת זמן ויקרה, גם לאחר שנוצרו¹⁰. מודלים ניתנים להשתלה, כגון מודלים של xenograft ו-allograft, מציעים איזון טוב בין רלוונטיות ביולוגית לבין קלות ניסויית, ולעיתים קרובות זולים בהרבה לייצור מאשר^{GEMMs 11}. בנוסף להשהיה נמוכה יותר מאשר GEMMs, הקלות שבה ניתן לשנות גנטית תאי גידול במבחנה הופכת את המודלים הללו לנוחים ומתאימים לחקר כיצד גורמים גנטיים שונים משפיעים על התקדמות הגידול¹⁰. בזכות היתרונות הללו, מודלים של גידולים מושתלים הפכו לכלים חשובים הן למחקר בסיסי והן למחקר תרגומי בסרטן השחלות.

בדוח זה אנו מתארים את הפרוטוקול להקמת שני מודלים שונים של גידולי עכבר הניתנים להשתלה, המשמשים באופן נרחב לחקר סרטן שחלות גרורתי: (1) המודל התוך-פריטוני ו-(2) המודל האורתופופי או התוך-בורסי. שני הדגמים ניתנים להגדרה כמודלים של זנוגרפט או אלוגרפט. במודל התוך-פריטוניאלי, תאי סרטן מוזרקים לחלל הפריטונאלי של העכברים. הכנסת תאי סרטן השחלה למרחב התוך-פריטוניאלי משקפת את שלב הגרורות של סרטן השחלה, שבו תאי סרטן שחלה גרורתיים נשפכים מהגידול הראשוני אל חלל הפריטונאלי. בדומה לתהליך הגרורתי בבני אדם, תאי סרטן השחלה המושתלים יצטרכו להסתגל למיקרו-סביבה המצפקית העוינת, להיצמד ולפלוש לשכבת המזותליאל שמקיפה את חלל הפריטונאלי, וליצור נגעים גרורתיים באיברים ורקמות תוך-פריטוניאליות כגון האומנטום, המזנטריה, הכבד והסרעפת. בהתאם לקו התאים הסרטני המשמש ליצירת המודל התוך-פריטוניאלי, גידולים גרורתיים יכולים להיות מלווים באסיטס, כפי שנצפה במחלות בשלב מאוחר בבני אדם. לכן, המודל התוך-פריטונאלי שימש רבות להבנת גורמים המניעים את גרורות סרטן השחלות ואת התקדמותם למחלה בשלב מאוחר¹². מודלים אלו שימושיים גם לקביעת יעילות של אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן שחלות גרורתי¹². במודל הפנימי או האורתוטופי, תאי סרטן מושתלים בבורסה, מבנה ממברני שמקיף את שחלת העכבר. מודל זה מחקה שלבים מוקדמים של גידול שחלות וגרורות. בשלב זה תאי הסרטן עדיין מוגבלים לחצוצרת ולשחלה. מאתרים אלו תאי סרטן נשפכים לחלל הפריטונאלי, ובסופו של דבר מתפשטים לאיברים אחרים. לכן, המודל התין-בורסלי שימושי הן במחקר הן בשלבים המוקדמים של גידול השחלה והן באירועים שמובילים לגרורות טרנסקולומיות בחלל הפריטונאלי^.

לכן, בעוד שמודלים תוך-פריטוניאליים ותוך-בורסליים הם כלים מצוינים לחקר גרורות סרטן השחלות ותגובתן טיפולית, הם שונים בשלב הספציפי לאורך תהליך הגרורות שהם מחקים. בעוד שמודלים תוך-בורסליים יכולים לחקות את התקדמות סרטן השחלות משלבים מוקדמים לשלבים מאוחרים יותר בתהליך הגרורתי, בשל ההשהיה הקשורה לתהליך זה, הם משמשים בדרך כלל לחקר אירועים מוקדמים בגרורות סרטן השחלות. למחקרים המתמקדים בשלבים מאוחרים יותר של גרורות סרטן השחלות, המודל התוך-פריטונאלי מתאים יותר. יתרה מזאת, מודל התוך-בורסל גם מאתגר יותר מבחינה טכנית לבניית מודל תוך-פריטוניאלי¹². הקמת מודל תוך-בורסל דורשת גישה לחדר ניתוחים המצויד בציוד מיקרוכירורגי שיאפשר הזרקה מדויקת של תאי סרטן לבורסה השחלותית. היכולת של תאי סרטן להקים גידולים ("קצב קבלה" או "קצב השתלה") בדרך כלל נמוכה יותר במודלים תוך-בורסליים בהשוואה למודלים תוך-פריטונאליים. יתרה מזאת, מאחר שגידולים אינם ניתנים לזיהוי בקלות לאחר הזרקות אורטופטיות או תוך-פריטונאליות, בדרך כלל נעשה שימוש בטכניקת הדמיה ביולוגית לא פולשנית למעקב אחר התקדמות הגידול. לכן, גם מודלים תוך-פריטוניאליים וגם מודלים תוך-בורסליים דורשים ציוד נוסף שיאפשר הדמיה לא פולשנית של גידולים¹². בסופו של דבר, מטרות הניסוי, זמינות המשאבים ומערך הכישורים הטכניים יקבעו את בחירת המודל לכל מחקר.

דוח זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב לקביעת מודלים של זנוגרפט עכבר תוך-מצוקי ובתוך בורסל באמצעות קווי תאים של סרטן השחלות האנושי. ניתן להקים מודלים אלו על ידי השתלת התאים לזני עכברים עם מערכת חיסון מוחלשת כגון NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) או Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). אותה שיטה יכולה להיות מותאמת ליצירת מודלים אלוגרפטיים (סינגניים). בעת הקמת מודלים של אלוגרפט, תאי סרטן השחלות בעכברים מושתלים בעכברים חיסוניים מאותו רקע גנטי. מכיוון שמודלים של אלוגרפט מפותחים באמצעות עכברים בעלי יכולת חיסון, הם שימושיים לחקר האופן שבו גורמים שונים מווסתים את מיקרו-סביבת הגידול בשחלה, תפקיד מערכת החיסון בהתקדמות סרטן השחלות ויעילות האימונותרפיה. בנוסף לקביעת מודלים של עכברי זנוגרפט תוך-פריטוניאליים ותוך-בורסליים, דוח זה מתאר גם כיצד להשתמש בהדמיה ביולומינצנטית למעקב לא פולשני אחר התקדמות הגידול במודלים אלו.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) באוניברסיטת מרילנד, מחוז בולטימור (חוקר ראשי - אצ'ות' פדמנבאן; מספר פרוטוקול - 1947).  הרשימה המלאה של החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה ומספרי הקטלוג שלהם מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת קווי תאי סרטן השחלות להשתלה בעכבר

הערה: לכל המודלים ב-in vivo המתוארים בפרוטוקול זה, יש להכין תאי סרטן שחלות להשתלה בעכבר. תאי סרטן השחלות צריכים להיות מוכנים במכסה תרבית רקמה לזרימה למינרית כפי שמתואר להלן בטמפרטורת החדר אלא אם צוין:

1. גידול תאי סרטן שחלה בטמפרטורה של 37 ^מעלותצלזיוס באינקובטור_CO2 עם מעטפת מים, נשמר על 5%_CO2 באמצעות מדיה סטנדרטית כפי שהומלץ בספרות. אם רוצים הדמיה לא פולשנית בגוף של הגידול, יש להנדס את תאי סרטן השחלה כך שיבטאו לוסיפראז באופן יציב לפני ההשתלה.
2. כאשר התאים מגיעים לכ-80%–85% מפגש אחד, קצור אותם בתנאים סטריליים, כפי שמתואר להלן:
   1. שאיפת מדיה מלוח תרבית הרקמה.
   2. שטוף תאים דביקים פעמיים עם תמי מלח סטריליים מסוג 1X פוספט-בופר (PBS) ללא סידן ומגנזיום. נוכחות סידן ומגנזיום ב-PBS עלולה להפריע לפעילות הטריפסין ולקדם הידבקות תאים. שאפו את ה-PBS מלוח תרבית הרקמה.
   3. הוסיפו 0.05% טריפסין-EDTA ללוח תרבית הרקמה. כמות הטריפסין שתשתמש תלויה בגודל לוח תרבית הרקמה ובקו התאים שעליו עובדים. לרוב קווי התאים הגדלים על פלטת 100 מ"מ, השתמשו ב-1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. עבור קווי תאי סרטן שחלות הדבקים חזק כמו OVCA420, מומלץ ליטול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
   4. העבר את הפלטה עם התאים חזרה לאינקובטור_CO2 עם ציפוי מים של 37 ^מעלותצלזיוס המשמש לתרבות רקמות ודגירה למשך 1–5 דקות. זמן הדגירה המדויק הנדרש תלוי בקו התא. חלק מקווי התאים, כמו TYK-Nu ו-HEYA8, מתנתקים מהר מאוד (1–2 דקות), בעוד אחרים, כמו OVCA420, לוקחים יותר זמן (4–5 דקות).
   5. לאחר שהתאים מנותקים, הוסף מדיום המכיל FBS כדי לעצור את פעולת הטריפסין. הוסיפו 6 מ"ל מדיום המכיל FBS לכל 1 מ"ל טריפסין. הפיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להוציא תאים מלוח תרבית הרקמה ולפרק אותם לתלייה חד-תאית.
      הערה: כאשר צופים בהם תחת מיקרוסקופ הפוך בשדה בהיר, תאים מנותקים ייראו מעוגלים (במקום שטוחים/מוארכים) ויצפו בחופשיות במקום להידבק לתחתית הלוח.
   6. אסוף את התאים בצינור חרוטי וצנטריפוגה בעוצמה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. הסר את הסופרנטנט המכיל טריפסין והחזיר את כדור התא לתחום תרבית תאים חדש המכיל FBS.
3. ספירת תאים באמצעות צבע עמידות תאים כמו כחול טרייפן והמוציטומטר. לחילופין, ניתן להשתמש במונה תאים אוטומטי לספירת תאים.
4. שחזור התאים בנפח מוגדר של PBS סטרילי 1X (pH 7.4) כך שיושג הריכוז הרצוי של תאים ליחידת נפח. מספר התאים המומלץ להזרקה עבור קווי תאי סרטן השחלות האנושיים הנפוצים מוצג בטבלה 1¹³.
   הערה: הנפח המרבי שניתן להזריק בבטחה לעכברים תלוי במודל. במודל התוך-פריטונאלי, עוצמת הקול המקסימלית המומלצת היא 500 מיקרוליטר (ראו סעיף 2.1). במודל תוך-בורסל, הנפח המקסימלי המומלץ הוא 5 מיקרוליטר (ראו סעיף 2.2).
5. השאירו את תליית התא על קרח עד שיגיע הזמן להזריק אותו לעכברים. הזרקו תאים לעכברים בהקדם האפשרי, רצוי בתוך 30–45 דקות מהכנת התאים.

2. הקמת מודלים של סרטן שחלות הניתנים להשתלה בעכבר

1. הקמת המודל התוך-פריטוניאלי של סרטן השחלות
   הערה: בתהליך זה, תאי סרטן השחלה המבטאים לוסיפראז באופן יציב מוזרקים לחלל הפריטונאלי של עכבר בוגר. שימוש בתאים שמבטאים לוסיפראז באופן יציב יאפשר ניטור ארוך ולא פולשני של התקדמות הגידול באמצעות מערכת ההדמיה In Vivo (IVIS).
   1. הכינו את התאים כפי שמתואר בסעיף 1. החזירו את התאים בעדינות באמצעות מיקרופיפטה של 1000 מיקרוליטר וודאו שהתאים נשארים מנותקים.
      הערה: אי הסרת הגושים תגרום לסתימת המחטים.
   2. משוך 500 מיקרוליטר של מתלה תא לתוך מזרק של 1 מ"ל וחבר מחט בגודל 21G על 1 אינץ'. ודא שאין בועות אוויר במזרק.
      הערה: הנפח המרבי שניתן להזריק תוך-פריטונית לעכבר בוגר (25–30 גרם) הוא 500 מיקרוליטר. לכן, להחזיר תאים בנפח כך שמספר התאים הנדרש יהיה בנפח מקסימלי של 500 מיקרוליטר. מספר התאים המומלץ להזרקה עבור קווי תאי סרטן השחלות האנושיים הנפוצים מוצג בטבלה 1¹³.
      הערה: אם העכבר שוקל בין 20–25 גרם, מומלץ להזריק נפח קטן יותר (פחות מ-400 מיקרוליטר).
   3. הוציאו את החיה מהכלוב והניחו אותה על משטח מחוספס או מחוט כדי לרסן אותה.
   4. הרסן את העכבר על ידי ליטוף עדין של העור הרפוי בבסיס הצוואר באמצעות היד הלא-דומיננטית כפי שמוצג באיור 1A.
   5. הרם בעדינות את העכבר וסובב אותו כך שהצד הגחוני שלו פונה כלפי מעלה. אבטח את זנב החיה באצבעות כפי שמוצג באיור 1B.
   6. צייר קו דמיוני במרכז הבטן. כדי לאתר את אתר ההזרקה, דמיינו משולש בין קו האמצע לשתי הפטמות ברבע הימני התחתון. ודא שאתר ההזרקה נמצא במרכז המשולש הדמיוני הזה. עיין באיור 1B.
   7. הטה את ראש העכבר מעט לכיוון הקרקע, כך שהוא נמוך יותר מהקצה האחורי. הגבלת העכבר במצב זה עוזרת לתכולת הבטן לזוז בראש. זה מפחית את הסיכון לניקוב איברים פנימיים במהלך הזריקה.
   8. השתמש במקלעת אלכוהול סטרילית כדי לנקות את אזור ההזרקה.
   9. באמצעות היד הדומיננטית, מכניסים את המחט לאתר ההזרקה בזווית של 45° או פחות. קדימו רק 0.5 אינץ' ולא יותר מחצי מאורך המחט. ודאו שהמחט נשארת יציבה, שכן תנועה בחלל הבטן עלולה לגרום לפגיעה באיברים פנימיים.
   10. משחרר את התאים בקצב איטי ויציב אל חלל הבטן של העכבר.
   11. תוציא את המחט מהעכבר באותו זווית של הכנסה. מיד הניחו מד סטרילי מעל אתר ההזרקה כדי למנוע דליפה.
   12. השליכו את המחט והמזרק במיכל החדים המתאים.
   13. לפני שמכניסים את העכבר לכלוב, תתייג אותם באוזניים בשיטה מועדפת. תיוג האוזניים יאפשר זיהוי העכבר שהוזרק מאוחר יותר.
2. הקמת מודל הבורסה של סרטן השחלות
   הערה: במודל התוך-בורסלית, תאי סרטן השחלה שמבטאים לוסיפראז באופן יציב מוזרקים ישירות לבורסה השחלתית של עכבר בוגר. בורסה היא שק ממברני שמקיף את שחלות העכברים. ביטוי יציב של לוסיפראז בתאי סרטן השחלה יאפשר ניטור אורך לא פולשני של התקדמות הגידול באמצעות IVIS.
   1. יום 1 – הכנת ציוד ועכבר לניתוח השתלת הבורסה
      1. אוטוקלב את הכלים הנדרשים לניתוח. רשימת הכלים היא (איור 2A):
         מספריים עם קצה דק, מלקחיים דקים מעוקלים בקוטר 5 אינץ', מחזיק מחט מאיו-היגר, מלקחיים מיקרו-מלקחיים לניתוח, קצה דק, כלים לניתוח מלקחיים עם נקודות עדינות
      2. ניתן להזרקת כאבים לפני הניתוח של קרפרופן (15 מ"ג/ק"ג) כל 24 שעות בהזרקה תת-עורית לעכבר.
         הערה: ניתן את הקרפרופן המשכך בכאבים תת-עורית כל 24 שעות, החל יום לפני הניתוח וממשיך 3 ימים לאחר הניתוח.
   2. יום 2 – השתלת תאי סרטן בשחלות בתוך הבורסל בעכבר
      1. הכינו תאי סרטן שחלות להזרקה כפי שמתואר בסעיף I. הנפח המרבי שניתן להזריק בבטחה בתוך המעבדה בעכבר הוא 5 מיקרוליטר. לכן, עדיף שיהיו תאים בריכוז של 10.4 תאים/מיקרוליטר. זה יאפשר השתלה של 5 על¹⁰ תאים בגודל 4.
         הערה: מספר התאים המומלץ להזרקה עבור קווי תאי סרטן שחלות נפוצים מוצג בטבלה 1¹³.
      2. תשאיר את התאים על הקרח עד השימוש. לאחר הקציר, מומלץ להזריק תאים בהקדם האפשרי, רצוי בתוך 30–45 דקות.
      3. השרה הרדמה על ידי הצבת העכבר בתא איזופלוראן עם קצב זרימת איזופלוראן של 4 אחוזים וקצב זרימת חמצן של 3.5 ליטר לדקה. וודא שהעכבר מורדם על ידי בדיקת קיבוע והיעדר רפלקס צביטת האצבע.
      4. העבר את העכבר המורדם על וילון ניתוחי סטרילי שמונח על כרית חימום מכרסמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הנח במהירות חרוט אף ושמור על הרדמה עם 1.5% איזופלוראן ו-98.5% חמצן. ודא שהעכבר נרדם על ידי אישור היעדר רפלקס צביטת האצבעות.
      5. ודאו שהעכבר נשאר מורדם לאורך כל ההליך על ידי אישור היעדר רפלקס צביטת האצבעות כל 15 דקות. עקבו אחרי קצב הנשימה של העכבר במהלך ההרדמה כדי לוודא שהוא איטי וחלק. אם קצב הנשימה משתנה, התאימו את מינון האיזופלורן. אם העכבר מציג נשימה קשה או נשימות, הפחיתו את המינון. לעומת זאת, אם העכבר מציג קצב נשימה מוגבר, יש להעלות מעט את מינון האיזופלורן.
         הערה: הימנע מהשארת העכבר תחת הרדמה ליותר מ-40 דקות. כדי להשיג זאת, חשוב להיות יעיל ומהיר במהלך ההליך.
      6. מקם את העכבר בצד שבו תאי סרטן השחלה אמורים להיות מושתלים בתוך המקורה, פונים כלפי מעלה כפי שמוצג באיור 2B.
      7. מרחו משחת עיניים על שתי עיני העכבר כדי להגן עליהן מהתייבשות (ייבוש הקרנית).
      8. אם לעכבר יש פרווה, גלח את השיער בחלק התחתון של העכבר בצד הפונה כלפי מעלה. נקה את האזור המגולח כמו שצריך והניח את העכבר על כרית סטרילית חדשה. אם עובדים עם Foxn1 עירום (B6. זן עכבר Cg-Foxn1 nu/J, דלג על השלב הזה.
      9. השתמש בכיסוי כירורגי סטרילי כדי לכסות את העכבר כך שרק החלק התחתון של גופו ייחשף.
      10. שטוף ידיים כראוי עם סבון לפני תחילת הניתוח ולבש זוג כפפות ניתוח סטריליות חדשות. הימנעו מלגעת באזורים או פריטים שאינם סטריליים לאחר שימוש בכפפות כירורגיות.
      11. השתמשו במפעיל כותנה סטרילי כדי למרוח נוזל בטאדין באתר הניתוח בתנועה מעגלית עם כיוון השעון מבפנים החוצה. לאחר מכן, השתמש במנגון אלכוהול סטרילי כדי לנקות את אותו אזור בצורה דומה. חזור על ההליך הזה עוד פעמיים.
          הערה: אין לגעת בפריטים או אזורים לא סטריליים במהלך הניתוח. החלפת כפפות מיד אם יש מגע עם משטח לא סטרילי. מומלץ מאוד שיהיה לך אדם נוסף שיעזור בעת ביצוע הזרקה תוך-בורסלית. אדם זה יכול לעזור בטיפול בפריטים לא סטריליים במהלך הניתוח.
      12. חכה דקה עד שהאלכוהול יתייבש.
      13. מצא את האתר שנמצא כ-1.5 ס"מ מעל הרגל האחורית וכ-5 מ"מ מהצלעות של העכבר, כפי שמוצג באיור 2B. הרם את העור במקום זה עם מלקחיים מעוקלים, ואז בצע חתך אנכי של 5 מ"מ עם מספריים עם קצה דק.
          הערה: לפני ביצוע החתך, ודאו שהעכבר תחת השפעת הרדמה לחלוטין על ידי אישור היעדר רפלקס הצביטה של האצבע.
      14. החזק את העור מצד אחד עם מיקרופוספס דק ובצע חתך ברקמה התת-עורית באותו מקום.
      15. בשלב זה, השכבה הפריטונאלית מתחת לרקמה התת-עורית תהפוך לנראית. השתמשו במלקחיים דקים, מעוקלים ומשוננים כדי להחזיק את שכבת הפריטונאלית, וצרו חתך באורך של כ-2.5 מ"מ עם מספריים עם קצה דק.
      16. החזק את צד החתך הפריטונאלי עם המלקחיים המשוננים ומצא את כרית השומן של השחלה באמצעות מלקחיים דקים. השחלה ממוקמת מתחת לרפוד השומן.
      17. משכי בעדינות מעט מכרית השומן של השחלה יחד עם השחלה דרך החתך.
      18. השתמשו במלקחיים לניתוח כדי להחזיק את כרית השומן כך שהשחלה תהיה פונה כלפי מעלה ואינה זזה.
          הערה: אל תחזיק את השחלה עם מלקחיים. תמיד השתמש במלקחיים משוננים כדי להחזיק את כרית השומן כי הרקמה חלקה.
      19. בקש מהאדם המסייע להכין את המזרק המכיל את תליית התא. מומלץ להשתמש במזרק אינסולין בנפח 0.3 מ"ל.
      20. הכנס בעדינות את המחט כשהזדעזוע פונה כלפי מעלה אל בורסה השחלה מהמפגש בין החצוצרה לשחלה. ודא שכל הזיועה נכנס לתוך הבורסה לפני שלוחצים על הבוכנה.
          הערה: יש להיזהר לא לנקב את הבורסה בקצה הנגדי של אתר ההכנסה.
      21. דחוף בעדינות את הבוכנה והעבר את תכולת המזרק לבורסה השחלתית. הסר את המחט במהירות.
      22. נפיחות הבורסה שמקיפה את השחלה מעידה על חיסון מוצלח של תאים.
      23. המתינו 5 שניות והחזרו בעדינות את השחלה לחלל הפריטונאלי.
      24. סגור את הפריטונאום באמצעות תפר מונופילמנט נספג בקוטר 6-0 עם תפר כירורגי קטוע אחד או שניים.
      25. סגור את חתך העור באמצעות תפר מונופילמנט נספג 6-0 עם תפר כירורגי פשוט ורצה. ודא שאין דימום מאזור החתך.
      26. מרחו משחה אנטיביוטית משולשת (Bacitracin, Neomyצין ופולימיקסין B) באתר החתך לאחר סגירתה.
      27. נתנו קרפרופן 15 מ"ג/ק"ג תת-עורית לעכבר להקלה על הכאב.
      28. תייג את העכבר באוזן בשיטה מועדפת. תיוג האוזניים יאפשר זיהוי העכבר שהוזרק מאוחר יותר.
      29. העבר את העכבר לכלוב חדש. הניחו את הכלוב עם חצי על כרית חימום למשך לפחות 60 דקות. ודא שהשפעת ההרדמה כבר חלפה לחלוטין עד אז, והעכבר ער ופעיל.
          הערה: עכברים נוטים להיפותרמיה תחת הרדמה. לכן, חשוב לספק חום חיצוני כדי לווסת את טמפרטורת הגוף.
      30. בדקו את העכברים לאחר 4-5 שעות לאחר הניתוח לסימנים לדימום מאזור החתך או אי נוחות אחרת.
      31. תנו לעכברים קרפרופן 15 מ"ג/ק"ג תת-עורית כל 24 שעות במשך 3 הימים הקרובים.
      32. אם התאים המושחנים מהונדסים גנטית לביטוי יציב של לוסיפראז, ניתן למדוד את נטל הגידול באמצעות IVIS מהיום הראשון לאחר ההזרקה כפי שמתואר בסעיף 3.

3. הדמיה לא פולשנית של גידול עכבר באמצעות מערכת ההדמיה In Vivo (IVIS)

מטרה חשובה במספר מחקרים המשתמשים במודלים הגידולים הניתנים להשתלה המתוארים בדוח זה היא לקבל נתונים לאורך זמן על התקדמות הגידול. בעוד שניתן להעריך את נפח הגידולים התת-עוריים באמצעות קליפר ורנייה, זו אינה אפשרות ישימה לגידולים שנוצרו באמצעות מודלים תוך-הצפקיים והתוך-בורסליים. כדי להתגבר על אתגר זה ולקבוע את עומס הגידול התוך-פריטוניאלי, רוב המעבדות משתמשות בהדמיית ביולומינסציה לא פולשנית מבוססת לוסיפראז. כדי לאפשר זאת, תאי סרטן שהושתלו מהונדסים לבטא לוסיפראז באופן יציב, שמייצר ביולומינסציה לאחר מתן הסובסטרט D-לוסיפרין. ביולומינציה מתגלה באופן לא פולשני באמצעות מערכת הדמיה In Vivo (IVIS). אות זה מומדד לאחר מכן כדי לעקוב אחר עומס הגידול ולחשוף מידע על גרורות ויעילות תרופתית. להלן אנו מתארים את הפרוטוקול למעקב אחר עומס הגידול באמצעות הדמיה ביולוגית לא פולשנית מבוססת לוסיפראז עם IVIS בעכברים.

1. הכנת מצע D-luciferin
   1. הכינו תמיסת D-לוסיפרין של 15 מ"ג/מ"ל ב-1X PBS (pH 7.4) בתנאים סטריליים.
   2. חיטא את התמיסה באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון.
   3. עטוף את התמיסה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מהאור עד השימוש.
2. אתחול מדלם IVIS לרכישת תמונה
   1. פתח את תוכנת "תמונה חיה" במחשב שמחובר למצלמת IVIS והתחבר.
   2. יש לאתחל את המצלמת לצורך רכישת תמונה. זה נעשה כך:
      1. עם התחברות, חלון בלוח הבקרה של IVIS ייפתח כפי שמוצג באיור 3A.
      2. לחץ על כפתור "אתחול" הממוקם בצד הימני התחתון של החלון (איור 3A). ייקח כמה דקות עד שהמערכת תתחיל.
         הערה: בתחילה, פס הטמפרטורה בתחתית החלון הופך לאדום, מה שמעיד שמצלמת ההדמיה בתהליך הגעה לטמפרטורת היעד שלה של -90°C (איור 3B).
      3. כאשר מצלמת ההדמיה מגיעה לטמפרטורת היעד (-90 מעלות צלזיוס), פס הטמפרטורה יהפוך לירוק, וסטטוס המערכת יופיע "מוכן לשימוש" (איור 3C). עכשיו המצלמת מוכן להדמיית העכבר.
         הערה: זמן החשיפה, ה-binning וה-f/stop ניתנים לכוונון בהתאם לדרישות המשתמש.
3. הכנת העכבר להדמיית IVIS
   לפני הדמיית העכבר, יש להזריק D-לוסיפרין תוך-פריטוני.
   1. הוציאו את העכבר מהכלוב והניחו אותו על משטח מחוספס או מחובר. ללטף בעדינות את העכברים כדי לרסן אותם כראוי כפי שמתואר בסעיף 2.1.
   2. הרימו את העכבר וסובבו כך שהצד התחתון שלו פונה כלפי מעלה.
      הערה: אם העכבר כבול כראוי, כל ארבע הרגליים יימתחו החוצה בעת ההרמה כפי שמוצג באיור 1B. החזק את הזנב בין האצבעות כאמצעי איפוק נוסף במהלך ההליך.
   3. השתמשו במטוס אלכוהול סטרילי לניקוי אתר ההזרקה כפי שמופיע בפרוטוקול ההזרקה התוך-פריטוניאלי בסעיף 2.1.
   4. השתמשו במזרק TB של 1 מ"ל ומחט בגודל 30G, חצי אינץ' כדי להזריק תוך-פריטונית נפח מתאים של D-luciferin מהתמיסה המקורית ולהשיג מינון סופי של 150 מ"ג/ק"ג D-לוסיפרין.
      הערה: יש לעיין בפרוטוקול הזרקה תוך-פריטוניאלית בסעיף 2.1 לקבלת הוראות כיצד לבצע הזרקה תוך-פריטוניאלית. אם משתמשים בעכברים C57BL/6 (למודלים של אלוגרפט סינגני), מומלץ מאוד להסיר את הפרווה לפני ביצוע הדמיה ביולוגית באמצעות IVIS. פרווה שחורה ועור פיגמנטלי מחלישים משמעותית את האור, ומפחיתים את עוצמת האות.
   5. החזיר את העכבר בעדינות לכלוב. זמן ההמתנה והחשיפה המדויקים יצטרכו להיקבע אמפירית. ניתן לקבוע זאת כך.
      1. הרדימו את העכבר מיד לאחר הזרקת D-luciferin וצילמו אותו כפי שמתואר בסעיף 3.4 כל 2 דקות למשך 20 דקות.
         הערה: כאשר מבצעים ניסוי זה לראשונה, מומלץ לבדוק כיצד אות הלוציפראז משתנה לאורך זמן לאחר מתן D-לוסיפרין. זה יעזור לקבוע את הזמן המתאים ביותר לצלם את העכבר לאחר מתן D-לוסיפרין בניסויים הבאים. אות הביולומינסנטי יכול להשתנות בהתאם למספר גורמים, כולל קו התאים, מודל הזנוגרפט של העכברים, רמת ביטוי הלוציפראז ועוד.
      2. בכל אינטרוול קחו אקספורות של 5, 10 ו-15 שניות.
      3. השתמש בנתונים אלה כדי לשרטט עקומה סטנדרטית. בהתבסס על העקומה, בחר את זמן ההמתנה והחשיפה שבהם האות מגיע לפלטו תוך שמירה על העוצמה הגבוהה ביותר.
         הערה: בדרך כלל הזמן הזה הוא בין 5–10 דקות, אך יכול להשתנות בהתאם לדגם.
4. הדמיה לא פולשנית של גידולי עכבר באמצעות IVIS
   1. לאחר תקופת ההמתנה, מניחים את העכבר בתא איזופלוראן עם קצב איזופלוראן של 4% וקצב זרימה של 3.5 חמצן.
   2. ודא שהעכבר מורדם על ידי בדיקת היעדר רפלקס הצביטה של האצבע.
   3. הנח את העכבר על הבמה בתוך מדלמת IVIS והחליק את אפו לתוך חרוט האף לתחזוקת ההרדמה במהלך ההדמיה. תוודא שהם נשארים בתוך הקווים המסומנים של פוקוס המצלמה וסגור את דלת הצילום.
      הערה: יהיו חמש עמדות על הבמה בתוך המצלמה. לכל תנוחה יהיו גם חרוטי אף הרדמה משלה. זה מאפשר הדמיה של 5 עכברים בו-זמנית. בהתאם למספר העכברים לתמונה, כוון את שדה הראייה של המצלמה בתיבת הבקרה מ-"D" (שדה רחב יותר) ל-"A" (פוקוס צר). ניתן למקם את העכבר בכל מקום על הבמה בתנאי שהאף שלו נשמר בתוך קונוסי האף של ההרדמה לאורך כל תקופת ההדמיה. מומלץ לצלם את העכברים ברצף תחילה בצידי הגב שלהם ואחר כך בצדדים התחתונים.
   4. כוון את זמן החשיפה ולחץ על "רכוש" בלוח הבקרה (איור 3C).
      הערה: ודא שהזוהר, הצילום והשכבה "דלוקים" בלוח הבקרה.
      לאחר שהתמונה נלכדה, תמונת העכבר עם אות הלוציפראז תופיע על המסך.
   5. פתח את המצלמה וסובב את העכבר כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה ולחץ על "רכוש" אחרי סגירת דלת המצלמה.
      הערה: ודא שהאף של העכבר נמצא בתוך קונוס האף כדי להבטיח תחזוקת הרדמה במהלך ההדמיה.
   6. לאחר שצילמו תמונות גם בגב וגם בבטן, פתחו את דלת המצלמה והחזירו את העכבר לכלוב.
   7. חכו 5-10 דקות כדי לוודא שהעכבר מתעורר.
5. ניתוח תמונת IVIS לקביעת עומס הגידול בעכבר
   1. התאמת סולם הצבעים של התמונות
      1. שמור את התמונות הגולמיות בתיקייה המתאימה על ידי לחיצה על "קובץ" ואחריו "שמור כ".
         הערה: המצלמת מתאימה אוטומטית את סולם הצבעים בהתאם לעוצמת האות. מומלץ לשמור על קנה המידה הצבעוני קבוע בכל התמונות שצולמו במהלך הניסוי. ניתן גם לכוונן את קנה המידה של הצבעים מאוחר יותר על ידי פתיחת התמונה הגולמית באמצעות תוכנה זו.
      2. לכיוון ידני, חלון נוסף בפלטת הכלים קופץ בפינה הימנית העליונה של המסך (איור 3D), לך ל"התאמת תמונה" ואז בחר "ידני" לגודל המדידה. הזן את המספר המינימלי והמקסימלי הרצוי לערך הסולם ולחץ על "הזן" (איור 3E).
         הערה: בעת התאמת סולם הצבע של תמונה שנרכשה קודם, תחילה פתח את קובץ התמונה הגולמי infoclick.txt השמור מהתיקייה המתאימה באמצעות "file" ואחריו "open".
         3.5.1.3. שמור תמונה זו בנפרד מהתמונה הגולמית בתיקייה המתאימה.
   2. ניתוח עומס הגידול בעכבר
      הערה: למדידה כמותית של עומס הגידול, ניתן למדוד את עוצמת האות של כל עכבר בתמונות שצולמו לאורך כל התקופה. אתה יכול למקם את הערכים האלה ב-Excel או GraphPad Prism לניתוח סטטיסטי וליצירת גרפים קוויים של התקדמות הגידול.
      1. פתח את קובץ infoclick.txt הגולמי השמור מהתיקייה המתאימה.
      2. עבור לאזור ה-ROI (אזור עניין) בחלון פלטת הכלים שמופיע בפינה הימנית העליונה (איור 3F).
      3. צייר את אזור ה-ROI בכל עכבר ידנית או אוטומטית בעזרת פונקציית "ציור" בכל צורה שמתאימה לך. כדי לעשות זאת ידנית, שמור על אחידות האזור לכל התמונות בכל העכברים שמושווים.
         הערה: לחיסון תוך-פריטוניאלי, בחירה ידנית של ה-ROI לכל החזה והבטן בתמונה הגחונית של העכבר עובדת הכי טוב. לחיסון תוך-בורסל, בחירה ידנית של ה-ROI באזור התמונה הגבית עם האות היא הטובה ביותר.
         הערה: בחירת ROI אוטומטית תבחר רק אזורים עם עוצמת אות תמונה גבוהה יותר.
      4. לחץ על "מדידת ROI" (איור 3F). זה יפתח חלון נוסף עם נתונים על הסך הכולל והממוצע של כל ROI שנבחר.
      5. שמור את הקובץ הזה בתיקייה המתאימה כדי שניתן יהיה לגשת אליו מאוחר יותר. השתמש בנתונים אלה כדי לשרטט את הגרף ב-MS Excel או ב-GraphPad Prism.

תוצאות

נתונים מייצגים ממודל סרטן שחלות תוך-פריטונאלי המשתמש בתאי OVCAR8 עם תויג לוסיפראז בעכברים עירומים מסוג Foxn1 עם מערכת חיסון מוחלשת מוצגים באיור 4. ביטוי לוסיפראז יציב בתאים אלו אפשר ניטור אורך של התקדמות הגידול באמצעות הדמיה ביולומינצנטית לא פולשנית באמצעות מדם IVIS כפי שמתואר בסעיף III. הזרקה תוך-פריטונלית של 5 מיליון תאי OVCAR8-לוסיפראז לעכברי Foxn1 עירומים הובילה להקמת גידולים גרורתיים בחלל הפריטונאלי עם קצב קליטה של 100 אחוז (איור 4<...

דיון

היכולת לחקות אינטראקציות מורכבות בין תאי גידול, מיקרוסביבה וגורמים מערכתיים הופכת מודלים של עכברים למשאב מצוין לחקר התקדמות סרטן השחלות¹². בנוסף לקידום הבנתנו את הגורמים המניעים את התקדמות סרטן השחלה והגרורות, מודלים של עכברים ב-in vivo ממלאים תפקיד חשוב גם בהערכה טרום-קלינית של מולקולות קטנות ובאסטרטגיות טיפול בסרטן שחלות גרורתי^12,15. בהתחשב ביתרונות אלו, פותחו מספר מודלים של עכברים בגוף כדי לחקור סרטן שח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פילטר סטרילי של 0.22 אמ"מ עם מזרק, 33 מ"מ	פישר סיינטיפיק	09-720-004
מזרק TB של 1 מ"ל	BD	309659
21G, מחט 1 אינץ'	BD	305167
30G, ו-frac12; מחט אינץ'	BD	305106
מלקחיים דקים מעוקלים בקוטר 5 אינץ'	פישר סיינטיפיק	1631
תפר מונופילמנט נספג 6-0	MaxonTM	6532-11
מטוש אלכוהול (70% איזופרוליל אלכוהול)	דוקל קורפ	80003156
בטדין (תמיסת יוד 1%)	מוצרי פרדו	367618150085
קרפרופן אינג', 50 מ"ג/מ"ל	לבאפן	RXLEVA50-20INJ
צנטריפוגה	אפנדורף	5702
ד-לוסיפרין	מעבדות סיד	MB000102-R70170
ניתוח מיקרופוספסים של צורף, קצה עדין	פישר סיינטיפיק	08-953E
משחת עיניים	מדווט	11897
מספריים עם קצה דק	פישר סיינטיפיק	8940
כרית חימום	סאן-ביים	731-500
כלים לניתוח מלקחיים עם נקודות עדינות	פישר סיינטיפיק	S08096
מזרק אינסולין 3/10 מ"ל	BD	328438
איזופוראן	פלוריסו	Fluriso250
IVIS	פרקין אלמר	IVISLMIII
מאיו- מחזיק המחט הישר של הגר	פישר סיינטיפיק	08-966
PBS סטרילי 1X, ללא סידן ומגנזיום	קורנינג	21-040-CV
אפליקטורים עם קצה כותנה סטרילית	מקיסון	24-106-1S
מסילה סטרילית	קנדל	3033
פד/מגבת/וילון סטרילי, לא עם רצות	הנרי-שיין	100-9687
משחה אנטיביוטית משולשת	גלוב	4006-4SL
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום	גיבקו	25200-056