במחקר זה, באמצעות השוואה של תוצאות הגילוי של 24 תרחיפים חיידקיים של Helicobacter pylori (H. pylori) שהושגו באמצעות שיטות לגילוי אנטיגנים ו-digital PCR, ניתחנו את המתאמים ביניהם כדי לבחון את חשיבותם באפיון של חומרי ייחוס של H. pylori ובהערכה אבחנתית in vitro.
מאמר מחקר
מתאם בין תיתור נוגדנים ל- H. pylori לבין כימות באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית: הערכה אנליטית של בידודים מוכתבים ומנוטרלים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הסטנדרטיזציה של אבחון Helicobacter pylori (H. pylori) נותרת מאתגרת במגוון בדיקות זיהוי שונות. אימונוכרומטוגרפיה מזהה אנטיגנים ספציפיים ל-H. pylori אך מספקת תוצאות איכותיות בלבד, שהן רגישות להפרעות מחלבונים בקטריאליים מסיסים שאינם המטרה, באמצעות קישור לא ספציפי או עיכוב תחרותי. לעומת זאת, dPCR (digital PCR) מאפשר כימות מדויק של עותקי DNA גנומי, תוך זיהוי חיידקים חיים ולא חיים כאחד. מחקר זה השווה בין תיתרים של נקודת סיום שהתקבלו באימונוכרומטוגרפיה (ערכים חצי-כמותיים שחושבו כהופכי של הדילול הסדרתי הכפול הגבוה ביותר שניתן לזיהוי) לבין מספר עותקי חומצות גרעין שכומו ב-dPCR. עשרים וארבעה תרחיפי חיידקי H. pylori, שגודלו במשך 72 h בטמפרטורה של 37 °C על מצע Brucella agar בתוספת 5% דם כבשים ללא פיברין בתנאי מיקרו-ארוביליות (85% N2, 10% CO2, 5% O2), הועמדו לבדיקת אנטיגן ומדידת dPCR במקביל. לצורך הערכה סטטיסטית הוחלו מתאם פירסון ורגרסיה ליניארית. צפינו מתאם חיובי מובהק בין תיתר האנטיגן לבין מספר העותקים הגנומיים (r = 0.536, n = 24, P = 0.007). עם זאת, מקדם הדטרמינציה הנמוך (R2 = 0.287) הדגים כושר ניבוי מוגבל, שכן תיתר האנטיגן הסביר רק 29% מהשונות שנמדדה ב-dPCR ואינו יכול לתמוך בניבוי חסון של דגימה בודדת. פרופילים שאינם תואמים של dPCR גבוה/תיתר נמוך עשויים לנבוע משאריות בקטריאליות שאינן חיות או מ-DNA גנומי חופשי. בדיקות מבוססות אנטיגן ובדיקות מבוססות חומצות גרעין מכמתות אנליטים הקשורים ביולוגית אך אינם ניתנים להחלפה. מאפיינים רב-פרמטריים המשלבים יחידות יוצרות מושבות, תיתרי אנטיגן ומספרי עותקי גנום מוצעים לפיתוח חומרי ייחוס ותיקוף של בדיקות אבחנתיות. עבודה זו מדגישה את הצורך בהנחיות קונסנזוס ספציפיות ל-H. pylori כדי לפתור סתירות אבחנתיות.
מבוא
Helicobacter pylori (H. pylori) הוא בציליל גרם-שלילי מיקרו-אווירופילי המקבל נפוצה במערכת העיכול האנושית, ובמיוחד באנטרום של הקיבה. הוא מהווה את הגורם העיקרי לגסטריטיס כרונית, כיבים פפטיים וסרטן הקיבה1,2. העברה של H. pylori בין בני אדם מתרחשת בעיקר דרך נתיב הפה-פה או הצואה-פה, והוא נפוץ ברחבי העולם, כאשר שיעורי הזיהום משתנים בין אזורים שונים. במדינות מפותחות, שיעור הזיהום הוא כ-50%, בעוד שבמדינות מתפתחות מסוימות הוא יכול להגיע עד 80%3. בשנת 1994, ארגון הבריאות העולמי (WHO) סיווג את H. pylori כחומר מסרטן מקבוצה 1 עבור סרטן הקיבה4. גורמי virulentness מרכזיים כגון CagA (cytotoxin-associated antigen A) ו-VacA (vacuolating cytotoxin A) מניעים דלקת כרונית ונזק אפיתליאלי, ותורמים למנגנונים הפתוגניים העומדים בבסיס סיווגו כחומר מסרטן מקבוצה 1. בשנת 2018, מספר מקרי הסרטן המיוחסים לזיהום ב-H. pylori הגיע ל-810,000, ובכך עקף את מספר המקרים המצטבר של סרטן צוואר הרחם וסרטן הכבד הנגרמים על ידי נגיף הפפילומה האנושי (HPV), נגיף ההפטיטיס B (HBV) ונגיף ההפטיטיס C (HCV)5. נתון זה מדגיש את הסיכון המשמעותי לסרטן המהווה H. pylori, אשר אם לא יטופל, עלול להוביל לסרטן הקיבה בהסתברות של כ-1%–3% על פי חלק מהמחקרים. השכיחות העולמית הגבוהה של זיהום ב-H. pylori הופכת את הדיוק בכימות — ולא רק בגילוי — לעדיפות של בריאות הציבור, שכן הערכה מדויקת של העומס החיידקי יכולה להנחות החלטות טיפוליות ולסייע במניעת טיפולי מיגור מיותרים או כושלים. לפיכך, גילוי וכימות מדויקים של H. pylori הם בעלי חשיבות רבה למחקרי אפידמיולוגיה, לבחירת תוכניות טיפול ולהערכת היעילות הטיפולית.
בהינתן נטל הסרטן המשמעותי המיוחס ל- H. pylori, גילוי וכמות מדויקים הם קריטיים למעקב אפידמיולוגי, לבחירת טיפול ולניטור טיפולי. השיטות הלא-פולשניות הנוכחיות כוללות את בדיקת אנטיגן בצואה (SAT), בדיקת נשיפה לאוריאה ובדיקות מולקולריות. בעוד ש-digital PCR (dPCR) מציעה דיוק גבוה וכמותית מוחלטת, יישומה הקליני מוגבל בשל עלות גבוהה יותר, מורכבות טכנית ודרישות לציוד בהשוואה ל-SAT. פער זה הוא הסיבה לכך שיש לבחון את המתאם בין שתי השיטות, במטרה לשפר את הסטנדרטיזציה של ה-SAT תוך שימוש ב-dPCR כייחוס כמותי.
PCR דיגיטלי (dPCR), טכנולוגיה מתהווה לכימות מוחלט, יכולה לזהות באופן ישיר את מספר העותקים המוחלט של גנים מטרתים ללא הסתמכות על עקומת סטנדרט. במחקר על H. pylori, dPCR שימש לכימות חיידקים ברירית הקיבה, ברוק ובדגימות צואה6,7.
בפיתוח, בהערכת איכות ובבקרת ריאגנטים לאבחון in vitro, הכנה וכיול של חומרי ייחוס הם חיוניים להבטחת הדיוק, ההשוואתיות והעקיבות של התוצאות. עבור ריאגנטים לאבחון in vitro של חיידקים (כגון ריאגנטים לגילוי אנטיגן/נוגדן של H. pylori), חומרי ייחוס צריכים להכיל לעיתים קרובות זנים או דגימות קליניות עם ריכוזים או יחידות פעילות מוגדרים היטב. שיטת הכמות החיידקית המסורתית היא יחידות יוצרות מושבה (CFU/mL), המשקפת באופן ישיר את מספר החיידקים החיים בעלי יכולת התרבות, ומשמשת לעיתים קרובות לקביעת ערך של חומרים סטנדרטיים חיידקיים, להערכת רגישות של ריאגנטים ולהשוואה מתודולוגית8. למרות ש-CFU עדיין נמצא בשימוש נרחב, יש לו מגבלות ברורות מבחינת זמן הגילוי, צריכת החומרים ועלויות העבודה9.
עם השימוש הנרחב יותר בטכנולוגיות אבחון in vitro, שיטות מולקולריות כגון dPCR מאפשרות כיום לכמת פתוגנים בדיוק וברגישות גבוהים יותר. במקביל, שיטות אימונולוגיות כגון טיטרציה של אנטיגנים מיושמות יותר ויותר בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, בפעולות מעשיות, מרבית הבידודים הקליניים שנאספו או הדגימות הסטנדרטיות שהוכנו הן דגימות שהושבתו או דגימות שנשמרו לטווח ארוך, מה שהופך את ביצוע תרביות חיידקים חיים וספירת CFU לקשים או בלתי אפשריים10. בעת הכנת חומרי ייחוס, כדי לעמוד בדרישות בטיחות ביולוגית ולהבטיח את יציבותם של החומרים לטווח ארוך, יש לבצע השבתה. לפיכך, שיטות כמותיות המבוססות על אנטיגנים או חומצות גרעין הופכות לאמצעים חיוניים לקביעת ערך8,11.
מכאן עולה שאלה מעשית בנוגע למתאם ולשקילות בין שתי גישות כמותיות נבדלות אלו: כאשר משתמשים בזיהוי אנטיגן וב-dPCR להערכת חומרים סטנדרטיים, האם קיים קשר יציב וכמותי בין תוצאות שתי השיטות הללו? ניסויים ראשוניים שבוצעו על קבוצה מוגבלת של דגימות H. pylori מנוטרלות הדגימו מתאם חיובי עקבי בין עוצמת האות של בדיקות אימונוכרומטוגרפיות לבין מספר עותקי ה-DNA שנמדד באמצעות dPCR. שיערנו כי קיים מתאם חיובי משמעותי ועקבי בין תיתור אנטיגן של H. pylori, כפי שנמדד בבדיקות אימונוכרומטוגרפיות, לבין מספר עותקי ה-DNA, כפי שנמדד ב-dPCR, בדגימות חיידקים מנוטרלות. אם מתאם כזה קיים, הוא יאפשר המרה של תוצאות איכותניות המבוססות על אנטיגן למקבילים כמותיים של חומצות גרעין. דבר זה יספק בסיס חשוב להערכת ביצועי ריאגנטים, קביעת סטנדרטים, הגדרת חומרי ייחוס ופרשנות של תוצאות בדיקות קליניות במקרים שבהם תרבית מסורתית אינה khảה.
כיום, המחקר על הקשר בין תוצאות אנטיגן של H. pylori לבין תכולת חומצות הגרעין אינו מספק, וחסרים נתונים מערכתיים התומכים בעבודות ביקורת, רגולציה וסטנדרטיזציה. כדי לבחון השערה זו, מחקר זה ביצע בדיקות מקבילות ל-24 תרחישי חיידקים מתורגבים של H. pylori, במטרה לנתח באופן מערכתי את המתאם בין תיתור האנטיגן שזוהה בשיטה של כרומטוגרפיה אימונולוגית קולואידית לבין התוצאה הכמותית מוחלטת של dPCR. בהתבסס על ממצאינו, הגשנו המלצות לגבי הערכת הביצועים של ריאגנטים לזיהוי H. pylori וקביעת ערכים לחומרי סטנדרט.
פרוטוקול
כל בידודי ה-Helicobacter pylori שנכללו במחקר זה בודדו במקור מדגימות ביופסיה של קיבה וצואה מאנשים על ידי בית החולים המסופח החמישי של אוניברסיטת Zhengzhou, אשר סיפק תרחיפים בקטריאליים מעובדים ואנונימיים עבור ניסויי ה-in vitro שלנו. כל ההליכים המקוריים (איסוף דגימות קליניות, בידוד בקטריאלי והקפאה ראשונית) אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסופח החמישי של אוניברסיטת Zhengzhou (מספר אישור אתי: KY2026080). הסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימות, וכל ההליכים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי ולהנחיות האתיקה הלאומיות הרלוונטיות למחקר ביו-רפואי. כל מידע המאפשר זיהוי מטופלים הוסר לצמיתות על ידי בית החולים המקור לפני העברת הדגימות, ולא ניתן להסיק את זהותו של אף מטופל מהחומרים הניסויים או מהתוצאות המדווחות במחקר זה.
המחקר הנוכחי אינו דורש אישור אתי עצמאי נוסף או הסכמה מדעת. כל הניסויים כוללים אך ורק בדיקות in vitro תוך שימוש בתרחיפי חיידקים אנונימיים, ללא גישה לדגימות אנושיות מקוריות, לרשומות קליניות של מטופלים או למידע אישי פרטי. בהתאם לתקנות האתיקה הלאומיות למחקר ביו-רפואי, מחקר in vitro שאינו התערבותי המשתמש באיזולטים מיקרוביאליים אנונימיים לחלוטין עומד בקריטריונים לפטור אתי. האישור האתי המקורי מבית החולים המסופח החמישי של אוניברסיטת Zhengzhou כבר מכסה את כל היישומים האקדמיים המשניים הלגיטימיים של זנים אנונימיים אלו, דבר שאושר רשמית על ידי ועדת האתיקה המוסדית.
הכל .H. pylori in vitro הניסויים בוצעו במעבדות בעלות הסמכת בטיחות ביולוגית בתוקף (רמת בטיחות ביולוגית 2, BSL-2, רישום בטיחות ביולוגית במעבדות של ועדת הבריאות של מחוז דונגצ'נג בבייג'ינג [2020] מס' 059), בהתאם לנוהלי העבודה הסטנדרטיים של המוסד ובמענה לכל דרישות הבחינה והאישור של הבטיחות הביולוגית. אישור הבטיחות הביולוגית למחקר זה כולל את כל הפרוצדורות המערבות את ה-heat-inactivated .H. pylori חומר, כולל עבודה עם חומר שאינו מעוכב באופן מלא (כלומר, המכיל אורגניזמים חיוניים שיוריים כפי שאופיינו באמצעות viability PCR). לאורך כל המחקר נשמר הקפדה יתרה על נהלי מיקרוביולוגיה סטנדרטיים, דרישות לציוד מגן אישי (PPE) ונהלי דה-קונטמינציה של פסולת. כל הדגימות הבקטריאליות עוכבו כראוי לפני השלכתן, בהתאם להנחיות המוסדיות לניהול פסולת ביו-סיכונית. פרטיהם של כל הרכיבים, הציוד והתוכנה ששימשה לניתוח סטטיסטי מפורטים ב- טבלת חומרים.
זן ותרבית
אזהרה: H. pylori הוא פתוגן אנושי מקבוצת סיכון 2. את כל פעולות העבודה עם תרביות חיות (הקלעה, דגירה והכנת סספנסיות) יש לבצע בתוך קבאלת בטיחות ביולוגית מאושרת במתקני BSL-2, תוך לבישת חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים.
השבתה תרמית ב-56 °C למשך 25 דקות מפחיתה באופן משמעותי אך אינה מסלקת לחלוטין אורגניזמים חיוניים (ראה סעיף 1); יש להמשיך לטפל בתמיהים שהושבתו חלקית תחת תנאי BSL-2. יש להעביר את כל הפסולת הביולוגית והמתכלים המזוהמים באוטוקלאב (121 °C, ≥30 דקות) או לחטא אותם בהתאם לנהלי הבטיחות הביולוגית המוסדיים לפני ההשלכה. העבודה תחת רמת בטיחות BSL-2 המתוארת כאן אושרה תחת אותה הגשה לבטיחות ביולוגית (Beijing Dongcheng District Health Commission Laboratory Biosafety Filing [2020] No. 059).
זני ה- Helicobacter pylori ששימשו במחקר זה היו 24 תרחיפי חיידקים שגודלו במעבדה, ואשר הופקו במקור מדגימות ביופסיה של קיבה אנושית ומדגימות צואה על ידי בית החולים המסוף החמישי של אוניברסיטת ז'נגז'ו, והועברו לאחר מכן בצורת תרחף חיידקים לאוסף הזנים של המחלקה לאבחון In Vitro של מחלות זיהומיות במכוני הבקרה הלאומיים לתרופות (NIDC), בבייג'ינג, סין. כל העבודה הניסויית במחקר זה בוצעה ב-NIDC (בייג'ינג, סין). זנים אלו הוחדרו לצלחות מצע Brucella בתוספת 5% דם כבשים ללא פיברין, וגודלו בתנאים מיקרו-אווירופיליים (85% N₂, 10% CO₂, 5% O₂) בטמפרטורה של 37 °C למשך 72 h. זמן תרבית זה תואם לשלב הצמיחה הסטציונרי, שבו ביטוי האנטיגן של כל זן הוא יציב יחסית. לאחר מכן נאספו תרחיפי החיידקים.
ביטול פעילות באמצעות חום בוצע באמצעות מקלח מים דיגיטלי בטמפרטורה של 56 °C למשך 25 דקות. טיפול זה נערך על מנת לעמוד בדרישות בטיחות ביולוגית ולהבטיח את היציבות לטווח ארוך של חומרי הייחוס. ביטול פעילות בחום ב-56 °C למשך 25 דקות מפחית באופן דרסטי את חיוניות החיידקים אך אינו מסלק לחלוטין את כל האורגניזמים החיים, כפי שאושר בניתוח PCR לבדיקת חיוניות שבוצע לאחר מכן, ומדד חלק חי שיורי חציוני של 4.6% (טווח של 0.00%–33.00%) בקרב 24 תרחיפי החיידקים שבושקו (ראו סעיף 6 בתוצאות ובדיון). האישור לבטיחות ביולוגית עבור מחקר זה מכסה עבודה עם חומר שאינו מנוטרל לחלוטין (ראו הצהרה על אתיקה ובטיחות ביולוגית). ההשפעה הפוטנציאלית של ביטול פעילות בחום על זיהוי אנטיגנים נחשבת למינימלית, שכן הטיפול התרמי הוא מתחת לסף הדנטורציה של רוב האנטיגנים שעל פני השטח של H. pylori; עם זאת, הוא עשוי להשפיע על השלמות של חלק מהאנטיגנים החלבוניים הרגישים לחום. לצורך כימות DNA, ביטול פעילות בחום אינו מפרק DNA גנומי ואף עשוי לשפר את יעילות המיצוי על ידי פירוק ממברנות התאים.
זיהוי אנטיגן
24 תרחיפי חיידקים שנאספו דוללו פי 100 ב-PBS להכנת דגימות לגילוי אנטיגן. דילול ראשוני של פי 100 מתאים את ריכוז האנטיגן לטווח הגילוי הליניארי של ערכות מסחריות וממזער הפרעות מטריקס, ובכך מבטיח תוצאות גילוי מהימנות ומדויקות. הדילול גם שומר על נפח הדגימה. דגימות אלו נבדקו באמצעות שמונה ערכות רשומות לגילוי אנטיגן של H. pylori (Table 1), כולל שיטת הזהב הקולואידי, שיטת הלטקס ושיטה אימונוכרומטוגרפית. אם התוצאה הייתה חיובית, הדגימה המדוללת עברה דילולים סדרתיים (1:2, 1:4, 1:8 וכו') ונבדקה עד שהתוצאה הייתה שלילית. יחס הדילול הגבוה ביותר שנותר חיובי תועד והוגדר כ"יחס הדילול החיובי הסופי של האנטיגן" (למשל, 1:64). הדילולים הסדרתיים פי שניים הוכנו בתוך תמיסת סליין עם בופר פוספט (PBS, 0.01 M, pH 7.2–7.4). לאחר יישום הדגימה, כל רצועה דגרה בטמפרטורת החדר למשך 15–20 min לפני הקריאה; התוצאה נקראה חזותית על ידי מפעיל מיומן אל מול קו הבקרה, ונקודת הסיום נרשמה כדילול הגבוה ביותר שהראה קו בדיקה גלוי. מכיוון שרצועות זהב קולואידי נקראות באופן חזותי, נקודת החיתוך תלויה במפעיל.
עבור כל דגימה שנבדקה באמצעות מספר ערכות מסחריות לזיהוי אנטיגנים, titer נקודת הסיום מוגדר כמדיאנ של כל ה-titers האינדיבידואליים של הערכות. מכיוון ששמונה הערכות במחקר זה תוכננו עם אנטיגנים למטרה ועקרונות זיהוי הטרוגניים, לא נעשה שימוש ב-Cohen's Kappa או ב-CV% כדי לכמת את העקביות בין הערכות, שכן מדדים אלו מניחים קיומו של סטנדרט ייחוס משותף. לפיכך, השונות שנצפתה בין הערכות משקפת הטרוגניות ביולוגית ואנליטית אמיתית ולא שגיאות מדידה. המדיאנ, כמידה חסונה של נטייה מרכזית, יכול להתנגד ביעילות לסטיות ספציפיות לערכה. בקרב 24 הדגימות, הפיזור בתוך הדגימה בין ה-titers הגבוהים ביותר לנמוכים ביותר של הערכות נע בין פי 2 לפי 16 (מדיאנ, פי 4): שש דגימות נבדלו בפי 2, ארבע עשרה בפי 4, שלוש בפי 8, ואחת בפי 16 בין הערכות. ה-titers המינימליים, המדיאנ והמקסימליים לכל ערכה עבור כל דגימה מפורטים ב-Supplementary Table 1.
גילוי כמותי באמצעות Digital PCR
24 התלייה הבקטריאליות שנאספו עברו דילול של 500-פעמים ב-PBS ולאחר מכן שימשו כדגימות לזיהוי כמותי ב-dPCR. כימות מוחלט של דגימות מדוללות אלו בוצע על ידי ארבע מעבדות dPCR (Table 2). ה-dPCR בוצע באמצעות סטים של פריימרים ופרובים קנייניים הספציפיים לפלטפורמה, המכוונים לרצפי גנום שמורים של H. pylori. ערכות הזיהוי של ה-dPCR ששימשו במחקר זה הן ערכות ריאגנטים אוניברסליות הישימות למספר פתוגנים ומספר מטרות. כל פלטפורמה תכננה ואופטימיזציה באופן עצמאי של רצפי הפריימר/פרוב הספציפיים ואת אזורי הגן המטרה, המהווים את הקניין הרוחני הליב שלה. רצפים אלו לא נחשפו למשתמשי הקצה. קיבלנו מידע בלבד כי מטרה הספציפית לזיהוי H. pylori היא אזור גנומי שמור שהוכח כבעל יכולת זיהוי ספציפית. רצפי גן 23S rRNA של 24 זני Helicobacter pylori הוגשו ל-NCBI GenBank תחת מספר גישה של BioProject PRJNA1520048. רצפים אלו הוגשו לצורך אישור זהות הזן ואינם מהווים את מטרת הכימות של ה-dPCR. מכיוון שתכנון הפריימר/פרוב, הכימיה של ההגברה וספירת המחיצות המבוססת על התפלגות פואסון הן קנייניות של כל פלטפורמה, שלבים אלו תלויים בפלטפורמה ולא ניתן לשחזרם ללא גישה של היצרן; לעומת זאת, הדילול של הדגימות, שחזור האקסטרקציה ונהלי אגרגציית הנתונים המתוארים לעיל הם בלתי תלויים בפלטפורמה ומפורטים במלואם. מספר עותקים מוחלט חושב באמצעות אלגוריתם התפלגות פואסון המוטמע בתוכנת הניתוח הקניינית של המכשיר. הפרמטרים החישובים הספציפיים וקוד המקור הם קנייניים של היצרן ולא נחשפו למשתמשי הקצה. לבסוף, מספר העותקים המוחלט (copies/mL) של הגן המטרה בתמיסה המקורית חושב על בסיס התפלגות פואסון ומקדם הדילול.
ארבע מעבדות dPCR עצמאיות (Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., Ustar Biotechnologies Ltd., ו-TargetingOne) השתתפו במחקר זה, כאשר כל אחת השתמשה בערכות הפקת חומצות גרעין ובריאגנטים ל-dPCR קנייניים שעברו אופטימיזציה עבור פלטפורמת המכשיר שלה, כאשר כולן התמקדו ברצפים גנומיים שמורים של H. pylori. כל פלטפורמה קיבלה את תרחיף החיידקים ללא דילול והכינה דגימות בהתאם לפרוטוקול שלה: Ustar השתמשה בתרחיף ללא הדילול באופן ישיר, בעוד ש-Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., ו-TargetingOne דיללו אותו פי 500 ב-PBS לפני ההפקה. עבור כל בידוד בכל פלטפורמה, בוצעו שתי הפקות עצמאיות של חומצה גרעינית מאותו תרחיף חיידקים מדולל פי 500, וכל תמצית נבדקה בשלוש חזרות, מה שהניב שש מדידות לכל בידוד לכל פלטפורמה (חריג אחד ב-Ustar שבו הפקה אחת הניבה רק שתי חזרות תקפות). תגובה סווגה כבלתי תקפה והוצאה מהניסוי אם מספר הטיפות החיוביות היה נמוך מגבול הגילוי התחתון של המכשיר או אם בקרה ללא תבנית (no-template control) הראתה הגברה לא ספציפית; תגובות בלתי תקפות חזרו פעם אחת, וכישלונות מתמשכים הובילו להוצאה של כל התמצית. נתונים גולמיים ספציפיים לפלטפורמה מוצגים ב-Supplementary Table 1.
איסוף הנתונים בוצע באמצעות הליך דו-שלבי: ראשית, כל המדידות הגולמיות התקפות (copies/µL) בכל פלטפורמה נמוארו והומרו לריכוז המקורי של תרחיף החיידקים ללא דילול (copies/mL) באמצעות נוסחאות המרה ספציפיות לפלטפורמה; שנית, ארבעת הריכוזים שהתקבלו מהפלטפורמות עבור כל בידוד נמוארו (ממוצע חשבוני) כדי להניב את ערך מספר העותקים הסופי והיחיד. מסגרת זו מבטיחה תרומה שווה של כל פלטפורמה ללא קשר לשונות בין חזרות בתוך הפלטפורמה, ובמקביל מפחיתה הטיות שיטתיות הגלומות למכשירים בודדים או למערכות ריאגנטים.
כל תרחיף חיידקים שהותיר בתרבית נמדד במקביל בארבע פלטפורמות dPCR, ומקדם השונות (CV) של מספרי העותקים שעברו טרנספורמציה ללוג₁₀ בין הפלטפורמות חושב עבור כל בידוד כדי להעריך את השונות הבין-מעבדתית. התוצאות המתאימות מדווחות בפרק התוצאות.
ניתוח סטטיסטי
שער הנוגדנים לאנטיגן של H. pylori הוגדר כהופכי של גורם הדילול הגבוה ביותר של הדגימה שבו נצפה תוצאה חיובית (לדוגמה, דילול של 1:64 תואם לשער של 64). עבור כל בידוד, שמוני שערי האנטיגן הספציפיים לערכה אוגדו לפי החציונה שלהם, וארבעה ריכוזי dPCR הספציפיים לפלטפורמה אוגדו לפי הממוצע האריתמטי שלהם, כדי להפיק ערך נציג יחיד לכל בידוד עבור ניתוח קורלציה בהמשך. אסטרטגיה זו של צמצום נתונים מוצדקת מתודולוגית מכיוון ש: (i) שמונה ערכות האנטיגן מזהות את אותו אנליט באמצעות עקרונות סמימולוגיים (immunoassay) דומים, והחציון מספק מעריך חסון העמיד לקריאות חריגות מזדמנות; (ii) כל אחת מארבע פלטפורמות ה-dPCR מכמתה לוקוס גנומי שמר של H. pylori, והממוצע האריתמטי של הערכות ריכוז בעלות התפלגות לוג-נורמלית מניב נטייה מרכזית לא מוטה; ו-(iii) איחוד זה עולה בקנה אחד עם המטרה העיקרית של המחקר – הערכת ההתאמה בין שיטות כימות המבוססות על שער אנטיגן לבין שיטות המבוססות על DNA ברמת הבידוד – במקום להעריך ביצועים אנליטיים בין ערכות או בין פלטפורמות. הקורלציה בין שער האנטיגן לכימות ה-dPCR (copies/mL) נבדקה תחילה באמצעות ניתוח קורלציית פירסון. שני המשתנים בעלי התפלגות נורמלית בקירוב לאחר טרנספורמציה לוגריתמית (skewness: log10 dPCR = −0.66; log2 antigen titer = −0.60; regression residual skewness = −0.16), ובכך הם עומדים בהנחות לקורלציית פירסון. שער האנטיגן עבר טרנספורמציה של log2 כדי לשקף את הליניאריזציה של דילול סדרים כפולה, בעוד שתוצאות ה-dPCR עברו טרנספורמציה של log10, דבר התואם גם לפורמט הדיווח של תקן העומס הבקטריאלי. לאחר מכן, כדי להעריך את הקשר הליניארי, בוצעו ניתוחי קורלציית פירסון ורגרסיה ליניארית באמצעות שער האנטיגן בטרנספורמציית log2 ותוצאות ה-dPCR בטרנספורמציית log10. עבור כל הניתוחים, הוחלה רמת מובהקות (α) של 0.05, כאשר P < 0.05 נחשב כמובהק סטטיסטית. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות פלטפורמת הניתוח הסטטיסטי המקוונת SPSSPRO.
תוצאות
השוואה בין תיתר נוגדנים ל-H. pylori לתוצאות כימות מוחלט ב-dPCR
מתוך סך של 24 תרחיפים של חיידקים שגודלו בתרבית, titer של האנטיגן נע בין 8 ל-256, עם חציון של 32 (טבלה 1). תוצאות הכימות ב-dPCR נעות בין 2.67 × 107 copies/mL ל-2.04 × 109 copies/mL, עם חציון של log₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 copies/mL) (טבלה 2). הקשר שהוצג בנתונים הגולמיים היה בעל מאפיינים לא ליניאריים, מה שמרמז על קשר מעריכי או חוק חזקה, דבר שהצדיק את התמרות הלוגריתם שבוצעו לאחר מכן הן לערכי ה-titer של האנטיגן והן לערכי הכימות ב-dPCR.
קשר ליניארי בין תיתר האנטיגן לאחר טרנספורמציה לוגריתמית לבין תוצאות כמותיות של dPCR
כדי לבחון האם קיים מתאם משמעותי בין התוצאות של שתי שיטות הגילוי, ביצענו טרנספורמציה לוגריתמית וניתוח מתאם פירסון (Pearson), מכיוון ששני המשתנים מתפלגים באופן מקורי בקירוב לאחר טרנספורמציה לוגריתמית. כפי שמוצג ב-איור 1, לאחר הטרנספורמציה, תרכיז האנטיגן (בטרנספורמציית log2) והתוצאה הכמותית המוחלטת של ה-dPCR (בטרנספורמציית log10) הראו מתאם ליניארי חיובי בינוני ומשמעותי (r = 0.536, n = 24, P = 0.007).
מידול כמותי של הקשר בין תיתור האנטיגן למספר העותקים ב-dPCR
כדי לכמת את הקשר בין שתי שיטות הגילוי ולהעריך את הפוטנציאל לניבוי הדדי, ביצענו ניתוח רגרסיה ליניארית על הנתונים שעברו טרנספורמציה לוגריתמית, במטרה להשתמש במודל הרגרסיה לניבוי העומס החיידקי באמצעות תיתר האנטיגן בעתיד. הניתוח חושף קשר ליניארי בין log2 (תיתר האנטיגן) לבין log10 (dPCR), המניב את המשוואה: log10(dPCR) = 0.1588 × log2(titer) + 7.7988 (R2 = 0.287). מקדמי הרגרסיה (עם שגיאות תקן ומרווחי סמך של 95%) היו: שיפוע 0.1588 ± 0.053 (95% CI 0.048–0.270) ונקודת חיתוך 7.7988 ± 0.292 (95% CI 7.193–8.404); השגיאה התקנית של השאריות הייתה 0.318 log10 units, והרגרסיה הכללית הייתה מובהקת (F(1,22) = 8.84, P = 0.007). הדבר מעיד כי עבור כל הכפלה של תיתר האנטיגן, מספר העותקים ב-dPCR עולה רק פי 1.441 (100.1588). עם זאת, עבור תיתר אנטיגן נתון, מרווח הניבוי של 95% לתוצאות ה-dPCR יכול להשתרע על פני כמעט שני סדרי גודל (לדוגמה, בתיתר של 1:32, מרווח הניבוי הוא בערך 8.3 × 107 עד 1.85 × 109 copies/mL). הדבר מצביע על כך שביישומים מעשיים, תיתר האנטיגן לבדו אינו יכול לנבא במדויק את מספר העותקים של חומצת הגרעין בדגימה בודדת, אך שימוש במודל זה עשוי לספק הערכה גסה של סדר הגודל להשוואות ברמת הקבוצה, אם כי הוא מוגבל לניבוי דגימות בודדות בשל כוח ההסבר המתיון (R2 = 0.287).
שונות בין-פלטפורמית של כימות dPCR וניתוח רגישות של המתאם
השונות הבין-מעבדתית הוערכה בערכי לוגריתם10-המרנו את הריכוזים כדי להתחשב בהתפלגות הלוג-נורמלית של נתוני הכימות המיקרוביאלית. ה-CV% לאורך ארבעת ה-log שהופקו מהפלטפורמה10 הריכוזים נעו בין 0.9% ל-8.3% (חציון 1.8%, ממוצע 2.5%) ב-24 בידודים. חריג אחד (Hp06, CV = 8.3%) הראה >פער של פי 30 בין Sniper (5.93 × 108 עותקים/מ"ל) ו-TargetingOne (1.50 × 107 עותקים/מ"ל); למעט בידוד זה, ערכי ה-CV נעו בין 0.9% ל-6.4%. כדי להבטיח שחריגה זו לא הייתה הגורם המכריע במתאם שנצפה בין האנטיגן ל-dPCR, בוצע ניתוח רגישות ללא Hp06, אשר הניב r = 0.479, R2 = 0.230, ו- P = 0.021 (n = 23) — נתון הדומה לאניליזה הראשונית שכללה את כל 24 הבידודים — דבר המאשר כי המתאם המרכזי אינו תלוי בבידוד זה. פיזור זה משקף הבדלים שיטתיים בין הפלטפורמות ביעילות המיצוי, רגישות הרכיבים והכיול של המכשירים, ולא שגיאת מדידה אקראית, מה שתומך בביצוע ממוצע בין פלטפורמות להפחתת הטיה ספציפית לפלטפורמה.
הגדרה וסיווג של תוצאות באמצעות ספי שעה של שיטה כפולה
בהתבסס על הניתוחים לעיל ועל קריטריונים גששים הספציפיים למסד הנתונים, מחקר זה קבע את החציון של תרכיב הזיהוי של האנטיגן ב-1:32 כסף לרמה גבוהה של זיהוי אנטיגן, וזאת בשל ההתפלגות הבלתי-נורמלית של נתוני תרכיב האנטיגן, ובחר בחציון הממשי של log₁₀(dPCR) = 8.61 (≈4.09 × 108 copies/mL) כסף לרמה גבוהה של תכני חומצות גרעין. ספים אלו הם נקודות חיתוך גששיות הספציפיות למסד הנתונים ונגזרו מנתוני בידודים מתרביים, ואינם מייצגים קריטריונים מאובחנים לאבחון קליני. כתוצאה מכך, כל יישום של נקודות חיתוך אלו לאספויות דגימות אחרות או להקשרים אנליטיים אחרים יחייב גזירה מחדש מהנתונים התואמים במקום העברה ישירה.
תוך שימוש בספי thresholds גישוש (titer של אנטיגן ≥ 1:32 כגבוה, ≤ 1:16 כנמוך; dPCR log₁₀ ≥ 8.61 כעומס חומצות גרעין גבוה), סיווג ארבעת הרביעים של 24 תרחיפי החיידקים שהוצאו לתרבית (איור 2, טבלה 3) הוא כדלקמן: 9 דגימות (Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25) נכללות בקטגוריית אנטיגן גבוה–חומצה גרעינית גבוהה (37.5%); 3 דגימות (Hp09, Hp26, Hp27) מסווגות כאנטיגן נמוך–חומצה גרעינית גבוהה (12.5%); 8 דגימות (Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) מראות אנטיגן גבוה–חומצה גרעינית נמוכה (33.3%); ו-4 דגימות (Hp06, Hp07, Hp12, Hp20) שייכות לקטגוריית אנטיגן נמוך–חומצה גרעינית נמוכה (16.7%). מכיוון ש-24 הבידודים חולקו לשישה קבוצות titer עם ממוצע של 4 דגימות בלבד לקבוצה, השוואה פורמלית בין קבוצות (למשל, מבחן Kruskal-Wallis) תסבול מחוסר בעוצמה סטטיסטית מספקת; לפיכך, מדווחים רק סיכומי תיאור של תוצאות כמותיות של dPCR על פני קבוצות ה-titer.
חלקיק החיים השיורי לאחר נטרול בחום (viability PCR)
כדי לכמת את החיידקים החיוניים שנותרו לאחר אינאקטיבציה בחום, נעשה שימוש במערכת ריאגנטים של viability PCR עבור כל 24 האיזולטים. בקצרה, כל תרחיף שעבר אינאקטיבציה בחום (200 µL) דגר עם ריאגנט Viability PCR שאינו חודר ממברנות (ריכוז סופי של 10 µM) ב-37 °C למשך 75 דקות, כאשר במקביל עובדה ביקורת ללא ריאגנט (−VR) באופן זהה. לאחר מכן, הריאגנט עובד אינאקטיבציה כימית על ידי הוספת Viability PCR Neutralization Buffer (כ-20 µL, 10×) ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. DNA גנומי הופק הן מהמנות של +VR והן מאלו של −VR, ובוצע dPCR על כל תמצית; החלק החיוני חושב כיחס בין מספר העותקים של +VR למספר העותקים של −VR × 100%. החלק החיוני החציוני היה 4.6% (טווח של 0.00%–33.00%; תוצאות מלאות לכל איזולט מופיעות ב-Supplementary Table 2). אחוז החיוניות לא נמצא במתאם מובהק עם תיתר האנטיגן (r = 0.03, P = 0.90) או עם מספר העותקים ב-dPCR (r = 0.37, P = 0.08).
זמינות נתונים:
רצפי הגנים של 23S rRNA מ-24 זני Helicobacter pylori הופקדו במאגר NCBI GenBank תחת מספר גישה של BioProject PRJNA1520048. רצפים אלו שימשו אך ורק לאישור זהות הזנים ואינם מהווים את יעד הכימות של ה-dPCR, שהוא אזור גנומי שמור הקנייני ליצרן, כפי שמתואר בפרוטוקול.
את titers של האנטיגנים הגולמיים הספציפיים לערכה משמונה ערכות אימונוכרומטוגרפיות מסחריות של זהב קולואידי, ואת הערכים הכמותיים של dPCR הספציפיים לפלטפורמה מארבעה מכשירים של PCR דיגיטלי, לא ניתן להפקיד במאגר ציבורי עקב רגישות מסחרית, הסכמי סודיות של היצרן ומגבלות רגולטוריות הקשורות למוצרי אבחון in vitro בעלי סימון CE או מאושרים על ידי ה-National Medical Products Administration.
ניתן יהיה להשיג נתונים מוגבלים נוספים באופן חסוי בעת הצורך, בכפוף למגבלות הסודיות והרגולציה הרלוונטיות.
איור 1: מתאם בין תיתר נוגדנים של Helicobacter pylori לבין כימות באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית (dPCR). מוצג תרשים פיזור עם קו רגרסיה להדגמת הקשר בין תיתר הנוגדנים למספר עותקי ה-DNA ב-24 תרחיפי חיידקים מתורבדים (n = 24). תיתרי הנוגדנים נקבעו באמצעות בדיקת אימונוכרומטוגרפיה של זהב קולואידי עם קריאה ויזואלית. נבחנו דילולים סדרתיים של כל דגימה, והתיתר מבוטא כגורם הדילול הגבוה ביותר המניב תוצאה חיובית (מוצג בציר ה-x כערכים חסרי ממד שעברו טרנספורמציה של log2). מספר עותקי ה-DNA כומת באמצעות dPCR ומוצג בציר ה-y כריכוזים שעברו טרנספורמציה של log10 (log10 copies/mL). כל נקודה מייצגת דגימה בודדת של תרחיף חיידקים. הקו הכחול הרצוף מייצג את התאמת הרגרסיה הלינארית. הפס המוצל סביב קו הרגרסיה מייצג את רווח הסמך של 95% עבור התגובה הממוצעת המותאמת. הקווים המקווקוים האנכיים והאופקיים מצביעים על ספי סיווג גששים (log₂ titer = 5, כלומר 1:32; log₁₀ dPCR = 8.61, כלומר 4.09 × 108 copies/mL) ששימשו באיור 2 ובטבלה 3. המתאם הוערך באמצעות מקדם המתאם של פירסון, שהניב r = 0.536, P = 0.007, R2 = 0.287, דבר המצביע על מתאם חיובי מובהק סטטיסטית בין שתי השיטות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מסגרת סיווג אנליטית לבדיקת H. pylori המשלבת תוצאות בדיקת אנטיגן עם כימות dPCR. איור זה מציג סיווג של ארבעה רבעים עבור 24 תרחילי חיידקים (n = 24) בהתבסס על ההתאמה בין תיתור אנטיגן אימונוכרומטוגרפי לבין תוצאות כמותיות של dPCR. באמצעות ספי רכיבים ספציפיים למסד הנתונים למטרות מחקריות (תיתור אנטיגן ≥ 1:32 כגבוה, ≤ 1:16 כנמוך; dPCR log₁₀ ≥ 8.61 כעומס חומצות גרעין גבוה), הדגימות מסווגות ל: אנטיגן גבוה–חומצת גרעין גבוהה (n = 9, 37.5%), אנטיגן גבוה–חומצת גרעין נמוכה (n = 8, 33.3%), אנטיגן נמוך–חומצת גרעין גבוהה (n = 3, 12.5%), ואנטיגן נמוך–חומצת גרעין נמוכה (n = 4, 16.7%). ספים אלו הם נקודות חיתוך מחקריות שנגזרו מנתוני בידודים מתרביות ואינם מייצגים קריטריונים אבחנאיים קליניים מתוקפים. מסגרת הסיווג ממחישה את ההסכמה והאי-הסכמה בין שיטות זיהוי אימונולוגיות למולקולריות. קטגוריות עם פערים עשויות לשקף גורמים כגון יציבות האנטיגן, חיוניות החיידקים או שונות במספר העותקים של ה-DNA. מסגרת זו מיועדת למטרות השוואה אנליטית ואינה מהווה המלצות לאבחון קליני או לטיפול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| No. | Detection reagent | Manufacturer |
| 1 | Helicobacter pylori antigen detection kit (colloidal gold method) | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | Gastric Helicobacter pylori (HP) Antigen Detection Kit (Colloidal Gold Method) | Shanghai Chemtron BIOTECH Co., Ltd |
| 3 | Helicobacter pylori antigen detection kit (colloidal gold method) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd |
| 4 | Helicobacter pylori antigen detection kit (colloidal gold method) | Hangzhou Genesis Biodetecton & Biocontrol Ltd |
| 5 | Helicobacter pylori antigen detection kit (colloidal gold method) | JIANGSU COWIN BIOTECH CO., LTD |
| 6 | Helicobacter pylori antigen detection reagent (latex method) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co. Ltd |
| 7 | Helicobacter pylori (HP) antigen detection reagent (immunochromatographic method) | GUANGZHOU WONDFO BIOTECH CO., LTD |
| 8 | Helicobacter pylori antigen detection kit (colloidal gold method) | Beijing Core Technology Co., Ltd |
טבלה 1: רשימת ריאגנטים לזיהוי אנטיגן של Helicobacter pylori והיצרנים שלהם. הטבלה מונה שמונה בדיקות אימונוכרומטוגרפיות הזמינות מסחרית לזיהוי אנטיגן של H. pylori, אשר נבחנו במחקר זה. עבור כל מוצר, מוצגים המספר (כפי שסופק על ידי היצרן), השם המסחרי של ריאגנט הזיהוי ושם היצרן. ערכות אלו נבחרו על בסיס השימוש הנרחב בהן באבחון קליני ובבדיקות בנקודת הטיפול (point-of-care). כל המידע נלקח מעלונים המצורפים למוצרי היצרנים ומאתרים רשמיים (נכון למרץ 2026). הכללת ריאגנטים אלו אינה מהווה המלצה; הם מייצגים את המגוון של הבדיקות הזמינות.
| No. | Instrument model | Digital PCR Platforms |
| 1 | DQ24 | Sniper |
| 2 | Bio Rad QX200 Droplet Digital PCR | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd |
| 3 | DQ24 Pro | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd |
| 4 | TD-1 Digital PCR System | TargetingOne |
טבלה 2: רשימה של פלטפורמות dPCR (PCR דיגיטלי) ודגמי מכשירים. טבלה זו מפרטת ארבע פלטפורמות מעבדה המצוידות במערכות dPCR, יחד עם דגמי המכשירים המתאימים ששימשו לבדיקה. פלטפורמות אלו נבחרו בהתחשב במגוון הטכנולוגי שבהן ובמידת ייצוגן של היישומים הנוכחיים של dPCR. כל המידע סופק על ידי כל פלטפורמה בהתאמה. הכללת פלטפורמות אלו אינה מהווה המלצה; הן פשוט מייצגות את היקפן של מערכות ה-dPCR הקיימות.
| סוג | מספר מקרים | פרופורציה | מספר דגימה |
| אנטיגן גבוה - חומצת גרעין גבוהה | 9 | 37.5% | Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25 |
| אנטיגן נמוך - חומצת גרעין גבוהה | 3 | 12.5% | Hp09, Hp26, Hp27 |
| אנטיגן נמוך - חומצת גרעין נמוכה | 4 | 16.7% | Hp06, Hp07, Hp12, Hp20 |
| אנטיגן גבוה - חומצת גרעין נמוכה | 8 | 33.3% | Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17 |
טבלה 3: סיווג ופרופורציה של תוצאות בדיקות אנטיגן ובדיקות חומצות גרעין במחקר זה. טבלה זו מסווגת 24 תרחיפי חיידקים מתורבת בהתאם להתאמה בין תיתור האנטיגן (שנקבע באמצעות בדיקה אימונוכרומטוגרפית, ומבוטא כגורם הדילול הגבוה ביותר שהוביל לתוצאה חיובית) לבין תוצאות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית כמותית מוחלטת (dPCR) (המבוטא כ-log₁₀ copies/mL). תוך שימוש בערך סף לתיתור אנטיגן של 1:32 (גבוה ≥ 1:32, נמוך ≤ 1:16) ובערך סף לכימות dPCR של 4.09 × 108 copies/mL (log₁₀ = 8.61) כספי סף גששיים הספציפיים למערך הנתונים, סווגו האיזולטים לארבע תתי-קבוצות: אנטיגן גבוה-חומצה גרעינית גבוהה, אנטיגן נמוך–חומצה גרעינית גבוהה, אנטיגן גבוה–חומצה גרעינית נמוכה, ואנטיגן נמוך-חומצה גרעינית נמוכה. מתוך 24 הדגימות, 9 סווגו כאנטיגן גבוה–חומצה גרעינית גבוהה (37.5%; Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25), 3 כאנטיגן נמוך–חומצה גרעינית גבוהה (12.5%; Hp09, Hp26, Hp27), 8 כאנטיגן גבוה–חומצה גרעינית נמוכה (33.3%; Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17), ו-4 כאנטיגן נמוך–חומצה גרעינית נמוכה (16.7%; Hp06, Hp07, Hp12, Hp20). עבור כל קטגוריה, הטבלה מציגה את מספר המקרים (n), את הפרופורציה ביחס לגודל המדגם הכולל (%) ואת מספרי הדגימות בכל קטגוריה. סיווג זה ממחיש את ההסכמה והאי-הסכמה בין שיטות זיהוי אימונולוגיות לבין שיטות מולקולריות; קטגוריות עם פערים עשויות לשקף גורמים כגון יציבות האנטיגן, חיוניות חיידקית או שונות במספר עותקי ה-DNA, ובכך לספק תובנות לצורך פרשנות של תוצאות בדיקות אנליטיות.
טבלה משלימה 1: מערך נתונים מצטבר של זיהוי אנטיגן וכמימות dPCR עבור 24 בידודים של Helicobacter pylori. גיליון 1 (זיהוי אנטיגן): תארים (titers) של נקודת סיום לכל ערכה משמונה ערכות אימונוכרומטוגרפיות מסחריות של גולדי קולואידי עבור כל בידוד, כולל התאר המינימלי, החציוני והמקסימלי לדגימה וטווח המכפלה בתוך הדגימה. גיליון 2 (זיהוי כמיות ב-Digital PCR): ריכוזי dPCR (עותקים/mL) ספציפיים לפלטפורמה עבור כל בידוד, עם סטטיסטיקות סיכום בין-פלטפורמיות (חציון, מינימום, מקסימום ו-CV% של ריכוזים שעברו טרנספורמציית log₁₀). גיליון 3 (ניתוח קורלציה ורגרסיה): תארי אנטיגן שעברו טרנספורמציית log₂ וריכוזי dPCR שעברו טרנספורמציית log₁₀ ברמת הזן, תוצאות קורלציית פירסון ורגרסיה ליניארית (r, R2, משוואת רגרסיה), ניתוח רגישות ללא החריג Hp06, וסטטיסטיקות רגרסיה מפורטות (שגיאות סטנדרטיות, רווחי סמך של 95%, שגיאה סטנדרטית של השאריות, F-statistic ו- P-value). מזהים ספציפיים לערכות ולפלטפורמות הוסתרו לצורך סודיות מסחרית; מערך הנתונים מכיל את כל הערכים הדרושים לשחזור של דמויות 1–2 וטבלה 3.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
טבלה משלימה 2: תוצאות PCR לבדיקת חיוניות עבור 24 בידודים של Helicobacter pylori . מספרי העתקים של dPCR לכל בידוד עבור המנות שעובדו עם ריאגנט חיוניות (+VR) ומנות ללא ריאגנט (−VR) לאחר השבתה בחום ב-56 °C למשך 25 min, יחד עם חלק החיוניים המחושב (%) וערך ΔCq שקול עבור כל בידוד. החלק החיוני החציוני בקרב כל הבידודים היה 4.6% (טווח 0.00%–33.00%).אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
במחקר זה של 24 בידודים של H. pylori שגודלו בתרבית, תר titer של אנטיגן בשיטת אימונוכרומטוגרפיה ומספר עותקים גנומיים ב-dPCR הראו מתאם חיובי בינוני אך מובהק (r = 0.536, P = 0.007); עם זאת, ה-titer של האנטיגן הסביר רק 29% מהשונות במספר העותקים ב-dPCR (R2 = 0.287), ולכן שתי המדידות קשורות אך אינן ניתנות להחלפה. המגבלה העיקרית של מחקר זה היא גודל המדגם הקטן (n = 24), המגביל את העוצמה הסטטיסטית ומסביר את אופיה החקרני של ספי סיווג שנעשה בהם שימוש להלן.
מחקר זה ניתח באופן כמותי את תיתור האנטיגן בתרביות של H. pylori ואת מספר העותקים של חומצות גרעיניות שזוהו באמצעות dPCR, וחשף מתאם בינוני אך מובהק בין תוצאות הגילוי של שתי שיטות אלו (r = 0.536, P = 0.007). למרות שמתאם מובהק בין שתי השיטות נצפה ברמת האוכלוסייה, בפועל הקליני נתקלים לעיתים קרובות בפערים ברמה האינדיבידואלית. זאת משום שמטרות גילוי שונות משקפות מאפיינים ביולוגיים שונים של פתוגנים. באופן ספציפי, בדיקות אנטיגן מזהות חלבונים שעשויים להישאר גם לאחר סילוק החיידקים, בעוד שבדיקות של חומצות גרעיניות מזהות DNA שעלול להתמיד ברמות נמוכות גם לאחר חיסול החיידקים החיוניים. חוסר התאמה זה תועד היטב במגוון מחלות זיהומיות. לדוגמה, באבחון קליני של זיהום ב-Clostridioides difficile, לחלק מהנשאים יש תוצאות חיוביות בגילוי גן הרעלן אך תוצאות שליליות בגילוי אנטיגן של חלבון הרעלן, מה שמוביל לאבחנה שגויה כאדם נגוע וגורם לטיפול יתר ולהופעת עמידות לתרופות. לכן, איגוד המחלות הזיהומיות של אמריקה (IDSA)12 הבחין בבירור בהנחיות בין המשמעות הקלינית של "גילוי רעלן" לבין "גילוי גן רעלן" עבור Clostridioides difficile. אין זה מספיק לאבחן זיהום באמצעות בדיקה של חומצות גרעיניות בלבד, ומומלץ לאמץ שיטות שיכולות לזהות באופן ישיר חלבון רעלן פעיל. בנוסף, בדלקת ריאות שנרכשה בקהילה לאחר טיפול באנטיביוטיקה, עומס ה-DNA הבקטריאלי בליחה של המטופל יורד במהירות, בעוד שהאנטיגן בשתן נותר חיובי לאחר ההחלמה ומתמיד במשך מספר שבועות עד מספר חודשים13. תופעות דומות נצפות גם באבחון ובטיפול בזיהום ב-H. pylori. בשנת 2022, מעבדות Mayo Clinic העריכו כי ב-223 מטופלים במעקב לאחר טיפול באנטיביוטיקה, PCR היה רגיש יחסית בזיהוי DNA שיורי ברמה נמוכה בדגימות צואה. חלק מהמטופלים, למרות שהחלימו קלינית והיו שליליים לאנטיגן, עדיין הראו תוצאות PCR חיוביות במשך מספר שבועות14. כל אלה מאשרים עוד יותר את ההבדלים הביולוגיים בין מטרות גילוי שונות.
במחקר זה, זיהוי של מתאם כמותי ושקילות בין תיתר האנטיגן של H. pylori שזוהה בשיטה אימונוכרומטוגרפית לבין ערכי הכמות של dPCR, מספק הנחיה מעשית לאפיון של חומרי ייחוס של H. pylori ולערכת ריאגנטים לאבחון in vitro. 1) קידום שדרוג של מודל הערכת ביצועי המוצר: נכון לעכשיו, הערכה של ניסויים קליניים עבור ריאגנטים לגילוי אנטיגן של H. pylori מבוצעת באמצעות השוואה סינכרונית עיוורת מול "תקני זהב" קליניים כגון היסטולוגיה, תרבית או מבחן נשיפת Urea15. מחקר זה מציע שגופי רגולציה יחייבו חברות לספק נתוני מתאם רלוונטיים בין תוצאות הבדיקה שלהן לבין שיטות כמותיות של חומצות גרעין במסמכי הבקשה במהלך תהליך הבדיקה, ולהגדיר בבירור את ביצועי המוצרים שלהם ב"טווח תוצאות לא עקביות", כדי לשקף באופן ריאליסטי יותר את יכולת הגילוי של המוצר בתרחישים קליניים מורכבים ולהגדיר באופן מקיף יותר את ה-LOD של הריאגנט. 2) הדבר מספק גישה חדשה להקצאה של חומרי ייחוס בקטריאליים: חומרי ייחוס לבקרת איכות וכיול יכולים להשתנות מ-"CFU" בודד ל"ערכי מאפיין רב-ממדיים"8 הכוללים תיתר אנטיגן ומספרי עותקים של חומצה גרעינית. מודל הרגרסיה שהוקם במחקר זה יכול לספק הערכה גסה של סדרי הגודל עבור הקשר בין שני ערכים אלה, ובכך לספק בסיס כמותי לשימוש בחומרי ייחוס ולהשוואות בין מעבדות.
אנו ממליצים שיצרנים יכללו לא רק את גבול הגילוי (LOD) ביחידות אנליטיות (למשל, CFU/mL או titer של אנטיגן), אלא גם את השקול שלו במספר עותקים גנומיים — כפי שנקבע באמצעות dPCR (digital PCR) — כדי שניתן יהיה להשוות ולסנכרן תוצאות בין מעבדות ופלטפורמות שונות. דיווח כפול זה של יחידות עומד בדרישות העקיבות המטרולוגית של ISO 175118 ובמסגרת הערכת יכולת הגילוי של CLSI EP17-A216.
הסיבות הפוטנציאליות להופעת דגימות של "אנטיגן נמוך–חומצת גרעין גבוהה" הן כדלקמן: 1) וריאציה גנטית של הזן: אם חומצת אמינו באפיטופ האנטיגני הוחלפה, או אם חלבון ההפרשה נחסם במהלך ההובלה וההפרשה, עלולה להתרחש תופעת "בריחה" (escape) בזיהוי האנטיגן17. 2) שיטת dPCR תוכננה כדי להתמקד ברצפי גנים שמורים ולהגבירהם. הגן הספציפי שאליו התמקד ה-dPCR במחקר זה לא נחשף בתיעוד של היצרן. עם זאת, ערכות מסחריות לזיהוי אנטיגנים עשויות להתמקד באנטיגנים שונים של H. pylori (למשל, VacA, אוראז, חלבוני שוטים או אנטיגנים של תא שלם), וכל אי-התאמה בין הגן מטרה של ה-dPCR לבין האנטיגן המזוהה על ידי ערכה נתונה עלולה להתבטא כחוסר התאמה כמותית בארבעת רבעי תרשים הפיזור—dPCR גבוה/אנטיגן נמוך, dPCR נמוך/אנטיגן גבוה, התאמה גבוה-גבוה, או התאמה נמוך-נמוך—במקום אי-התאמות בינאריות של חיובי/שלילי18. 3) מגבלות של שיטת הזיהוי: טכנולוגיית זיהוי אנטיגנים מוגבלת על ידי ריכוזי אנטיגנים נמוכים ביותר או גבוהים ביותר, אשר יחלישו את האות עקב זיקה לא מספקת לנוגדנים או רוויה יתר, והיא מושפעת גם ממטריצת הדגימה. 4) אסימטריה בביצועי סף הגילוי: סף הגילוי התחתון (LOD) של dPCR יכול להגיע ל-10–100 copies/mL, בעוד שסף הגילוי של שיטת אימונוכרומטוגרפיה קולואידית לאוראז הוא בערך 104–105 CFU/mL. כאשר כמות החיידקים נמצאת בערך הקריטי, תופעת "אנטיגן נמוך–חומצת גרעין גבוהה" נוטה להתרחש. 5) ההשפעה של מצב הזיהום על התוצאות הקליניות היא משמעותית, במיוחד בהבחנה בין זיהומים חיידקיים לוויראליים. בתהליך הזיהום, מספר העתקי הגנים ורמת ביטוי האנטיגן אינם מראים קשר התאמה קבוע. בעקבות טיפול מוצלח, רמות חומצת הגרעין עשויות לרדת במהירות, בעוד שסילוק האנטיגן עשוי להתעכב למשך זמן מה19.
התרחיפים הבקטריאליים ששימשו במחקר זה הופקו הן מדגימות ביופסיה של הקיבה והן מדגימות צואה, המייצגות סביבות מטריצה שונות עם פרופילי הפרעה שונים. בידודים שהופקו מביופסיה של הקיבה נקיים במידה רבה מעכבי PCR הקשורים לצואה, אך עשויים להיות חשופים לשאריות פפסין במהלך עיבוד הדגימה. לעומת זאת, דגימות צואה מכילות מעכבי PCR (למשל, מלחים של חומצות מרה, פוליסכרידים מורכבים, תוצרי פירוק של המוגלובין) שעלולים להפחית את יעילות ההגברה ולהוביל להערכת חסר של כימות dPCR, וכן פרוטאזות של המעי שעלולות לפרק אנטיגנים מטרה גם כאשר ה-DNA הבקטריאלי נותר שלם. השפעות ספציפיות אלו למטריצה פועלות באופן בלתי תלוי ממנגנוני חוסר ההתאמה באזור המטרה שתוארו לעיל, ומצביעות על כך שפרוטוקולי ההכנה ותיקוף השיטה צריכים להיות מותאמים לסוג הדגימה בעת פירוש אי-התאמה כמותית בין דגימות קליניות.
כדי לכמת באופן ניסיוני את היחס בין חיידקים חיוניים לבלתי חיוניים לאחר אינאקטיבציה בחום, בוצע viability PCR באמצעות מערכת ריאגנטים ל-viability PCR בכל 24 הבידודים שהתרביעו. ריאגנט זה פועל באופן אנלוגי ל-propidium monoazide (PMA): הוא חודר באופן סלקטיבי לתאים עם ממברנות פגומות ומשנה באופן קוולנטי את ה-DNA הגנומי שלהם כדי לחסום הגברה עוקבת. אחוז החיידקים החיוניים חושב באמצעות הנוסחה: Viable % = (DNA copies/µL treated with viability reagent (VR)) / (DNA copies/µL without VR) × 100. בכל הבידודים, החציון של החלק החיוני לאחר אינאקטיבציה בחום היה 4.6% (טווח: 0.00%–33.0%), מה שמאשש כי אינאקטיבציה בחום ב-56 °C למשך 25 min מפחיתה באופן דרסטי את חיוניות החיידקים אך אינה מצליחה להמיט לחלוטין אורגניזמים חיוניים. נתוני חיוניות אלה תומכים נחרצות בפרשנות שלנו שפרופילים של dPCR גבוה/טיטר אנטיגנים נמוך נובעים בעיקר מ-DNA חופשי שנותר ומ-DNA בתוך חלקיקי חיידקים בלתי חיוניים, ולא מ- H. pylori חיוני שלם. תוצאות הכמות החיוניות המלאות עבור כל 24 הזנים מסוכמות ב-Supplementary Table 2.
במחקר זה, הסיווג לארבעה רבעים (המבוסס על ספי ש belirlו באופן גשש וספציפי למסד הנתונים) חשף כי 8 דגימות הפגינו רמה גבוהה של אנטיגן ורמה נמוכה של חומצת גרעין, ו-4 דגימות השתייכו לקטגוריית אנטיגן נמוך וחומצת גרעין נמוכה, לצד 9 דגימות בקטגוריית גבוה-גבוה ו-3 דגימות בקטגוריית נמוך-גבוה תואמות. נוכחותן של דגימות עם אנטיגן גבוה וחומצת גרעין נמוכה (n = 8) מרמזת כי ביטוי האנטיגן ותוכן חומצת הגרעין אינם תואמים תמיד, אפילו בתרביות טהורות. כל 24 הבידודים נאספו בשלב הצמיחה הסטציונרי (תרבית של 72 h; ראו פרוטוקול, סעיף 1). בשלב הסטציונרי, רפליקציית ה-DNA פסקה במידה רבה, בעוד שאנטיגנים מבניים ומטבוליים נשמרים או אפילו ממשיכים להצטבר; ניתוק זה בין שלבי הצמיחה מספק בסיס ביולוגי סביר לאסימטריה בין המחלקה השכיחה של אנטיגן גבוה וחומצת גרעין נמוכה (n = 8) לבין המחלקה הקטנה של אנטיגן נמוך וחומצת גרעין גבוהה (n = 3), אם כי הוא אינו יכול לשלול כשלעצמו מנגנונים אחרים, כגון הבדלים בין זנים בביטוי האנטיגן או ליזיס חלקי במהלך אינאקטיבציה תרמית. קיומן של דגימות עם אנטיגן נמוך וחומצת גרעין גבוהה (n = 3) מאשר כי תיתר אנטיגן נמוך אינו תואם בהכרח לעומס נמוך של חומצת גרעין, ומראה כי בדיקת חומצת גרעין משלימה את בדיקת האנטיגן בתרחישים ספציפיים. ספים אלו הם גששים וספציפיים למסד הנתונים, ואינם מייצגים קריטריונים אבחוניים קליניים מתוקפים.
מחקר זה מוגבל בשל גודל מדגם קטן (n = 24), המהווה עוצמה סטטיסטית שאינה מספיקה כדי לתמוך בניתוח תתי-קבוצות חסון. המדגם חולק לשישה קבוצות תיתור, עם ממוצע של 4 דגימות בלבד בכל קבוצה, ולכן להשוואות רשמיות בין-קבוצתיות חסרה עוצמה סטטיסטית מספיקה כדי לזהות הבדלים משמעותיים. לפיכך, לא הופעל מבחן Kruskal-Wallis, כדי להימנע מהצגת תוצאות סטטיסטיקה הסקתית בעלות עוצמה לא מספיקה. יתרה מכך, כל הדגימות היו בידודים שגודלו בתרבית ולא כיסו את השפעות המטריצה המורכבות יותר הנמצאות בדגימות קליניות כגון רירית הקיבה, צואה או רוק.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית (AI) בכתיבה, בעריכה, בניתוח הסטטיסטי, בפיתוח הקוד או בהכנת האיורים של כתב יד זה.
תרומות מחברים:
כל המחברים אישרו את תרומותיהם לעבודה זו. תפקידיהם האישיים של המחברים מפורטים להלן. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי שהוגש ולוקחים אחריות מלאה על דיוק ויושרה של נתוני המחקר. Wenwen Sun: חקירה, אוצרות נתונים, ניתוח פורמלי, מתודולוגיה, כתיבת טיוטה, השגת מימון; Xiaona Han: חקירה, מתודולוגיה; Jin Zhang: חקירה, מתודולוגיה; Xinxin Duan: חקירה, מתודולוגיה; Tingting Li: המשגה, פיקוח; Manyu Li: המשגה, פיקוח, כתיבה – ביקורת ועריכה; Haiwei Zhou: המשגה, פיקוח, כתיבה – ביקורת ועריכה.
תודות
מחקר זה מומן על ידי הקרן למחקר פיתוח נוער של המכונים הלאומיים לבקרת סמים (NIDC) (מענק מס' 2025C5).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR Probe Master Mix Plus (Rox) | צלף | RT021096A | ריאגנט לגילוי כמותי באמצעות PCR דיגיטלי |
| ערכה למיצוי DNA גנומי חיידקי | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. | Y2213/DP302-02 | מיצוי חומצות גרעין מחיידקים |
| מערכת Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | QX200 | זיהוי כמותי באמצעות PCR דיגיטלי |
| מכשיר PCR דיגיטלי משולב | צלף | DQ24 | גילוי כמותי באמצעות PCR דיגיטלי |
| מכשיר PCR דיגיטלי משולב | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd. | DQ24 | זיהוי כמותי באמצעות PCR דיגיטלי |
| אמבט מים דיגיטלי | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | השבתה תרמית של תרחיפים בקטריאליים ב- 56 °C |
| פריימר קדמי | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | הגברת חומצות גרעין ב-PCR דיגיטלי |
| ערכה לזיהוי אנטיגן של Helicobacter pylori בקיבה (שיטת גולד קולואידי) | Shanghai Chemtron Biotech Co., Ltd. | B202301020 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| מצע אגר עבור Helicobacter pylori (מוצק) | Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. | HB8647 | מצע גידול ל-H. pylori |
| ערכה לזיהוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטת זהב קולואידלי) | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ערכה לזיהוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטת הזהב הקולואידי) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd. | 20240310 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ערכה לזיהוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטת הזהב הקולואידי) | Hangzhou Genesis Biodetection & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ערכה לזיהוי אנטיגן Helicobacter pylori (שיטת זהב קולואידלי) | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd. | 28223 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ערכה לגילוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטת זהב קולואידלי) | Beijing Core Technology Co., Ltd. | 2415810 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ריאגנט לגילוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטה אימונוכרומטוגרפית) | Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd. | W028402001 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| ריאגנט לגילוי אנטיגן של Helicobacter pylori (שיטת לטקס) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co., Ltd. | 0000805308 | גילוי אנטיגן של H. pylori |
| מדגרה Heracell Tri-Gas | Thermo Fisher Scientific | לא רלוונטי | תרבית מיקרו-אירובית; הרכב גזים: 5% O2, 10% CO2, 85% N2 |
| מבחנות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל / 2 מ"ל) | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | דילול דגימות והפקת חומצות גרעין |
| ריאגנטים להפקה או לטיהור של חומצות גרעיניות | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | SDK60105 | הפקת חומצות גרעין מחיידקים |
| ריאגנט להפקת חומצות גרעיניות | TargetingOne | פתוגנים TNA-B1 (11019) | מיצוי חומצות גרעין חיידקיות |
| PBS, 1X (pH 7.2-7.4, 0.01 M, לתרבית תאים) | Solarbio Science & טכנולוגיה בע"מ | P1020 | דילול דגימה |
| צלוחיות פטרי (90 מ"מ) | Beekman Biotech | לא רלוונטי | צלחות תרבית סטריליות לבידוד חיידקים והעברה לתרביות משנה |
| טיפים לפיפט (10 uL / 200 uL / 1000 uL) | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | טיפים מסוננים סטריליים לדילול דגימות ולהגשת ריאגנטים |
| גשושית | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | הגברה של חומצות גרעין ב-PCR דיגיטלי |
| פריימר הפוך | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | הגברה של חומצות גרעין ב-PCR דיגיטלי |
| פלטפורמת הניתוח הסטטיסטי המקוונת SPSSPRO | SPSSPRO | מבוסס רשת (https://www.spsspro.com/; נגישה באוגוסט 2026) | ניתוח סטטיסטי: מתאם פירסון, רגרסיה ליניארית |
| דם כבשים סטרילי ללא פיברינוגן | Solarbio Science & חברת טכנולוגיה בע"מ | TX0030-100 מ"ל | תוסף לצלחות תרבית של H. pylori |
| מערכת TD-1 Digital PCR | TargetingOne | TD-1 | זיהוי כמותי באמצעות dPCR (PCR דיגיטלי) |
| מערכת ריאגנטים ל-PCR לבדיקת חיוניות | Promega | A8881 | הערכת חיות באמצעות PCR של H. pylori שעומתבטלה בחום |
| מערבל וורטקס | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | הומוגניזציה של תרחיפי חיידקים |
מקורות
- Ndip RN, et al. Helicobacter pylori isolates recovered from gastric biopsies of patients with gastro-duodenal pathologies in Cameroon: current status of antibiogram. Trop Med Int Health. 2008;13(6):848-54.
- Malfertheiner P, et al. Management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht VI/Florence consensus report. Gut. 2022;71(9):1724-62.
- Hooi JKY, et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology. 2017;153(2):420-9.
- International Agency for Research on Cancer. Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1994;61:1-241.
- de Martel C, et al. Global burden of cancer attributable to infections in 2018: a worldwide incidence analysis. Lancet Glob Health. 2020;8(2):e180-90.
- Wang YK, et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: current options and developments. World J Gastroenterol. 2015;21(40):11221-35.
- Hindson BJ, et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 2011;83(22):8604-10.
- International Organization for Standardization. ISO 17511:2020, In vitro diagnostic medical devices—requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. International Organization for Standardization; Geneva; 2020.
- Morisset D, et al. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013;8(5):e62583.
- World Health Organization. WHO international standard for SARS-CoV-2 RNA, NIBSC code 20/146. World Health Organization; Geneva; 2020.
- Forootan A, et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomol Detect Quantif. 2017;12:1-6.
- Johnson S, et al. Clinical practice guideline by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA): 2021 focused update guidelines on management of Clostridioides difficile infection in adults. Clin Infect Dis. 2021;73(5):e1029-44.
- Hyams C, Williams OM, Williams P. Urinary antigen testing for pneumococcal pneumonia: is there evidence to make its use uncommon in clinical practice? ERJ Open Res. 2020;6(1):00223-2019.
- Marrero Rolon R, et al. Erratum for Marrero Rolon et al., “Clinical evaluation of a real-time PCR assay for simultaneous detection of Helicobacter pylori and genotypic markers of clarithromycin resistance directly from stool.” J Clin Microbiol. 2022;60(2):e0245221.
- China Food and Drug Administration. Technical review guidelines for registration of Helicobacter pylori antigen/antibody detection reagents. China Food and Drug Administration; Beijing; 2018.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. EP17-A2, Evaluation of detection capability for clinical laboratory measurement procedures; approved guideline. 2nd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute; Wayne, PA; 2012.
- Yamaoka Y, Graham DY. Helicobacter pylori virulence and cancer pathogenesis. Future Oncol. 2014;10(8):1487-500.
- Leal YA, et al. Utility of stool sample-based tests for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;52(6):718-28.
- Devonshire AS, et al. The use of digital PCR to improve the application of quantitative molecular diagnostic methods for tuberculosis. BMC Infect Dis. 2016;16:366.