פרוטוקול למיזור תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים דמויי תאי נבט פרימורדיאליים

סיכום

הנחיה שלב אחר שלב ליצירת תאים דמויי תאי נבט פרימורדיאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי אדם, בצורה איתנה באמצעות שיטה מונו-שכבתית דו-ממדית עם שכבת תמצית ממברנה בסיסית.

תקציר

שימוש בהבדלת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים במבחנה הרחיב משמעותית את ההבנה של אירועי מפרט שושלת המתרחשים במהלך ההתפתחות המוקדמת ב-vivo, תקופה שקשה מאוד לחקור. אחת השושלות העובריות הראשונות שצוינו בעובר האנושי היא שושלת תאי הנבט, המסומנת בהשראה של תאי הנבט הראשוניים (PGCs). ה-PGCs הם האוכלוסייה המייסדת היחידה של הגמטות בשלב מאוחר יותר, וההגדרה שלהן היא צעד ראשון קריטי לקראת פוריות האורגניזם. כאן מתואר פרוטוקול חזק ליצירת תאים דמויי PGC (PGCLCs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי בני אדם (hiPSCs), החל מהערכה ראשונית של מצב הפלורפוטנטי והמאפיינים התאיים של ה-hiPSC כדי להבטיח התמיינות יעילה של PGCLC. לשם כך, נדונים השפעות של צפיפויות תאים שונות, ציפויי לוחות ו-hiPSCs המשמשים להבדלת PGCLC. לבסוף, מסופק תהליך לאפיון וכימות של hPGCLCs, באמצעות אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה. פרוטוקול ההבדלה מתמקד במצבים שקל להקים ולבדוק ברוב המעבדות וניתן להתאים אותם לפי הצורך. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מהיר ומאפשר לקבוע האם hiPSCs מתאימים להבדלת PGCLC. הפרוטוקול שואף לקדם עקביות ותאימות בתוצאות hPGCLC בין קווי hiPSC ופלטפורמות תרביות שונות, ולהבטיח תפוקות חזקות התומכות באפיון אמין ואופטימיזציה נוספת של שלבי התמיינות במורד הזרם לקראת גמטוגנזה מוצלחת במבחנה בבני אדם.

מבוא

התפתחות קווי הנבט האנושיים היא תהליך מתואם מאוד שמתחיל מוקדם בהתפתחות העוברית ומתחיל בהגדרת תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs), האוכלוסייה שבסופו של דבר יוצרת ביציות ותאי זרע¹. ב-vivo, מפרט PGC מתרחש זמן קצר לאחר ההשתלה ^2,3 בתגובה לאותות אינדוקטיביים מתאים סמוכים ^4,5. התפתחות PGCs נחקרה בהרחבה בקרב מכרסמים, במיוחד באמצעות מחקרים גנטיים שהראו מעורבות של מסלולי איתות, כגון BMP, WNT ו-TGFβ 6,7,8,9. לאחר המפרט, ה-PGCs עוברים תכנות מחדש אפיגנטי, המאופיין בדמתילציה של DNA כלל-גנומי ועיצוב מחדש של כרומטין, כדי לקבוע בהמשך זהות גנטית (ספציפית למגדר) 10,11,12,13,14.

ביונקים, מפרט ה-PGC מונע על ידי שיחת חלב מתואמת בין מסלולי איתות, וחלק מההיבטים נשמרים אבולוציונית בבני אדם, פרימטים לא-אנושיים, חזירים ועכברים, כולל מעורבות של גורמי פלוריפוטנטיות כמו POU5F1 ו-NANOG 9,15,16,17,18 . למרות מאפיינים משותפים, הבדלים ספציפיים למין במנגנוני ההבדלה של PGC ורשתות רגולציה גנטית מגבילים את התרגום הישיר ממודלים בעלי חיים לבני אדם 9,19,20,21.

כדי להבין גמטוגנזיס בבני אדם, מחקרים עם חומר אנושי נחוצים, אך הם נשארים מאתגרים בשל הגישה המוגבלת לעוברים אנושיים מוקדמים. התקדמות מתמשכת בפרוטוקולים המאפשרים התמיינות חוץ-גופית של תאי נבט פרימורדיאליים אנושיים (hPGCLCs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs), הפחיתה את התלות ברקמת הגונדות האנושית תוך מתן אפשרות להגדלה ומחקרים גנטיים ^18,22. רוב האסטרטגיות המקובלות להבדלת hPGCLC מתבססות על אגרגטים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) או גופים עובריים¹⁸. באמצעות פלטפורמות אלו, מחקרים רבים הראו כי hPGCLCs משחזרים תכונות אפיגנטיות מרכזיות של PGCs אנושיים מוקדמים, כולל תוכניות שעתוק של קו הנבט^23,24 ותכנות מחדש של מתילציה DNA כלל-גנום²⁵. ביחד, פלטפורמות אלו במבחנה מקדימות משמעותית את הידע בביולוגיה של PGC האנושי, כולל מחויבות שושלת ואיפוס אפיגנטי. עם זאת, פרוטוקולי התמיינות hPGCLC מבוססי אגרגציה נותרים מאתגרים כיוון שהם גוזלים זמן, והתפוקה הכוללת של hPGCLCs לאפיון אפיגנטי חזק, בדיקות התמיינות נוספות או שימוש ביישומים ניסיוניים בעלי תפוקה גבוהה נותרת נמוכה.

לאחרונה, שיטה דו-ממדית מבוססת שכבה אחת ללא הזנה באמצעות תמצית ממברנת בסיס מדוללת (BMEx) בשילוב עם רמות נמוכות של BMP4 להבדלת hiPSCs ל-hPGCLCs הוכיחה את עצמה כקלה יחסית להגדלה בלוחות תרבית רקמה והשיגה יעילות גבוהה (~55%) בתוך חלון התמיינות קצר (5 ימים)²⁶. בהשוואה למערכות דו-ממדיות אחרות שדרשו שלב פריימינג Activin A ביניים לפני האינדוקציה והשתמשו בריכוזי BMP4 גבוהים יותר (40–50 ng/mL)^27,28, גישת BMEx זו לא דרשה שלב קדם-אינדוקציה והשתמשה ברמות BMP4 נמוכות יותר (10 ng/mL), תוך שמירה על יעילות דומה ושיפור בקנה מידה.

כאן מסופק מדריך מפורט שלב אחר שלב לפרוטוקול התמיינות BMEx הדו-ממדי hPGCLC, החל מהערכה ראשונית של תחזוקת hiPSC, כולל פלורפוטנטיות ומאפיינים תאיים, ולאחר מכן בדיקת השפעות ציפויי לוחות hiPSC שונים וצפיפויות תאים על התמיינות hPGCLC. כמו כן, מתואר אפיון במורד הזרם באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה ואימונופלואורסצנציה. נקודות טיפול קריטיות והנחיות לפתרון תקלות להפחתת סטיות במעבדה מסופקות, המאפשרות לחוקרים לשחזר באופן עקבי את ההבדלה של hPGCLC בפורמט דו-ממדי זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה עומד בהנחיות ותקנות של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC), הבנק הביולוגי והביוחומרים של LUMC (TCBio), ומרכז ה-hiPSC של LUMC ליידן (תחת BB24.037). כל החומרים וקווי hiPSC זכריים (XY) הבקרה (M54 ו-M199) המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. כל הליכי תרביות הרקמה בוצעו בחדר תרבית רקמה ייעודי ברמת בטיחות ביולוגית 2, המצויד באינקובטור נורמוקסי לח (37°C, 5%_CO2), צנטריפוגה רב-תכלתית (רוטור דלי מתנדנד) וארון בטיחות ביולוגית מסוג Class II עם מיקרוסקופ סטריאו.

אזהרה: לא כל קווי hiPSC יכולים להבחין בין hPGCLCs ^26,29. עם זאת, אם נעשה שימוש ב-hiPSC אחרים להבדלת PGCLC ונצפו PGCLCs, השיטה המתוארת כאן (איור 1A) תאפשר הגדלת ייצור hPGCLC.

1. ציפוי לוחות תרבית רקמה לתרבית hiPSC

פרוטוקול זה מתאר ציפוי לוחות תרבית רקמה גם ב-BMEx מדולל וגם בויטרונקטין.

1. ציפוי תמצית ממברנה בסיסית (BMEx)
   1. הפשיר אליקו של BMEx על הקרח. זה יכול להיות Geltrex, Cultrex או Matrigel.
   2. מדלל את האליקו של תמצית הממברנה הבסיסית ב-DMEM/F12 הקר לריכוז סופי של 1% (v/v) והשלים אותו בעדינות.
   3. יש לצפות את מספר הבארות הרצוי של לוח 6 בארות ב-1 מ"ל של BMEx מדולל לכל באר.
   4. דגרו את הפלטה המצופה לפחות 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: צלחות מצופות יכולות להיאחסן בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד. כאשר משתמשים בלוחות מצופים המאוחסנים בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס, יש לדגור את הפלטה לפחות 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש הנוסף.
2. ציפוי ויטרונקטין
   1. הפשרו אליקו של ויטרונקטין בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10–15 דקות.
   2. מדלל ויטרונקטין לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS ללא סידן ומגנזיום (DPBS -/-) והשעה בעדינות.
   3. ציפוי את מספר הבארות הרצויות של לוח 6 בארות ב-1 מ"ל ויטרונקטין מדולל לכל באר.
   4. תדגר את הפלטת המצופה עם 6 בארות למשך שעה אחת ב-RT.

2. מעבר לתחזוקת hiPSC

1. מדיום להכנת תרבית: מדיום תרבית תאים ללא סרום mTeSR Plus בתוספת תמיסת מניעת זיהום מיקופלזמה (MycoZap (1:1000)).
2. שאפו את מדיום התרבית מהתאים המוכנים למעבר מחדש.
3. הוסף 0.5 מ"ל חומר לבחירה והעברת PSC אנושי (ReLeSR) לכל באר ושאוף אותו תוך דקה. תדאג ששכבה דקה מאוד נשארת על התאים.
4. דגרו את התאים למשך 6 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. הקישו על הצדדים של צלחת 6 בארות כמה פעמים.
6. נתק בזהירות את התאים עם מדיום תרבית של 1 מ"ל על ידי פיפט למעלה ולמטה עם פיפטת p1000, ודא שאתה בודק באופן קבוע את גודל שברי המושבה כדי לשמור על גודלם בין 50–200 מיקרון.
7. קח את הלוחות המצופים מראש עם 6 בארות והסר את תמיסת הציפוי (שלב 1).
8. הוסף 2 מ"ל תרבית מדיום לכל באר.
9. העבר את מדיום התרבית המכיל את שברי המושבה המנותקים של HiPSC לבאר החדשה ביחס הרצוי.
   הערה: היחס האידיאלי לפיצול שברי מושבות hiPSC הוא 1:6-1:50, ומאפשר מעבר כל 4–7 ימים.
10. הניחו את פלטת תרבית התאים עם שברי המושבה של ה-hiPSC שעברו באינקובטור נורמוקסי לח (37 °C, 5% CO₂).
11. רענן את מדיום התרבות כל יומיים עם מדיום תרבית של 2 מ"ל עד שה-hiPSC יהיו מוכנים למעבר שוב.
    הערה: הוסף 4 מ"ל תרבית במקום 2 מ"ל לכל 6 בארות כדי למנוע רענון בסוף השבוע.
    אזהרה: אל תעבירו hiPSCs כאשר המפגש נמוך מדי, ואל תזרקו את התרבות כאשר המפגש גבוה מדי כדי לשמור על תרבות hiPSC בריאה ולמנוע הבחנה ספונטנית.

3. הבדלת hPGCLC

1. הכנה לפני התמיינות hPGCLC (יום 0).
   1. רענן את תווך התרבית של hiPSCs שעה לפני שמתחילים להבדיל hPGCLC.
   2. הכינו את תמיסת הציפוי: תמיסת BMEx של 1% מדוללת v/v ב-DMEM/F12 קר.
   3. ציפוי את מספר הבארות הרצוי של לוח 12 בארות בתמיסת ציפוי של 0.5 מ"ל.
   4. דגרו את הפלטה המצופה לפחות 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות לפני תחילת הדיפרנציאציה.
   5. הכינו את מדיום הציפוי: תמיסת BMEx של 2% (v/v) במדיום תרבית קרה והשלימו זאת עם מדיום התאוששות לאחר הפשרה (RevitaCell) (1:100).
      זהירות: שמרו את מדיום השריון על קרח במהלך ההכנה והציפוי של hiPSCs.
2. ציפוי hiPSC להבדלת hPGCLC (יום 0).
   1. הסר את מדיום הגידול מ-6 בארות המכיל את ה-hiPSC לשימוש בהבדלה של hPGCLC. התחל עם HIPSC איכותיים ב-50–80% קונגונסיה, ללא סימני התמיינות ספונטנית.
   2. הוסף 1 מ"ל תמיסת טריפסין (TrypLE) לכל באר.
   3. דגרו את ה-hiPSC למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   4. צרו מתלה חד-תאי על ידי השעיה זהירה של מושבות ה-hiPSC 2–3 פעמים עם פיפטה p1000.
   5. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוך האם מתקבל תלייה חד-תאית. אם לא, יש להחזיר את מושבות ה-hiPSC עוד 1–2 פעמים עם פיפטת p1000.
   6. העבר את מתלה תא ה-hiPSC לצינור של 15 מ"ל.
   7. הוסף 4 מ"ל DMEM-F12 בינוני לצינור של 15 מ"ל.
   8. צנטריפוגה את מתלה תא ה-HiPSC ב-200 x g למשך 5 דקות.
   9. שאפו את הסופרנטנט ותחזירו בזהירות את תאי ה-hiPSC במדיום ציפוי של 0.5–1.0 מ"ל.
   10. ספרו את מספר ה-hiPSC באמצעות מונה תאים או המוציטומטר וחשבו את מספר ה-hiPSCs הנדרש לכל באר לצורך התמיינות hPGCLC.
       הערה: כנקודת התחלה, ניתן להשתמש בצפיפות ציפוי של 40–80K תאים לסמ^"ר . עם זאת, עבור כל קו תא ובכל מספר מעבר, מומלץ לאופטימיזציה של צפיפות הציפוי כדי להשיג תפוקה אופטימלית. כאן, hiPSCs צופו בצפיפות ציפוי של 10K עד 100K תאים/סנטימטר^רבוע.
   11. יש להחזיר בזהירות את מספר ה-hiPSCs הנדרש בנפח המתאים של חומר הציפוי (1 מ"ל לכל באר של צלחת 12 בארות), ולוודא שמתקבל תלים הומוגניים באמצעות פיפטת p1000.
   12. קח את לוח 12 הבארות המצופה מהאינקובטור והסר את תמיסת הציפוי.
   13. הוסיפו 1 מ"ל של מתלה התא לכל באר של פלטת 12 בארים.
   14. נער בזהירות את הפלטה כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בבאר.
   15. הנח את לוח 12 הבארות בתנור נורמוקסי לח (37°C, 5%_CO2) למשך 16–24 שעות.
3. הבדלת hPGCLC (יום 1–2)
   1. הכינו מדיום בסיס RB27: RPMI160 מתקדם עם B-27 (1:100), תחליף 1X אמינוחומצה (גלוטמקס), 1X חומצות אמינו לא חיוניות MEM, ותמיסת זיהום מיקופלסמה (1:1000).
   2. הכינו מדיום התמיינות: תמיסת BMEx של 2% (v/v) בתווך בסיסי קר RB27 והוסף BMP4 לריכוז סופי של 10 ng/mL. תמצית הקרום הבסיסית נדרשת כדי לגרום ללומנוגנזה ולהפעיל את מפרט PGCLC בחיים החיים.
      אזהרה: שמור את מדיום ההתבגרות על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ניתן להכין את מדיום ההבדלה לימים 1 ו-2 של פרוטוקול ההבחנה.
   3. ביום הראשון (בתוך 16–24 שעות לאחר הצלחת ה-hiPSCs), הוציאו את הפלטה מהאינקובטור והסירו את מדיום הציפוי.
   4. שטוף את הבארות על ידי הוספת 0.5 מ"ל RB27 באזל בינוני לכל באר.
   5. שואף את המדיום הבסיסי RB27 והוסף 1 מ"ל מדיום התמיינות לכל באר.
   6. הניחו את הפלטה עם התאים חזרה לאינקובטור נורמוקסי לח (37 מעלות צלזיוס, 5%_CO2).
   7. ביום השני של ההתמיינות, רעננו את התאים עם מדיום התמיינות של 1 מ"ל לכל באר.
4. התמיינות hPGCLC (יום 3–5)
   1. מדיום מתג הכנה: מדיום בסיס RB27 בתוספת BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) ו-EGF (50 ng/mL). מדיום המתג משקף את המעבר ב-in vivo ממפרט hPGC להישרדות והתפשטות. BMEx מושמט כי לומנוגנזה כבר אינה הכרחית.
   2. ביום 3 ו-4, רעננו כל באר עם 1 מ"ל סוויץ' בינוני.
   3. ביום החמישי של ההתמיינות, ניתן לאפיין את hPGCLCs באמצעות אימונופלואורסצנציה או ציטומטריית זרימה.

4. אפיון hPGCLCs באמצעות אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה

1. אפיון באמצעות אימונופלואורסצנציה.
   1. הכינו תמיסת חדירה: 0.3% טריטון X-100 מדולל ב-PBS.
   2. להכנת תמיסת כביסה: 0.05% טווין 20 אינץ' PBS (PBST)
   3. הכינו תמיסת חסימה: אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב-PBST.
   4. הסר את מדיום המתג מהבארות המשמשות להבדלת hPGCLC.
   5. שטוף את התאים ב-1 מ"ל לכל באר DPBS (-/-).
   6. תקבע תאים עם 1 מ"ל לבאר עם 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 15 דקות ב-RT.
   7. שטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל באר.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן לוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני תחילת האימונופלואורסצנציה.
   8. פרמיאביליזציה של תאים עם תמיסת פרמיאביליזציה למשך 15 דקות ב-RT, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל באר.
   9. שטוף תאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם תמיסת שטיפה, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל באר.
   10. תאי חסימה עם תמיסת חסימה למשך שעה ב-RT, תוך שימוש ב-1 מ"ל לבאר.
   11. הכינו תמיסת נוגדנים ראשונית: דיללו נוגדנים ראשוניים שמעניינים את התמיסה החוסמת.
       הערה: כאן השתמשו בשני שילובי נוגדנים לסמנים של PGC: אנטי-SOX17 לעזים ואנטי-TFAP2C של ארנבים, ואנטי-SOX17 ועכבר אנטי-POU5F1 (טבלת חומרים).
   12. הסר את תמיסת החסימה, הוסף 0.4 מ"ל תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר, ודגרה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
       הערה: חשוב לכלול ביקורות שליליות להערכת קישור נוגדנים לא ספציפי. לשם כך, יש להשאיר אותו היטב בלילה בתמיסת חסימה, תוך היעדר הנוגדנים הראשוניים, אך לאחר מכן צבע אותו היטב עם תמיסת הנוגדן המשנית.
   13. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים הראשית ושוטף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBST.
   14. הכינו תמיסת נוגדנים משניים: דילול נוגדנים משניים מעניינים (טבלת חומרים) ו-DAPI (1:500) בתמיסת חסימה.
       הערה: תמיסת הנוגדן המשנית רגישה לאור ויש לשמור אותה בחושך.
   15. הסר PBST והוסף 0.4 מ"ל תמיסת נוגדנים משנית לכל באר למשך שעה ב-RT בחושך.
   16. שטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל באר.
   17. בצע הדמיה של התאים (עדשת אובייקטיבית 20x).
       הערה: תמונות אימונופלואורסצנציה צולמו באמצעות אובייקטיב של 20x במיקרוסקופ Airyscan, בעוד תמונות שדה בהיר צולמו באמצעות אובייקטיב 4x וכן אובייקטיבי 10x במיקרוסקופ EVOS.
2. אפיון באמצעות ציטומטריית זרימה
   1. הכנת מאגר FACS: 0.5% BSA ב-DPBS (-/-)
   2. הסר את מדיום המתג מהבארות עם hPGCLCs.
   3. שטוף תאים עם 1 מ"ל DPBS (-/-).
   4. הוסיפו 0.5 מ"ל אקוטאז מחומם מראש לכל באר ודגרו 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לצורך דיסוציאציה, אקוטאז מועדף על פני תמיסת טריפסין מכיוון ש-hPGCLCs רגישים מאוד לדיסוציאציה.
   5. צרו תלייה חד-תאית על ידי השעיית התאים בזהירות 2–3 פעמים עם p1000.
   6. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוך האם מתקבל תלייה חד-תאית. אם לא, יש להחזיר את התאים עוד 1–2 פעמים עם פיפטת p1000.
   7. סנן את מתלה התא דרך מסננת של 40 מיקרון לצינור של 15 מ"ל.
   8. שטפו את המסננת של 40 מיקרון עם בופר FACS של 5 מ"ל.
   9. צנטריפוגה את מתלי התא ב-300 x g למשך 5 דקות.
   10. הסר את הסופרנטנט.
   11. החזירו את כדור התא בבופר FACS של 0.3 מ"ל בצינור של 1.5 מ"ל.
       הערה: זה אופציונלי לספור תאים באמצעות מונה תאים או המוסיטומטר. אם נספרים את התאים, צפו לכ-מיליון תאים לכל באר של צלחת 12 בארות.
   12. הכינו דגימות בקרה מתאימות לציטומטריית זרימה (בקרות לא מוצבעות וכתם בודד). לשם כך, העבר 15–30 מיקרוליטר מתליית התא לצינורות של 1.5 מ"ל וממלא ל-100 מיקרוליטר עם בופר FACS.
       הערה: למחקר זה הוכנו 3 צביעות בודדות: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200), ו-7AAD (1:200). התמיסות המכילות את הנוגדנים הצמודים ו-7AAD רגישות לאור ויש לשמור אותן בחושך.
   13. הוסיפו את הנוגדנים המצומדים הרלוונטיים ישירות למותש התא כדי להשיג דילול מספק. כאן, נוגדנים מצומדים לסימני PGC שימשו יחד: EPCAM-PEcy7 (1:200) ו-ITGA6-BV421 (1:200) (טבלת חומרים).
   14. דגרו את התאים עם הנוגדנים הצמודים למשך 30 דקות על קרח בחושך.
   15. הוסיפו 1 מ"ל בופר FACS לדגימות, בקרה לא מוצבעת, ובקרת נוגדן יחיד, וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
   16. הסר את הסופרנטנט.
   17. החזירו את הדגימות ל-0.5 מ"ל, ואת דגימות הביקורת ב-0.2 מ"ל, של בופר FACS המכיל 1 mM EDTA. זה מונע תאים מלהתגבש.
   18. הוסיפו את הדגימות והבקרות לצינור FACS בנפח 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים, ואז העבירו אותם דרך המסננת.
   19. הוסיפו 7AAD ישירות לכל דגימה כמה דקות לפני המדידה בציטומטר זרימה.
   20. מדוד דגימות באמצעות ציטומטר זרימה. כאן נעשה שימוש באנלייזר התאים המבוסס פלואורסצנציה למדידת הדגימות, הנתונים נאספו באמצעות תוכנת FACSDiva (גרסה 9.0), ותוכנת FlowJo (גרסה 10.10.0) שימשה לניתוח הנתונים.
   21. השתמשו בדגימות הביקורת (בקרות לא מוצבעות ונוגדן בודד) כדי להגדיר את אסטרטגיית השער ולבצע פיצוי במידת הצורך.
   22. מערבל את הדגימות לפני שמכניסים אותן למכונה.
   23. חילוץ אוכלוסיית התאים מכל האירועים על ידי הצבת שער המבוסס על שטח [שטח פיזור קדמי (FSC-A) ושטח פיזור צד (SSC-A)].
   24. מאוכלוסיית תאים זו, ניתן להפיק תאים בודדים לפי גודל [רוחב FSC (FSC-W) וגובה FSC (FSC-H)] וגרנולריות [SSC-W ו-SSC-H].
   25. להוציא תאים מתים מניתוח נוסף על ידי קביעת שער לתאים שליליים ל-7AAD.
   26. השתמש בדוגמה כדי לבדוק אם השערים מכוונים כראוי, ואם צריך.
   27. נתחו את הסמנים המעניינים מאוכלוסיית תאים חיים זו. כאן, התאים המוגברים שהיו חיוביים ל-EPCAM ו-ITGA6 התאמו ל-hPGCLCs.

תוצאות

האיכות והמצב היציב של ה-hiPSC חשובים להבחנה נוספת
HiPSCs נשמרו בלוחות בעלי 6 בארות לפחות ל-3 מעברים (בציפויים השונים) לפני ניסויי התמיינות וניתוח. hiPSCs עברו כאשר מושבות התאים הגיעו למפגש של 70–80% (איור 1B), שהוא גם המפגש האופטימלי של hiPSC להתחלת התמיינות hPGCLC. תרביות hiPSC בריאות הציגו מורפולוגיה אחידה של מושבות ללא אזורים כהים או מובחנים, הנראים בתמונות שדה בהירות (איור 1B). עם זאת, איכות ה-hiPSC הושפעה כאשר מושבות התאים לא נשמרו בנקודת המפגש האופטימלית שלהן או הראו סימני התמיינות (איור 1B). במפגש נמוך, ה-hiPSC המשיך להתרבות, ונדרש זמן נוסף להיווצרות מושבה עד שהמפגש יהיה מתאים לניסויי מעבר או התמיינות. במפגש גבוה, ה-hiPSCs גדלו זה על גבי זה, בעוד שהופיעו אזורים מובחנים. מצב הרב-יכולת של ה-hiPSC אושר על ידי ביטוי של SOX2 או POU5F1, שני גורמי שעתוק חיוניים לשמירה על פלוריפוטנטיות והתחדשות עצמית ב-hiPSCs³⁰, והכי חשוב, SOX2 אינו מתבטא ב-hPGCLCs³¹. צביעת פאלואידין שימשה להערכת ארגון התא-שלד ומורפולוגיית המושבות, המעידים על איכות ה-hiPSCs. יש לשים לב שהבדלים במורפולוגיית התאים קשורים להפחתת SOX2 או POU5F1 (איור 1B).

השפעת תת-התחזוקה של hiPSC על התמיינות hPGCLC
כדי להעריך האם שמירה על hiPSCs על מצעים שונים משפיעה על התמיינות ל-hPGCLCs, ה-hiPSCs גודלו על סובסטרטים שונים (Geltrex, Matrigel, Cultrex ו-vitronectin) (איור 2). בכל הסובסטרטים, hiPSCs הראו רמות SOX2 או POU5F1 גרעיניות חזקות ואחידות, המעידות על מצבם הרב-פוטנטי. מושבות hiPSC שנשמרו על Geltrex, Matrigel ו-Cultrex היו בעלות מורפולוגיה דומה, כולל גבולות מושבות מוגדרים היטב וצורות מושבות לא סדירות בסך הכל, בהשוואה למושבות העגולות על ויטרונקטין (איור 2). hiPSCs שהגיעו ל-70–80% חיבור צופים בצפיפות של 40K תאים לסמ^"ר והתמיינו ל-hPGCLCs ב-Geltrex²⁶. ביום החמישי, תמונות שדה בהיר הראו מושבות hPGCLC אופייניות בכל התנאים (איור 3). יתרה מזאת, זוהו SOX17/TFAP2C/PDPN משולש חיובי או SOX17/POUF51 hPGCLCs כפולים בכל התנאים (איור 3). דבר זה הציע כי ניתן להשתמש בפרוטוקול ההתמיינות עם HiPSC שגודלו בתנאים שונים.

השפעת צפיפות התאים הראשונית של hiPSC על התמיינות hPGCLC
חשוב לבדוק את צפיפות הזריעה האופטימלית להבדלה מיטבית של hPGCLC (בג'לטרקס), שכן ל-hiPSC שונים יש שיעורי התרבות שונים. יתרה מזאת, במקרה שיעילות ההתמיינות של hPGCLC יורדת ככל ש-hiPSCs עוברים באופן רציף, מומלץ להתאים את צפיפות תאי הזריעה של hiPSC. כדי להעריך את השפעת צפיפות תאי הזריעה על יעילות התמיינות hPGCLC, הוזרעו hiPSCs בצפיפויות שונות, מ-10K עד 100K תאים לסמ^"ר (איור 4A). ביום החמישי, אחוז hPGCLCs הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות שני נוגדנים מצומדים שונים לסמני PGC אנושיים, EPCAM ואינטגרין α6 (ITGA6)³². ניתוח זרימה-ציטומטריה עקב אחר אסטרטגיית שער סדרתית סטנדרטית, כפי שהוצג עבור HiPSCs של M199 שזרעו ב-40K תאים/סמ^{"ר (}איור 4B). בקצרה, אוכלוסיית התאים הכוללת (כל האירועים) הוגדרה כדי להוציא פסולת (שטח חלקיקים), לאחר מכן נבחרו תאים בודדים לפי גודל (FSC) וגרגוריות (SSC), ולבסוף, תאים מתים הוצאו על בסיס צביעת 7AAD. לאחר מכן, הוגדר השער לכימות תאים המבטאים EPCAM-cy7 ו-ITGA6-BV421 באמצעות דגימות מוצבעות ולא מוצבעות (איור 4B).

השוואת יעילות ההתמיינות של hPGCLC באמצעות צפיפויות שונות של תאי זריעה ושימוש ב-hiPSC שתרבו על תת-קרקעים שונים חשפה מגמה תלויה בצפיפות (איור 4C). בצפיפות הזריעה של 20–40K תאים לסמ^"ר, ה-HiPSCs של M54 ו-M199 הראו את השיעור הגבוה ביותר של hPGCLCs כפולים חיוביים מסוג EPCAM+/ITGA6+, שהושג מ-hiPSCs שנשמרו על ג'לטרקס וקולטרקס. מעניין לציין שצפיפויות גבוהות יותר הביאו ליעילות דיפרנציאציה נמוכה יותר. תוצאות אימונופלואורסצנציה באמצעות סמני PGC SOX17/TFAP2C/PDPN או SOX17/POUF51 על hPGCLCs אימתו את תוצאות ציטומטריית הזרימה (איור 4D). תוצאות אלו הציעו כי התאמת צפיפות הזריעה ל-hiPSCs הספציפיים חשובה להשגת יעילות הבדלה מיטבית. שילוב אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה משפר את עמידות מבחן ההתמיינות hPGCLC.

איור 1: תהליך ההבדל של hPGCLC ואיכות ה-hiPSCs. (א) סכמטי של זרימת העבודה ששימשה במחקר זה. ה-hiPSCs נשמרו (במדיה תרבותית) והגיעו למפגש של 60–80% ביום ההבדלה (יום 0, D0). ב-D0, ה-hiPSCs פורקו לתאים בודדים וצופו בצפיפות הזריעה הרצויה (במדיום הציפוי). למחרת, התאים טופלו במדיום התמיינות (D1–D3), ואחריו מדיום מתג (D3–D5). ב-D5, hPGCLCs שימשו לאימונופלואורסצנציה או לציטומטריית זרימה. (B) תמונות Brightfield (שורה עליונה - הגדלה פי 4); אימונופלואורסצנציה ל-SOX2, צביעת פאלואידין וצביעה ב-DAPI (שורה אמצעית); ול-POU5F1, צביעת פאלוידין וצביעה ב-DAPI (שורה תחתונה) המראות hiPSCs עם חיבור שונה. פסי קנה מידה = 50 מיקרון. הציורים באיור 1A נוצרו על ידי המחברים באמצעות כלי ציור בסיסיים ב-Adobe Illustrator; לא נעשה שימוש בתוכנה או כלים בתשלום. לכן, לא נדרש רישיון זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: השפעת מצעי הציפוי השונים במהלך תרבית hiPSC. תמונות ברייטפילד (שורה עליונה); אימונופלואורסצנציה ל-SOX2, צביעת פאלואידין וצביעה ב-DAPI (שורה אמצעית); ול-POU5F1, צביעת פאלוידין וצביעת DAPI (שורה תחתונה) המראות hiPSCs שגודלו על תת-שכבות ציפוי שונות. פסי קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.

איור 3: השפעת מצעי ציפוי שונים במהלך תרבית hiPSC על התמיינות hPGCLCs. תמונות Brightfield (שורה עליונה - הגדלה פי 10); אימונופלואורסצנציה ל-SOX17, TFAP2C, PDPN וצביעת DAPI (שורה אמצעית); ולצביעת POU5F1, SOX17 וצביעת DAPI (שורה תחתונה) של hPGCLCs (באמצעות Geltrex) ביום החמישי, החל מ-hiPSCs שגודלו על תת-שכבות ציפוי שונות. הקו הצהוב עם מקווקו מדגיש אזורים עם hPGCLCs. פסי סולם = 25 מיקרון (שורה עליונה) ו-50 מיקרון (שורות אמצעיות ותחתונה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: השפעת צפיפות הזריעה של hiPSC על התמיינות hPGCLCs. (A) תמונות Brightfield ביום 1 (D1) ו-D3 של התמיינות hPGCLCs באמצעות צפיפויות שונות של זריעות hiPSC (40K תאים/ס"מ², 60K תאים/ס"מ², 80K תאים/ס"מ²). פסי קנה מידה = 250 מיקרון. הגדלה פי 4. (ב) גרפים מייצגים של ציטומטריית זרימה המציגים את אסטרטגיית השער לכימות את אחוז ה-EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs. לשם כך, נעשה שימוש ב-HiPSC של M199 (על ג'לטרקס) בצפיפות זריעה של 40K תאים/ס"^{מ רבוע}. (C) תרשים בר המציג את אחוזי ה-EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLC ב-D5 בעת שימוש ב-hiPSCs (M199 ו-M54) שגודלו על ציפויים שונים וזרעו בצפיפויות שונות. (D) אימונופלואורסצנציה לצביעת SOX17, TFAP2C, PDPN וצביעת DAPI (פאנלים שמאליים); ו-SOX17, POU5F1, וצביעת DAPI (פאנלים ימניים) ב-D5 של התמיינות hPGCLCs באמצעות hiPSCs (M199 ו-M54, על Geltrex) שהוזרעו ב-40K ו-80K תאים לסמ"ר. פסי קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של התמונה הזו.

דיון

גמטוגנזיס במבחנה מהווה פלטפורמה ניסיונית עוצמתית לחקר התפתחות קווי הנבט האנושיים, רעילות רבייתית ואי-פוריות בתנאי תרבית מבוקרת ועל בסיס ספציפי למטופל. למרות שדווחו¹⁸ פרוטוקולים רבים להבחנה בין hPGCLCs ל-hiPSCs, ההתקדמות בתחום הוגכרה בשל זמינות מוגבלת של גישות סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור בין מעבדות. מחקרים עדכניים תיארו גישות פשוטות ויעילות לאינדוקציה של hPGCLC, כולל התמיינות מיקרודפוסית מבוססת BMP4²⁷, פלטפורמת חד-שכבה דו-ממדית מהירה המאפשרת יצירת hPGCLC בתוך 3.5 ימים^ו-28, ומערכת תרביות תלת-ממדית המדגמת התפתחות סביב השתלה ואיתות נישה פרקרינית³³. למרות שפרוטוקולים אלו תמכו ביעילות בהבדלת hPGCLC, הם עדיין חסרים את היכולת לשמש כפלטפורמות בעלות תפוקה גבוהה. כדי שמחקרים מבוססי hPGCLC יהיו ישימים באופן רחב, במיוחד לסריקות טוקסיקולוגיות רבייתיות, הפרוטוקולים חייבים להיות חזקים, נגישים טכנית ותואמים לבדיקות כמותיות במורד הזרם. כאן מוצג ניתוח שלב אחר שלב של פרוטוקול ההבדלה BMEx של hPGCLCs, המדגיש פרמטרים טכניים קריטיים שקובעים את השחזוריות והביצועים.

גורם מרכזי להבחנה מוצלחת הוא מצב הרב-יכולות הראשוני של ה-hiPSCs. מספר המעבר, בריאות התאים, מאפיינים ספציפיים לקו ותנאי תרבית טרום-התמיינות יכולים להשפיע על תוצאות התמיינות hPGCLC. בתחילה, במהלך תחזוקת ה-hiPSC, ניתן להקדיש תשומת לב למצע הציפוי, צפיפות התאים הזריעה ולפורמט לוח התרבית, אשר יחד מגדירים את ארכיטקטורת המושבה וסביבות האיתות בתחילת התמיינות hPGCLC. המחקר הנוכחי מדגים את השפעת השימוש ב-hiPSCs המגודלים על ציפויים שונים וצפיפויות זריעה שונות על התמיינות hPGCLCs (על ג'לטרקס). שני קווי hiPSC שנבדקו כאן הראו יעילות התמיינות מקסימלית בצפיפות זריעה של 20,000–40,000 תאים/סנטימטר^רבוע . דבר זה מדגיש את הצורך לקבוע את צפיפויות הזריעה האופטימליות בעת הכנסת קווי תאים חדשים, לאחר מעבר ממושך, או שינוי פריסות ניסיוניות או פורמטים של לוחות תרבית. אפילו שינויים קטנים לכאורה ביחס שטח לנפח או בקינטיקת הצמיחה עשויים לדרוש אופטימיזציה לשמירה על יעילות הבדייל גבוהה. בהתאם לכך, מומלץ למשתמשים לבצע ניסויים פיילוט בקנה מידה קטן כדי לקבוע תחילה תנאים אופטימליים להבדלת hPGCLC.

למרות עמידותה, לשיטה יש מגבלות שיש להכיר בהן. למרות שהיא תואמת למספר ציפויים וצפיפויות, יעילות ההתמיינות נשארת רגישה לתכונות הטבעיות של hiPSC, כולל מצב אפיגנטי והיסטוריית מעבר, שאינן ניתנות לשליטה מלאה. מספר HiPSCs שנבדקו נראו כלא מצליחים להבחין בין hPGCLCs²⁶. החשוב מכל, בניגוד לויטרונקטין, שהוא מוצר מוגדר במלואו, BMEx הוא מוצר שמקורו בבעלי חיים הנתון לשונות בין אצווה, מה שעשוי להשפיע על השחזוריות. למרות שנבדקו בעבר אצוות שונות של Matrigel, Cultrex ו-Geltrex והניבו תוצאות עקביות²⁶, הדבר נותר מהווה דאגה, ויש לשקול חלופות מוגדרות לחלוטין ל-BMEx כדי להבטיח שחזוריות והעברה בעתיד. כאן השתמשו בשני קווי hiPSC זכריים (XY), אך פרוטוקול זה נבדק עם קווים^{נשיים (XX) וגבריים (XY) 26}. לבסוף, בעוד שהפרוטוקול הוביל ל-hPGCLCs, שהוכח כדומים לשעתוק ל-hPGCs ובעלי יכולת להתפתחות נוספת^26,34, הבשלה נוספת לשלבים מאוחרים יותר של תאי הנבט לא טופלה כאן. למרות שהודגמה יכולת הרחבה ביישומים בסגנון סקר, התאמה מבוססת אוטומציה ואימות בין-מעבדתי על פני פאנל רחב יותר של קווי hiPSC יחזקו עוד יותר את השימושיות התרגומית.

בהשוואה לאסטרטגיות ההבדלה הקיימות של hPGCLC, פרוטוקול זה מציע מספר יתרונות. בניגוד לגישות מתמחות מאוד או מוגבלות במטריצה, היא מתאימה לתת-תחזוקת hiPSC ולפורמטים של לוחות תרבית נפוצים, ובכך מפחית מחסומים טכניים. הדגש על אופטימיזציה של צפיפות ובקרת איכות בשלבים מוקדמים משפר עוד יותר את השחזוריות, אתגר מתמשך בתחום הגמטוגנזיס במבחנה .

המסגרת המתודולוגית המתוארת כאן רלוונטית במיוחד לטוקסיקולוגיה רבייתית, מודלים של אי-פוריות וביולוגיה התפתחותית. התאימות שלה לפורמטים ניתנים להרחבה מאפשרת סינון מורכבות בקצב בינוני עד גבוה, בעוד ששחזוריות היכולת שלו תומכת בהשוואות בין מחקרים ובמאמצי שיתוף פעולה בקונסורציום. באופן רחב יותר, תקנון שיטתי של פרוטוקולי השראת hPGCLC בין מעבדות, תוך השוואת אפיון ונקודות קצה פונקציונליות^18,35, יהיה חיוני לקידום הגמטוגנזיס במבחנה לעבר פלטפורמות חיזויות רלוונטיות לאדם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01