מסכי נוקאאוט מבוססי CRISPR-Cas9 רחבי האפיגנום על תאים עמידים לכימיה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תאים עמידים לכימיה באמצעות גישת העלאת מינון, ואחריו סקר מבוסס CRISPR/Cas9 באמצעות ספריית sgRNA ממוקדת המכוונת למשנים אפיגנטיים לזיהוי רגולטורים של כימוזיציות נרכשת. הפרוטוקול מספק גם נקודות אופטימיזציה מרובות המותאמות למודלים של תאים עמידים לכימולוגיה, ומציע מסגרת איתנה לחוקרים החוקרים מנגנוני עמידות.

תקציר

עמידות לכימותרפיה נותרה אתגר מרכזי בטיפול בסרטן, המונעת על ידי יכולת תאי הסרטן לרכוש תכונות אדפטיביות, לשנות מסלולי איתות ולשנות את מבנה הכרומטין כדי להימנע מציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות. מכיוון שתהליכים אלו תלויים במידה רבה במנגנונים אפיגנטיים המווסתים את ארגון הכרומטין ואת הפלסטיות השעתוקית, רגולטורים אפיגנטיים הפכו לתורמים מרכזיים לעמידות לכימותרפיה. כדי לחקור עמידות לפקליטקסל, אחד התרופות הכימותרפיות הנפוצות ביותר בסרטן שד משולש שלילי (TNBC), השתמשנו בספריית הדחיפה ממוקדת אפיגנום (EPIKOL), ספרייה מבוססת CRISPR-Cas9, שנועדה לשבש באופן שיטתי גנים המעורבים בוויסות הכרומטין. קווי תאים עמידים לכימיה נוצרו באמצעות פרוטוקול העלאת מינון מדרגתית, שמסכם התאמה קלינית רלוונטית לתרופות. עם זאת, תאים עמידים אלו מציגים פנוטיפ עמיד לתרופות מרובות (MDR), מה שמציב אתגרים משמעותיים בהעברת וירוס יעילה ובבחירת אוכלוסיות תאים יציבות. במחקר זה אנו מתארים שלבים מתודולוגיים מרכזיים להשגת טרנסדוקציה וברירה לנטי-ויראלית ביעילות גבוהה, מה שמאפשר יישום מוצלח של מסכי EPIKOL CRISPR במודלים עמידים לכימויות TNBC. בהתאם לפרוטוקול המתואר, בוצע סקר CRISPR רחב היקף אפיגנום על תאי TNBC עמידים לכימותרפיה, וזוהו רגולטורים אפיגנטיים חדשים של כימורזיסטוס. פרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה לזיהוי רגולטורים אפיגנטיים התורמים לעמידות לפקליטקסל באמצעות גישה מבוססת CRISPR על אובדן תפקוד.

מבוא

סרטן השד השלילי המשולש (TNBC) הוא תת-סוג של סרטן השד האחראי ל-12–17% מכלל סוגי סרטן השד¹. הוא מאופיין בביטוי לקוי של קולטני אסטרוגן (ER), קולטני פרוגסטרון (PR) וקולטן פקטור גדילה אפידרמלי אנושי-2 (HER2), מה שמגביל מאוד את זמינות אפשרויות הטיפול הממוקדות ומשאיר את הכימותרפיה הקונבנציונלית כשיטת הטיפול העיקרית². טקסאנים ואנתרציקלינים משמשים לעיתים קרובות בטיפול ב-TNBC; עם זאת, מטופלים בדרך כלל מפתחים עמידות ^2,3. רכישת כימורזיסטנס היא תהליך מורכב ורב-ממדי הכולל התאמות גנטיות, מטבוליות, שעתוקיות ואפיגנטיות ^2,4. שינויים אפיגנטיים הופיעו כרגולטורים מרכזיים של הפלסטיות התאית, המסייעים בתכנות מחדש דינמי של שעתוק שמאפשר לתאי סרטן לסבול רעילות הנגרמת מכימותרפיה⁵.

טקסול (פקליטקסל) הוא חבר בקבוצת הטקסאן, הגורם למוות תאים על ידי פגיעה בדינמיקת המיקרוטובול ומשמש כסוכן אנטימיטוטי⁶. למרות שמטופלי TNBC מגיבים בתחילה לטיפולי כימותרפיה כולל טקסול, ההתנגדות בדרך כלל מתפתחת עם הזמן². עמידות נרכשת לטקסול קשורה לעיתים קרובות לביטוי יתר של נשאי קלטות הקשרים ל-ATP (ABC), במיוחד ABCB1 (MDR1, P-גליקופרוטאין), המתווכים את פליטת התרופות של טקסול, מה שמוביל לירידה ברעילות התוך-תאית⁷. מכיוון שמגוון רחב של תרופות כימותרפיות הן תת-קרקעיות של נשאי ABC אלו, העלאת הוויסות שלהם מגבילה את השימוש בתרופות כימותרפיות אחרות, וגורמת לפנוטיפ עמידות רב-תרופתית (MDR)⁸. עיכוב נשאי ABC לא הצליח ברובו כאסטרטגיה להתגבר על עמידות לרב-תרופות בהקשרים קליניים, בעיקר בשל ביטוי נפוץ ותפקידם החיוני בהובלת מגוון רחב של מצעים אנדוגניים וחיצוניים⁹. למרות ש-Verapamil, מעכב ABCB1 דור ראשון, הראה תועלת קלינית מוגבלת או ללא תועלת והיה קשור לרעילות משמעותית בניסויים^{קליניים 10}, הוא נותר כלי ניסויי חשוב לשיפור יעילות הבחירה במודלים מבחנתיים של MDR.

פנוטיפ MDR הוא תהליך דינמי ומסתגל שמתפתח בעיקר בתנאי לחץ². ביטוי נשאי ABC נשלט בעיקר על ידי מנגנוני ויסות שעתוק ואפיגנטי, ולא על ידי אירועים מוטציוניים ^5,11. המגבלה של מיקוד ישיר במובילי ABC מדגישה את הצורך לזהות את הרגולטורים העליונים של חלבונים אלו כפגיעות ספציפית לתאים העמידים. לכן, חקירה שיטתית של גורמים אפיגנטיים הפכה לאסטרטגיה חשובה לזיהוי רגולטורים חדשים של עמידות לכימותרפיה ולפיתוח טיפולים משולבים המיועדים לפגיעות אלו.

מסכי נוקאאוט תפקודיים מבוססי CRISPR-Cas9 מאפשרים הפרעות גנומיות שיטתיות ובלתי מוטות לחקור השפעות אובדן גנים בסרטן בקנה מידה^{גנומי 12}. עם זאת, ספריות CRISPR כלל-גנומיות מציעות ייצוג מוגבל של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לכל גן, מה שמפחית רגישות בהשוואה לספריות ממוקדות¹³. חשוב לציין שמסך עמיד תלוי לא רק באיכות ההפרעות אלא גם במודל מתאים ובפרוטוקול ניסויי אופטימלי. בהקשר זה, חקר תהליך דינמי ומורכב כמו עמידות לתרופות עשוי להפיק תועלת מספרייה ממוקדת עם פרוטוקול מותאם אישית¹³. בעבודה קודמת, יצרנו ספריית CRISPR-Cas9 ממוקדת אפיגנום כדי למקד את רגולטורי הכרומטין¹⁴. בהשוואה לספריות CRISPR ממוקדות אפיגנום נוספות הזמינות לציבור, ספריית הדחיפה האפיגנטית (EPIKOL) מכילה 779 גנים, הכוללים קוראי כרומטין, כותבים, מחקים וחלבונים נלווים, שכל אחד מהם מכוון ל-10 sgRNA, ובכך מאפשר הגדלת עומק הגן ושיפור החוסן והשחזור של מסכים פונקציונליים ממוקדי כרומטין¹⁴. EPIKOL זמינה הן במערכת LentiGuide, שבה Cas9 מבוטא מווקטור שונה, ובמערכת LentiCRISPR, הכוללת את Cas9, ומספקת גמישות בהתאם לקו התא. השגת כיסוי ספרייה מספק, המוגדרת כמספר התאים הממוצע לכל sgRNA (למשל, 500×–1000×), קלה יותר עבור EPIKOL בהשוואה לספריות גנום רחבות, ומספקת יתרון בחקר קווי התאים העמידים לכימיה שגדלים לאט.

בעוד שסקר CRISPR מציע גישה עוצמתית לבחינת מנגנוני כימועמידות, תהליכי סקר משולבים סטנדרטיים אינם מותאמים לתאים עמידים לכימפולקס פעיל של תרופות. פורומיצין, אנטיביוטיקה סלקטיבית נפוצה במערכות CRISPR לנטיויראליות, ניתן לשאוב מתוך התאים העמידים על ידי נשאי ABC, בעיקר ABCB1, ובכך מונעת בחירה מוצלחת של תאים מועברים^15,16. מגבלה זו עלולה להוביל לאוכלוסיות תאים הטרוגניות, לעלייה ברעש רקע, ולבסוף לפגוע באיכות הנתונים. כדי להתמודד עם אתגר זה, אופטימיזציה של שלב בחירת הפורומיצין על ידי עיכוב זמני של פליטת תרופות המתווכת על ידי ABC באמצעות ורפאמיל, ובכך אפשרנו העשרה יעילה של תאי sgRNA. באמצעות אסטרטגיה זו, זיהינו את Bromodomain ו-PHD Finger Containing 1 (BRPF1) כרגולטורים של ביטוי ABCB1 ועמידות לטקסול ב-TNBC¹⁷. עיכוב BRPF1, גנטית או פרמקולוגית, החזיר את הרגישות לטקסול בתאים עמידים, והדגים את התועלת של פרוטוקול אופטימלי זה בזיהוי מטרות ניתנות ליישום בכימורזיסטנס¹⁷.

כאן, אנו מתארים את השלבים המרכזיים בסקר CRISPR של ברירה שלילית על מודלים עמידים לכימותרפיה, תוך התמקדות במיוחד באתגרים הטכניים שלרוב מתעלמים מהם ברוב פרוטוקולי הסינון של כימורזיסטנס או CRISPR. הפרוטוקול מדגים תחילה שיטת העלאת מינון מדורגת ליצירת תאים עמידים לכימיה ואז מייעל את תנאי ההפצה והבחירה הוויראלית כדי להתגבר על אפלוקס התרופות המתווכים על ידי נשאי ABC. ביחד, האופטימיזציות הללו מבטיחות העשרה יעילה של תאי sgRNA חיוביים במהלך סקרי CRISPR, תוך חיסול יעיל של התאים הלא מועברים, ובכך מספקים אסטרטגיה איתנה ויעילה להעברה וברירה בתאי TNBC עמידים לכימו. לבסוף, הפרוטוקול מדגיש את יסודות זיהוי פגיעות סקר CRISPR באמצעות ריצוף מהדור הבא וניתוח ביואינפורמטי.  ביחד, פרוטוקול זה מאפשר יישום יעיל של פלטפורמת הסקר EPIKOL לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות להתמודדות עם עמידות 17,18,19.

פרוטוקול

כל החומרים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. יצירת קווי תאי סרטן השד הטריפל-שליליים עמידים לטקסול

1. כדי לקבוע את רגישות התאים לתרופות, כוונן את צפיפות התאים SUM159PT התאים הדבקים ל-2 ×-10³ תאים בכל באר בלוחות שחורים שקופים עם 96 בארות עם תערובת מזינים של Ham's F12 בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 10 מ"מ HEPES ו-1 מיקרוליטר/מ"ל הידרוקורטיזון, ודגרו את התאים במשך 16 שעות באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
2. הכינו מלאי טקסול מומס בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). לטיפול בתאים, יש להכין דילול סדרתי של טקסול במדיות תרבית, בטווח של 0.3 ננומטר עד 10 מיקרומולר (למשל, 0.3 ננומטר, 1 ננומלר, 3 ננומטר, 10 ננומטר, 30 ננומטר, 100 ננומטר, 300 ננומטר, 1 מיקרומון, 10 מיקרומון), ולהשתמש ב-DMSO בלבד כאמצעי בקרה.
3. לטפל בתאים ב-200 מיקרוליטר של מינונים הולכים וגדלים של טקסול (שהוכן בשלב 1.2) כמשולשים והשאירו את הפלטה באינקובטור תרבית תאים למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
4. לאחר 72 שעות של טיפול תרופתי, יש למדוד את חיוניות התאים באמצעות בדיקת כימות תאי אדנוזין טריפוספט (ATP) מבוססת לומינסנציה. השתמש בקורא מיקרופלט כדי למדוד לומינסצנציה ולנרמל ערכים לבקרות DMSO. חישבו את ערכי הריכוז המעכב של 10% (IC10) ו-IC50 באמצעות רגרסיה לא ליניארית באמצעות מודל מינון-תגובה לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים בתוכנה סטטיסטית מתאימה.
5. כדי להתחיל לייצר תאים עמידים לכימותרפיה, זרעו 2 ×-^{10 5} תאים SUM159PT בכל באר בלוחות של 6 בארות. דגרו בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
6. למחרת, טפלו בתאים בערכי IC10 או IC50 של טקסול ב-2 מ"ל מדיום תרבית למשך 72 שעות כריכוזי התחלה.
7. אם התאים סובלים את ריכוז התרופה הנוכחי, חלקו אותם לשני בארות. שמרו באר אחת כבקרה גיבוי במדיום טרי והחליפו את המדיום בבאר השנייה במדיום שמכיל פי שניים את ריכוז הטקסול הקודם.
   הערה: אם תאים זקוקים להחלמה בעקבות שינויים מורפולוגיים שנגרמו מלחץ כמו בליטות תאיות לא תקינות, עיגול והיפרדות נרחבים, או ירידה משמעותית בהתפשטות, שמרו אותם במדיום נטול תרופות והמתינו עד שהתאים יהיו בריאים ומתאחדים. לאחר מכן חזרו על השלבים החל משלב 1.7.
8. בעת יצירת תאים עמידים, תאי הורה עוברים עם מדיום המכיל DMSO כאמצעי בקרה. כוון את נפח ה-DMSO כך שיתאים לכמות ה-DMSO הנמצאת בטיפול הטקסול המתאים.
9. מדדו את חיוניות התאים בשלבים 1.2–1.4 כל 3–4 שבועות והמשיכו בהליך זה עד שמתקבל הבדל משמעותי (p < 0.05 או פי 10–50 תלוי בתרופה המיושמת) בין ערכי IC50 של קווי תאים הוריים ועמידים. הליך הגדלת המינון נמשך בדרך כלל 6–9 חודשים, בהתאם לתרופה שבה משתמשים.
10. לאחר השגת תאים עמידים יציבים, שומרים אותם במינון התחזוקה (המינון האחרון שהוחל) של התרופה תוך כדי טיפוח לשימור הפנוטיפ העמיד.
    הערה: יצירת תאים עמידים לכימו-כימיה בשיטת העלאת מינון היא תהליך ארוך זמן, ומשך הזמן תלוי במספר גורמים, כולל קו התאים, קצב גדילה פנימי והתרופה הכימותרפית הספציפית שבה משתמשים. בדרך כלל זה לוקח 6–9 חודשים, בהתאם לרמת ההתנגדות הקלינית הרלוונטית. גישה חלופית לקביעת הבדלים משמעותיים ברמות עמידות היא להעריך את ריכוז התרופות המינימלי שבו תאים עמידים שורדים, אך תאי ההורים אינם שורדים.
11. אפיון תאים עמידים: ביצוע ריצוף RNA, ווסטרן בלוטינג, תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובדיקות קיום תאים עם טיפול תרופתי (למשל, בדיקת יצירת מושבה) לאפיון פנוטיפ תאים עמיד. ודאו שאתם מעריכים מחדש את הפנוטיפ העמיד לאחר מספר מעברים כדי להראות שהפנוטיפ המוגבר של IC50 יציב לאורך זמן.

2. ייצור לנטיווירוס

1. יום 0: זרע תאי HEK293T כ-4 × 10⁶ לכל 100 מ"מ עם Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, להשגת 90% חיבור ביום הבא.
2. יום 1: הכינו תערובות פוליאתילנימין (PEI) ו-DNA ב-DMEM ללא סרום (-/-) בנפרד לכל וירוס. השתמשו בטבלאות 1 ובטבלה 2 כדי לכוונן את נפח וריכוזי PEI ו-DNA בהתאם לתפוקה הוויראלית הרצויה.
   הערה: PEI משמש פי ארבע מתוך סך המיקרוגרם של DNA (למשל, בלוח של 100 מ"מ, משתמשים ב-30 מיקרוליטר PEI לסך כולל של 7.5 מיקרוגרם DNA). ייצור וירוסים בצלחות 100 מ"מ מתבצע בפרוטוקול זה, והווירוס המופק מ-5–10 צלחות 100 מ"מ יאפשר ביצוע מסכים מרובים. לניסויי אימות או זיהומים בקנה מידה קטן, באר אחת של צלחת 6 בארות או צלחת 60 מ"מ מספיקה. מכיוון שפוליאתילנימין הידרוכלוריד ליניארי הוא סוכן טרנספקציה רעיל, ודא שחיבור התאים הוא 90% בזמן הטרנספקציה.
   1. לאחר ערבוב יסודי, הוסף את תערובת ה-DNA לצינור ה-PEI. ערבבו היטב ותנו לקומפלקסים של PEI-DNA לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. לאחר מכן מוסיפים את 600 מיקרוליטר של קומפלקס PEI-DNA ל-HEK293Ts, בדרופ. הניחו צלחות באינקובטור הווירוס למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
3. יום 2: החלפת המדיום של התאים הנגועים על ידי שאיבת ה-PEI והמדיה המכילה וירוס והוספת 8 מ"ל DMEM מלא לכל צלחת תרבית רקמה בגודל 100 מ"מ. דגרו את התאים כדי לאפשר ייצור ויראלי.
4. יום 3: ביצוע האיסוף הראשון של הווירוסים על ידי הוצאה עדינה של 8 מ"ל של סופרנטנט לצינור צנטריפוגה בגודל מתאים ואחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אם יש מספר לוחות לייצור הוויראלים, שלבו את הסופרנטנטים. לאחר מכן הוסף 8 מ"ל DMEM טרי ומלא לכל מנה והחזיר את הצלחות לדוגמת הווירוס.
5. יום 4: חזרה על שלבי האיסוף ושילוב עם סופרנטנטים מהיום השלישי.
   1. הכינו תמיסה של 50% פוליאתילן גליקול (PEG)-8000 במי מלח עם בופר פוספט (PBS) לקבלת תמיסת 5× PEG. אוטוקלאב כדי להתמוסס ולעקר.
   2. צנטריפוגות את הסופרנטנטים הוויראליים שנאספו ב-300 x גרם למשך 5 דקות לתאי הכדור השאריות, ואז ממשיכים לסינון.
   3. סנן 16 מ"ל של סופרנטנט ויראלי באמצעות פילטר של 0.45 מיקרון (בין אם במזרק או במסנן ואקום של 50 מ"ל) לתוך הצינור המכיל 4 מ"ל תמיסת PEG כדי להגיע לריכוז סופי של 1× PEG ולהסיר פסולת ותאים שנותרו.
   4. מכסה את הצינור וערבב באמצעות היפוך. חזור על השלב הזה לכל ההכנות לוויראלים. אחסן ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך, עם ערבוב עדין אופציונלי.
   5. ביום הבא אמורים להיות משקעים נראים לעין. צנטריפוגה את הצינורות ב-1400 x g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדורי ויראליים ששוקעים PEG עשויים להיאחסן בטמפרטורה של 4°C עד 5 ימים לפני הצנטריפוגה; עם זאת, הטיטר הוויראלי עשוי לרדת עם דגירה ממושכת.
   6. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך בזהירות את הסופרנאנט, ולהשאיר נפח קטן (כ-100 מיקרוליטר) בצינור כדי למנוע הפרעה לכדור.
   7. צנטריפוגה את הצינורות 5 דקות ב-300 x g כדי לאסוף כמה שיותר נוזל מהצדדים של הצינור. ואז זרוק בזהירות את הסופרנטנט שנותר.
   8. כדי לרכז את הווירוס פי 100, הוסף PBS ל-1/100 מהנפח ההתחלתי של הסופרנטנט הוויראלי לכדור והחזיר את הכדור על ידי פיפטינג (למשל, אם מתחילים ב-16 מ"ל סופרנטנט ויראלי, הוסיפו 120–140 מיקרוליטר PBS לכדור כדי להגיע לנפח הסופי של 160 מיקרוליטר, תוך התחשבות בנפח הכדור). הימנעו מפיפטינג אינטנסיבי; אליקו את הווירוס.
      הערה: הטיטר הצפוי לאחר ריכוז PEG הוא >1 ×^{10 8} חלקיקים זיהומיים למ"ל (ip/mL) עבור מערכת LentiGuide ו->1 × 10⁷ עבור מערכת LentiCRISPR. טיטרים הנמוכים בסדר גודל אחד עשויים עדיין להיות מקובלים, אך יש לאמת אותם מול ההדבקה של קו התאים היעד ונפח הווירוס הנדרש.
   9. אם ריכוז הווירוס אינו נדרש, יש להפריד את הווירוס כדי למזער מחזורי קיפאון-הפשרה. אחסן וירוס מרוכז או לא מרוכז בטמפרטורה של -80°C. אקונומיקה וצלחות אשפה.
      הערה: לתיאור מפורט יותר של ייצור וטיפול בלנטיויראל, הקוראים מוזמנים לפרוטוקולים^{מבוססים 20}. לבעיות נפוצות במהלך ייצור הלנטיווירוס, ראו טבלה משלימה 1.

	באר אחת של לוח 6 בארות	פלטת 60 מ"מ	פלטת 100 מ"מ	פלטת 150 מ"מ
נפח PEI (נפח מלאי של 1 מ"ג/מ"ל)	6 מיקרוליטר	9 מיקרוליטר	30 מיקרוליטר	60 מיקרוליטר
כרך DMEM (-/-)	54 מיקרוליטר	100 מיקרוליטר	270 מיקרוליטר	540 מיקרוליטר

טבלה 1: נדרשו נפחי PEI ו-DMEM לצלחות שונות עבור תערובת PEI.

	באר אחת של לוח 6 בארות	פלטת 60 מ"מ	פלטת 100 מ"מ	פלטת 150 מ"מ
VSV-G	75 ננוגרם	150 ננוגרם	375 ננוגרם	750 ng
גאג-פול	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
וקטור מטרה	750 ng	1500 ננוגרם	3750 ng	7500 ננוגרם
DMEM (-/-) כוון את הווליום הסופי ל-	60 מיקרוליטר	100 מיקרוליטר	300 מיקרוליטר	600 מיקרוליטר

טבלה 2: נדרשו נפחי פלסמיד ו-DMEM לצלחות שונות עבור תערובת ה-DNA.

3. הקמת בחירה אופטימלית של פורומיצין לתאי MDR

הערה: בתאים עמידים לכימיה המציגים ביטוי יתר של ABCB1, בחירת פורומיצין נכשלת בשל פליטת פורומיצין המופעלת על ידי ABCB1, מה שמונע בחירה יעילה של תאי sgRNA. כדי להתגבר על מגבלה זו, וראפמיל ניתן יחד עם פורומיצין כדי לעכב באופן זמני אפלוקס מתווך ABCB1, מה שמאפשר הצטברות תוך-תאית של פורומיצין והסרת תאים לא נגועים ביעילות.

1. קבעו את ריכוז הוורפאמיל שחוסם את פליטת התרופות המתווכת על ידי ABCB1 מבלי להשפיע על חיוניות התא. לשם כך, יש להשתמש בסוכן הכימותרפי שאליו נרכשה עמידות (במקרה זה, טקסול) בשילוב עם מינונים הולכים וגדלים של ורפאמיל.
   1. זרעים SUM159PT עמידים לטקסול ותאי הור ללוחות שחורים שקופים בתחתית עם 96 בארות ב-2 × 10^{תאים בשלושה} שכפולים. דגרו תאים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2.
   2. לטפל בתאים בדילול סדרתי של ורפאמיל (0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 ו-80 מיקרומון) תוך שמירה על ריכוז קבוע של הטקסול (למשל, מינון תחזוקה) בכל המצבים.
   3. לאחר 72 שעות טיפול, יש להעריך את חיוניות התאים באמצעות בדיקת כימות ATP מבוססת זוהר. קבעו את ריכוז הוורפאמיל שאינו מפחית את החיוניות לבדו (≥90%–95% בהשוואה לביקורת שלא טופלה) אך משיב את הרגישות בתאים עמידים.
2. כדי למצוא את ריכוז הפורומיצין לשימוש בשילוב עם וראפמיל, זרעים SUM159PT תאי עמיד לטקסול ללוח של 96 בארות ב-2 ×-10³תאים בכל באר. דגרו את הפלטה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2.
   1. הכינו דילול סדרתי של פורומיצין (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ו-40 מיקרוגרם/מ"ל) במדיום המכיל את ריכוז הווראפמיל שנקבע מראש וטפלו בתאים בהתאם.
   2. לאחר 72 שעות, מדדו את חיוניות התאים באמצעות בדיקת כימות ATP מבוססת לומינסנציה, וקבעו את הריכוז המינימלי של פורומיצין שמבטל את כל התאים (≤5% חיוניות) בנוכחות ורפאמיל. ריכוז זה ישמש לבחירה במהלך סקר CRISPR.
      הערה: שלבי אופטימיזציה של ריכוז התרופות תלויים בקו התאים ובהקשר. גורמים כמו רגישות פנימית לתרופות, רמות ביטוי נשאי ABC וקצב גדילה יכולים להשפיע על הריכוזים היעילים. לכן, בצע אופטימיזציה זו עבור כל מודל חדש של קו תאים והתנגדות. (לשם השוואה, 5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין בשילוב עם 20 מיקרומום ורפאמיל משמש לתאים עמידים לטקסול ששימשו במחקר^{זה 17}). לפתרון בעיות בבחירת פורומיצין + וורפאמיל, עיין בטבלה משלימה 1.

4. טיטרציה ויראלית וחישוב ריבוי זיהום (MOI)

1. יום -1: זרעים SUM159PT תאים עמידים לטקסול כ-2 × 10⁵ בכל באר של צלחת 6 בארות עם תערובת מלאה של Ham's F12.
2. יום 0: ביצוע ארבעה דילול סדרתי של הנגיף בתערובת החומרים המזינים F12 של Ham המכילה פרוטמין סולפט (PS) בעוצמה של 8 מיקרוגרם/מ"ל. (עבור וירוסים מרוכזים, התחל ב-1 מיקרוליטר ודילל פי עשרה בכל דילול כ-1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. עבור וירוסים לא מרוכזים, יש לכוון את הנפחים בהתאם (למשל, 100 מיקרוליטר > 10 מיקרוליטר > 1 מיקרו-ליטר > 0.1 מיקרוליטר).
   1. נתן 1 מ"ל של חומר המכיל וירוס לכל אחת מארבע הבארות. השאירו באר אחת כבקרת ברירה פורומיצין ובאר אחת כבקרה לא מטופלת.
3. יום 1: החלפת המדיה הוויראלית ב-2 מ"ל של חומר טרי 16 שעות לאחר ההדבקה.
4. יום 2: העברת תכולת התאים בכל באר לצלחת תרבית תאים בעובי 100 מ"מ עם תערובת תזונה F12 של Ham המכילה פורומיצין + ורפאמיל בריכוזים שנקבעו בשלב 3.2. אם תאים לא נבחרים מתאחדים יתר על המידה, זרעו שבר מוגדר (למשל, 1/2), וזה יילקח בחשבון בעת ביצוע החישובים הסופיים.
   הערה: מלא את המדיה בפורומיצין טרי + ורפאמיל, במידת הצורך, ב-3-4 הימים הבאים עד שכל התאים בפלטת הבקרה מתים.
5. ימים 4–5: כאשר התאים בלוח הבקרה מתים, קבעו את הלוחות שיש להם מספיק תאים לספירה. טריפסיניזציה של התאים, ספורים, וקבעו את מספר התאים הכולל.
6. לאחר ספירת תאים ברי קיימא, יש לחשב את יעילות הטרנסדוקציה ואת ריבוי הזיהום (MOI) כדלקמן (השתמש בטבלה המשלימים 2 כתבנית):
   1. חישבו את קצב ההעברה (חלק מהתאים הנגועים) באמצעות הנוסחה למטה
      
      
      N_נבחר: מספר התאים הכולל לאחר בחירת פורומיצין בבארות הנגועות
      N_בקרה: מספר כולל של תאים בבאר הבקרה הלא מומרת ולא נבחרה
      p: קצב הטרנסדוקציה (חלק מהתאים הנגועים).
      הערה: אם רק חלק קטן מתאי הביקורת שלא טופלו נזרע, יש לקחת זאת בחשבון בחישוב N_בקרה
   2. חשב את MOI. במהלך הטרנסדוקציה לנטיויראלית, אירועי הזיהום עוקבים אחרי התפלגות פואסון. לכן, שיעור התאים הנגועים לפחות בווירוס אחד מוגדר כך:
      p =1- e ^-MOI
      לכן, מחשבים את MOI כ:
      MOI = - ln(1-p)
   3. חישוב טיטר הלנטי-וירוס (חלקיק זיהומי/מיליליטר, IP/מ"ל) בהתבסס על מספר התאים הנגועים:
      טיטר (IP/mL) = (MOI x N_מתחיל)/ נפח הווירוס
      _{N התחלה}: מספר התאים שהוזרעו לזיהום
      נפח הווירוס: נפח הווירוס שנוסף לכל באר (במיליל)
      הערה: חשב את הטיטר של הלנטי-וירוס לכל זיהום בנפרד וקבע את הטיטר הסופי על ידי לקיחת ממוצע הבארות המציג את כמות הווירוס וערכי הטיטר הפרופורציונליים. בארות המציגות רוויה או סטייה מהקנה מידה פרופורציונלי צריכות להיפסל בחישובי טיטר.

5. יצירה ו/או אימות של קו תא יציב המבטא Cas9

הערה: שלב זה נדרש בעת שימוש ב-LentiGuide_EPIKOL. אם קו יציב של Cas9 מאומת כבר זמין, או אם LentiCRISPR_v2_EPIKOL בשימוש, פנה ישירות לסעיף 6.

1. הפיק את הלנטיווירוס Cas9 באמצעות וקטור LentiCas9_blast כפי שמתואר בסעיף 2.
2. להדביק תאים ביום הבא, במטרה ל-MOI של 10. חשב את כמות הנגיף לפי ה-MOI המיועד בסעיף 4, השתמש בכמות החישוב של נפח הנגיף, והעבר אותה ישירות לתאים בלוח המכיל תווך תרבית המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל פרוטמין סולפט (PS).
3. החלפת מדיום ויראלי במדיום טרי 16 שעות לאחר ההדבקה
4. למחרת, יש לבצע סלקציה של בלסטיצידין על ידי מתן חומר התרבית לתאים המכיל את הריכוז שנקבע מראש של בלסטיצידין (הריכוז הסופי נקבע לפי קו תאים עם בדיקת עמידות תאים כפי שמתואר בסעיף 3) עד שתאים לא נגועים יושמרו (בדרך כלל 6–7 ימים).
   הערה: אם תאים המבטאים את Cas9 מתורבתים לפרקי זמן ממושכים לפני הסקר, יש לחזור על בחירת הבלסטיצידינים כדי לחסל תאים שליליים ל-Cas9.
5. אימות Cas9 (מומלץ): אימות פעילות Cas9 באמצעות sgRNA בקרה המכוונים לגנים חיוניים (רצפי sgRNA זמינים בספריית EPIKOL; ראו טבלה משלימה 3) או מערכות דיווח כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להערכת יעילות הנוקאאוט והקינטיקה. שיטות אימות מפורטות ניתן למצוא במחקר קודם¹⁹.

6. זיהום וסקר בספריית הלנטיויראל של CRISPR בהדחפת CRISPR ברחבי האפיגנום

הערה: כדי להבטיח מיפוי מדויק מגנוטיפ לפנוטיפ, מסכי CRISPR מאוחדים דורשים זיהום עם MOI נמוך וכיסוי ספרייה מספק (בדרך כלל 500×–1000), בהתאם לחומרה הניסיונית ולהתנהגות קו התאים. לעקרונות כלליים של תהליכי סינון CRISPR משותפים ברחבי הגנום, כולל תכנון ספרייה והגדרת ניסויים, ראו פרוטוקולים^{שפורסמו בעבר 21,22}. עבור EPIKOL, שמירה על כיסוי >500x מומלצת בחום לאורך כל הסקר, שכן ירידה מתחת לסף זה מעלה את הסיכון לנפילת sgRNA סטוכסטית, במיוחד בזרוע הטיפול בסמים של המסך. החישובים הבאים נדרשים כדי לקבוע את מספר התאים ההתחלתי, יעילות ההעברה ונפח הווירוס הנדרשים כדי לבצע העברת EPIKOL זיהום MOI נמוך מבלי לפגוע במורכבות הספרייה.

1. יום -1: זרע כמות תאים כוללת שמחושבת למטה בצלחות תרבית תאים בגודל 100 מ"מ או 150 מ"מ עם מספר מתאים של תאים בכל צלחת.
   1. חשב את מספר התאים שנדבקו בהצלחה כדי להגיע לכיסוי הספרייה הרצוי (השתמש בטבלה משלימה 2 כתבנית):
      N_נגוע = (מספר sgRNAs) × (כיסוי מטרה)
   2. חשב את מספר התאים ההתחלתי לכל שכפול כדי לפצות על החלק של התאים הלא נגועים בעת זיהום MOI נמוך (0.3–0.4):
      N_מתחיל = N_נגוע/p
      כאשר p הוא קצב ההעברה (חלק מהתאים הנגועים) שנקבע על פי התפלגות פואסון (ראו שלב 4.6).
      הערה: התאמה זו מבטיחה שמספר מספיק של תאים נגועים ב-sgRNA בודדים יהיו בבריכה בעת זיהום MOI נמוך כדי להגיע לכיסוי הספרייה הרצוי.
2. יום 0 - טרנסדוקציה
   1. חשב את נפח הווירוס הנדרש לכל שכפול
      נפח ויראלי נדרש = (N_מתחיל × MOI) / (מדד ויראלי (נקבע קודם IP/mL))
      הערה: יעילות ההעברה בטווח MOI המטרה של 0.3–0.4 מתאימה בערך ל-
      26%–33% תאים עמידים לפורומיצין לפני הבחירה.
   2. הדביקו תאים בנפח הווירוס המחושב במדיית התרבית המלאה המכילה 8 מיקרוגרם/מ"ל פרוטמין סולפט (PS). הפחתת נפח המדיה כדי להגדיל את המגע בין וירוס לתאי הנגיף בזמן הדבקה (למשל, 8 מ"ל במקום 10 מ"ל לפלטה של 100 מ"מ)
   3. הכינו תערובות זיהום עצמאיות לכל שכפול ביולוגי.
      הערה: מומלץ לפחות שני שכפולים ביולוגיים; שלושה מועדפים. שכפולים ביולוגיים חייבים להיות מועברים, נבחרים ומתוחזקים בנפרד (כולל שינויים במדיה והעברת נתונים) ואסור לאגד אותם בשום שלב לפני הריצוף.
3. יום 1 - החלפת מדיה ויראלית במדיה טרייה לאחר 16 שעות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2
4. יום 2 - בחירת תאים מומרת: יישום ברירה פורומיצין בנוכחות ורפאמיל (ריכוזים שנקבעו בשלב 3.2) להעשיר תאי sgRNA נגועים בתאים עמידים לטקסול SUM159PT. המשך את הבחירה עד שכל התאים בלוח הבקרה הלא נגוע יוסרו (בדרך כלל ~3 ימים).
5. יום 5 - דגימת ייחוס T₀ : לאחר השלמת בחירת פורומיצין + וורפמיל, טריפסיניזציה של התאים ואספו כדור תא בנקודת זמן התחלתית של זמן אפס (T₀) מכל שכפול ביולוגי המתאים לרמת הכיסוי שנקבעה במהלך ההעברה. מכיוון שהוא ישמש כהפניה להפצת ספרייה ראשונית, יש לאסוף כדורי תאים מיד עם סיום הבחירה, לפני שמתרחש אובדן תאים. תזרע מספיק מספרי סלולריים כדי לשמור על כיסוי בכל עת.
   הערה: לאחר בחירת פורומיצין + וורפמיל, מספר התאים המומרת ששרדו ישתנה בהתאם לזמן ההכפלה של קו התאים וליעילות ההעברה שהושגה. האוכלוסייה ששרדה בדרך כלל מתאוששת לצפיפות הזריעה הראשונית עם סיום הסלקציה, ועלולה לעלות עליה בקווי תאים שגדלים במהירות. אם מספר התאים שנותר מאפשר, אסוף מספר כדורי T₀ והקפא דגימות גיבוי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. בנוסף, תאים נגועים ב-EPIKOL יכולים להיות מוקפאים בחנקן נוזלי תוך שמירה על כיסוי. מאגרי הגיבוי הללו ניתנים להפשרה במקרה של כשל מסך בלתי צפוי או לגישות ניסוי חלופיות עתידיות (למשל, בדיקת טיפולים תרופתיים נוספים). בדוק את יעילות ההעברה באמצעות פלטת בקרה לא מזוהמת כדי לוודא שהיעילות המיועדת בהמרה הושגה (ראו סעיף 4). אם יעילות ההעברה שנצפתה גבוהה מהמצופה, יש להחזיר את הניסוי כדי לוודא שהטרנסדוקציה מתבצעת ב-MOI נמוך, מה שמונע אינטגרציה מרובה של sgRNA לכל תא.
6. ביצוע מסך: לאחר השלמת עריכת הגנום בתיווך Cas9, למשך הזמן שנקבע בסעיף 5, פיצול התאים לקבוצות טיפול.
   הערה: בדרך כלל זה לוקח 7–9 ימים לאחר ההעברה, שכן יעילות הנוקאאוט המקסימלית מושגת בערך ביום 7 לאחר ההעברה^. למטרות אפיגנטיות, חלון של 9 ימים מאפשר גם שינויים ברמת הכרומטין לפני תחילת הברירה התרופתית.
   1. פיצול תאים לזרועות ניסיוניות תוך שמירה על כיסוי: אחד הוא זרוע הביקורת שהיא מצב בסיסי שמקבל DMSO, והשני הוא זרוע הטיפול שמקבל את המצב המקבל טקסול.
   2. לשמור על תרביות להכפלת אוכלוסייה בגילאי 14–16. רמת הכפלת האוכלוסייה (PDL) מחושבת כך:
      PDL = PDL_s + 3.322 (Log C_f – log C_i)
      PDL_s = רמת הכפלת אוכלוסייה התחלתית
      C_i = מספר תא התחלתי שהוזרע
      C_f = מספר התאים הכולל בסוף תקופת הגדילה
   3. בכל מעבר, יש לעקוב אחר הקיימות והקינטיקה של הצמיחה ולהימנע מצווארי בקבוק על ידי שמירה על מספר תאים מספק. כוון את עוצמת הטיפול אם מתרחש מוות תאים מופרז.
      הערה: שאפו לאסוף כדורי תאים גיבוי בכל קטע, שבועי או ב-PDLs מסוימים במהלך המסך. דגימות הגיבוי הללו עשויות לשמש כנקודות זמן חלופיות לריצוף או כדגימות אופטימיזציה לתהליך חילוץ ה-DNA הגנומי. שימור תאים בקריורפורד מדי פעם כדי למנוע אובדן תאים בלתי צפוי.
7. דגימה_סופית T סופית: עם הגעה ל-PDL הרצוי, לאסוף כדורי נקודת זמן סופיים (T_סופי) לכל שכפול ומצב על ידי שמירה על כיסוי הספרייה לכל כדור. אחסן כדורים בטמפרטורה של -80°C עד להפקת gDNA במורד הזרם.
   הערה: שאפו לסיים את המסך ב-PDLs דומים בין הזרועות, גם אם משך התרבית משתנה בין מצבים.

7. חילוץ DNA גנומי

1. חילוץ DNA גנומי (gDNA) באמצעות שיטה מאומתת (למשל, MN NucleoSpin Tissue Kit), עם התאמות פרוטוקול קלות לשיפור יעילות הליזה מכדורי תאים גדולים ומאוגדים.
   1. עקבו אחרי פרוטוקול הרקמה ולא לפי פרוטוקול התא בגלל גודל הכדור הגדול. שקול להגדיל את נפחי המגיב ולהשתמש במספר עמודות ספין לכל כדור תא (לא לעלות על 5 × 10^{או 6} תאים בעמודה) במידת הצורך כדי להבטיח ליזיס יעיל.
      הערה: לפני הליזיס, השעיית הגלולה עם כמות מינימלית של PBS (~50 מיקרוליטר) יכולה לשפר את יעילות הליזה. פירוק לא שלם של הכדור עלול לסתום את עמוד הספין, מה שמוביל לירידה בתפוקת ה-DNA.
   2. פעל לפי המלצות להסרה בתפוקה גבוהה ובריכוז גבוה. gDNA אלוט בנפח מופחת של בופר שחרור (כ-2/3 מהנפח המומלץ) לכל עמודה, במיוחד אם כדורי התאים חולקו למספר עמודות.
2. מדדו את איכות וכמות ה-gDNA (למשל, Nanodrop).

8. הכנת ספריית ריצוף EPIKOL מ-DNA גנומי

1. השתמש בארון PCR ייעודי לביצוע כל שלבי ה-PCR בספרייה למניעת זיהום פלסמיד במהלך PCRs של gDNA, שכן תבניות הפלסמיד מתגברות ביעילות רבה יותר מ-DNA גנומי ועלולות לעוות את התפלגות ה-sgRNA.
   1. נקה את מרחב העבודה, המיקרופיפטות והמדפים עם 10% אקונומיקה ו-70% אתנול, בהתאמה.
   2. עליקווט את כל התגובות (במיוחד פריימרים) בנפחים חד-פעמיים לפני השימוש כדי להפחית את הסיכון לזיהום צולב ומחזורי הקפאה-הפשרה.
   3. אחסן חומרים בטמפרטורה של -20°C ושמור אותם על הקרח בזמן ההגדרה של PCR.
2. אופטימיזציה של נפח הקלט ההתחלתי של gDNA על ידי מיקוד בכיסוי של 200×–500× לכל sgRNA כדי לשמור על מורכבות ספרייה מתאימה. דוגמה: בספריית EPIKOL, gDNA מופקים רצוי מכדורי תאים שנאספו בכיסוי של 1000×, וכיסוי סופי של 250× משמש להגברת gDNA.
   1. חשב את קלט ה-gDNA הנדרש עבור הכיסוי הרצוי כך.
      כמות gDNA = (מספר sgRNAs) × כיסוי × (66pg DNA/גרעין)
      דוגמה: 8000 gRNA × (250× כיסוי) × (6.6 pg DNA/גרעין) = 13.2 מיקרוגרם gDNA לדגימה צריך להיות מוגבר.
   2. בצע בדיקת PCR באמצעות תנאי תגובה חיצוניים ופנימיים של PCR בטבלה 3, טבלה 4, טבלה 5 וטבלה 6 עם כמויות הולכות וגדלות של gDNA בכל תגובה (למשל, 1 מיקרוגרם, 3 מיקרוגרם, 6 מיקרוגרם) כדי לקבוע את כמות ה-gDNA האופטימלית לכל צינור.
      הערה: קלט לא מספק של gDNA או מחזור יתר של PCR עלולים ליצור הטיית הגברה ולעוות את כיסוי ה-sgRNA.
   3. הרץ ג'ל אגרוז 2% כדי לנתח מוצרי PCR פנימיים. ודא שרצועה בהירה של כ-350 בסיסים נצפה.
   4. בהתבסס על כמות ה-gDNA האופטימלית לכל צינורה, קבעו את סך תגובות ה-PCR הנדרשות לכל דגימה כדי להשיג את כיסוי הספרייה הרצוי, תוך הימנעות מכמויות מופרזות של gDNA לכל תגובה בודדת.
      הערה: אם נדרש 13.2 מיקרוגרם gDNA כולל ו-3.3 מיקרוגרם gDNA בכל תגובה מניבים הגברה אופטימלית, יש להכין ארבע תגובות PCR מקבילות עם 3.3 מיקרוגרם gDNA בנפח תגובה של 100 מיקרוליטר. בהקשר זה, נפח ה-gDNA לא צריך לעלות על 10% מנפח התגובה כדי למנוע עיכוב PCR עקב קלט תבניות מופרז.
3. הגברת קלטות sgRNA מתוך תבנית gDNA (PCR ראשון/חיצוני)
   1. הגבר אזורים גנומיים המכילים את קלטת sgRNA הלנטיויראלית האינטגרטיבית באופן יציב באמצעות הפריימרים המפורטים בטבלה המשליפה 2. בצע תגובות PCR עם כמות ה-gDNA שנקבעה בשלב 8.2 (ראו טבלה 3) באמצעות תנאי תגובת PCR בטבלה 4. הכינו צינור בקרה PCR ללא תבנית DNA לבדיקת זיהום אפשרי, ושמרו את הצינורות על הקרח כל הזמן.
   2. מוסיפים סוף סוף DNA פולימראז, ערבבו היטב על ידי טפיחה או פיפטינג, וסובבו בקצרה את צינורות ה-PCR לפני שמכניסים אותם למחזור התרמי. בצע הפעלה חמה כדי למנוע הגברה לא ספציפית.
   3. לאחר סיום ה-PCR החיצוני, אסוף את כל תגובות ה-PCR בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. ניקוי PCR או ויזואליזציה של ג'ל לאחר PCR חיצוני אינם נדרשים. השתמש במוצר ה-PCR המשותף ישירות כתבנית ב-PCR השני (הפנימי). אחסן מוצרי PCR בטמפרטורה של -20°C.

ריאגנט	נפח לתגובה
dNTP (10 mM כל אחד)	2 מיקרוליטר
פוזיון פולימראז	1 מיקרוליטר
בופר GC בקוטר 6'	20 מיקרוליטר
פריימר קדמי (10 מיקרומטר)	5 מיקרוליטר
פריימר הפוך (10 מיקרומטר)	5 מיקרוליטר
gDNA	X μL
מים ללא נוקלאז	עד 100 מיקרוליטר (67–X מיקרוליטר)
סך הכל	100 מיקרוליטר

טבלה 3: תגובות נדרשות ל-PCR הראשון/חיצוני.

מספר מחזור	דה-טור	אנילינג	הרחבה
1	95 °C, 3 דקות
2–19	95 מעלות צלזיוס, 25 ש'	65 מעלות צלזיוס, 20 ש'	72°C 15 שניות
20			72 °C 3 דקות

טבלה 4: תנאי PCR עבור ה-PCR הראשון/חיצוני.

4. ביצוע ברקידוד אינדקס (PCR שני/פנימי) וחילוץ ג'ל
   1. במהלך ה-PCR השני (הפנימי), משתמשים בפריימר אינדקס הפוך לברקודינג לדגימות; לכן, השתמשו בפריימרים אינדקסים שונים לכל דגימה.
      הערה: עבור ספריות שנוצרו באמצעות עמוד השדרה pLentiCrispr v2 , השתמשו בפריימרים הפוכים שמסתיימים בבסיסי CT, המסומנים כ-lenticrisprv2_rev(אינדקס X) (ראו טבלה משלימה 2).
   2. עבור ספריות שנוצרו באמצעות עמוד השדרה של pLentiGuide , השתמש באינדקסים שמסתיימים בבסיסי GT ומסומנים כ-rev_index_X בטבלה משלימה 2.
   3. הכינו תערובת פריימר מדורגת קדימה על ידי שילוב של 2 מיקרו ליטר מכל אחד מתשעת הפריימרים המדורגים (100 מיקרומטר מקורי) והוספת 162 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. הריכוז הסופי של תערובת הפריימר יהיה 10 מיקרומון.
   4. השתמשו במוצר ה-PCR החיצוני המאוחד כקלט ובצעו שתי תגובות PCR פנימיות מקבילות של 100 מיקרוליטר לכל דגימה, באמצעות ההוראות בטבלה 5 וטבלה 6. הכינו תגובת בקרה PCR באמצעות בקרת 'ללא תבנית' מ-PCR חיצוני (שלב 7.3) כקלט למעקב אחר זיהום פוטנציאלי.
   5. הוסיפו DNA פולימראז לבסוף, ערבבו היטב על ידי נקישה או פיפטינג, סובבו לזמן קצר את צינורות ה-PCR לפני שמכניסים אותם למחזור התרמי. בצע הפעלה חמה כדי למנוע הגברות לא ספציפיות.
   6. שלב והפעיל תגובות PCR פנימיות בג'ל אגרוז 2% כדי להפריד את האמפליקון המטרה.
      הערה: אין לזהות רצועות בבקרות ה-PCR ללא תבנית. יש להקפיד על רצועה מובחנת סביב 337 bp ל-LentiCrispr_V2 ו-357 bp לספריות LentiGuide. רצועת עליונה לא ספציפית של כ-500 bp עשויה להיות קיימת גם היא ויש להוציא אותה מהעיבוד במורד הזרם.
   7. טעון 12 מיקרוליטר (10 מיקרוליטר של מוצר PCR + 2 מיקרוליטר צבע טעינה) של מוצר PCR פנימי כדי להמחיש את הרצועות, וטעין את שאר מוצר ה-PCR בבארות מאוחדות או סמוכות המיועדות להפקת ג'ל. מזער את עובי האגרוז כדי למקסם את שחזור ה-DNA. הימנעו מחשיפת נתיבי חילוץ הג'ל במהלך הוויזואליזציה כדי למזער את נזק ה-DNA שנגרם מ-UV במהלך כריתת הג'ל.
   8. מוצרי Purify PCR מג'ל אגרוז באמצעות ערכת חילוץ ג'ל ייעודית (למשל, NucleoSpin Gel ו-PCR Clean-up) בהתאם להוראות היצרן. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. אחסן מוצרי PCR בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: נדרש ריכוז מינימלי של >20 ng/μL לאחר חילוץ ג'ל לצורך ריצוף נכון. אם לא ניתן להשיג את התפוקה הנדרשת אפילו עם שלוש תגובות PCR פנימיות מקבילות, בודדו gDNA חדש וחזרו על התהליך.

ריאגנט	נפח לתגובה
dNTP (10 mM כל אחד)	2 מיקרוליטר
פוזיון פולימראז	1 מיקרוליטר
בופר GC בקוטר 6'	20 מיקרוליטר
פריימר Forward Stagger Mix (10 מיקרומטר)	5 מיקרוליטר
פריימר אינדקס הפוך (10 מיקרומטר)	5 מיקרוליטר
PCR חיצוני	5 מיקרוליטר
מים ללא נוקלאז	62 מיקרוליטר
סך הכל	100 מיקרוליטר

טבלה 5: מגיבים נדרשים ל-PCR השני/פנימי.

מספר מחזור	דה-טור	אנילינג	הרחבה
1	95 °C, 3 דקות
2–25	95 מעלות צלזיוס, 25 ש'	65 מעלות צלזיוס, 20 ש'	72°C 15 שניות
26			72 °C 3 דקות

טבלה 6: תנאי PCR עבור ה-PCR השני/פנימי.

9. רצף

1. קבעו את מספר הקריאות הממופות הנדרש בהתבסס על כיסוי הספרייה המוגדר בתחילת המסך. בהנחה של יעילות מיפוי של 60%–70%, יש לבקש מספר גבוה יותר של קריאות כוללות כדי לפצות על אובדן הקריאה. לכיסוי של 1000× ספריית EPIKOL, נדרשות ~8 מיליון קריאות ממופות, המקבילות ל-10–12 מיליון קריאות בסך הכל.
2. לבצע בקרת איכות של ספריות הריצוף באמצעות Tapestation או Bioanalyzer לפני הריצוף כדי לאשר את גודל הספרייה ושלמותה.
3. אוספים ספריות רצף מדגימות שונות לפני ריצוף, מכיוון שהן מקודדות באופן ייחודי עם פריימרים של אינדקס.
4. אשר את מבנה הקריאה (כיוון R1/R2) ודרישות דה-מולטיפלקסינג עם מתקן הסיקוונסינג. 2× רצף זוגות של 150 bp מוצע ב-Illumina HiSeq, Novaseq או פלטפורמת ריצוף תואמת Illumina מקבילה. שקול לבקש לפחות 5% PhiX spike-in כדי לשפר את הגיוון ברצף.

10. סקירה של ניתוח ריצוף עבור EPIKOL

1. השתמש בצינור הניתוח MAGeCK לניתוח קבצי FASTQ בקצה הזוגי²⁴. ארגן כל שכפול ביולוגי כקובץ קלט נפרד.
2. השתמש בקובץ הקלט sgRNA של EPIKOL התואם ל-MAGeCK כספריית ייחוס (מסופקת בטבלה משלימה 4) ויישם את פונקציית הספירה כדי לכמת קריאות sgRNA מקבצי FASTQ בודדים ליצירת קבצי ספירה גולמיים לכל שכפול ומצב.
   1. נרמול כל קובץ ספירה באמצעות נרמול Reads per million (RPM) כדי לבדוק את איכות וההתפלגות של כל דגימה על ידי המחשת גרפי ספירת sgRNA המנורמל¹⁴.
3. בצע פונקציית -ספירה שנייה למיזוג ספירות לקובץ יחיד באמצעות נרמול חציוני עם הגדרות ברירת מחדל.
4. הרץ פונקציית -test לזיהוי שינויים ברמת הגן באמצעות קבצי ספירת גולם מאוחדים. כדי להעריך את ביצועי המסך, השוו דגימות_סופיות של T לדגימות T₀ ובדוק את התפלגות ה-sgRNA המרכזי שאינם ממוקדים בבקרה ובעלי מטרה גנטית חיונית.
   הערה: חשוב להעריך את דלדול גני הבקרה החיוביים בכל זרוע מסך כדי להעריך את ביצועי המסך. צפוי לראות שונות ביולוגית בין שכפולים בזרוע המסך המטופלת בתרופות, שכן חשיפה לתרופות עלולה לגרום להבדלים סטוכסטיים בתגובה התאית. שונות זו טבועה במסכי כימורזיסטנס ואינה בהכרח מצביעה על איכות מסך ירודה. לכן, במהלך קריאות פגיעה, יש לנתח לפחות שלוש חזרות ביולוגיות יחד, ויש לקבוע פגיעות כגנים שיש להם לפחות 6 sgRNA יעילים מתוך 10.
5. כדי לזהות שינויים שנגרמו על ידי תרופות בשפע sgRNA ובהשפעות ברמת הגנים, השוו דגימות שטופלו_{בטסטוסטרון סופי} בטקסול_{ל-T סופי-DMSO}, תוך שימוש בקבוצת DMSO כקבוצת ביקורת.
6. יש ליישם סף קצב גילוי שגוי (FDR) של FDR < 0.05 כדי לזהות גנים מדוללים בקבוצת הטיפול ולחשוף את הגנים התורמים לכושר או עמידות של התאים העמידים לטקסול.

תוצאות

כדי לחקור רגולטורים אפיגנטיים של כימורזיסטנס ב-TNBC, הפרוטוקול הכולל המשתמשת בקו התאים SUM159PT מוצג באיור 1. ראשית, ערכי IC₁₀ ו-IC₅₀ של טקסול בתאי SUM159PT נקבעו על ידי טיפול בתאים בריכוזים עולים של טקסול (איור 2A). שיטת העלאת מינון מדורגת שימשה ליצירת תאי SUM159PT עמידים לטקסול. לאחר מספר חודשים, שינוי בערכי IC50 ממחיש את הקמת הפנוטיפ העמיד באמצעות פרוטוקול זה, בהשוואה לתאי ביקורת שעברו במקביל ללא חשיפה לטקסול (איור 2B).

איור 1: סכמטי של מסך EPIKOL בתאי SUM159PT עמידים לטקסול. זרימת העבודה הכוללת של סקר EPIKOL בתאי SUM159PT עמידים לטקסול שנוצרו. הדמות נוצרה עם BioRender.com אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

לאחר שהתאים העמידים התבססו, נערכו מספר ניסויים לאפיון השינויים הפנוטיפיים והמולקולריים שלהם. יכולות ההתרבות של תאים עמידים תחת טיפול בטקסול הוערכו באמצעות בדיקת היווצרות מושבה בהשוואה לתאים הוריים. כפי שנראה באיור 2C,D, תאים עמידים שומרים על יכולת ההתרבות שלהם תחת טיפול בטקסול בעוד שתאי ההורים אינם יכולים לשרוד. בדיקה זו היא אחד השלבים החשובים באפיון תאים עמידים ומדגימה כיצד ניתן להעריך יכולת רבייה תחת טיפול תרופתי בין תאים הוריים לתאים עמידים.

כחלק מאפיון התאים העמידים, בוצע ריצוף RNA על תאים הוריים ועמידים לניתוח השינויים הטרנסקריפטומיים הקשורים לכימורזיסטנס (איור 2E). בין הגנים המוסדרים ביותר בתאים עמידים היה ABCB1, ואחריו הגיעו כמה נשאי ABC נוספים, כולל ABCB4 ו-ABCA5. הגברת ביטוי ABCB1 אומתה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), וזה ממחיש כיצד ניתן לאמת שינויים מועמדים בביטוי גנים באמצעות qPCR (איור 2F).

איור 2: יצירת תאים עמידים ואפיונם. (א) סכמטי המציג את יצירת תאי SUM159PT עמידים לטקסול באמצעות שיטת העלאת המינון. (B) עקומת תגובת המינון המראה את ההבדל בין ערכי IC50 של תאים הוריים ועמידים שנוצרו. IC50 הורי = 6 ננומטר ו-IC50 עמיד לטקסול = 355.4 ננומטר. (ג) בדיקת היווצרות מושבה בנוכחות טקסול. (D) כימות אזורי מושבה ב-(C) ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA) עם מבחן הפוסט-הוק של Tukey יושם באמצעות Prism 8 (תוכנת GraphPad). רמות המובהקות נקבעו כ-*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. (ה) גרפים של Volcano המציגים גנים מבוטאים באופן שונה בתאי Taxol-Res בהשוואה לתאים הוריים, עם חיתוך LFC>2 ו-p<0.001. (F) אימות qPCR של ביטוי mRNA של ABCB1 בתאי הורים ותאי Taxol-Res. ערכי P שנקבעו על ידי מבחן t דו-זנבי של סטודנט בהשוואה לקבוצת הביקורת; **P < 0.01. פאנל א' נוצר עם BioRender.com. איור פאנל E שונה באישור ידייר-ביירם ואח' ¹⁷. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לאחר שהראה ביטוי יתר של ABCB1 ומובילי ABC אחרים בתאים עמידים לטקסול והתחשבות בספקטרום הסובסטרט הרחב של ABCB1, הוערך נוכחותו של פנוטיפ MDR. לשם כך, תאים עמידים לטקסול טופלו בתרופות מרובות שידועות כסובסטרטים של מוביל ABCB1 ויש להן מנגנוני פעולה שונים, והרגישות שלהם לתרופות הוערכה (איור 3A,B). בהתאם לפרופיל הביטוי של נשאי ABC שנצפה, תאים עמידים לטקסול הראו גם עמידות לדוקסורוביצין ווינקריסטין, מה שמאשר את נוכחות פרופיל MDR וממחיש כיצד ניתן להעריך פונקציונלית פנוטיפ עמידות רב-תרופתית.

פנוטיפ MDR מהווה אתגר בגישת הסינון המבוססת על CRISPR, EPIKOL, שכן הספרייה דורשת בחירת פורומיצין להעשיר תאים שעברו טרנסדוקציה. מכיוון שניתן לשאוב פורומיצין מהתאים באמצעות תרופה אפלוקס המתווכת על ידי ABCB1, סלקציה פורומיצין עשויה שלא להיות יעילה בתאים עמידים (איור 3C). לכן, תאים לא מומרת יכולים לשרוד סלקציה ובכך לבלבל את תוצאות המסך.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, תהליך הבחירה של תאים עמידים לכימיה עם פרופיל MDR אופטימיזציה לפני סקר EPIKOL. Verapamil, מעכב ABCB1 דור ראשון, שימש לחסימת אפלוקס תרופות מתווכת נשא ABC, ובכך אפשר הצטברות תוך-תאית של תרופות כימותרפיות או פורומיצין (איור 3D). למרות שווראפאמיל לבדו לא השפיע על חיוניות התאים, הוא החזיר את רגישות התרופות בשילוב עם תרופות כימותרפיות (איור 3E,F). באופן דומה, עקומות ההרג של פורומיצין בשילוב עם מינונים לא רעילים של ורפאמיל הראו כי עיכוב ABCB1 משיב את הרגישות לפורומיצין (איור 3G,H). זה מבטיח שתאים ששורדים את הברירה הם אלה שעוברים טרנסדוציה מוצלחת, ולא תאים שנמלטים מהברירה בעקבות אפלוקס תרופה מונע על ידי ABCB1. הקמת תהליך בחירה יעיל בתאים עמידים לכימפולציה היא קריטית לתוצאות סקר EPIKOL אמינות.

איור 3: פנוטיפ עמידות לרב-תרופות והשפעת הוורפאמיל על תאים עמידים. עקומות תגובת המינון המציגות את ההבדל בין ערכי IC50 של תאים הוריים ותאים עמידים שנוצרו עם (א) דוקסורוביצין, (ב) וינסריסטין, (ג) פורומיצין. (ד) סכמטי המראה את בחירת תאי SUM159PT עמידים לטקסול עם ובלי ורפאמיל. הדמות נוצרה עם BioRender.com. (ה) בדיקת קיום תאים עם תאי טקסול-רס לקביעת ריכוז אופטימלי של ורפאמיל עם טקסול. (ו) ורפאמיל מחזיר רגישות לתאים עמידים לטקסול לטקסול. (ז) ורפאמיל אינו משנה את תגובת תאי ההורים לפורומיצין. (H) ורפאמיל משיב את הרגישות לפורומיצין בתאי טקסול-רס. לוחות A, B ו-F שומשו מחדש באישור Yedier-Bayram ואח' ¹⁷. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

כדי למצוא רגולטורים חדשים של כימו-עמידות ב-TNBC, בוצע סקר EPIKOL עם תאי SUM159PT עמידים לטקסול כפי שמודגם באיור 4A. מכיוון שתאים עמידים גדלים לאט יותר מתאים הורים¹⁷, רמות הכפלת האוכלוסייה נבדקו לאורך כל הסקר הן בקבוצות טקסול והן בקבוצות שטופלו ב-DMSO כדי לקבוע את הזמן הנדרש להגיע ל-16 הכפלות אוכלוסייה (איור 4B). בהתאם לכך, סקר EPIKOL עבור קבוצת ה-DMSO הושלמה בסביבות היום ה-35, בעוד שהקבוצה שטופלה בטקסול עברה גידול נוסף של 15 ימים כדי להגיע לרמת הכפלת אוכלוסייה זהה.

לאחר הריצוף, צינור הניתוח MAGeCK שימש לשילוב השפעת sgRNA המכוונים לאותו גן כדי לחשוף את השינויים ברמת הגן לאחר הדחיפה²⁴. ספריית EPIKOL כוללת sgRNA המכוונים לגנים חיוניים כביקורת חיובית, הצעד הראשון לבקרת איכות היה להעריך האם ה-sgRNA הללו התרוקנו כמצופה. גרפים של מפלי מים ממחישים את השינויים ב-Log2 של גנים חיוניים בהשוואות שונות (איור 4C–E). כאשר דגימות נקודת זמן סופיות מתנאים שטופלו ב-DMSO או בטקסול הושוו לנקודת הזמן הראשונית, כמעט כל הגנים החיוניים התרוקנו עם ההכרעה, מה שמעיד על ביצועי מסך יעילים (איור 4C,D). עם זאת, דלדול זה אינו נראה בבירור כאשר שני דגמי הקצה (מטופלים ב-DMSO וטופלו בטקסול) הושוו זה לזה, כפי שמצופה, שכן גנים חיוניים נדרשים להישרדות התאים בשני התנאים (איור 4E).

המחשה חלופית של תוצאות המסך היא גרף הר געש, שמציג את השינויים ב-Log2 יחד עם מובהקות סטטיסטית (ערך p או ערכי FDR). בסקר EPIKOL שבוצע בתאים עמידים לטקסול, זוהו מספר גנים חיוביים כבעלי דלדול משמעותי, מה שתומך עוד יותר באמינות הסקר, שכן דלדול sgRNA המכוון לגנים חיוביים ממחיש בקרת איכות טיפוסית של סקר מוצלח (איור 4F). בנוסף לבקרות גנים חיוניות, ספריית EPIKOL כוללת sgRNA ביקורת חיובית ספציפית להקשר, המכוונים למספר גנים של מובילי ABC. כצפוי, ספירות מנורמלות של sgRNA של ABCB1 בקבוצות שונות הדגישו את הירידה המשמעותית ב-sgRNA המכוונים ל-ABCB1 במיוחד בקבוצת הטקסול (איור 4G). בסך הכל, הדבר מדגים כיצד ניתן לפרש שינויים ברמת sgRNA כדי לזהות גנים מועמדים הקשורים לתגובה לתרופות.

איור 4: מסך EPIKOL מביא לתאים עמידים לטקסול וגרפים לדוגמה. (א) סכמטי של פרוטוקול מסך EPIKOL. (ב) רמת הכפלת האוכלוסייה (PDL) של תאי טקסול-רס. (C–E) תרשימי Waterfall המציגים תוצאות מסך EPIKOL על תאי Taxol-Res, המדגישים גנים חיוניים, קבוצת DMSO מטופלת בהשוואה לנקודת הזמן הראשונית בפאנל C, הקבוצה שטופלה בטקסול לעומת נקודת הזמן הראשונית בפאנל D, קבוצת הטיפול בטקסול לעומת קבוצת ה-DMSO בפאנל E. (F) תרשים Volcano המציג Log2Foldשינויים של גנים בדגימות שטופלו בטקסול בהשוואה לנקודת הזמן הראשונית. גנים עם p<0.05 נצבעו וסומנו. מספר זה שונה מפרסום קודם¹⁷. (G) קריאה למיליון (סל"ד) של 10 גרפים שונים של ABCB1 sgRNA מ-EPIKOL. פאנל א' נוצר עם BioRender.com. פאנל E שומש מחדש באישור ידיר-ביירם ואח' ¹⁷. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה משלימה 1: טבלת פתרון תקלות.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: חישוב טיטר ו-MOI ויראלי.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 3: רשימת sgRNA של ספריית EPIKOL.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 4: פריימרים המשמשים בהכנת ספריית ריצוף EPIKOL. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

שיטות סקר מאוחדות מבוססות CRISPR-Cas9 מבוססות היטב בהקשרים תאיים שונים. עם זאת, סקר בתאים עמידים לכימיה מציב אתגרים ברורים ודורש אופטימיזציה נוספת. מכיוון שתאים עמידים לכימיה משמשים כמודלים חשובים לחקר הפגיעות של גידולים עמידים לכימות, חשוב להתמודד עם מגבלות אלו באסטרטגיות סקר לזיהוי אמין של רגולטורים גנטיים או אפיגנטיים של כימוזיסיות.

יצירת קווי תאים עמידים לכימיה עצמה עלולה להיות מסורבלת ותלויה מאוד בתרופה הכימותרפית. בעוד שתאים עשויים להסתגל בקלות לתרופות מסוימות, הם עלולים להיות רגישים^{מאוד לאחרות}. לכן, חשוב לקבוע ערכי IC50 ספציפיים לקו התאים לפני פרוטוקול יצירת קו התאים העמיד. במקרים שבהם תאים אינם סובלים חשיפה לתרופות ברמת IC50 לאורך מספר מעברים, ניתן להתחיל בריכוז תרופה נמוך יותר (למשל, IC10-20) (ראו סעיף פרוטוקול 1)¹⁷. מכיוון שרכישת ההתנגדות היא אירוע סטוכסטי, ניתן לטפל בו זמנית מספר בארות/לוחות תאים כדי להגדיל את הסיכוי לקבל תאים עמידים. חשוב לאפיין באופן מקיף את אוכלוסיית התאים העמידים לתרופות כדי לתאר שינויים שעתוק ופנוטיפיים במהלך תהליך העלאת המינון, בהשוואה למצבם התמים. גישות פרופיל גלובליות כמו RNA-seq יכולות לשמש לזיהוי גנים המובעים באופן שונה ביחס לקו ההורה. פונקציונלית, יש לאמת עמידות נרכשת לתרופות באמצעות בדיקות חיוניות והתרבות של תאים, כדי להוכיח שתאים עמידים שומרים על הישרדות בתנאי טיפול תרופתי שהם ציטוטוקסיים לתאים הוריים. כמו כן, יש למדוד שינויים פוטנציאליים בקיבולת ההתרבות ובקצב הגדילה שלהם בהשוואה לקו התאים ההורי כדי לחשב את ה-PDL שלהם. מכיוון שידוע כי עמידות נרכשת לטקסול מתווכת, לפחות בחלקה, על ידי אפלוקס תרופתי המתווך על ידי ABC, יש להעריך את הביטוי של נשאי ABC מרכזיים (כגון ABCB1) ברמות ה-mRNA והחלבון באמצעות qPCR ו-Western blotting, וניתן להשלים אותו בנתונים טרנסקריפטומיים. בהתבסס על פרופיל הביטוי של נשאי ABC, יש לשקול את נוכחות הפנוטיפ של MDR, ולהעריך את העמידות לחומרים כימותרפיים אחרים. במחקר הקודם שלנו אפיינו את קווי התאים העמידים לטקסול וזיהינו את ABCB1 כאחד הגנים המוסדרים ביותר, והסקנו כי עמידות רב-תרופתית המתווכת ל-ABCB1 עלולה לגרום לכישלון בבחירת פורומיצין¹⁷. לכן, לאחר יצירת תאים עמידים, יש להעריך את ביטוי נשאי ABC ופנוטיפ MDR לפני כל הליך טרנספקציה.

שיטת העלאת המינון מציעה יתרונות על פני פרוטוקולי חשיפה לתרופות במינון גבוה, שכן ניתן להקפיא תאים בכל שלב לפני העלאת המינון, מה שמספק גמישות והגנה מפני אובדן תרבית. יתרה מזאת, העלאת מינון הדרגתית מאפשרת רכישת פנוטיפים של עמידות לאורך זמן, ומאפשרת אבולוציה אדפטיבית; בניגוד לטיפול חריף במינון גבוה, שמוביל לבחירת תת-אוכלוסיות עמידות קיימות. ההתקדמות ההדרגתית שלו מאפשרת לחוקרים לבחור במכוון את רמת ההתנגדות הרצויה שבה ניתן לעצור את הסלקציה ולהעריך את תכונות הפנוטיפ המתקבל. כמו כן, השלבים הביניים של העלאת המינון יכולים לשמש לחקר מנגנוני ההתנגדות הנרכשת בזמן-מהלך. לפי השאלה הביולוגית הבסיסית, ניתן להשיג רמות עמידות שונות כדי לחקור מנגנונים אדפטיביים מוקדמים עם רמות עמידות נמוכות יותר או פנוטיפים עמידות יציבים ומבוססים בתאים עמידים יותר. יתרה מזאת, ספי העמידות הרלוונטיים קלינית משתנים באופן משמעותי בהתאם לתרופה, קו התאים וקצב ההתרבות הפנימי; לכן, ציר הזמן של העלאת המינון עשוי להשתנות בהתאם (במקרה שלנו, יצירת תאים עמידים לטקסול דרשה כ-6 חודשים). בהתאם לנימוק זה, קבענו שתי רמות שונות של עמידות לתאים SUM159PT במחקר הקודם שלנו והשווינו את התכונות המובחנות והמשותפות שלהם.¹⁷. לכן, אנו ממליצים לחוקרים להגדיר את טווח היעד IC50 של התרופה הרלוונטית בהתאם לרלוונטיות הקלינית והביולוגית.

ידוע היטב כי גמילה מלחץ תרופה עלולה להוביל לאובדן הכימו-עמידות, שכן תאים עשויים לשנות את האפיגנום והטרנסקריפטום²⁵ שלהם. מסיבה זו, מומלץ להעריך את יציבות הפנוטיפ של ההתנגדות לאורך מספר חודשים. אם תאים נוטים לחזור למצב רגיש לאחר גמילה מהתרופה, תאים עמידים עשויים להיות מתורבתים בנוכחות מינון התחזוקה, בדרך כלל התואם לריכוז התרופה הסופי המשמש במהלך יצירת העמידות, כדי לשמר את הפנוטיפ של העמידות. בעוד שמודלים של קווי תאים עמידים לכימו-כימוגרפיה הם מעשיים, ניתנים לשכפול ונרחבים לחקר כימוזיציות נרכשת, הם עשויים שלא לשחזר במלואם את ההטרוגניות הפנוטיפית שנצפתה בגידולים של מטופלים וחסרים את מיקרו-סביבת הגידול, אינטראקציות חיסוניות והטרוגניות מרחבית ^3,4,25. יתרה מזאת, מעבר ממושך במהלך יצירת ההתנגדות עלול לגרום לשינויים גנטיים ואפיגנטיים השונים מאלו שנצפו בדגימות המטופלים, מה שעלול להגביל את הרלוונטיות התרגומית של פגיעות שזוהו. לכן, גנים ומנגנונים מועמדים שזוהו באמצעות פרוטוקול זה צריכים להיות מאומתים עוד יותר במערכות ניסוי קליניות רלוונטיות יותר, כגון מודלים של קו-קולטורה, אורגנואידים שמקורם במטופל, או מחקרים in vivo. EPIKOL מספק יתרונות באופיו המרוכז אם מבצעים סקרים משלימים על מודלים אלו, שבהם מספר התאים המקסימלי שניתן להשיג מוגבל מטבעו.

תאים עמידים לכימיה גדלים לעיתים לאט יותר מהתאים ההוריים שלהם, מה שעלול להוות אתגר מעשי למסכים גנומיים שדורשים אוכלוסיות תאים גדולות כדי לשמור על כיסוי ספרייה. ספריות ממוקדות כמו EPIKOL מציעות יתרון בביצוע מסך עם פחות חומר התחלתי, תוך מתן עומק sgRNA מוגבר לכל גן, ובכך לשפר את הרגישות והשחזור בתוך המרחב המוגדר ליעד. עם זאת, בתכנון, EPIKOL לוכדת רק מנגנוני עמידות אפיגנטית ואינה מכסה תורמים לא-אפיגנטיים לכימו-עמידות. לכן, יש להנחות את בחירת הספרייה על ידי ניסויים קודמים והשאלה הביולוגית הספציפית. משתמשי ספריות אלו צריכים להיות מודעים למגבלות של הספריות הממוקדות ולפרש את התוצאות במסגרת תחום הספרייה.

מחסום מרכזי בסקר CRISPR של מודלים עמידים לכימיה הוא הופעת פנוטיפ MDR המונע על ידי הגברת מוקלט ABC ^9,10. מובילי ABC שונים מתווכים את הפליטה של סובסטרטים שונים. לאחר שנוצר קו תאים עמיד לתרופות, חשוב להעריך האם העמידות מתרחבת גם לסוכנים כימותרפיים אחרים. עמידות לפורומיצין נגרמת בעיקר מביטוי יתר של ABCB1, וזה משפיע על תהליך הבחירה של גישות הסקר המשולבות של CRISPR, שכן רוב הספריות הללו מחזיקות קלטות בחירה של פורומיצין להעשיר תאים מומרת. כאן השתמשנו ב-Verapamil, מעכב ABCB1 דור ראשון, כדי להקל על הצטברות תוך-תאית של פורומיצין ולהסיר באופן סלקטיבי את התאים העמידים שלא עברו טרנסדוקציה שהיו בורחים מהבחירה בשל תרופה אפלוקס מתווכת ABCB1. מכיוון שהוראפאמיל נקשר ל-ABCB1 באופן הפיך, תפקוד ABCB1 משוחזר תוך שעות לאחר הסרת הווראפמיל. לכן, ורפאמיל אינו מעניק פגיעות נוספת לתאים עמידים במהלך שלב הטיפול התרופתי הבא בסקר. עם זאת, יש להכיר בכמה מגבלות של ורפאמיל. מכיוון שווראפאמיל הוא מעכב של תעלות סידן ומובילים אחרים, הוא יכול להשפיע על הפיזיולוגיה התאית מעבר לעיכוב ABCB1¹⁰. בנוסף, ריכוז הוורפאמיל האפקטיבי משתנה בין קווי תאים ומודלים של MDR בהתאם לרמת הביטוי של ABCB1 ולפעילות של מובילים אחרים. לכן, יש לייעל את ריכוז הוורפאמיל לכל קו תאים, ודור חדש של מעכבי ABCB1 יישקל במיוחד אם יש חשש להשפעות מחוץ למטרה. כשלב קריטי נוסף, יש לבצע טיטרינג ויראלי על התא העמיד עצמו ולא על התאים ההוריים, שכן ההדבקה והבחירה משתנה לעיתים קרובות בין תאים עמידים.

שיקול חשוב נוסף הוא לקבוע את משך הבדיקה הנכון, שכן תאים עמידים לכימיה גדלים לעיתים לאט יותר מאשר תאים ההוריים המתאימים²⁶. כדי להתחשב בהבדל זה, השתמשנו בחישובי רמת הכפלת אוכלוסייה (סעיף 6 בפרוטוקול) כדי להעריך מתי קבוצות הביקורת והטיפול הגיעו לסף הרצוי של PDL. לכן, ניתן להפסיק את הסקרים בימים שונים, מה שמאפשר הכפלת אוכלוסייה דומה ומאפשר פרשנות בטוחה יותר של השפעות sgRNA בקבוצת הטיפול.

PCR להכנת ספרייה חשובים מאוד לדיוק זיהוי הפגיעה בהמשך. הטיה שנוצרת מקלט gDNA נמוך ומחזורי PCR מוגברים עלולה להוביל להגברה של רצפי sgRNA מסוימים, ולגרום להעשרות חיוביות שגויות או לדלדול. כדי לצמצם זאת, אנו ממליצים להשתמש בכמות המקסימלית האפשרית של gDNA, להיצמד למספרי מחזור ה-PCR המוצעים בפרוטוקול זה, ולהריץ תגובות מקבילות לאיסוף לפני הריצוף. כאשר אפשרי, כיסוי הספרייה לא צריך לרדת מתחת לסף המומלץ (כיסוי >300×) כדי להבטיח זיהוי אמין של sgRNA מדולדל במקום נפילה אקראית של sgRNA דלי שכיח עקב כיסוי נמוך.

לאחר ריצוף, השתמשנו במסגרת הניתוח MAGeCK וביצענו מספר ניתוחי בקרת איכות ושלבים²⁴ של פרשנות נתונים. ראשית, נעשה שימוש בניתוח רכיבים עיקריים (PCA) להערכת התפלגות ויכולת השחזור של שכפולים ביולוגיים (הנתונים לא מוצגים, פלט MAGeCK). מצופה ריכוז שכפול ב-PCA בתוך כל זרוע; עם זאת, שונות גבוהה יותר בזרוע המטופלת בתרופה היא תכונה נפוצה במסכי כימו-עמידות, שכן התרופה עלולה לגרום לשינויים סטוכסטיים. אם הבקרות החיוביות והשליליות מתנהגות כמצופה בכל זרוע, שונות זו אינה מונעת זיהוי פגיעות אמיתיות-חיוביות. לאחר מכן, נמרח נירמול קריאות למיליון (RPM) של ספירת sgRNA בנקודות זמן ראשוניות וסופיות כדי להעריך האם sgRNA המכוונים לגנים חיוניים התרוקנו כפי שציפו¹⁴. בהמשך, נעשה שימוש בנרמול החציוני לצבירת השפעות ברמת sgRNA, מה שאפשר זיהוי דלדלות ברמת הגן²⁴. ציוני דלדול ברמת הגנים הוצגו באמצעות גרפים של מפל מים, שמדרגים גנים מהנחלש ביותר לאלו המועשרים. שינויים במספר העותקים ופוליפלואידיות הנובעים מחשיפה ממושכת לתרופות עלולים לבלבל תוצאות מסך באמצעות חיתוך Cas9 לא יעיל או מופרז²⁷. בעוד ש-EPIKOL מכוון לווסתי כרומטין שבדרך כלל אינם כפופים להגדלות מונעות טקסול, אנו ממליצים להעריך את מצב הפלואיד ושינויים במספר ההעתקים בתאים העמידים לפני הסקר. אם יש חשד לשינויים במספר העותקים, ניתן ליישם כלים לתיקון חישובי כמו CRISPRcleanR או CERES במהלך ניתוח MAGeCK.

בסקרים הכוללים שתי זרועות ניסוי, קבוצות ביקורת וקבוצות טיפול, נדרשות השוואות שונות כדי לפרש נכון את ביצועי המסך ותלות ביולוגית¹⁷. השוואות מההתחלה לסופיות מתאימות להערכת ביצועי מסך, כולל התנהגות צפויה של גנים חיוניים ובקרות שאינן ממוקדות במטרה. השוואה בין נקודת הסיום של קבוצת הביקורת (DMSO) לנקודת הזמן ההתחלתית מאפשרת זיהוי גנים הנדרשים לצמיחה וכושר של תאים עמידים בהיעדר לחץ תרופתי. לעומת זאת, השוואה בין שני דגימות קצה, שטופלו בתרופות (טקסול) וביקורת (DMSO), מגלה את הגנים הספציפיים שנדרשו לעמידות לתרופה ולא להתאמה כללית. יש לציין כי השוואה ישירה בין שתי דגימות הקצה מובילה להתפלגות מעוותת של בקרות גנים חיוניות, שכן הן נדרשות להישרדות בשתי הקבוצות. שיטת ויזואליזציה חלופית עשויה להיות גרף Volcano, שמציג שינויים ב-log2 יחד עם ערכי מובהקות, ומאפשר זיהוי גנים מדוללים משמעותית. לאחר זיהוי הגנים המועמדים, ספירות sgRNA מנורמלות וגרפים ויזואליזציה שימושיים להחלטה על ה-sgRNA הביצועים הטובים ביותר לבדיקות אימות במורד הזרם. לסקר EPIKOL, אנו ממליצים לתת עדיפות לגנים מועמדים הנתמכים בהתנהגות תואמת של לפחות 6 מתוך 10 sgRNAs, שכן זה מעניק ביטחון רב יותר להשפעות ברמת הגן.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי לביצוע סקר EPIKOL על קווי תאים עמידים לטקסול שהגבירו את ויסות ABCB1 והפגינו פנוטיפ MDR. פרוטוקול זה רלוונטי באופן רחב לכל מודל עמיד לכימיה המציג עמידות צולבת לפורומיצין או אנטיביוטיקות בחירה אחרות, ובכך מאפשר סקר CRISPR בתאים אלו. הנחיות מעשיות לאתגרים הטכניים הנפוצים ביותר בכל שלבי הפרוטוקול מוצגים בטבלה משלימה 1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 מ"מ צלחת	Corning	353003	תרבית תאים
מסנן 45 µm	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	תרבית תאים
צלחת 6 באר	Corning	3506	תרבית תאים
צלחות 96 באר שחורות עם תחתית שקופה	Sigma-Aldrich	CLS356259	לצורך CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
בלסטיצידין	Thermo Fisher	A1113903	לבחירה
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	לצורך CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
DMEM	Gibco		תרבית תאים
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	תרבית תאים
FBS	Gibco	16140071	תרבית תאים
תערובת תזונה Ham’s F12	Gibco	11765054	תרבית תאים
תאי HEK293T			מתנות חינם מרוברט ויינברג (MIT, בוסטון, ארה"ב).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	תרבית תאים
הידרוקורטיזון	Sigma-Aldrich	H4001-1G	תרבית תאים
אינסולין	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	תרבית תאים
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	לצורך יצירת קו תאים יציב של Cas9
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	בסיס לשיבוט gRNA
ערכת MN NucleoSpin לרקמות	Macherey-Nagel	740952.5	להפקת DNA גנומי
PBS	Gibco	10010023	תרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140122	תרבית תאים
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	בסיס לשיבוט gRNA
פוליאתילן גליקול (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	לריכוז לנטיווירוס
פוליאתילימין, ליניארי (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	לייצור לנטיווירוס
פרוטמין סולפט (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	להדבקה בלנטיווירוס
psPAX2	Addgene	# 12260	לייצור לנטיווירוס
פורומייסין	Thermo Fisher	A1113803	לבחירה
תאי SUM159PT מודבקים			מתנות חינם מרוברט ויינברג (MIT, בוסטון, ארה"ב).
טקסול	פקליטקסל, סיגמה	PHR1803-200MG	ליצירת תאים res ותחזוקתם
טריפסין-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	תרבית תאים
וראפמיל	Selleck Chemicals	S4202	לבחירה
VSV-G	Addgene	# 8454	לייצור לנטיווירוס