פרוטוקול זה מתאר מתן תוך-ורידי של זן Brucella melitensis מוחלש המייצר אינדול לעכברי NOD/ShiLtJ, ואחריו ניטור סוכרת לאורך זמן, היסטולוגיה של הלבלב, ואופציונליות של פרוטאומיקה מרחבית עם פלקס גבוה וריצוף RNA חד-תאי להערכת תכנות מחדש של מערכת החיסון באיים.
מאמר שיטה
מנה תוך-ורידית אחת של ברוצלה מוחלשת המייצרת אינדול בעכברים NOD: הערכת התחלת סוכרת סוג 1 ועיצוב חיסוני באיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
סוכרת סוג 1 (T1D) נגרמת מהרס אוטואימוני של תאי β בלבלב, והטיפולים הנוכחיים אינם מצליחים לשקם את הסבילות החיסונית המתמשכת. חיידקים מהונדסים מטבולית המייצרים מטבוליטים אימונומודולטוריים מהווים אסטרטגיה טיפולית מבטיחה למנה אחת. כאן, מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף שבו מתן תוך-ורידי יחיד של זן BmΔvjbR::tnaA המייצר אינדול ומוחלש בשם BmΔvjbR::tnaA להערכת השפעות על הופעת סוכרת אוטואימונית בעכברים נקבות טרום-סוכרתיות מסוג NOD/ShiLtJ.
הפרוטוקול מתחיל בהכנת BmΔvjbR::tnaA ממאגרי גליצרול קפואים, גידולו במדיה סלקטיבית ועד לשלב לוגריתמי אמצע, וחישוב יחידות יצירת מושבות על בסיס צפיפות אופטית. נקבות עכברי NOD בני <5 שבועות מוגבלות ללא הרדמה ומוזרקות לתוך-ורידי דרך וריד זנב צדדי במינון חיידקי מוגדר במי מלח עם בופר פוספט, תוך שמירה על כריות חימום. רמת הסוכר בדם נמדדת פעמיים בשבוע לאחר צום של שעתיים למשך 70–105 ימים, כאשר סוכרת מוגדרת כגלוקוז ≥250 מ"ג/ד"ל בשתי מדידות רצופות. בנקודות הקצה הניסיוניות, הלבלב שנקטף מקובע בפורמלין מופעל נייטרלי למשך 72 שעות, מוטמע בפרפין, ומחלק לצביעת המטוקסילין ואאוזין, אימונוהיסטוכימיה של אינסולין וכימות שטח האי הכולל. מקטעים מוטמעים עם פרפין קבוע בפורמלין מוגשים לפרטאומיקה מרחבית עם פאנל נוגדנים של 25 סמנים להמחשת אוכלוסיות חיסוניות רגולטוריות ואפקטוריות. לבסוף, רקמת הלבלב הטרייה עוברת בידוד תא יחיד, הכנת ספרייה באורך 3′, ריצוף וניתוח ביואינפורמטיקה מבוססת סוראט כדי לפרופיל שינויים בתעתוק בין אוכלוסיות חיסון וסטרומיות.
פרוטוקול משולב זה מאפשר מתן טיפול חיידקי במינון יחיד שניתן לשחזור ואפיון רב-מודאלי של שיקום מערכת החיסון באיים, ומספק מסגרת לבדיקת מיקרובים מהונדסים על ידי מטבוליט במודלים אוטואימוניים ולניתוח מנגנוני חיסון ספציפיים לרקמה ברזולוציה של תא יחיד.
מבוא
סוכרת סוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית כרונית המתאפיינת בהרס תאי β לבלב המייצרים אינסולין על ידי מערכת החיסון, מה שמוביל לתלות ארוכת טווח באינסולין ולסיכון מוגבר לסיבוכים כלי דם1. עכבר NOD/ShiLtJ משחזר תכונות מרכזיות של סוכרת אוטואימונית אנושית, כולל אינסוליטיס ספונטני והתקדמות לסוכרת גלויה, ומשמש באופן נרחב כמודל פרה-קליני למחקרים מכניים וטיפוליים 1,2,3. טיפולי סוכרת סוג 1 עכשוויים—כולל תרופות מדכאות חיסון, נוגדנים מונוקלונליים וטיפולי תאי T רגולטוריים (Treg) מאמצים—יכולים להאט זמנית את התקדמות המחלה אך לעיתים קרובות אינם מספקים שיקום עמיד של סבילות חיסון או שימור מתמשך של מסת תאי β 1,2,4,5,6,7,8,9,10, 11.
מיקוד ב-Tregs ובאוכלוסיות רגולטוריות אחרות הוא מוקד מרכזי בטיפולי T1D מתפתחים, כולל עירויי Treg פוליקלונליים אוטולוגיים, Tregs מהונדסים ספציפיים לאנטיגן, ומשטרי IL-2 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11 . עם זאת, מיקרו-סביבה פרו-דלקתית בתוך איי הלבלב עלולה לפגוע ביעילות הגישות הללו, ולהדגיש את הצורך לתכנת מחדש מקומית את רשתות החיסון של רקמות 2,7. מטבוליטים טריפטופנים שמקורם במיקרוביאליזם, במיוחד אינדול ותרכובות קשורות, יכולים לווסת הן את החסינות המולדת והן את החסינות האדפטיבית על ידי קידום התמיינות רגולטורית-תאי T, השראת קיטוב מקרופאגים אנטי-דלקתיים ודיכוי תגובות Th1712,13. תרופות מיקרוביאליות חיות וחיידקים מהונדסים מטבולית מהווים לכן אסטרטגיה מבטיחה לספק מטבוליטים אימונומודולטוריים במקום ולעצב מחדש את חסינות הרקמה 12,13,14,15,16,17,18.
בעבר פיתחנו זן מיליטנסיס מהונדס מטבולית, BmΔvjbR::tnaA, שמייצר באופן קבוע אינדול ושולט בדלקת מפרקים אוטואימונית על ידי הרחבת Tregs ועיצוב מיקרו-סביבות דלקתיות 14,15,16. זני ברוסלה מוחלשים כמו BmΔvjbR אופינו בהרחבה כפלטפורמות חיסון וניתן לעבור שינוי גנטי לשאת מטענים רגולטורייםחיסונים 14,15,16.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת מינון תוך-ורידי יחיד של BmΔvjbR::tnaA במודל NOD/ShiLtJ, הכולל הכנה חיידקית, מתן תוך-ורידי סטנדרטי, ניטור סוכרת, וניתוח רב-מודלי של רקמת הלבלב באמצעות היסטולוגיה, פרוטאומיקה מרחבית high-plex ו-RNA תא יחיד. תהליך עבודה זה מספק מסגרת מעשית לבדיקת מיקרובים מהונדסים על ידי מטבוליט כאימונותרפיות במינון יחיד באוטואימוניות ספציפית לאיברים. ניתוח מינון-תגובה קודם הראה בטיחות וסבילות עד 1 × 1010 CFU של הזן המוחלש.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם קפדני להנחיות אתיות ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) של אוניברסיטת טקסס A&M (מספר פרוטוקול: 2021-0123).
1. הכנה ואפיון של BmΔvjbR::tnaA
- רקע ואחסון זן חיידקים
הערה: BmΔvjbR::tnaA נגזר מ-Brucella melitensis 16M עם מחיקת רגולטור הווירולנס vjbR והחדרת גן Escherichia coli tnaA לייצור אינדול מרכיב, כפי שתואר קודם 14,15,16.- לשמור על מלאי גליצרול בטמפרטורה של −80°C ב-20% גליצרול.
- תרבית חיידקים על אגר סלקטיבי
- שלפו מלאי גליצרול קפוא מאחסון בטמפרטורה של −80°C. רצף של 10–20 מיקרוליטר על לוחות סויה טריפטיים (TSA) בתוספת כלורמפניקול (25–30 מיקרוגרם/מ"ל).
- לוחות דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאי CO₂ סביבתיים למשך 48–72 שעות עד שמושבות בודדות (בקוטר 2–3 מ"מ) נראות.
אזהרה: עבודה עם זני ברוסלה דורשת מתקני בטיחות ביולוגית מתאימים (מינימום BSL2). פעלו לפי פרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים ואישורים נדרשים.
- הכנת תרבית נוזלית
- בחר לוחית TSA טרייה (≤בן שבוע). בחרו 2–3 מושבות מבודדות באמצעות לולאה סטרילית.
- הסנן לתוך 10 מ"ל של מרק סויה טריפטי (TSB) בתוספת כלורמפניקול (25–30 מיקרוגרם/מ"ל) בצינור סטרילי של 15 מ"ל. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד בתנאי CO₂ סביבתיים.
הערה: להגדלת הגדלה, השתמשו בבקבוק Erlenmeyer עם בלבלינג בנפח 250 מ"ל.
- ניטור צמיחה וקציר
- לשטוף את הספקטרופוטומטר באמצעות TSB סטרילי בתוספת כלורמפניקול.
- מדדו OD₆₀₀ כל 2–3 שעות.
- המשך את הדגירה עד ש-OD₆₀₀ מגיע ל-2.0 ± 0.2 (בערך 18–24 שעות).
שלב קריטי: קציר בקצב OD₆₀₀ = 2.0 ± 0.2 לריכוז חיידקים עקביים וחיוניות.
הערה: בתנאים אלו, OD₆₀₀ ≈ 2.0 מתאים לשלב הלוגריתמי באמצע עד מאוחר.
- הערכת CFU
- הערכת ריכוז החיידקים באמצעות הקשר:
OD₆₀₀ = 1 מתאים ל-5 × 109 CFU/mL.
הערה: תרבית של 10 מ"ל ב-OD₆₀₀ = 2.0 מכילה בערך 1 ×11 CFU. - אופציונלי: הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים (10⁻6 עד 10⁻9) ב-PBS סטרילי. לוח 100 מיקרוליטר ל-TSA בתוספת כלורמפניקול. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48–72 שעות. ספר מושבות כדי לאשר את CFU.
- הערכת ריכוז החיידקים באמצעות הקשר:
- קציר וריכוז חיידקים
- העבר את תרבית ה-10 מ"ל לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ב-3,000–4,000 גרם × למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
- השעיה מחדש להזרקה
- הוסף 1 מ"ל של סליין סטרילי, ללא אנדוטוקסין 1× עם בופר זרחן (PBS, pH 7.4) לכדור החיידקי. יש להחזיר בעדינות על ידי פיפטינג של 10–15 פעמים עד שמושגת השעיה הומוגנית ללא גושים נראים לעין.
הערה: הריכוז הסופי הוא בערך 1 ×10 11 CFU/mL.
- הוסף 1 מ"ל של סליין סטרילי, ללא אנדוטוקסין 1× עם בופר זרחן (PBS, pH 7.4) לכדור החיידקי. יש להחזיר בעדינות על ידי פיפטינג של 10–15 פעמים עד שמושגת השעיה הומוגנית ללא גושים נראים לעין.
- אחסון ושימוש
- השאירו את תליית החיידקים על קרח בצינור סגור. השתמש במתלה להזרקות תוך ורידיות בתוך 4 שעות מההכנה.
הערה: אין להקפיא או לאחסן בלילה, שכן חיוניות החיידקים יורדת.
נקודת הפסקה: חיידקים יכולים להישאר על קרח עד 4 שעות; מומלץ להשתמש באותו יום.
- השאירו את תליית החיידקים על קרח בצינור סגור. השתמש במתלה להזרקות תוך ורידיות בתוך 4 שעות מההכנה.
2. רכש, דיור והכנת עכבר NOD/ShiLtJ
- השגת עכברי NOD/ShiLtJ נקבות. הסתגלות לעכברים לפחות 7 ימים לפני הניסוי.
הערה: השתמשו בעכברים בגלל שכיחות סוכרת גבוהה ועקבית יותר. - עכברי בית בכלובים מאווררים בנפרד בתנאים מסוימים ללא פתוגנים. שמרו עד חמישה עכברים בכל כלוב.
- לספק מצעים, העשרה סביבתית, מזון ומים בחופשיות. שמרו על טמפרטורה של 20–24 מעלות צלזיוס, לחות של 40–60%, ומחזור אור/חושך של 12 שעות.
- השתמש בעכברים מתחת לגיל 5 שבועות. שרישום את משקלי הגוף הבסיסיים.
- לחלק עכברים ברמת הכלוב לקבוצות טיפול וביקורת. הקצה מזהים ייחודיים (תג אוזן או קעקוע זנב) לכל עכבר.
הערה: שמור רישום ראשי של כל העכברים והמשימות הקבוצתיות. - העבר את הכלובים לחדר הליך לפחות 30 דקות לפני ההזרקה. הניחו את הכלובים על כריות חימום בטמפרטורה של 37–40 מעלות צלזיוס כדי לעודד התרחבות ורידים זנביים.
3. מתן תוך-ורידי דרך וריד הזנב הלטרלי
- באמצעות טכניקת סטרילית, שואבים 100 מיקרולטר מהמתנה החיידית למזרקי אינסולין סטריליים (29G–30G). סמנו כל מזרק עם מזהה העכבר המתאים.
- הכינו מזרקי בקרה המכילים 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
הערה: יש להכין מזרקים מיד לפני ההזרקה. - הניחו כל עכבר בתוך מגבל, כדי לאפשר גישה לזנב.
הערה: אין להשתמש בהרדמה להזרקות וריד זנב. - נגב את הזנב ב-70% אתנול ותן לו להתייבש באוויר.
- הדמיינו את ורידי הזנב הצדדיים תחת תאורה מספקת.
טיפ: חמם את הזנב אם ורידים אינם נראים. - החזק את השליש המרוחק של הזנב במתח עדין. הכנס את זרימת המחט בזווית רדודה (10–15°) לתוך הווריד הלטרלי.
- הזרקו 100 מיקרוליטר לאט לאורך 5–10 שניות. משכו את המחט ולחצו בעדינות עם גזה סטרילית.
שלב קריטי: אישור הצלחה של הזרקה תוך-ורידית בהיעדר עמידות, נפיחות או חיוורון. - החזיר את העכבר לכלוב שלו על כרית חימום. שימו לב במשך 5–10 דקות לסימני מצוקה. תעד כל אירוע לוואי.
- בצע הזרקות לכל העכברים בסדר אקראי בתוך חלון של שעתיים.
4. ניטור סוכר בדם והגדרת סוכרת
- התחל במעקב אחרי הסוכר 7 ימים לאחר ההזרקה. מדד את רמת הסוכר בדם פעמיים בשבוע עד לסיום המחקר.
- הסר את האוכל שעתיים לפני המדידה תוך שמירה על גישה למים.
- לרסן את העכבר. נקה את קצה הזנב עם 70% אתנול.
- לשרוט את הזנב בעזרת מחט או לנסט סטרילי. זרוק את הטיפה הראשונה של הדם. אסוף את הטיפה השנייה על רצועת בדיקת גלוקומטר. רשמו ערכי סוכר בדם יחד עם מזהה העכבר ותאריך.
הערה: השתמש באתר חדש אם קצה הזנב מתמלא בצלקות. - הגדר סוכרת כסוכר בדם ≥ 250 מ"ג/ד"ל בשתי מדידות רצופות המופרדות לפחות ב-24 שעות.
- הורד עכברים שמראים סימני מחלה חמורים לפי הנחיות מוסדיות.
5. קציר, קיבוע ועיבוד של הלבלב
- הורד עכברים לפי פרוטוקולים מאושרים. נתח ואסוף את הלבלב בקפידה, כולל כל האונים.
- הניחו את הלבלב בפורמלין ניטרלי עם 10% נפח מופעל ביחס מינימלי של 10:1 בין קיבוע לנפח רקמה. תיקון ל-72 שעות בטמפרטורת החדר.
זהירות: יש לטפל בפורמלין במכסה אדים כימי עם ציוד מגן מתאים. - העבירו רקמות ל-70% אתנול לאחר קיבוע הרקמות.
- הגשת רקמות קבועות למתקן ליבת היסטולוגיה להטמעת פרפינים, חתך בעובי 5 מיקרון על מגלשות טעונות חיוביות, צביעת המטוקסילין ואאוזין, ואימונוהיסטוכימיה של אינסולין.
הערה: בקש קטעים נקיים אם מתוכננים ניתוחים נוספים במורד הזרם.
6. הערכה היסטולוגית וכימות שטח האיים
- רכוש תמונות שקופיות שלמות באמצעות סורק שקופיות או מיקרוסקופ.
- פתח תמונות בתוכנה שהוזכרה. הערות ידנית לאיים באמצעות כלים מתאימים.
- מדדו שטח האי הקטן באמצעות כלי סימון.
- מייצא מדידות לניתוח.
הערה: שטח האי הכולל כולל תאים אנדוקריניים וחודרנים.
7. ניתוחים שונים במורד הזרם
- חשב את שטח האי הממוצע לכל עכבר. השווה קבוצות באמצעות מבחנים סטטיסטיים מתאימים.
- אופציונלי: ניתוח פרוטאומיקה מרחבית (ראו טבלה משלימה S1)
- הכינו מקטעי FFPE על שקופיות טעונות חיוביות. שלח דגימות לספק שירותי פרוטאומיקה מרחבית. ספק מפרטי פאנל נוגדנים.
- אופציונלי: ריצוף RNA חד-תאי (ראו טבלה משלימה S2)
- קצור לבלב והניח אותו בטמפרטורה קרה.
- שלחו דגימות למתקן ליבת גנומיקה לבידוד תא יחיד והכנת ספרייה.
- עיבוד נתוני ריצוף באמצעות צינורות מתאימים (למשל, Cell Ranger, Seurat).
- הפקדת נתוני ריצוף במאגר ציבורי לפני הפרסום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעוד שהפרוטוקול הרחב יותר המתואר במאמר זה הוסב מאז למשטר מניעה במנה אחת, תוצאות הפיילוט הללו מוצגות כאן אך ורק כדי להמחיש את הקריאות ההיסטולוגיות והגליקמיות הצפויות שניתן להשיג בזרימת עבודה זו.
ההקשר הכולל של המחלה והניגוד בין לבלב סוכרתי בריא ללבלב סוכרתי מסוג 1 מוצגים באופן סכמטי באיור 1A. ההרס האוטואימוני של תאי β ואובדן ייצור האינסולין המתוארים בסכמת זו משקפים את הפתוגנזה המוכרת של סוכרת סוג 1 הן בבני אדם והן בעכברי NOD 1B. נק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מגבלה קריטית של התוצאות המייצגות המוצגות כאן היא שהנתונים שניתנו להמחשת נקודות הקצה האנליטיות (איור 3) נגזרו מקבוצת פיילוט מוקדמת שהשתמשה בלוח זמנים של שתי מנות. מכיוון שפרוטוקול זה שוכלל למשטר מניעה של מנה אחת, נדרשים מחקרים עתידיים רחבי היקף המשתמשים בפרוטוקול המנה היחידה האופטימלי המתואר כאן כדי לקבוע יעילות סטטיסטית פורמלית.
פרוטוקול JoVE זה מתאר מתן תוך-ורידי במנה אחת של זן ברוצלה מליטנסיס המוחלש המייצר אינדול בעכברי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות R01CA273002 R21AI167793 ל-J.S. ו-P.D.F., ועל ידי פרס שירות מחקר לאומי של NIH (T32) התומך ב-K.D. אנו מודים למרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס A&M על התמיכה המוסדית. אנו מודים לד"ר יבה ג'ונס-הול על הערכות היסטופתולוגיה עיוורת, למעבדת סונג לתמיכה טכנית בפיילוטים ובעלי חיים, ל-Texas A&M Institute for Genome Sciences & Society (TIGSS) Molecular Genomics Workspace להכנת וריצוף ספריית RNA חד-תאית וריצוף, ל-TIGSS Bioinformatics Core לניתוח ופרשנות נתונים, ול-Akoya Biosciences על שירותי פרוטאומיקה מרחבית. אנו מודים על תמיכת ליבת הביואינפורמטיקה של מכון טקסס A&M למדעי הגנום והחברה (TIGSS) על סיועם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% פורמלין נייטרלי עם בופר (NBF) | VWR | 10790-714 | |
| בקר כרום של 10x Genomics | TIGSS Molecular Genomics Workspace, Texas A& אוניברסיטת M | ||
| 70% אתנול | VWR | 89125-164 | |
| שקופיות מיקרוסקופ דביק ל-FFPE | Leica Biosystems | 3800084E | |
| פאנל נוגדנים FFPE של עכבר אקויה (~25 סמנים) | אקויה ביוסיינסיס | [מזהה פאנל/פאנל מותאם אישית] | |
| אנלייזר ביולוגי או TapeStation עם ערכות DNA HS | TIGSS Molecular Genomics Workspace, Texas A& M/ Agilent | ||
| BMΔ vjbR::tnaA זן חיידקי | מלאי מעבדה (מעבדות סונג/דה פיגיירדו) | ||
| צינור Cell Ranger | 10x גנומיקה | v7.1 | |
| כלורמפניקול | Research Products International | 56-75-7 | |
| ערכת Chromium Next GEM Single Cell 3' | 10x גנומיקה דרך ליבת TIGSS | ||
| קולגנאז מ-Clostridium histolyticum | מיליפור סיגמא | C7657-100MG | |
| כתם גרעיני DAPI | אקויה ביוסיינסיס | [שירות מסופק] | |
| הטמעת FFPE, H& צביעת E, אינסולין IHC וסריקת שקופיות | מעבדת היסטולוגיה של VMBS, טקסס A& אוניברסיטת M | https://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/ | |
| רצועות בדיקת סוכר | אבחון EKF / פישר סיינטיפיק | 22-022-649 | |
| רצועות בדיקת גלוקוז (חלופיות) | טיפול בסוכרת אסנסיה | רצועות מבחן CONTOUR NEXT | |
| גליצרול (בכמויות גדולות, 500 מ"ל) | מיליפור סיגמא | G7893-500ML | |
| גליצרול (סטרילי, 100 מ"ל) | סיגמא אולדריץ' (G Biosciences) | G5516-100ml | |
| GraphPad Prism (או חבילת הישרדות R) | תוכנת GraphPad / R | v10.2 | |
| מד גלוקומטר נייד | טיפול בסוכרת אסנסיה | CONTOUR NEXT EZ | |
| סיקוונסר Illumina NextSeq 2000 | TIGSS Molecular Genomics Workspace, Texas A& אוניברסיטת M | ||
| מזרקי אינסולין,29– 30 G (U-100) | VWR | 10002-702 | |
| Lancets לבדיקות סוכרת | בקטון, דיקינסון ושות' (BD) | 366594 | |
| דרגת מחקר ליבראז' TL | מיליפור סיגמא | 5401020001 | |
| רפידות חימום בטמפרטורות נמוכות | מדעי ההתנהגות | RWD-69025 | |
| ערכת בידוד גרעינים/תאים של Miltenyi | TIGSS Molecular Genomics Workspace, Texas A& M/ מילטני ביוטק | ||
| כרית חימום לעכבר (חלופית) | קנט סיינטיפיק | RightTemp | |
| מגבלות עכברים | בריינטרי סיינטיפיק | TV-RED 150-STD | |
| עכברי NOD/ShiLtJ (נקבה, 5 שבועות) | מעבדת ג'קסון | מתח #001976 | |
| ערכת תאי זרימה P2 XLEAP ל-100 מחזורים | אילומינה דרך ליבת TIGSS | ||
| רכישת נתונים ושירות בקרת איכות של PhenoCycler | אקויה ביוסיינסיס | ||
| ריאגנטים של PhenoCycler וזרימת עבודה של הדמיה | אקויה ביוסיינסיס | [שירות מסופק] | |
| מערכת PhenoCycler-Fusion | אקויה ביוסיינסיס | ||
| סליין מופתר-פוספט (PBS), 1x | תרמו פישר | 10010023 | |
| מעכב RNase מגן | מיליפור סיגמא | 3335402001 | |
| פלואורומטר קיוביט וערכת בדיקת HS של dsDNA | TIGSS Molecular Genomics Workspace, Texas A& M/ תרמו פישר | ||
| QuPath | קוד פתוח | v0.4.3 | |
| תוכנת R | פרויקט R | v4.0+ | |
| סוראט (חבילת R) | Satija Lab / CRAN | גרסה 4.3 | |
| סטארדיסט | קוד פתוח | v0.8.3 | |
| טריפטון סויה אגר (TSA) | VWR | CA90002-706 |
מקורות
- Bender, C., et al. A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes. Sci Transl Med. 16, eadn2404 (2024).
- Yang, S. J., et al. Pancreatic islet-specific engineered Tregs exhibit robust antigen-specific and bystander immune suppression in type 1 diabetes models. Sci Transl Med. 14, eabn1716 (2022).
- . NOD/ShiLtJ (001976) datasheet Available from: https://www.jax.org/strain/001976 (2026)
- Raeber, M. E., et al. Interleukin-2 immunotherapy reveals human regulatory T cell subsets with distinct functional and tissue-homing characteristics. Immunity. 57 (9), 2232-2250.e10 (2024).
- Efe, O., et al. A humanized IL-2 mutein expands Tregs and prolongs transplant survival in preclinical models. J Clin Invest. 134 (5), e173107 (2024).
- Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. JCI Insight. 4 (7), e126471 (2019).
- Su, W., et al. Protein prenylation drives discrete signaling programs for the differentiation and maintenance of effector Treg cells. Cell Metab. 32 (6), 996-1011.e17 (2020).
- Hassan, M., Elzallat, M., Mohammed, D. M., Balata, M., El-Maadawy, W. H. Exploiting regulatory T cells (Tregs): cutting-edge therapy for autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 155, 114624 (2025).
- Chen, X., et al. Differential roles of human CD4+ and CD8+ regulatory T cells in controlling self-reactive immune responses. Nat Immunol. 26 (2), 230-239 (2025).
- Huang, Q., Zhu, J. Regulatory T cell-based therapy in type 1 diabetes: latest breakthroughs and evidence. Int Immunopharmacol. 140, 112724 (2024).
- Passerini, L., Forlani, A., Gregori, S. Advances in regulatory cell therapy for type 1 diabetes: emerging strategies and future directions. Eur J Immunol. 55 (5), e202451722 (2025).
- Singh, N. P., et al. Dietary indoles suppress delayed-type hypersensitivity by inducing a switch from proinflammatory Th17 cells to anti-inflammatory regulatory T cells through regulation of microRNA. J Immunol. 196 (3), 1108-1122 (2016).
- Krishnan, S., et al. Gut microbiota-derived tryptophan metabolites modulate inflammatory response in hepatocytes and macrophages. Cell Rep. 23 (4), 1099-1111 (2018).
- Das, J. K., et al. A metabolically engineered bacterium controls autoimmunity and inflammation by remodeling the pro-inflammatory microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2143222 (2022).
- Plocica, J., et al. Engineering live attenuated vaccines: old dogs learning new tricks. J Transl Autoimmun. 6, 100198 (2023).
- Bender, E. Could a bacteria-stuffed pill cure autoimmune diseases?. Nature. 577, S12-S13 (2020).
- Chen, G., Wang, C., Wan, Q., Dong, F., Radstake, T. Editorial: next generation therapeutic modality to cure autoimmune diseases. Front Immunol. 16, 1631995 (2025).
- Adedokun, A. I., et al. Exploring immunotherapeutic strategies for bacterial and viral diseases. Explor Immunol. 5, 100320 (2025).
- Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878 (2017).
- Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F., Regev, A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 33 (5), 495-502 (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהתגיות
