הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מסגרת רב-מודאלית להערכת תרביות משותפות של אורגנואידים של גידולי מעי הגבירה המופקים מחולה ותאי מערכת החיסון

196 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71204

⸱

3 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הקמתם של אורגנואידים של גידולי מעי הגבילי המופקים מחולים, בתרבית משותפת (co-culture) עם לימפוציטים אוטולוגיים, ולאחר מכן טיפול באמצעות מולקולות קטנות טיפוליות ומעכבי נקודות בקרה חיסונית להערכת תגובתיות תאי T ויעילות הטיפול.

תקציר

תאי T ממלאים תפקיד מרכזי באימונותרפיה של סרטן, והבנת האינטראקציות שלהם עם גידולים חיונית לפיתוח טיפולים אימונותרפיים חדשניים. פרוטוקול זה מתאר את סבב העבודה שלב אחר שלב להקמת אורגנואידים המופקים מחולי סרטן מעי גס ורקטום (PDOs) מהביובנק שלנו, ולפיתוח מערכות של תרבית משותפת (co-culture) של תאי T עם PDOs אותולוגיים. באמצעות צביעה ב-Annexin V NIR וב-cleaved caspase-3, תיקננו פרוטוקולי ציטומטריית זרימה לצביעה של פני השטח וצביעה תוך-תאית כדי להעריך את התגובתיות והציטוטוקסיות של תאי T, כמו גם את הרג האורגנואידים של הגידול. בנוסף לניתוח מבוסס ציטומטריית זרימה, הפרוטוקול כולל גישות מתודולוגיות לבדיקות תפקודיות, כגון בדיקות ELISpot לכימות הפרשת granzyme B ו-perforin, ודימוי תאי חיים (live-cell imaging) לניטור הרג הגידול המתווך על ידי תאי T לאורך זמן באמצעות זיהוי אפופטוזיס מבוסס Annexin V. סבב עבודה זה מפרט עוד את הגדרת תנאי התרבית המשותפת, כולל שילוב של מעכבי מטרה ומעכבי נקודות בקרה חיסונית (immune checkpoint inhibitors) הן במסגרת של מונו-תרפיה והן בטיפול משולב. ניתנות הנחיות לבחירה ויישום של סמנים אימונולוגיים וסמנים הקשורים לגידול, כולל CD137 לתגובתיות של תאי T, CD107a לדגרנולציה של תאי T, caspase-3 לאפופטוזיס של הגידול, ו-Ki67 לפרוליפרציה של הגידול. יחד, מאמר זה מספק מסגרת מקיפה וניתנת לשחזור להקמת אורגנואידים של סרטן מעי גס ורקטום, תרבית והרחבה של תאי T אותולוגיים, הגדרת תרבית משותפת, הפרעות טיפוליות וניתוחים המשכיים באמצעות ציטומטריית זרימה, ELISpot, מיקרוסקופיה קונפוקלית ודימוי תאי חיים.

מבוא

סרטן המעי הגס והחלחולת (CRC) נותר אחת הסיבות המובילות לתמותה מסרטן ברחבי העולם, למרות התקדמות בגילוי מוקדם ובטיפולים רב-מודליים1. אתגר מרכזי בשיפור תוצאות הטיפול בחולים הוא המחסור במודלים פרה-קליניים המשחזרים במדויק את הארכיטקטורה המורכבת, את ההטרוגניות התוך-גידולית, את האינטראקציות בין הגידול למערכת החיסון ואת התגובות הטיפוליות הנצפות ב-CRC אנושי2,3,4,5,6. מודלים קונבנציונליים, כולל מודלים של עכברים שעברו הנדסה גנטית (GEMMs) ושיכונים של גידולים ממקור חולה (PDXs), קידמו משמעותית את המחקר ב-CRC אך סובלים ממגבלות בולטות. מודלי GEMMs לרוב אינם מצליחים לתפוס את המגוון של גידולים אנושיים ומפותחים בסביבות מיקרו-סביבתיות של עכברים השונות באופן מהותי מהפיזיולוגיה האנושית. באופן דומה, מודלי PDX משמרים היבטים של הטרוגניות גידולית אך הם יקרים, גוזלים זמן, תלויים בעכברים עם חסר חיסוני, ומוגבלים ביכולתם לבחון תגובות חיסוניות ספציפיות לבני אדם עקב הבדלים בין-מיניים7,8. בנוסף, הגברות במגבלות השימוש בבעלי חיים קטנים מדגישות את הצורך בחלופות רלוונטיות יותר לבני אדם ובנות-קיימא מבחינה אתית.

בשנים האחרונות, אורגנואידים המופקים מחוליי (patient-derived organoids, PDOs) הפכו לפלטפורמה משנה-מבנה למחקר סרטן תרגומי. אורגנואידים של CRC המופקים מדגימות כירורגיות או ביופסיות טריות משמרים את המאפיינים ההיסטולוגיים, הגנטיים והפנוטיפיים של הגידולים הראשוניים, כולל גיוון קלונאלי ומצבי תאים המגיבים לטיפול. תכונות אלו הופכות את ה-PDOs לכלים בעלי ערך למידול מחלות, גנומיקה פונקציונלית, גילוי סמנים ביולוגיים ורפואה מותאמת אישית7,8,9,10,11. באופן חשוב, שילובם של רכיבי מערכת חיסון אנושית במערכות אורגנואידים הרחיב עוד יותר את תועלתם. תרבית משותפת (Co-culture) של אורגנואידים של CRC עם תאי דם פריפריים מונונוקלאריים (PBMCs) או תתי-אוכלוסיות חיסוניות מהונדסות מאפשרת חקירה של אינטראקציות בין הגידול למערכת החיסון, מנגנוני חמיקה חיסונית, הצגת אנטיגנים ותגובות לאימונותרפיה במערכת רלוונטית פיזיולוגית12. מודלים כאלו תומכים בהערכה של מעכבי נקודות בקרה (checkpoint inhibitors), טיפולי CAR-T/TCR ונוגדנים ביספציפיים, תוך מתן תובנות לגבי סמנים ביולוגיים ניבויים ומנגנוני עמידות.

מעבר לאימונותרפיה, אורגנואידים של CRC הפכו לחשובים יותר ויותר עבור סריקת תרופות ויישומים של אונקולוגיה מותאמת אישית. ניתן לבחון תרביות המופקות מחולים אל מול סוכנים כימותרפויטיים וסוכנים טיפוליים ממוקדים כדי לחזות תגובות טיפוליות אינדיבידואליות, כאשר מספר מחקרים הדגימו מתאמים בין תגובות של אורגנואידים לתוצאות קליניות. מערכות אלו מספקות, לפיכך, חלופה ניתנת להרחבה וממוקדת-מטופל לגישות קונבנציונליות מבוססות בעלי חיים10,13,14,15,16,17,18.

כאן מוצג פרוטוקול בר-ביצוע וניתן להרחבה להקמת אורגנואידים של CRC המופקים מחולים ושילובם עם מערכות של תרבית משותפת (co-culture) חיסונית למחקר תרגומי ופרה-קליני. רקמות גידול מופרדות באופן אנזימטי ומוטמעות בתוך מטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית תחת תנאי גידול אופטימליים השומרים על ההטרוגניות של הגידול ועל התמיינות השושלת. אורגנואידים שהוקמו ניתנים להרחבה, להקפאה (cryopreservation), למניפולציה גנטית ולשימוש ביישומים המשכיים, כולל אפיון מולקולרי, מחקרי הפרעה תרופתית ואפיון חיסוני. בנוסף, תרבית משותפת עם PBMCs מאפשרת הערכה של ציטוטוקסיות ממתווכת-חיסון, רגישות לחסמי נקודות בקרה (checkpoint blockade) והפעלה חיסונית ספציפית לגידול.

אנו מתארים בהמשך פרוטוקולים לעיבוד רקמות, הערכת איכות אורגנואידים, אנליזה בציטומטריית זרימה, דימוי באימונופלורסנציה וניטור חיסוני מבוסס ELISpot. יחד, מערכות אלו המבוססות על אורגנואידים מספקות פלטפורמה בת-קיימא מבחינה אתית ורלוונטית מבחינה קלינית לחקר הביולוגיה של CRC, עמידות טיפולית, הטרוגניות של גידולים ותגובות לאימונותרפיה. התקדמויות שוטפות בהנדסת אורגנואידים ובשילוב הסביבה המיקרובית ממשיכות להציב מודלים אלו כאבן יסוד במחקרי CRC עתידיים ובאונקולוגיה מותאמת אישית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המטופלים סיפקו הסכמה מדעת תחת הפרוטוקול המאושר על ידי ה-IRB של ביו-בנק מרכז הסרטן המקיף מונטפיורי איינשטיין (Einstein IRB# 2021-13730). תיאום קליני ותמיכה רגולטורית סופקו על ידי המשרד לניסויים קליניים בסרטן (CCTO). רקמות גידול נאספו לאחר כריתה כירורגית לפי סטנדרט הטיפול וסקירה פתולוגית, ולאחר מכן עובדו עבור קיבוע בפורמלין, יצירת אורגנואידים המופקים ממטופלים, או שימור בהקפאה ב-DMEM עם 20% FBS ו-10% DMSO. כל הכנות الريאגנטים מופיעות ב-Table 1.

1. הקמת תרבית אורגנואידים של גידול מרקמת ביופסיה או כריתה (4 שעות)

  1. הניחו את רקמת הגידול שהושגה זה עתה בצלחת פטרי סטרילית ושטפו אותה עם תמיפת שטיפה לאורגנואידים 5 פעמים, בכל פעם למשך 5 דקות על קרח. בעזרת להב תער סטרילי או מחטים דקות, חתכו את הרקמה לקוביות קטנות בגודל של כ- 1–2 מ"מ3.
    הערה: שמר את הרקמה לחה באמצעות תמיסת סליין במאזן פוספאט (PBS) קרה מאוד במהלך הניתוח כדי למנוע התייבשות.
  2. העבירו את מקטעי הרקמה המנוסחים לשפופרת Falcon של 15 מ"ל, שטפו פעם אחת עם תמיסת סלין חוצבת פוספטים של דולבקו (DPBS), וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 200 x ג במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו בזהירות את העלייה (supernatant), ולאחר מכן העבירו את קוביות הרקמה לפלטת 6 בארות סטרילית או לצלח פטרי ב 直קוטר 35 מ"מ.
  3. בעזרת מספריים סטריליים, זוויתיים ועשויים בסיס שעבר עיקור באוטוקלאב, קצצו את הרקמה לחתיכות דקות יותר. בעזרת 1X Gentle Collagenase/Hyaluronidase, דללו 1 מ"ל ב-9 מ"ל של DPBS. הוסיפו 10 µL של Y-27632 (מעכב ROCK) ו- 20 µL של פרימוצין (Primocin).
  4. הוסיפו תמיסת דיסוציאציה שחוממה מראש לשפרוֹר של 15 מ"ל המכיל את פיסות הרקמה. צפו שוב את קצה הפיפטה (P1000) לפני ביצוע פעולות של שאיבה ושחרור (pipetting up and down) כדי לערבב את פיסות הרקמה.
  5. דגרו את המבחנה בנפח 15 מ"ל ב- 37 °C במקלחת מים עם נדנוד למשך 30 דקות, תוך הפיכה בכל 10 דקות. יש להמתין לשקיעת חלקי הרקמה, להעביר את מרבית תמיסת העיכול לשפופרת חדשה, ולסבב בצנטריפוגה ב-500 x ג׳ במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף 1 מ"ל DMEM לשפופרת ה-15 מ"ל המקורית ובצע פיפטינג נמרץ באמצעות טיפ P1000 מצופה כדי לפרק מכנית את רגמני הרקמה ולשחרר קריפטות נוספות.
  7. בדקו את ההתקדמות תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב האם הרקמה מתפרקת לתאים בודדים או לצבירים קטנים. העבירו 10–20 µL את ה-DMEM עם פיסות הרקמה לצלח פטרי ובדקו תחת מיקרוסקופ לאיתור קריפטות.
    הערה: זמן האינקובציה משתנה בהתאם לסוג הדגימה. עבור ביופסיות, זמן האינקובציה הוא 15–30 דקות, ועבור כריתות כירורגיות, זהו 45–60 דקות.
  8. מרגע שזוהו קריפטות (או לאחר 30 דקות עבור ביופסיות/60 דקות עבור כריתות), יש לעצור את העיכול באמצעות נפח שווה של מצע בסיסי קר מאוד ולסבב בצנטריפוגה במהירות של 500 x ג במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שטפו את המשקע בעזרת DPBS כדי לתלות אותו מחדש, ולאחר מכן סובבו אותו שוב בצנטריפוגה. באופן רשות, העבירו את התמיה לתבנית קונית וסובבו בצנטריפוגה ב- 300 x ג' במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) להשקת תאים.
    הערה: עבור במקרה של CRC, בדרך כלל אין צורך בליזיס של RBC.
  10. אם המשקע נראה אדום, יש לליית את האריטרוציטים באמצעות דגירה ב- 5 מ"ל בופר לליזיס של תאי דם אדומים (RBC lysis buffer) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר הליזה, מלאו מיד את המבחנה ב-PBS וסבבו שוב בצנטריפוגה.
  11. שטפו את המשקע פעם אחת עם DPBS. סבב במערך צנטריפוגה ב- צנטריפוגה במהירות של 300 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן השלף את הנוזל העליון (supernatant). השהה מחדש את המשקע (pellet) בנפח קטן של מצע גידול. ספור תאים חיים באמצעות המ ציטומטר באמצעות הדרה של trypan blue או סופר תאים אוטומטי.
  12. שחזר את התאים ב- Matrigel (מטריצת קרום בסיס) מקורר בקרח (אופציונלי: ריכוז של ~1.5–3 x 104 תאים ל- 10 µL מדיום). ערבב את תרחיף התאים עם מטריצת קרום בסיס באמצעות טיפים רחבי-פתח מקוררים (מעבדות מסוימות משתמשות ביחס של 1:1 בין מטריצת הקרום הבסיס לבין מצע גידול אורגנואידים מלא).
    הערה: שמרו על מטריצת קרומי הבסיס ועל כל התערובות קר מאוד כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
  13. פלטה50 µL כיפות של תערובת תאי-מטריקס ממבנה הבסיס לכל באער של פלטה סטרילית שחוממה מראש פלטת תרבית בעלת 24 בארות. דגרו את הפלטה ב- 37 °C במשך 10–12 דקות כדי לאפשר למטריצת קרומי הבסיס להתמצק לצורת כיפה (הפוך את הפלטה).
  14. לאחר הת굳דתו של מטריצת קרומי הבסיס, הפוך את הפלטה למצב זקוף. הוסף בזהירות 500 µL/well של מצע PDO המכיל מעכב Rock (1:1000) ו-Primocin (1:500).
    הערה: יש להשתמש ב-Primocin בכל מצעי התרבית עד להקמת ביו-בנק קפוא של אורגנואידים, כדי למנוע זיהום.
  15. החלף את מצע הגידול של האורגנואידים פעמיים בשבוע עם מצע גידול אורגנואידים טרי ומלא. יש לעקוב באופן קבוע אחר צמיחת האורגנואידים תחת מיקרוסקופ.

2. בידוד PBMCs אנושיים מדם (שעתיים)

  1. העבירו מנות (aliquots) של 5 מ"ל Histopaque לשפופרות Falcon סטריליות של 15 מ"ל, המתינו להשגת טמפרטורת החדר, והוסיפו בזהירות שכבה של נפח שווה של דם אנושי טרי (עד 5 מ"ל) מעל כן. העבירו את הדם באיטיות לאורך דופן השפופרת מעל ה-Ficoll מבלי להפר את הממשק; שמרו על נפח כולל של ≤10 מ"ל לכל שפופרת.
    הערה: יש לשמור על הפרדה מובחנת בין שכבת ה-Ficoll לשכבת הדם לפני הסבוב בצנטריפוגה כדי להשיג הפרדה אופטימלית.
  2. במקרה של שימוש במספר מבחנות, יש לאזן אותן כראוי בצנטריפוגה. הימנעו מערבוב או מניעור. ה- הממשק בין הדם ל-Ficoll חייב להישאר שלם.
  3. סבב בצנטריפוגה ב- 1500 x ג' במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש ב- הגדרות בלימה ב-0 כדי למנוע הפרעה למעבר הריכוזים (gradient). לאחר סבוב הצנטריפוגה, ייווצרו שכבות נפרדות: א) שכבת תאי דם אדומים (RBC) בתחתית, ב) שכבת ה-buffy coat של תאי PBMC במרכז, ו-ג) שכבת פלזמה בחלק העליון. שאבו בעדינות והסירו את הפלזמה עד להופעת שכבת ה-buffy coat.
    הערה: טפלו במבחנה בעדינות כדי למנוע הפרעה לשכבת ה-PBMC.
  4. באמצעות פיפטה סטרילית וחדשה, שאבו בזהירות את ה- שכבת ה-buffy coat המכילים PBMCs והעברה של תאים לכלי סטרילי חדש מבחנת Falcon בנפח 15 מ"ל. כדי להסיר Ficoll וטסיות דם, שטפו את התאים פעמיים עם 10 מ"ל PBSA (‏PBS + 0.1% BSA) באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות 1000 x ג במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר (RT), תוך כדי השלכה זהירה של הנוזל העליון (supernatant) לאחר כל שטיפה.
  5. כדי להסיר טסיות דם שנותרו, שטפו פעם אחת עם PBSA, סובבו בצנטריפוגה ב- 200 x ג' במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש להסיר בזהירות את העלייה. אם המשק נראה אדום, יש לבצע ליזיס של תאי דם אדומים (RBC lysis) על ידי דגירה ב-5 מ"ל של בופר לליזיס RBC ב- 37 °C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם PBSA ולסבב בצנטריפוגה במהירות של 200 x ג במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  6. יש להשעות מחדש את משקע ה-PBMC ב-2 מ"ל DPBS או במצע תרבית, ולקבוע את מספר התאים החיוניים באמצעות Trypan blue בעזרת המוציטומיטר או סופר תאים אוטומטי. במידה והם אינם בשימוש מיידי, יש להקפיא את ה-PBMCs בריכוז של 5–10 x 106 תאים/מ"ל ב-90% FBS ו-10% DMSO. הקפאה הדרגתית ב-80 °C במהלך הלילה, ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  7. הרחבת PBMCs (7–12 ימים):
    1. שקיע את התאים באמצעות סבוב (צנטריפוגציה) במהירות של 500 x ג במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השהו בריספנסיה (Resuspend) בריכוז של 5 x 105 תאים לבאר במצע להתרבות תאי T, והפעלה באמצעות תערובת של CD3/CD28.
    2. גרה את התאים באמצעות 500 IU/mL של IL-2 והדגר למשך 3 ימים. ביום השלישי, ערבב וספור את התאים, ולאחר מכן הרחב את התרבית על ידי הוספת מצע להרחבת תאי T המועשר ב-IL-2.
    3. יש להתאים את ריכוז התאים ל-1–2.5 x 10^5 תאים/מ"ל במצע הרחבה מלא לתאי T (complete T Cell Expansion Medium), לדגור למשך יומיים, ולנטר את החיות כל 2–3 ימים במהלך ההרחבה.
      הערה: יש להחליף למדיום מלא, טרי וחמים כל 2–3 ימים (אין לחרוג מ- >(3 ימים). ניתן להקפיא PBMCs במדיום הקפאה לתאי T לשימוש עתידי.

3. תרבית משותפת של אורגנואידים (4 ימים):

  1. הכנה ובקרת איכות:
    1. יש לוודא שהאורגנואידים בריאים, נקיים מזיהומים ומאופיינים פנוטיפית לפני התרבית המשותפת (co-culture). השג PBMCs מתורמים שהסכימו לכך או ממקורות מסחריים, ואשר את החיות ואת הפנוטיפ הבסיסי לפני השימוש.
    2. קבע האם ה-PBMCs ישמשו כטריים, לאחר מנוחה (rested) או לאחר הפעלה מוקדמת (pre-activated), והאם הם אוטולוגיים או אלוגנאיים. הערך את חיות האורגנואידים, אחידות הגודל והביטוי של סמנים לפני התרבית המשותפת.
    3. תקף את חיות ה-PBMCs ואת הרכב החיסון הבסיסי (סממני CD3, CD4, CD8, NK, ומונוציטים), ורשום את נתוני המטא-דאטה של התורם.
  2. בידוד אורגנואידים לתרבית משותפת עם PBMCs:
    1. הסר את מצע התרבית והוסף תמיסת התאוששות תאים שחוממה מראש לכל באר כדי להמיס את המטריצה החוץ-תאית ולשחרר את האורגנואידים. השהה בעדינות את האורגנואידים באמצעות טיפ פטה רחב (wide-bore) והדגר זמן קצר עד שהמטריצה נמסה והאורגנואידים משתחררים.
    2. העבר את התרחיף למבחנה לאיסוף, הוסף 0.5M EDTA במידת הצורך, וכייל את הנפח באמצעות באפר מאוזן. צנטריפוגה כדי לשקיע את האורגנואידים, השלף את העלייה, שטוף עם מצע בסיסי המכיל תוספים (HEPES ו-Glutamax) ואנטיביוטיקה, וצנטריפוגה שוב כדי לשקיע אותם מחדש.
    3. השהה את האורגנואידים במצע תרבית מלא, זרע בצלחת שעברה טיפול לתרבית רקמות, ואפשר התאוששות למשך כ-24 שעות לפני המשך העיבוד.
  3. התאוששות מקבילה של PBMCs:
    1. הפשר במהירות PBMCs קריו-משומרים לפי הנוהל הסטנדרטי ודלל אותם מיד במצע הרחבת תאי T שחומם מראש כדי לצמצם הלם אוסמוטי.
      הערה: אובדן תאים מסוים הוא טיפוסי במהלך ההפשרה; חימום מראש של המצע משפר את ההתאוששות.
    2. צנטריפוגה את ה-PBMCs המופשרים ב-400 x g כדי לשקיע את התאים, הסר את מצע ההקפאה, והדגר לזמן קצר במצע הרחבת תאי T המכיל benzonase כדי להפחית התגבשות תאים ולשפר את איכות תרחיף התאים הבודדים.
    3. שטוף ושקיע מחדש את ה-PBMCs במצע הרחבה טרי, ולאחר מכן השהה במצע תרבית תאי T מועשר בציטוקינים (למשל, IL-2) לתמיכה בחיות ובהתאוששות. זרע את ה-PBMCs בצלחת רב-בארים לתקופת מנוחה של לילה לפני התרבית המשותפת.
  4. הכנה לפני התרבית המשותפת (יום אחד לפני התרבית המשותפת):
    1. ניתן לטפל באורגנואידים בציטוקין מעורר-חיסוני (למשל, IFN-γ) לפני התרבית המשותפת כדי להגביר את מסלולי הצגת האנטיגן.
    2. הכן את צלחת התרבית המשותפת לפחות 24 שעות מראש על ידי ציפוי הבארות בנוגדן קו-סטימולטורי (למשל, anti-CD28) ואחסן ב-4 °C. לפני השימוש, הסר נוגדנים שאינם קשורים ושטוף את הבארות פעמיים עם DPBS.
  5. פירוק אורגנואידים לתאים בודדים (יום ניסוי התרבית המשותפת):
    1. אסוף אורגנואידים שעברו סטימולציה מוקדמת, שקיע והסר את העלייה, ולאחר מכן השהה בריאגנט פירוק אנזימטי (למשל, TrypLE) יחד עם כל תא נצמד כדי להשיב את כל אוכלוסיית התאים.
    2. הדגר תוך כדי ערבוב עדין ועקב מיקרוסקופית עד שמרבית האורגנואידים מתפרקים לתאים בודדים או לצבירים קטנים, תוך הימנעות מעיכול יתר.
    3. נטרל את ריאגנט הפירוק באמצעות באפר, שקיע את התאים, הסר את העלייה, והשהה במצע תרבית תאי T לצורך ספירה וערבוב.
  6. ספירת תאים והכנה לתרבית משותפת:
    1. ערבב בעדינות את תרחיף התאים וקבע את מספר התאים החיים באמצעות המוציטומטר או סופר אוטומטי עם צבע חיות. כייל את היחס בין הגידול ל-PBMC לצפיפות הרצויה במצע תאי T.
    2. הכן את ה-PBMCs על ידי שקיעה, השהה במצע טרי, וקבע את מספר התאים החיים. שטוף והשהה את ה-PBMCs במצע תאי T מועשר בציטוקינים (למשל, IL-2) ובנוגדנים אימונו-מודולטוריים אופציונליים (למשל, anti-PD-1) לפי הצורך.
  7. ביצוע התרבית המשותפת:
    1. שלב את תאי הגידול המפורקים וה-PBMCs ביחס הרצוי בין התא האפקטורי למטרה. שטוף את הבארות המצופות ב-anti-CD28 לפני הוספת התאים, והימנע מייבוש הבארות.
    2. זרע את תערובת האורגנואידים וה-PBMC בנפח הבדיקה הנדרש והדגר בתנאי תרבית סטנדרטיים. רענן או פצל את התרביות לפי הצורך במהלך הניסוי.
  8. תכנון ניסיוני ובקרות (עבור אסטרטגיית טיפול):
    1. השתמש במערכת התרבית המשותפת כדי להעריך כיצד תרופות (למשל, מעכבי נקודות בקרה או מולקולות קטנות) מווסתות את תגובות ה-PBMC לאורגנואידים של גידול.
    2. כלול חזרות ביולוגיות (קווי אורגנואידים ותורמי PBMC מרובים) וחזרות טכניות (לפחות שלשית בארות לכל תנאי).
    3. כלול בקרות: אורגנואידים בלבד, PBMC בלבד (vehicle או מופעלים), אורגנואידים + PBMCs (vehicle), אורגנואידים + תרופה, ותנאי PBMC + תרופה.
  9. מסגרות זמן טיפוסיות לתרבית משותפת:
    1. נתח את התרביות המשותפות ב-24, 48 ו-72 שעות לאחר התחלת התהליך כדי להעריך הפעלה חיסונית, פרולפרציה, הפרשת ציטוקינים, אפופטוזיס והריגה של תאי גידול.
    2. הערך סממני הפעלה מוקדמים והפרשת ציטוקינים ב-24 שעות, והערך ציטוטוקסיות, פרולפרציה וסממני הפעלה/התשה ב-48–72 שעות באמצעות ציטומטריה של זרימה, דימוג או בדיקות חיות.
      הערה: ניתן לכלול נקודות זמן מאוחרות יותר (למשל, ימים 5–7) כדי להעריך הפעלה כרונית, התשה חיסונית או תגובות תרופתיות ארוכות טווח.
  10. צביעה אימונו-פלורסצנטית של אורגנואידים:
    1. שטוף את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות וקבע אותן בתמיסת 4% פאראפורמאלדהיד (PFA) למשך 20 דקות ב-RT. לאחר הקיבוע, שטוף את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: שמור על הידרציה של האורגנואידים לאורך כל הצביעה. ניתן לאחסן שקופיות ב-PBS ב-RT למשך עד 3 שעות במידת הצורך, אך הימנע מאחסון בן לילה ב-PBS.
    2. בצע פרמבליזציה לאורגנואידים עם 0.1–0.5% Triton X-100 ב-PBS למשך 15–20 דקות ב-RT כדי לאפשר צביעה תוך-תאית וגרעינית תוך שמירה על מבנה האורגנואיד.
      הערה: הימנע מפרמבליזציה יתר, שכן היא עלולה לפגוע במבנה האורגנואיד. פרמבליזציה נכונה מבטיחה צביעה ציטופלזמית וגרעינית אחידה תוך שמירה על המורפולוגיה לצורך דימוג.
    3. שטוף את השקופיות פעמיים ב-1x IF buffer ובצע חסימה עם 1–10% BSA (או סרום תואם מין) ב-IF buffer למשך 60–120 דקות ב-RT כדי להפחית צביעה לא ספציפית.
      הערה: BSA מתאים לחסימה כללית, אך סרום תואם מין מומלץ לצביעת סמנים ספציפיים כדי להפחית קישור לא ספציפי ולשפר את ספציפיות האות.
    4. שטוף את השקופיות שלוש פעמים (5 דקות כל פעם) והדגר עם נוגדנים ראשוניים (10–50 µg/mL) בבאפר חסימה של 1% סרום למשך לילה ב-4 °C בתא לח.
      הערה: כסה את השקופיות ב-parafilm למניעת התאיידות ובצע טיטרציה לאופטימיזציה של ריכוז הנוגדן הראשוני לצביעה ספציפית עם רקע מינימלי.
    5. שטוף את השקופיות ב-1x IF למשך 3 x 5 דקות.
      הערה: יש לאופטימיז את השטיפה עבור צביעה של נוגדנים בודדים. אם משתמשים ביותר מנוגדן ראשוני אחד בו-זמנית, יש להפוך את השטיפה לסטנדרטית.
    6. הדגר את שקופיות האורגנואידים עם נוגדנים שניוניים מצומדים לפלואורופור (1:200–1:500 בבאפר חסימה של 1% סרום) בתא לח למשך לילה ב-4 °C או למשך שעתיים ב-RT בחשיכה.
      הערה: לאחר הוספת הנוגדן השניוני, בצע את כל השלבים הבאים בחשיכה כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג של הפלואורופורים.
    7. שטוף את השקופיות ב-1x IF buffer (פעמיים 5 דקות) ולאחר מכן ב-PBS (5 דקות). הדגר עם DAPI (1 µg/mL) ונוגדנים מצומדים ל-AlexaFluor-594 (20 µg/mL) בבאפר חסימה של 5% סרום למשך שעה ב-RT בחשיכה, ולאחר מכן שטוף ב-PBS (3 פעמים 5 דקות).
    8. הוסף מצע עיגון (mounting medium) לשקופיות ולכיסוי, ולאחר מכן הנח את הכיסוי על השקופית תוך הימנעות מבועות אוויר. לחלופין, אם משתמשים במצע עיגון המכיל DAPI, דלג על צביעת ה-DAPI. השתמש במצע עיגון קשיח (hard-mounting medium) עבור יישומי סריקת שקופיות.
    9. אפשר לשקופיות להתייבש ב-RT למשך שעה, אחסן ב-–20 °C, ודמגן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או סורק שקופיות.

4. פרוטוקול לציטומטריה של זרימה וצביעה תוך-תאית עבור אורגנואידים

  1. שאבו בזהירות את מצע גידול האורגנואידים ושטפו בעדינות את האורגנואידים פעם אחת ב-1x PBS כדי להסיר שאריות מצע וחלבוני סרום. שחררו את האורגנואידים מהמטריצה החוץ-תאית באמצעות PBS קר או תמיסת התאוששות (recovery solution), ובצעו פיפטור עדין כדי לפרק את המטריצה תוך מזעור מאמצי גזירה (shear stress).
  2. העבירו את תרחיף האורגנואידים למבחנה לצנטריפוגה, וצרו משקע במהירות של 300 x ג׳ במשך 5 דקות ב- 4 °C, והשליך את הנוזל העליון (supernatant). השהה מחדש את משקע האורגנואידים ב-250–500 µL של תמיסת TrypLE בריכוז 0.05% לפירוק אנזימטי. הדגרירו ב- 37 °C לעיכול יעיל של צמתים בין-תאיים.
    הערה: בכל 5 דקות, ערבבו בעדינות את התו)//סספנסיה על ידי תיפוף ושאיבה חוזרת עם פיפט, ועקבו תחת מיקרוסקופ עד להשגת סספנסיה של תאים בודדים, תוך הימנעות מעיכול יתר.
  3. העבירו את תרחיף התאים דרך 40 µm מסנן תאים להסרת גושים. סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 x ג במשך 5 דקות ב- 4 °C ולהמיס מחדש ב-1x PBS ללא Ca2+ / Mg2+ בופר
  4. ספירה של התאים והתאמה לריכוז של כ-1 x 106 תאים/מ"ל בבופר צביעה. דגרו עם Fc block (בדילול 1:200) וצבע חיוניות (לדוגמה, Live/Dead Blue, בדילול 1:1000–1:3000) כדי להפחית קישור לא ספציפי ולזהות תאים חיים/מתים.
  5. דגרו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן שטפו פעם אחת עם 1x PBS ופעם אחת עם תמיסת צביעה (staining buffer).
  6. הכינו את תערובת הנוגדנים לפני השטח על ידי ערבוב של כל נוגדן בדילול העבודה האופטימלי שלו בבופר צביעה, וחישוב הנפחים הכוללים בהתבסס על הטיטרציה. µL/test ערכים עבור תערובת המאסטר (master mix).
    הערה: אם הפאנל שלכם מכיל מספר פלואורוכרומים מבוססי פולימר (לדוגמה, צבעי Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet או Brilliant Blue), יש להוסיף Brilliant Stain Buffer (BSB) לתערובת הנוגדנים כדי להפחית אינטראקציות בין הפלואורוכרומים ולשפר את רזולוציית האות. הוסיפו BSB בהתאם להוראות היצרן (בדרך כלל בריכוז סופי של 1x), ערבבו בעדינות והכינו תערובת מאסטר (master mix) לכל הדגימות (נפח עודף של כ-10%). הגנו מאור ושמרו על קרח עד לשימוש.
  7. הוסיפו את תערובת הנוגדנים והדגירו למשך 30–50 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו עם באפר צביעה ו-PBS (ללא Ca2+).2⁺/מגניסיום2⁺), ולאחר מכן סבב במצנטריפוגה במהירות של 500 x ג למשך 5 דקות. הכין תמיסת עבודה לקיבוע/חדירות (fixation/permeabilization) על ידי דילול התרכיז במדלל. לדוגמה, חלק אחד תרכיז: 3 חלקים מדלל (להגעה לריכוז 1x או לחוזק עבודה המוגדר).
  8. הוסף תמיסת קיבוע/חדירות (fixation/permeabilization) כדי להחזיר את התאים לתליה מלאה (~100–200 µL לכל מיליון תאים) והדגירה למשך 15–20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או ב-2–8 °C, תוך הגנה מאור. לאחר זמן הקיבוע, שטפו את התאים עם Permeabilization Buffer בריכוז 1x. השליכו את הנוזל העליון (supernatant). חזרו על השטיפה לפחות פעם אחת (לעיתים פעמיים) כדי להסיר שאריות של חומר הקיבוע..
  9. הכינו תערובת צביעה תוך-תאית על ידי דילול נוגדנים מצומדים לפלואורופורים לריכוזים אופטימליים בבופר חדירה (permeabilization buffer) בריכוז 1x. הוסיפו את תערובת הנוגדנים התוך-תאיים לתאים שעברו חדירה, כולל נוגדנים המכוונים לציטוקינים, גורמי שעתוק או חלבונים מפוספורים, בהתאם לצורך.
  10. דגרו את התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) בחושך.
    הערה: במידת הצורך, ניתן לקצר את זמן הדגירה למינימום המומלץ על ידי היצרן, או לבצעה במהלך הלילה ב- 4 °C בחושך, מבלי לפגוע באיכות הצביעה.
  11. שטפו את התאים פעמיים בבופר חדירה (permeabilization buffer) בריכוז 1x ופעם אחת בבופר צביעה, ולאחר מכן השהו את המשקע ב-250–300 µL בופר צביעה.
  12. העבירו את התוחלת דרך 40 µm מסננת להשגת תרחיף של תאים בודדים ושמירת הדגימות על קרח או ב- 4 °Cמוגן מאור, עד לניתוח. יש להימנע מאחסון ממושך של דגימות צבועות, ולהעביר את הדגימות למדידה בציטומטר בהקדם האפשרי לאחר הצביעה.
  13. השתמשו בציטומטר זרימה עם לייזרים ומסננים מתאימים התואמים את הפלואורופורים. הגדירו בקרות פיצוי, כולל דגימות בצביעה בודדת ובקרות Fluorescence-Minus-One (FMO).
  14. יש לאסוף לפחות 50,000–100,000 אירועים (events) לדגימה לצורך ניתוח סטטיסטי מהימן. נתחו את הנתונים באמצעות FlowJo, FCS Express או תוכנה מקבילה. בצעו בחירה (gating) של תאים חיים ויחידניים. נתחו את הביטוי של סמנים על פני השטח וסמנים תוך-תאיים.
    הערה: בצעו טיטרציה לכל צמוד נוגדן-פלואורוכרום באמצעות דילולים סדרתיים, כדי לזהות את הריכוז האופטימלי המספק סיגנל מקסימלי, רקע מינימלי והפרדה ברורה בין האוכלוסיות.

5. ניתוח אפופטוזיס מבוסס Annexin V באמצעות ציטומטריית זרימה:

  1. ביקורות וריאגנטים חיוניים:
    1. ביקרת תאים ללא צביעה: קובעת את קו הבסיס של אוטופלואורסצנציית התאים, מה שמאפשר להבחין בין אות חיובי אמיתי לרקע.
    2. ביקורות צביעה בודדת: נדרשות עבור כל פלואורוכרום בפאנל כדי לאפשר קומפנסציה נכונה (בציטומטריית זרימה קונבנציונלית) או הפרדה ספקטרלית (בציטומטריית זרימה ספקטרלית). אלו מבטיחות הפרדה מדויקת של האות בין הערוצים.
    3. ביקורות FMO (Fluorescence-minus-one): חיוניות להגדרת שערים (gates) של אוכלוסיות חלשות או מעבריות. הן מסייעות במניעת הערכת יתר של אירועים חיוביים חלשים.
    4. ביקורת חיובית לאפופטוזיס: דגימה שעברה השראה מכוונת לאפופטוזיס (למשל, תאים שטופלו ב-staurosporine) מאמתת שהבדיקה מזהה אירועי אפופטוזיס באופן מהימן.
    5. ביקורות איזוטייפ: אינן יעילות עבור Annexin V עצמו, מכיוון שהקישור הוא ספציפי לפספוליפידים ולא מתווך על ידי נוגדנים. עם זאת, ניתן לכלול אותן עבור נוגדנים נוספים לסמני שטח במידת הצורך.
      הערה: השתמש בתמיסת קישור של Annexin V המכילה יוני סידן, שכן הקישור של Annexin V תלוי בסידן; השתמש בתמיסה מסחרית או בתמיסה שווית מאומתת.
    6. צבע חיוניות שאינו חודר לממברנה (למשל, PI, 7-AAD, DAPI, או צבעים קיבועים לתאים מתים) משמש להבחנה בין תאים באפופטוזיס מוקדם לתאים באפופטוזיס מאוחר או תאים נמקים. בחר צבע התואם ללייזרים של ציטומטר הזרימה ולתנאי הקיבוע.
  2. הליך הצביעה:
    1. קצור תאים מתרבית משותפת על ידי צנטריפוגה של הפלטות ב-500 x g למשך 5 דקות. שאב בזהירות והסר את הנוזל העליון (supernatant) כדי להסיר את מצע התרבית ושאריות צפות. שטוף את התאים פעמיים עם תמיסת צביעה קרה (למשל, PBS עם 1–2% FBS) כדי להפחית את צביעת הרקע ולהסיר חלבונים מפריעים.
    2. אם נדרשים סמני שושלת או סמני תת-אוכלוסיות (למשל, CD8 עבור PBMCs, סמן לתאי גזע סרטניים כמו Lgr5 בתאי גידול), הדגר את התאים עם תערובת נוגדנים למשך 30–45 דקות בטמפרטורת החדר על ניעור עדין, תוך הגנה מאור. צביעת שטח בשלב זה שומרת על שלמות האנטיגן ומאפשרת ניתוח ספציפי למדור.
    3. שטוף את התאים פעמיים: ראשית עם תמיסת צביעה קרה להסרת נוגדנים שאינם קשורים, ולאחריה תמיסת קישור Annexin V (למשל, BioLegend Cat. No. 422201) כדי להבטיח זמינות של סידן. התאם את ריכוז התאים לכ-1 x 106 תאים/mL בתמיסת הקישור.
    4. הוסף 5 µL של ריאגנט Annexin V מצומד לפלואורוכרום ל-100 µL של תגסוס תאים לכל דגימה. הפלואורוכרום הנבחר צריך להיות תואם ספקטרלית לצבעים אחרים בפאנל.
    5. בצע צביעה נגדית עם צבע חיוניות כגון PI, 7-AAD או DAPI. עבור PI ו-DAPI, מהללי המיהול האופטימליים נעים בדרך כלל בין 1:1000 ל-1:60,000, תלוי במכשיר ובעוצמת הלייזר, ויש לקבוע אותם באופן אמפירי. צבעי חיוניות קיבועים עדיפים אם נדרש קיבוע בהמשך.
    6. השהה את התאים בעדינות על ידי פיפטאג למעלה ולמטה והדגר למשך 20–40 דקות ב-RT בחשכה. יש לקבוע את זמן ההדגרה האופטימלי באופן אמפירי, שכן הדגרה ממושית מדי עלולה להגביר קישור לא ספציפי או תוצאות חיוביות שגויות.
    7. הוסף 200 µL של תמיסת קישור Annexin V לכל באר (מינימום 100 µL אם הדגימות בריכוז גבוה). פעולה זו מספקת נפח מספיק עבור ציטומטריית זרימה ושומרת על תנאי התמיסה במהלך הרכישה. רכוש את הדגימות במהירות בציטומטר זרימה מכויל, תוך וידוא שהגדרות המתח (voltage) אופטימליות כדי להבחין בבירור בין אוכלוסיות שליליות וחיוביות.
  3. אסטרטגיית gating מומלצת:
    1. השתמש בתרשימי פיזור של FSC (forward scatter) מול SSC (side scatter) כדי להסיר שאריות קטנות וצברים גדולים, ולהשאיר רק תאים שלמים. החל gating של FSC-A מול FSC-H (או FSC-W) כדי להסיר דובלטים וצברים, ולהבטיח שניתוחים של תאים בודדים בלבד.
    2. בהתבסס על צבע החיוניות, הסר תאים מתים חיוביים מאוד אם הדבר מתאים. לחלופין, כלול את הצבע ברבעי הניתוח של Annexin V. השתמש בסמני שטח כדי להבחין בין PBMCs (למשל, CD45+) לתאי גידול (למשל, EpCAM+ או סמן אחר ספציפי לגידול). דבר מאפשר כימות של אפופטוזיס ספציפי למדור.
    3. בתוך כל מדור שהוגדר, שרטט Annexin V מול צבע חיוניות כדי ליצור ארבע אוכלוסיות: א) Annexin V− / Dye− = תאים חיוניים; ב) Annexin V+ / Dye− = תאים באפופטוזיס מוקדם; ג) Annexin V+ / Dye+ = תאים באפופטוזיס מאוחר או תאים נמקים; ד) Annexin V− / Dye+ = תאים נמקים ראשוניים או ארטיפקטים (יש לפרש בזהירות).
    4. חלק את ה-PBMCs לתת-אוכלוסיות נוספות (למשל, תאי T CD4, תאי T CD8, תאי NK, מונוציטים) כדי לבחון פרופילי אפופטוזיס באוכלוסיות חיסוניות ספציפיות.

6. בדיקת ELISPOT לניטור תאי T בתרביות שיתוף (co-cultures) של אורגנואידים (3 ימים):

  1. ביום 0, יש לשטוף ולהפעיל את פלטת 96 הבארים בעלת ממברנת PVDF מצופה מראש. יש לאחסן ב-4 °C למשך 24 שעות בהתאם לפרוטוקול של ערכת ה-ELISpot לזיהוי הנוגדן/ציטוקין הרלוונטי.
  2. ביום 1,
    1. יש להפוך את האורגנואידים לתליה של תאים בודדים כפי שמתואר בסעיף 3.5. יש לסבב בצנטריפוגה ב-500 x g למשך 5 דקות ב-RT, ולאחר מכן להמיס מחדש במדיום CTL (המסופק עם ערכת ה-CTL ELISpot). יש להפשיר את ה-PBMCs שהוקפאו או להשתמש ב-PBMCs שבודדו טרי. יש לסבב את ה-PBMCs בצנטריפוגה ב-500 x g למשך 5 דקות ב-RT.
    2. יש להמיס מחדש את ה-PBMCs במדיום של הערכה. יש לבצע תרבית משותפת (co-culture) על ידי ערבוב עדין של תאי אורגנואידים בודדים עם PBMCs ביחס של 5:1. יש להוסיף 200 µL לבאר של תערובת התרבית המשותפת לכל באר בפלטת הבדיקה של 96 הבארים שהופעלה מראש. יש להקיש על הפלטה בזהירות רבה. יש לדגור למשך 4 שעות ב-37 °C. לאחר 4 שעות, יש להוציא בעדינות את פלטת הבדיקה מהאינקובטור. יש להוסיף את הטיפולים לבארים הייעודיות תוך הכללת בקרות חיוביות ושליליות מתאימות.
      הערה: יש לבצע אופטימיזציה ליחס בין האורגנואידים ל-PBMCs כדי להשיג התפתחות אופטימלית של נקודות ציטוקין ותוצאות סריקה מיטביות.
  3. ביום 2,
    1. לאחר דגירה של 24 שעות, יש לפעול לפי פרוטוקול הצביעה של היצרן. יש לשקול בקרות לצבע בודד או לצבע כפול כדי לזהות ולהשוות את מספר התאים המפרישים את הסמנים המוגדרים. זמן הדגירה משתנה לפי הצבע, ויש לנטר את התפתחות הנקודות באופן קבוע. יש לסרוק את הפלטה בהתאם להוראות היצרן. יש למפות ולהשוות את נקודות החיסון שהופרשו.
      הערה: בהתבסס על התכנון הניסיוני והסמנים הרלוונטיים, הקשר בין התאים שנזרעו לבין הנקודות מעיד על ביטוי הציטוקין/נוגדן בצבע בודד או כפול.

7. זיהוי אפופטוזיס בזמן אמת באמצעות Annexin V NIR ודימוי תאים חיים (3 ימים):

בשילוב עם דימוי אוטומטי של תאים חיים, Annexin V NIR מאפשר ניטור בזמן אמת ובתפוקה גבוהה של מוות תאי אפופטוטי לצורך ניתוח תגובה לתרופות וציטוטוקסיות.

  1. ביום 0, הפכו את האורגנואידים לתגסית של תאים בודדים. צבעו את התאים באמצעות GFP cell tracer. זרעו את התאים הבודדים הצבועים ב-100 µL מצע מלא לכל באר. אפשרו לתאים להיצמד וליצור צבירים.
    הערה: השתמשו בלוחות 96 עם תחתית בצורת U בעלי הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment). צפיפויות התחלה טיפוסיות (התאימו באופן אמפירי): 5,000 cells/well, 10,000 cells/well. כללו בארות עבור ביקורת שלילית לא מטופלת, ביקורת נשא (vehicle control) וכל טיפול ניסויי (בשלישייה או יותר).
  2. ביום 1, הפשירו PBMCs קריו-שימוריים או השתמשו ב-PBMCs שבודדו באופן טרי. סבבו PBMCs בצנטריפוגה במהירות 500 x g למשך 5 min ב-RT. השהו מחדש את ה-PBMCs במצע הרחבה (expansion media) המועשר ב-IL-2 והדגירו אותם באינקובטור.
  3. ביום 2, צבעו את ה-PBMCs בצבע yellow cell tracer. לאחר הצביעה, השהו מחדש את ה-PBMCs ב-RPMI. הוציאו את מצע האורגנואידים מהלוח בעדינות רבה. בצעו תרבית משותפת (co-culture) על ידי ערבוב עדין של תאי אורגנואידים בודדים עם PBMCs ביחס של 1:5. הוסיפו 200 µL מצע RPMI המכיל PBMCs לכל באר של תערובת התרבית המשותפת. הקישו על הלוח בזהירות רבה והניחו אותו באינקובטור.
    הערה: הימנעו מהפרעה לתאי האורגנואידים הבודדים בתחתית הבארות.
  4. הדגירו למשך 2–4 h ב-37 °C. לאחר 4 h, הוציאו בעדינות את הלוח מהאינקובטור.
  5. הכינו בארות תרופה עם ביקורות חיוביות ושליליות מתאימות. המיסו מחדש את ריאגנט Annexin V NIR הליופיליזציה ב-100 µL מצע מלא או PBS, וערבבו בעדינות. הכינו מצע טיפול 2x המכיל Annexin V NIR בריכוז כפול מהריכוז הסופי של העבודה (למשל, 1:100 עבור דילול סופי של 1:200) וודאו שהמצע מכיל ≥1 mM Ca2⁺.
  6. הוסיפו דילול של 1:200 של Annexin V NIR לבארות. הניחו את הלוח באינקובטור لديמוי תאים חיים למשך 48–72 h הבאות.
    הערה: יש לבצע אופטימיזציה של היחס בין אורגנואידים ל-PBMCs כדי להבטיח אינטראקציות תא-תא מספיקות ותגובות אפופטוטיות מדידות.
  7. דימוי תאים חיים ואנליזה
    1. השתמשו בעדשה של 4x או 10x ורכשו תמונות בערוץ ה-NIR עבור Annexin V NIR (בתוספת ערוצים נוספים במקרה של multiplexing). סרקו את הלוח כל 4–6 h למשך 24–72 h, בהתאם למשך הטיפול.
    2. השתמשו בתוכנה לדימוי תאים חיים כגון IncuCyte CX3. לצורך כימות בסיסי, נתחו את ערוץ ה-NIR באמצעות שטח כולל או ספירת אובייקטים; עבור קינטיקה של תאים בודדים, השתמשו במודולי Cell-by-Cell או Object analysis. במקרה של multiplexing (למשל, Cell tracer yellow ו-GFP), עיינו בהערות להפרדה ספקטרלית (spectral unmixing).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתחילה, יצרנו אורגנואידים של גידולים מדגימות של מספר חולים באמצעות זרימת עבודה סטנדרטית (איור 1). PDOs אלה דורשים בדרך כלל שבועיים להקמה, ולאחר מכן ניתן להרחיבם ולהעבירם למצע חדש (passaging) למחקר המשכי. יש לציין כי זמן ההקמה ויצירת האורגנואידים משתנים בין רקמות שונות. לדוגמה, חלק מהרקמות דורשות זמן נוסף ליצירת האורגנואידים, וחלק מהאורגנואידים זקוקים לזמן רב יותר כדי להגיע לצפיפות (confluency) המתאימה להעברה למצע חדש. ניתן להתאים את תוספי המצע של האורגנואידים בהתאם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, תוארה שיטה ניתנת לביצוע וניתנת לשחזור ליצירת PDOs ותאי T מורחבים ממאגר הביובנק שלנו. מערך השיתוף-תרביות (co-culture) של PDO CRC עבור דגימות החולים שלנו עם מוטציות שונות, לצד משטר הטיפול, תוארו אף הם בפירוט. התוצאות שהתקבלו הדגימו את השפעת הטיפול על מודלי שיתוף-תרביית.

מערכת השיתוף-תרבית (co-culture) של אורגנואידים המתוארת כאן מספקת פלטפורמה חסונה וגמישה למידול אינטראקציות ביולוגיות מורכבות in vitro. באמצעות שילוב של PBMCs עם אורגנואידים תואמים המופקים מהמטופל, פרוטוקול זה משחזר ט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

C.K. מדווח על הגילויים הבאים, שכולם אינם קשורים לכתב יד זה: Loki Therapeutics (מימון מחקר), Teiko (יועץ), Seattle Genetics (יועץ), Insights Driven Research (יועץ), BMS (יועץ), Guardant Health (יועץ), OMNI Oncology (יועץ), Exelixis (יועץ), Nuvectis Pharma (יועץ, תרופות), Real CME (שכר הופעה/Honoraria). C.K. ו-N.T. הם ממציאים שותפים בבקשה זמנית לארצות הברית 63/746,435 שהוגשה ב-17 בינואר 2025, שאינה קשורה לכתב יד זה. לשאר המחברים אין גילויים לדווח.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ה-Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330). אנו מודים ל-Hillary Guzik, Rotem Alon, Jinghang Zhang, Swathi Swaminathan ו-Jacky Chuen על הסיוע הטכני. מחקרי ציטומטריית זרימה בוצעו באמצעות אנלייזר Cytek Aurora שמומן על ידי ה-National Institutes of Health (1S10OD026833-01) במעבדה המרכזית לציטומטריית זרימה ב-Albert Einstein College of Medicine. דימות קונפוקאלי בוצע באמצעות מיקרוסקופ Leica STELLARIS 8 שמומן על ידי ה-NIH (1S10OD034397-01) במתקן הדימות האנליטי של ה-Albert Einstein College of Medicine. E.N., W.E. ו-C.K. נתמכו על ידי מענקי NIH מספרים T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 ו-K12CA279871. לגופים המממנים לא היה תפקיד בהכנת כתב היד.

אנו מודים גם למכון Ruth L. and David S. Gottesman למחקר תאי גזע ורפואה רגנרטיבית עבור MM, NS ו-NT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כימיקלים, ריאגנטים ונוגדנים
תוסף B27 ללא ויטמין A GIBCO C12587-010
תוסף B27 GIBCO 17504-044 
N-אצטילציסטאין Sigma-Aldrich A9165-5G 
ניקוטינאמיד Sigma-Aldrich N0636 
EGF רקומביננטי אנושי Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
פרוסטגלאנדין E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
קולגנאז מסוג II Sigma-Aldrich C6885 
היאלורונידאז מסוג IV Sigma-Aldrich H3506 
Advanced DMEM-F12 GIBCO 12634-028 
פניצילין/סטריפטומייסין GIBCO 15070063
אולטרגלוטמין סוג I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
מדיום הקפאה לתרבית תאי התאוששות GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
סרום אנושי, מפלזמה של זכר אנושי מסוג AB Sigma-Aldrich H3667 
בנזונאז (Benzonase) Merck 70746-3 
אינטרפרון גמא רקומביננטי אנושי Peprotech 300-02 
Dispase מסוג II Sigma-Aldrich D4693 
תמיסת התאוששות תאים Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
IL-2 אנושי רקומביננטי (הבעה ב-E. coli, ללא חומר נשא)Biolegend791906
IL-7 אנושי רקומביננטי (בוטא ב-E. coli, ללא נשא)Biolegend569706
IL-15 אנושי רקומביננטי (נקי מנשא)Biolegend570306
PE/Cyanine5 anti-human CD107a (LAMP-1)Biolegend328656
Brilliant Violet 711™ נוגדן נגד CD137 (4-1BB) אנושיBiolegend309832
Pacific Blue™ נוגדן anti-human CD8aBiolegend300928
anti-human CD3-APC/Cy7Biolegend317342
anti-human CD4PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4Biolegend980810
Alexa Fluor® 647 anti-human/mouse Granzyme BBiolegend515406
anti-human CD56-PE/Cy7Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 נוגדן נגד IFN-אנושיγ נוגדןBiolegend506530
PE anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1)Biolegend393608
נוגדן anti-human CD28 מנוקהBiolegend302901
Brilliant Violet 510™ נוגדן anti-human CD45Biolegend304036
נוגדן עכבר נגד CD326 אנושי (EpCAM) (מצומד ל-PE/Cy7)Biolegend324222
anti-Ki67Abcamab15580
NucView® ערכה לבדיקת Caspase-3 488 לתאים חייםBiotium30029
ערכה לזיהוי אפופטוזיס באמצעות FITC Annexin V עם PIBiolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® צבע NIR Annexin Vשריר התופר (Sartorius)4768
חי/מת™ ערכה לצביעת תאים מתים בכחול עם אפשרות לקיבוע, לעירור ב-UVInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
Cell Trace Far redThermo FischerC34564
Green CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (תמיסה לחסימת קולטני Fc)Biolegend422302
בופר צביעה BrilliantBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ בופר צביעה (BSA)BD Biosciences554657
חרוזי פיצויBiolegends424602
Corning® Dulbecco’מלחים של פוספט-בופר סלין (PBS), ריכוז 1X ללא סידן ומגנזיוםCorning20-031-CM
Corning® Dulbecco’מלחים בבופר פוספט (Phosphate-Buffered Saline), ריכוז 1X עם סידן ומגנזיוםCorning20-030-CV
נוגדן אנטי-PD1 אנושי (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
דימתיל סולפוקסידFisher ScientificBP231-100 
DMEMGenesee25-500
בופר EDTAInvitrogen15575020
סרום עגל רב (FBS)VWR97068-075
PBSGenesee25-507
פרפורמאלדהיד (PFA)Thermo Scientific Chemicals0473779L
ערכה לתמיסת קיבוע/חדירות (Fixation/Permeabilization)BD554714
גסטרין I אנושיMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
תערובת CD3/CD28 STEMCELL Technologies 10971
מדיום הרחבה ImmunocultSTEMCELL Technologies 10981
חומר קיבוע למניעת דהייה ProLong Diamond עם DAPIInvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Chemicals215680025
תמיסת Trypan blue, 0.4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
ציוד
מרכז ליבה לציטומטריית זרימה/ציטומטריית זרימהCytek (Wuxi) Biosciencesמספר דגם N7-0021
ציטומטר זרימה/מעבדת SinghInvitrogenATTUNE NXT (דגם מס' 4486517)
מיקרוסקופ קונפוקליLeicaSTELLARIS 8
מערכת לניתוח תאים חייםSartoriusIncucyte CX3

מקורות

  1. Cervantes A, et al. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2023;34(1):10-32.
  2. Colonna G. Overcoming barriers in cancer biology research: current limitations and solutions. Cancers (Basel). 2025;17(13):2102.
  3. Liu Y, et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):160.
  4. Rocha Neto J, Gaspar MM, Reis CP. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023;15(9):2570.
  5. Bleijs M, van de Wetering M, Clevers H, Drost J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. EMBO J. 2019;38(15).
  6. Hou X, et al. Opportunities and challenges of patient-derived models in cancer research: patient-derived xenografts, patient-derived organoids and patient-derived cells. World J Surg Oncol. 2022;20(1):37.
  7. Tentler JJ, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 2012;9(6):338-50.
  8. Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 2018;18(7):407-18.
  9. Zeng G, et al. Advancing cancer research through organoid technology. J Transl Med. 2024;22(1):1007.
  10. Jin MZ, et al. Organoids: an intermediate modeling platform in precision oncology. Cancer Lett. 2018;414:174-80.
  11. Dart A. Organoid 2.0. Nat Rev Cancer. 2019;19(3):126-7.
  12. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  13. Neal JT, et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  14. Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Clevers H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 2020;20(5):279-93.
  15. Jang J, et al. Redefining preclinical testing: human-relevant alternatives beyond animal models. BMB Rep. 2025; in press.
  16. Xie BY, Wu AW. Organoid culture of isolated cells from patient-derived tissues with colorectal cancer. Chin Med J (Engl). 2016;129(20):2469-75.
  17. Vlachogiannis G, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 2018;359(6378):920-6.
  18. Ooft SN, et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 2019;11(513).
  19. Mohammadi M, et al. Cyclin-dependent kinase 9 inhibitors as oncogene signaling modulators in combination with targeted therapy for the treatment of colorectal cancer [Preprint]. bioRxiv. 2025:2025.08.13.669992. doi:10.1101/2025.08.13.669992.
  20. Guo L, et al. Toward reproducible tumor organoid culture: focusing on standardization. Front Immunol. 2024;15:1290504.
  21. Wang J, et al. Tumor organoid-immune co-culture models: exploring a new frontier in cancer research. Cell Death Discov. 2025;11:98.
  22. Najafi M, et al. Organoid-immune co-cultures: a next-generation platform for studying human immunology and disease. Trends Immunol. 2026;47(1):45-62.
  23. Kakni P, et al. A microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Biomaterials. 2022;276:121018.
  24. Meirelles LA, Persat A. Decoding host-microbe interactions with engineered human organoids. EMBO J. 2025;44(6):1569-73.
  25. Ryu JO, et al. Applications and research trends in organoid-based infectious disease models. Sci Rep. 2025;15:7816.
  26. Du L, et al. Spatial omics in 3D culture model systems. Nat Rev Bioeng. 2025;3(1):45-67.
  27. Lombardi M, et al. Organoid models through the lens of metabolomics. Analyst. 2026;151(4):1458-78.
  28. Skardal A, et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 2020;12(2):025017.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אורגנואידים של גידולי מעי גסתרבית משולבת של תאי Tציטומטריה של זרימהבדיקת ELISpotדימוי תאים חייםבדיקת הריגת גידולמעכבי נקודות בקרה חיסוניותצביעת Caspase-3הפרשת Granzyme Bסממני התרבות גידולים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.