סדרה של נגזרות אצטמיד מבוססות טריאזול ואוקסדיאזול סונתזה והוערכה כמעכבי אוראז ו-α-גלוקוזידאז. תרכובת 8c הראתה את העיכוב החזק ביותר של אוראז, בעוד ש-9e הציג ביצועים טובים יותר מאקרבוז נגד α-גלוקוזידאז. קשרי BSA ומחקרים בסיליקו תמכו בתכונות התרופתיות שלהם, וזיהו את שתי התרכובות כמועמדות מובילות מבטיחות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
סינתזה, הערכה ביולוגית, ובמחקרים סילקו של אצטמידים חדשים מבוססי טריאזול ואוקסדיאזול כמעכבי אוראז וגלוקוזידאז α
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר זה בחן את הפוטנציאל הטיפולי של נגזרות אצטמיד חדשות מבוססות 1,2,4-טריאזול ו-1,3,4-אוקסדיאזול כמעכבי מטרה כפולה של אוראז α וגלוקוזידאז, שני אנזימים המעורבים בהפרעות במערכת העיכול ובסוכרת סוג 2, בהתאמה. גישה משולבת שילבה סינתזה אורגנית רב-שלבית, הערכה ביולוגית במבחנה, עגינה מולקולרית, חיזוי ADME בסיליקו וניתוח תורת פונקציונל צפיפות (DFT) שימשה לזיהוי תרכובות עופרת עוצמתיות עם תכונות פרמקוקינטיות מועדפות. החל מחומצה בנזואית, סדרה של נגזרות 1,2,4-טריאזול (8a–c) ו-1,3,4-אוקסדיאזול (9d–f) הנושאות חלקי אצטמיד חלופיים סונתזה בהצלחה. כל התרכובות הראו פעילות מעכבת נגד שני האנזימים המטרה. תרכובת 8c הייתה המעכבת האוראז החזקה ביותר (IC₅₀ = 6.14 ± 1.06 מיקרומון), בעוד שתרכובת 9e הראתה את העיכוב החזק ביותר של α-גלוקוזידאז (IC₅₀ = 27.29 ± 0.41 מיקרומטר), ועקף את מעכב הייחוס אקרבוז (IC₅₀ = 38.25 ± 0.12 מיקרומון). ניתוחים חישוביים תמכו בממצאים הניסיוניים: תחזיות ADME הצביעו על תכונות דמויות תרופות חיוביות, ועגינה מולקולרית הראתה אינטראקציות קשירה חזקות, כאשר תרכובת 8a הציגה את הזיקה הגבוהה ביותר ל-α-גלוקוזידאז (−7.165 קקלורי/מול) ותרכובת 9e הראתה את הקשר החזק ביותר לאוריאז (−7.30 קקלורי/מול). חישובי DFT קישרו עוד פעילות ביולוגית לתכונות אלקטרוניות, וחשפו פערי אנרגיה קטנים יחסית של HOMO–LUMO עבור התרכובות הפעילות ביותר, 8c (0.14831 a.u.) ו-9e (0.14302 a.u.). ביחד, ממצאים אלו מזהים את התרכובות 8c ו-9e כסוללות עופרת מבטיחות לפיתוח מעכבי אוראז ו-α-גלוקוזידאז מהדור הבא.
מבוא
חתיכות הטרוציקליות דווחו בעבר בתרופות רבות קיימות, והטרומחזורים מהווים סוג חשוב של מעכבי אנזימים המשמשים לטיפול במחלות מטבוליות וזיהומיות1. מבין ההטרוסייקלים, אוקסדיאזולים 1'3'4 הם אחד הפיגומים הנחקרים ביותר בגילוי תרופות ודווחוכסוכנים אנטי-ויראליים, אנטיבקטריאליים, אנטי-סרטניים, היפוטנסיביים, נוירופרוטקנטים, נוגדי פרכוסים ואנטי-שחפת. 3,4,5. באופן דומה, נגזרות 1'2'4-טריאזול הראו גם הן פעילויות אנטי-פרכוסיות, אנטיבקטריאליות, אנטי-ויראליות, אנטיבורקולריות, אנטי-סוכרתיות, אנטי-דלקתיות, אנטי-פרוליפרטיביות, נוגדי חמצון, אנטי-מלריה, ואוראז, 6,7. תרכובות המכילות אצטמיד מחזיקות בפרופיל פרמקולוגי חזק ושימשו כמתווכים סינתטיים בכימיה הטרוציקלית וכן כאנטי-סוכרתית, נוגדי קרישה וחומרים רגישים לכימות, מה שהופך אותם למבני עופרת אטרקטיביים לגילוי תרופות 8,9.
מאמצים משמעותיים הופנו לפיתוח מעכבים מרובי מטרות של α-גלוקוזידאז ואוראז. עיכוב α-גלוקוזידאז מעכב את עיכול הפחמימות ואת ספיגת הגלוקוז, ובכך מוריד את רמות הסוכר בדם לאחר הארוחה אצל חולי סוכרת סוג 2. מעכבים קיימים כמו אקרבוז יעילים אך קשורים לתופעות לוואי במערכת העיכול, מה שיוצר צורך במעכבים מגוונים מבנים10,11. אוראז מפרק אוריאה לאמוניה ופחמן דו-חמצני. התגובה מאפשרת לחיידק הליקובקטר פילורי, שגורם לכיבים והופך את המארח לרגיש יותר לסרטן הקיבה לשרוד בקיבה, ולכן אוראז הוא יעד חשוב בפיתוח תרופות נגד כיבים. א המטרה הטיפולית היא פיתוח מעכבים חדשים לשני האנזימים 9,12.
עם זאת, למרות המחקרים הזמינים על פיגומי 1'2'4-טריאזול ו-1'3'4-אוקסדיאזול, דווחו מעט מאוד מחקרים הקשורים לנגזרות אצטמיד של 1'2'4-טריאזול ו-1'3'4-אוקסדיאזול המכילות חתיכת תיואתר כמעכבי α-גלוקוזידאז ואוראזכפולים. התנהגות הקשירה לחלבון ואפיון החישובי שלהם זכו גם הם לתשומת לב מוגבלת בהקשר זה. כאן, הצענו שמיזוג הטריאזול או האוקסדיאזול וחתיכות אצטמיד שהוחלפו לאותה מסגרת מולקולרית יניב פרופיל מעכב אנזימי מספק עם תכונות פיזיקוכימיות מקובלת.
כדי לבדוק השערה זו, סדרה של נגזרות אצטמיד מבוססות 1,2,4 טריאזול (8a–c) ו-1,3,4-אוקסדיאזול (9d–f) סונתזו והוערכו לפעילות מעכבת שלהן נגד α-גלוקוזידאז ואוראז. האינטראקציות הקשירה של התרכובות הפעילות ביותר (8a, 8c ו-9e) עם אלבומין סרום בקר (BSA) נחקרו באמצעות ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה, קביעת קבועי קישור וניתוח תרמודינמי. בנוסף, בוצעו חישובי עגינה מולקולרית, חיזוי ADME ותיאוריה פונקציונלית של צפיפות (DFT) כדי לחקור את מצבי הקישור שלהם, תכונות פרמקוקינטיות ומאפייניהן האלקטרוניות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל התגובות היו באיכות אנליטית ושימשו ללא טיהור נוסף. התקדמות התגובה נבדקה באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) על ג'ל סיליקה באמצעות n-הקסאן/אתיל אצטט (7:3–6:4, v/v), עם נקודות שנראו תחת אור אולטרה סגול. אלא אם צוין אחרת, כל התגובות בוצעו תחת אטמוספירה סביבתית. התרכובות המסונתזות התאפיינו באינפרא-אדום של טרנספורם פורייה (FTIR), ספקטרוסקופיית 1HNMR וספקטרוסקופיה של 13CNMR. ספקטרום ה-NMR של 1H ו-13Cנרשמו ב-CDCl₃ בתדרים של 600 MHz ו-150 MHz, בהתאמה, ודווחו הזזות כימיות ב-ppm ביחס לאות הממס הנותר. הנתיב הסינתטי מתואר באיור 1. נתוני האפיון הפיזיקוכימי המלאים של כל התרכובות המסונתזות מסופקים בקובץ משלים 1.
סינתזה של אתיל בנזואט (1)
חומצה בנזואית (50 גרם, 0.41 מוליטר) הונחה בבקבוק תחתית עגול בנפח 500 מ"ל, והוספה אתנול מוחלט (150 מ"ל). חומצה גופרתית מרוכזת (6 מ"ל) נוספה בטיפה כזרז תחת ערבוב מגנטי רציף. תערובת התגובה חוממה ברפלוקס ב-78 מעלות צלזיוס במשך 4–6 שעות באמצעות מעבה מקורר מים. התקדמות התגובה נעקבה על ידי TLC. בסיום, התערובת התקררה לטמפרטורת החדר ונטרלה עם פחמן נתרן מימי רווי עד שה-pH הגיע ל-7–8. תערובת התגובה הועברה למשפך מפריד, והשכבה האורגנית נאספה, נשטפה במים מזוקקים ויובשה מעל סולפט נתרן חסר מים. לאחר הסינון, אתיל בנזואט (1) שימש ישירות בשלב הבא ללא טיהור נוסף (איור 1).
סינתזה של בנזוהידרזיד (2)
אתיל בנזואט (1; 0.41 מולי) הומס באתנול אבסולוטי (100 מ"ל), והידרזין הידראט (80%, 25 מ"ל, עודף) נוסף תחת ערבוב רציף. תערובת התגובה חוממה בריפלוקס בטמפרטורה של 78°C למשך 4–5 שעות באוויר באמצעות מעבה מקורר מים. התקדמות התגובה נעקבה על ידי TLC. עם השלמתו, המשקע הגבישי הלבן של בנזוהידראזיד (2) נאסף בסינון, נשטף באתנול קר, יובש למשקל קבוע בטמפרטורת החדר, ושימש בשלבים סינתטיים הבאים (איור 1).
סינתזה של 5-פניל-1,3,4-אוקסדיאזול-2-תיאול (3)
בנזוהידרזיד (2; 10 גרם, 0.073 מוליטר) ואשלגן הידרוקסיד (4.12 גרם, 0.073 מוליטר) הונחו בבקבוק עגול בתחתית בנפח 250 מ"ל המכיל אתנול (30 מ"ל). התערובת חוממה בריפלוקס בטמפרטורה של 78 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות מעבה מקורר מים. לאחר מכן נוסף דיסולפיד פחמן (CS₂; 5 מ"ל, 0.083 מולי), והריפלוקס נמשך עוד 3–4 שעות. התקדמות התגובה נעקבה על ידי TLC. לאחר סיום הטיפול, תערובת התגובה הועברה למים מזוקקים וחוממה בערבוב רציף. חומצה הידרוכלורית מדוללת נוספה בטיפה עד שה-pH הגיע ל-5, מה שגרם לשקיעה של תרכובת (3) (איור 1). המשקעים נאספו בסינון, נשטפו היטב במים מזוקקים קרים, יובשו למשקל קבוע, ונשקלו לקביעת התפוקה. התרכובת התאפיינה ב-FTIR, 1H NMR וספקטרוסקופיה של 13CNMR.
סינתזה של 4,5-דיפניל-4H-1,2,4-טריאזול-3-תיאול (4)
בנזוהידרזיד (2; 5 גרם, 0.037 מולה) ופנילאיזותיוציאנאט (4 מ"ל, 0.037 מולי) הונחו בבקבוק עגול בתחתית של 100 מ"ל המצויד במעבה מקורר מים. תערובת התגובה חוממה בריפלוקס בטמפרטורה של 78 מעלות צלזיוס עד להשלמת יצירת הביניים של תיוסמיקורבאזיד, כפי שאושר על ידי TLC באמצעות n-הקסאן/אתיל אצטט (7:3, v/v). הידרוקסיד אשלגן (2 גרם, 0.036 מולי), מומס באתנול (20 מ"ל), נוסף לאחר מכן, והרפלוקס נמשך עד להיווצרות התרכובת (4), כפי שאושר על ידי TLC. תערובת התגובה הועברה למים מזוקקים, חוממה בערבוב רציף, וחומצה בחומצה הידרוכלורית מדוללת ל-pH 5 כדי להשקיע תרכובת (4) (איור 1). המשקעים נאספו בסינון, נשטפו היטב במים מזוקקים קרים, יובשו למשקל קבוע, והתאפיינו בספקטרוסקופיה של FTIR, 1H NMR ו-13CNMR.
סינתזה של ברומואצטמידים ביניים 7(a–f)
כל נגזרת אנילין מוחלפת 5(a–f) (1 שווה) הומסה בכלורופורם וקיררה באמבט קרח כדי לשמור על טמפרטורת התגובה ב-0–5 מעלות צלזיוס. ברומוצטיל ברומיד (6, ≥98%, 1 שווה) נוסף בטיפה עם ערבוב רציף. במהלך התגובה, נוספה 18% תמיסת נתרן קרבונטית מימית לפי הצורך כדי לשמור על pH התגובה בין 9 ל-10 על ידי נטרול החומצה ההידרוברומית שנוצרה. לאחר סיום הוספת ברומואצטיל ברומיד, התערובת התגובתית התחיממה לטמפרטורת החדר וערבבה עד ש-TLC אישר את הצריכה המלאה של חומר ההתחלה. הברומואצטמידים המתקבלים 7(a–f) נאספו בסינון, נשטפו במים מזוקקים קרים, יובשו למשקל קבוע, ושימשו ישירות בשלב הסינתטי הבא ללא טיהור נוסף (איור 1).
סינתזה של נגזרות אצטמיד מבוססות טריאזול 8(a–c)
נגזרת הטריאזול (4; 0.5 גרם, 0.002 מולה) הומסה ב-N, N-דימתילפורמאמיד (10 מ"ל) בבקבוק תחתית עגול בנפח 50 מ"ל. הברומואצטמיד הביניים המתאים (7a, 7b או 7c; 0.002 מולה, 1 שווה) נוסף עם ערבוב רציף, ואחריו נתרן הידריד (0.05 גרם, 0.002 מולה) לקידום S-אלקילציה. תערובת התגובה ערבבה בטמפרטורת החדר במשך 24–48 שעות, כאשר התקדמות התגובה נוטרלה על ידי TLC. לאחר סיום הטיפול, נשפכה תערובת התגובה למים קרים כקרח כדי לגרום למשקעים. המשקע נאסף בסינון, נשטף היטב במים קרים, יובש ואופיין בספקטרוסקופיית FTIR, 1H NMR וספקטרוסקופיית 13CNMR (איור 1).
סינתזה של נגזרות אצטמיד מבוססות אוקסדיאזול 9(d–f)
נגזרת האוקסדיאזול (3; 0.5 גרם, 0.002 מולי) הומסה ב-N, N-דימתילפורמאמיד (10 מ"ל) בבקבוק תחתית עגול בנפח 50 מ"ל. הברומואצטמיד הביניים המתאים, 7d, 7e או 7f (0.002 מולה, 1 שווה), נוסף ואחריו נתרן הידריד (0.05 גרם, 0.002 מולה) כדי להקל על אלקילציית S. תערובת התגובה ערבבה בטמפרטורת החדר במשך 24–48 שעות, כאשר התהליך נוטר על ידי TLC. לאחר סיום הטיפול, התערובת נשפכה למים קרים כקרח כדי להניח את המוצר. המשקע נאסף בסינון, נשטף היטב במים קרים, יובש ואופיין בספקטרוסקופיית FTIR, 1H NMR וספקטרוסקופיית 13CNMR (איור 1).
בדיקת עיכוב α-גלוקוזידאז
פעילות העיכוב של α-גלוקוזידאז הוערכה על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר מתמיסת דגימת הבדיקה עם 100 מיקרוליטר של תמיסת α-גלוקוזידאז (0.35 U/mL) שהוכנה בבופר פוספט (pH 6.8). תערובת התגובה הודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן נוספה 100 מיקרוליטר של 1.5 מ"מ p-ניטרופניל-α-D-גלוקיפירנוזיד כמצב. לאחר דגירה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, התגובה הסתיימה בהוספת 1 מ״ל פחמת נתרן בעוצמה של 1 מ״ר (Na₂CO₃). הספיגה נמדדה ב-400 ננומטר14. אקרבוז שימש כבקרה חיובית. תערובת התגובה ללא תרכובת הבדיקה שימשה כבקרה שלילית, בעוד שתערובת התגובה ללא האנזים שימשה כבקרה השלילית.
כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים, והתוצאות מבוטאות כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). אחוז העיכוב של פעילות α-גלוקוזידאז חושב באמצעות המשוואה הבאה(1)14:
(1)
כאשר As מייצג את הספיגה של תמיסת דגימת הבדיקה, Ab היא הספיגה של חומר התגובה הריק (ללא α-גלוקוזידאז), ו-A0 היא הספיגה של הבקרה השלילית (ללא הדגימה). ערכי IC50 נקבעו על ידי בדיקת ריכוזי תרכובות בטווח של 3.125 עד 100 מיקרומון. ניתוח רגרסיה לא ליניארית בוצע באמצעות תוכנת גרפים סטנדרטית.
בדיקת עיכוב אוראז
פעילות מעכבת אוראז נקבעה באמצעות שיטת ברתלו מותאמת. תערובת התגובה כללה 300 מיקרוליטר של תמיסת דגימת הניסוי, 200 מיקרוליטר תמיסת אוראז ג'ק בין ו-200 מיקרוליטר של 25 מילימטר אוריאה. התערובת נדגרה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, נוספו 500 מיקרוליטר של תמיסה לפיתוח צבע המכילה 10 גרם לליטר פנול ו-50 גרם לליטר נתרן ניטרופרוסיד, ואחריה 500 מיקרוליטר של תמיסה שנייה המכילה 5% (v/v) נתרן היפוכלוריט ו-5 גרם לליטר נתרן הידרוקסיד. תערובת התגובה הודגרה לאחר מכן למשך 15–30 דקות נוספות כדי לאפשר התפתחות צבע.
הספיגה של התמיסה נמדדה ב-625 ננומטר לעומת תגובה ריק15. תיוריאה שימשה כבקרה חיובית, תערובת התגובה ללא תרכובת הבדיקה כבקרה שלילית, ותערובת ללא אנזים אוריז כבקרה השלילית. כל הניסויים בוצעו בשלוש פעמים (n = 3), והתוצאות מבוטאות כערכים ממוצעים ± סטיית תקן (S.D.). אחוז העיכוב חושב באמצעות הנוסחה המתמטית הבאה (2)15:
(2)
כאשר A0 היא הספיגה של הבקרה (ללא מעכב) ו-As היא הספיגה של דגימת הבדיקה (עם המעכב). גרפים וניתוח רגרסיה לא ליניארית לקביעת ערכי IC50 בוצעו באמצעות תוכנת גרף נתונים סטנדרטית.
מבחן קשירת BSA
אינטראקציות קישור בין אלבומין סרום בקר (BSA) לבין התרכובות המסונתזות נחקרו באמצעות ספקטרוסקופיית הקפאה פלואורסצנטית. תמיסת מאגר BSA של 10 מיקרומום הוכנה בבופר פוספט של 20 מ"מ (pH 7.4). לכל ניסוי טיטרציה, 1.0 מ"ל של תמיסת BSA עורבבה עם 2.0 מ"ל בופר פוספט בקובט קוורץ. התמיסה עברה טיטרציה על ידי תוספות עוקבות של 5 מיקרו-ליטר אליקווטים של תרכובת הבדיקה (1.5 מ"מ מולר במתנול). ספקטרום פליטת פלואורסצנציה תועדו לאורך טווח אורכי הגל של 300–400 ננומטר לאחר עירור ב-295 ננומטר, כאשר הפליטה המרבית נצפתה בכ-336 ננומטר. מדידות פלואורסצנציה בוצעו באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה המצויד בתוכנת רכישת פלואורסצנציה סטנדרטית, כאשר רוחבי חריצי העירור והפליטה מוגדרים ל-10 ננומטר ו-2.5 ננומטר, בהתאמה. כדי לקבוע את הפרמטרים התרמודינמיים של הקשירה, כולל אנרגיית גיבס החופשית (ΔG), אנתלפיה (ΔH) ואנטרופיה (ΔS), ניסויי הטיטרציה חזרו על עצמם ב-298, 308 ו-313 K.
כדי לחקור את מנגנון הכיבוי הפלואורסצנטי, נותחו נתוני הניסוי באמצעות משוואת סטרן–וולמר (משוואה 3)16:
(3)
כאשר F0 ו-F מייצגים את עוצמות הפלואורסצנציה של BSA בהיעדר ובנוכחות הכיבוי, בהתאמה; Kq הוא קבוע קצב הכיבוי הבימולקולרי; τ0 הוא אורך החיים הממוצע של BSA בהיעדר מעבד; KSV הוא קבוע הכיבוי סטרן-וולמר; ו-[Q] הוא הריכוז של המנטר. קבוע הקישור (Kb) ומספר אתרי הקישור (n) נקבעו לאחר מכן על ידי שרטוט הלוגריתם הכפול לפי משוואה (4)16:
(4)
יתרה מזאת, שינוי האנרגיה החופשית הסטנדרטי של גיבס (ΔG°), שינוי אנתלפיה סטנדרטי (ΔH°), ושינוי האנטרופיה הסטנדרטי (ΔS°) השולטים באינטראקציה של הקישור חושבו באמצעות יחסי ואן'ט הופ וגיבס-הלמהולץ המובעים במשוואות (5) ו-(6)17:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
כאשר R הוא קבוע הגז האוניברסלי ו-T הוא הטמפרטורה המוחלטת בקלווין.
עגינה מולקולרית
כל סימולציות המידול המולקולרי והעגינה בוצעו באמצעות Schrödinger Suite (ממשק Maestro), כאשר העגינה בוצעה באמצעות מודול Glide. מבני הגבישים של α-גלוקוזידאז (PDB ID: 5NN8) ואוראז (PDB ID: 4H9M) נאספו מבנק נתוני החלבונים של RCSB. מבני החלבון הוכנו באמצעות Protein Preparation Wizard על ידי הסרת ליגנדים קו-קריסטליזציה, מולקולות מים והטרואטומים לא חיוניים, הוספת שאריות ולולאות חסרים, הקצאת סדרי קשר נכונים, והוספת אטומי מימן קוטביים. מצבים פרוטונציה וטאוטומריים הוקצו ב-pH פיזיולוגי (7.0 ± 2.0) באמצעות מודול אפיק. מבני החלבון המוכנים עברו לאחר מכן מינימום אנרגיה מוגבל באמצעות שדה כוח OPLS להקלה על התנגשויות סטריות.
המבנים הדו-ממדיים של תרכובות 3, 4, 8(a–c) ו-9(d–f), יחד עם מעכבי הייחוס acarbose ו-thiourea, הוכנו באמצעות מודול LigPrep. סדרי קשרים, סטריאוכימיה ומצבי יינון ב-pH פיזיולוגי אופטימליזם, וקונפורמציות הליגנד התלת-ממדיות שהתקבלו הוקטנו באנרגיה באמצעות שדה הכוח OPLS.
רשתות קולטנים נוצרו באמצעות כלי יצירת רשת הקולטנים, כאשר תיבות הרשת מוקמות סביב הליגנדים הטבעיים שהתגבשו יחד כדי להגדיר את האתרים הפעילים. ממדי קופסת הרשת נקבעו ל-25 × 25 × 25 Å עבור שני החלבונים. רשת האוריז הייתה ממוקמת ב-x = −38.76, y = −44.14, ו-z = 66.88, בעוד שרשת ה-α-גלוקוזידאז הייתה ממוקמת ב-x = 21.14, y = −7.56, ו-z = 24.37.
חישובי עגינה בוצעו באמצעות מצב הדיוק המיוחד (XP) של Glide עם דגימת ליגנדים גמישה. נוצרו מספר תנוחות קישור לכל ליגנד, ונבחרה הפוזה עם ציון העגינה הנמוך ביותר ב-Glide לניתוח נוסף. פרוטוקול העגינה אומת על ידי חיבור מחדש של הליגנדים הקו-קריסטליים לרשתות הקולטנים שלהם. ערכי סטיית שורש ממוצע ריבוע (RMSD) של ≤2.0 Å אישרו את האמינות והשחזוריות של פרוטוקול העגינה.
קונפורמציות הקישור של הקומפלקסים המעוגנים הוצגו באמצעות PyMOL (גרסה 3.1)18. אינטראקציות חלבון–ליגנד, כולל קשרי מימן, מגעים הידרופוביים ואינטראקציות אלקטרוסטטיות, נותחו באמצעות Discovery Studio Visualizer19.
ניתוח תורת פונקציונליות צפיפות (DFT)
כל חישובי תורת הצפיפות (DFT) בוצעו באמצעות Gaussian 09, והגיאומטריות המולקולריות האופטימליות והאורביטלים המולקולריים הפרונטריים הוצגו באמצעות GaussView 5. הנגזרות הסינתטיות מבוססות טריאזול ואוקסדיאזול, 8(a–c) ו-9(d–f), עברו אופטימיזציה גאומטרית בפאזה מימית באמצעות פונקציונל היברידי תלת-פרמטרי Becke Le–Yang–Parr (B3LYP) בשילוב עם קבוצת הבסיס 6-311+G(d,p)20. אפקטים של ממס שולבו באמצעות מודל הרצף המקוטב (CPCM)21 בסגנון מוליך. חישובי תדר רטט בוצעו לאחר מכן באותה רמת תיאוריה כדי לאשר שכל המבנים האופטימליים תואמים למינימום המקומי האמיתי על פני האנרגיה הפוטנציאלית, כפי שמעיד היעדר תדרים מדומים.
כדי להבין את המעברים האלקטרוניים והיציבות הקינטית של התרכובות המסונתזות, חושבו האנרגיות של האורביטל המולקולרי הגבוה ביותר (EHOMO) והאורביטל המולקולרי הפנוי הנמוך ביותר (ELUMO). פער האנרגיה המולקולרי במסלול הגבול (ΔE = ELUMO - EHOMO) נקבע עבור כל נגזרת כדי להעריך את התגובתיות הכימית והיציבות הקינטית שלה, כאשר פער אנרגיה קטן יותר מצביע על תגובתיות גבוהה יותר.
יתרה מזאת, תיאורי תגובתיות כימית גלובלית — כולל קשיות כימית (η), רכות (S), פוטנציאל כימי (μ), אלקטרושליטיביות (X) ומדד האלקטרופיליות (w) — חושבו מהאנרגיות האורביטליות הגבוליות באמצעות משוואות תפעול סטנדרטיות22 הבאות:
(7)
(8)
(9)
(10)
התכונות האלקטרוניות המחושבות והתיאורים הגלובליים הושוו באופן שיטתי לאורך הסדרה כדי לקבוע יחסי מבנה-פעילות (SARs) המשקפים את פרופילי המעכבים של α-גלוקוזידאז ואוראז שנצפו בהם.
בנוסף, נוצרו והוצגו מפות פוטנציאל אלקטרוסטטי מולקולרי (MESP) באמצעות VESTA למיפוי התפלגות המטען במסגרת המולקולרית האופטימלית. המשטחים של MESP אפשרו זיהוי אזורים אלקטרופיליים (מועדפים על התקפה נוקלאופילית חסרי אלקטרונים) ונוקלאופיליים (מועדפים להתקפות אלקטרופיליות עשירים באלקטרונים). התפלגות הפוטנציאל האלקטרוסטטית הזו הייתה בסופו של דבר קשורה לאינטראקציות הקשירה הלא-קוולנטיות הספציפיות, כגון קשרי מימן ומגעים אלקטרוסטטיים, שנצפו בסימולציות העגינה המולקולרית.
ניתוח ADME
כדי להעריך את דמיון התרופות ותכונות הביופרמצבטיקה של נגזרות האצטמיד המבוססות על טריאזול ואוקסדיאזול 8(a–c) ו-9(d–f), בוצע ניתוח ספיגה, הפצה, מטבוליזם והפרשה (ADME) בסיליקו . ייצוגי מערכת כניסת קו (SMILES) הפשוטה של כל התרכובות הסינתזות, יחד עם מעכבי הייחוס acarbose וthiourea, נוצרו באמצעות חבילת תוכנת מידול מולקולרי והוגשו לשרת האינטרנט SwissADME23.
הפרמטרים הפיזיקוכימיים המחושבים כללו משקל מולקולרי (MW), ליפופיליות (logP), שטח פנים קוטבי טופולוגי (TPSA), מספר תורמי קשרי המימן (HBD), מספר מקבלי קשרי המימן (HBA), ומספר הקשרים הניתנים לסיבוב (RB).
תכונות פרמקוקינטיות הוערכו על ידי חיזוי ספיגת מערכת העיכול (GI) וחדירות מחסום דם-מוח (BBB). בנוסף, התרכובות הוערכו לעמידה בכלל החמש של ליפינסקי ובקריטריונים נוספים לדומות תרופה להערכת זמינות ביולוגית דרך הפה. לבסוף, ציון הנגישות הסינתטית (SA) חושב עבור כל תרכובת בסולם שנע בין 1 (קל לסינתזה) ועד 10 (קשה מאוד לסינתזה). פרופילי ה-ADME והדמיון לתרופות החזויים של התרכובות המסונתזות הושוו לאלו של מעכבי הייחוס כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם כמועמדים מובילים לפיתוח תרופות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כימיה ואפיון של תרכובות מסונתזות
נגזרות המטרה מבוססות טריאזול ואוקסדיאזול אצטמיד סונתזזו בהתאם למסלול הסינתטי המוצג באיור 1. התרכובות הרצויות התקבלו בתפוקה טובה עד מצוינת (69%–87%) כמוצקים גבישיים לבנים עד צהובים. טוהרם אושר באמצעות TLC, קביעת נקודת התכה וניתוחים ספקטרוסקופיים. ספקטרום NMR מייצגים המאשרים את הקבוצות הפונקציונליות האופייניות של התרכובות המסונתזות מוצגים באיור 2. הספקטר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה סינתז סדרה של נגזרות אצטמיד מבוססות טריאזול ואוקסדיאזול והעריך את תכונותיהן המבניות, הביולוגיות, החישוביות והפרמקוקינטיות. אפיון ספקטרוסקופי באמצעות HRMS, ניתוח יסודי,1 H NMR ו-13CNMR אישר את הסינתזה המוצלחת של מולקולות המטרה. השינויים הכימיים, דפוסי הקישור והתהודות הפחמן שנצפו היו תואמים למבנים המוצעים. אותות NH אופייניים של אמיד, תהודות מתילן, התפלגות פרוטונים ארומטיות ואותות פחמן קווטרנריים אישרו עוד יותר את השילוב המוצלח של חלקי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחבר מצהיר שאין ניגוד עניינים
תודות
המחבר מביע את הערכתו לפקולטה לרוקחות קלינית, אוניברסיטת אל-בה, ערב הסעודית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-Naphthylamine | Merck | 106148 | אמין ארומטי המשמש להכנת אנלוגים מוחלפים |
| 2,5-Dimethylaniline | Sigma-Aldrich | D146706 | אמין ארומטי המשמש לסינתזה של נגזרות מוחלפות |
| 3,4-Dimethylaniline | Alfa Aesar | A15416 | אמין ארומטי המשמש להכנת אנלוגים מבניים |
| Benzoic Acid | Sigma-Aldrich | 242381 | חומר התחלתי לסינתזה של ביניים של בנזוהידראזיד |
| Bromoacetyl Bromide | Sigma-Aldrich | B17601 | חומר אלקטרופילי המשמש בסינתזה של ביניים של ברומו-אצטאמיד |
| Carbon Disulfide | Sigma-Aldrich | 289116 | חומר ריאקציה מרכזי ליצירת מערכת טבעות אוקסדיאזול |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | ממס המשמש בתהליכי חילוץ וטיהור |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | ממס אפרותי קוטבי המשמש בתגובות דריבטיזציה והחלפה |
| Diphenylamine | Sigma-Aldrich | D23802 | אמין ארומטי המשמש בסינתזה של תרכובות נגזרות |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (תוכנה) | משמש לייצור מצבי יינון של ליגנדים ב-pH 7.0; RRID: N/A |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ממס תגובה להסטרפיקציה ויצירת הידראזיד |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989 | מרכיב פאזה ניידת קוטבית בניתוח TLC וחילוץ |
| Gaussian 09, Revision D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (תוכנה) | תוכנה המשמשת לחישובים של DFT (HOMO-LUMO, MESP, מתארים גלובליים של תגובתיות); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (תוכנה) | משמש להדמיה של מבנים מותאמים ואנרגיות אורביטלים; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (תוכנה) | תוכנת עגינה המשמשת ליצירת רשת קולטן ועגינה מולקולרית מדויקת במיוחד (XP); RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, version 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (תוכנה) | משמש לניתוח רגרסיה של IC50 והערכה סטטיסטית של נתוני עכבת אנזים; RRID:SCR_002798 |
| Hydrazine | Sigma-Aldrich | 225819 | ריאגנט המשמש להמרת אסטר לבנזוהידראזיד |
| L(+)-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | ריאגנט המשמש בחקירות הערכה ביולוגית |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (תוכנה) | משמש לאופטימיזציה של מבנה ליגנדים וליצירת קונפורמרים תלת-ממדיים; RRID:SCR_016746 |
| Lithium Hydride | Sigma-Aldrich | 201049 | זרז המשמש להפעלת קבוצת תיול בתגובות החלפה |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (תוכנה) | חבילת מודלים מולקולרית המשמשת להכנת מבנה חלבון/ליגנד ולהדמיה; RRID:SCR_016748 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | ממס המשמש בתהליכי טיהור והכנות מבחנים ביולוגיים |
| n-Hexane | Merck | 104391 | מרכיב פאזה ניידת לא קוטבית בניתוח TLC |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (שדה כוח) | שדה כוח המשמש למזעור אנרגיה של מבני חלבון וליגנד; RRID: N/A |
| Phenyl Isothiocyanate | Merck | 807028 | ריאגנט המשמש בסינתזה של נגזרות טריאזול |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (תוכנה) | משמש לשיפור מבנה הקולטן לפני עגינה; RRID:SCR_016749 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | בסיס המשמש להתאמת pH ולנטרול תגובה |
| Sulfuric Acid | BDH | 10276 | חומצה קטליזית המשמשת בשלב האסטרפיקציה בתנאי רפלוקס |
| Trimethylamine | Riedel-de Haen | 22129 | בסיס אורגני המשמש בסינתזה של נגזרות מוחלפות |
| VESTA, version 3.5.8 | Momma & Izumi (מפתחים); מופץ בחינם | N/A (תוכנה) | משמש להדמיה של פוטנציאל אלקטרוסטטי מולקולרי (MESP) ומפות משטח HOMO-LUMO; RRID: N/A |
מקורות
- Siddiqui SZ, et al. BSA binding, molecular docking, and in vitro biological screening of new 1,2,4-triazole heterocycles bearing an azinane nucleus. Pak J Pharm Sci. 2020;33(1):149-160.
- Khalilullah H, Ahsan MJ, Hedaitullah M, Khan S, et al. 1,3,4-Oxadiazole: A biologically active scaffold. Mini Rev Med Chem. 2012;12(8):789-801.
- Wang JJ, Sun W, Jia WD, Bian M, et al. Research progress on the synthesis and pharmacology of 1,3,4-oxadiazole and 1,2,4-oxadiazole derivatives: A mini review. J Enzyme Inhib Med Chem. 2022;37(1):2304-2319.
- Glomb T, Świątek P. Antimicrobial activity of 1,3,4-oxadiazole derivatives. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6979.
- Glomb T, Szymankiewicz K, Świątek P. Anti-cancer activity of derivatives of 1,3,4-oxadiazole. Molecules. 2018;23(12):3361.
- Aggarwal R, Sumran G. An insight into the medicinal attributes of 1,2,4-triazoles. Eur J Med Chem. 2020;205:112652.
- Strzelecka M, Świątek P. 1,2,4-Triazoles as important antibacterial agents. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(3):224.
- Kumar S, Khokra SL, Yadav A. Triazole analogues as potential pharmacological agents: A brief review. Future J Pharm Sci. 2021;7(1):106.
- Raza A, et al. Deep learning in drug discovery: A futuristic modality to materialize large datasets for cheminformatics. J Biomol Struct Dyn. 2023;41(18):9177-9192.
- Liu SK, et al. Discovery of new α-glucosidase inhibitors: Structure-based virtual screening and biological evaluation. Front Chem. 2021;9:639279.
- Lebovitz HE. Alpha-glucosidase inhibitors. Endocrinol Metab Clin North Am. 1997;26(3):539-551.
- Rego YF, et al. A review on the development of urease inhibitors as antimicrobial agents against pathogenic bacteria. J Adv Res. 2018;13:69-100.
- Daud S, et al. Design, synthesis, in vitro evaluation, and docking studies of ibuprofen-derived 1,3,4-oxadiazole derivatives as dual α-glucosidase and urease inhibitors. Med Chem Res. 2022;31(2):316-336.
- Chapdelaine P, Tremblay RR, Dubé JY. p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside as a substrate for measurement of maltase activity in human semen. Clin Chem. 1978;24(2):208-211.
- Manoharan A, et al. N-Acetylcysteine prevents catheter occlusion and inflammation in catheter-associated urinary tract infections by suppressing urease activity. Front Cell Infect Microbiol. 2023;13:1216798.
- Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed. Springer; New York, NY; 2006.
- Atkins P, de Paula J, Keeler J. Atkins' Physical Chemistry. 11th ed. Oxford University Press; Oxford, UK; 2018.
- DeLano WL. PyMOL: An open-source molecular graphics tool. CCP4 Newsl Protein Crystallogr. 2002;40:82-92.
- Discovery Studio Visualizer, Version 2.0. Accelrys Software Inc.; San Diego, CA; 2005.
- Tirado-Rives J, Jorgensen WL. Performance of B3LYP density functional methods for a large set of organic molecules. J Chem Theory Comput. 2008;4(2):297-306.
- Takano Y, Houk KN. Benchmarking the conductor-like polarizable continuum model (CPCM) for aqueous solvation free energies of neutral and ionic organic molecules. J Chem Theory Comput. 2005;1(1):70-77.
- Parr RG, Szentpály LV, Liu S. Electrophilicity index. J Am Chem Soc. 1999;121(9):1922-1924.
- Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7(1):42717.
- Wang YN, et al. Synthesis and biological evaluation of triazolones/oxadiazolones as novel urease inhibitors. Bioorg Med Chem. 2024;102:117656.
- Mehdi K, et al. Molecular docking and in vitro studies of synthesized oxadiazole derivatives as urease inhibitors. J Math Fundam Sci. 2025;57(1):1-23.
- Aziz M, et al. Phytochemical, pharmacological, and in silico molecular docking studies of Strobilanthes glutinosus Nees: An unexplored source of bioactive compounds. S Afr J Bot. 2022;147:618-627.
- Khan KM, et al. Biochemical, toxicological, and in silico aspects of Trillium govanianum Wall. ex D. Don (Trilliaceae): A rich source of natural bioactive compounds. Chem Biodivers. 2024;21(1):e202301375.
- Bibi H, et al. Isolation and characterization of bioactive constituents from Withania coagulans Dunal with antioxidant and multifunctional enzyme inhibition potential, supported by docking, molecular dynamics, and DFT studies. RSC Adv. 2025;15(56):48566-48584.
- Khurm M, Guo Y, Wu Q, Zhang X, et al. Conocarpus lancifolius (Combretaceae): Pharmacological effects, LC-ESI-MS/MS profiling and in silico. attributes. Metabolites. 2023;13(7):794.
- Abdo MA, Badawy SA, Fadda AA, Elmorsy MR. Design, synthesis, structural characterization, and antioxidant potential of novel triazole- and oxadiazole-based hydrazide-hydrazone derivatives: spectroscopic, DFT, and molecular docking studies. BMC Chem. 2025;19:192.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.