חמצון פנטון בסיוע ויטמין C משפר את ההרג החמצוני של הליקובקטר פילורי במבחנה

סיכום

מחקר זה בוחן כיצד ויטמין C מווסת את ההתנהגות הקינטית של תגובת פנטון בתנאי חוץ-גופה . בדיקות צבע כימיות ובדיקות חיידקיות מראות כי מינון מבוקר של ויטמין C משנה את התנהגות החמצון של התגובה והוא קשור לפעילות אנטיבקטריאלית מוגברת נגד הליקובקטר פילורי במערכת מודל פשוטה.

תקציר

זיהום הליקובקטר פילורי נותר נטל בריאותי עולמי משמעותי, והעלייה בשכיחות העמידות לאנטיביוטיקה מדגישה את הצורך באסטרטגיות אנטיבקטריאליות חלופיות. מחקר זה בדק האם מינון ויטמין C יכול לווסת את חמצון פנטון ולהגביר את הפעילות האנטיבקטריאלית החמצונית נגד H. pylori בתנאי חומציות מוגדרים במבחנה. הפעילות החמצונית הוערכה באמצעות הסרת צבע Acid Orange 7 כקריאה כימית עקיפה ובדיקת פלואורסצנציה של חומצה טרפתלית כאינדיקטור יחסי להיווצרות מוצר הקשור לרדיקלי הידרוקסיל בתגובות ברזל–פרוקסיד בתוספת ויטמין C. היעילות האנטיבקטריאלית הוערכה על ידי חשיפת H. pylori סטנדרטי תלונות במי מלח המכילים אוריאה ב-pH 3 למי חמצן וברזל ברזל עם או בלי תוספת של ויטמין C מדרגת, ואחריה ספירת יחידות ליצירת מושבה. תוספי ויטמין C שינו את הקריאות החמצוניות וקשרו לירידה גדולה יותר בחיידקים חיים בהשוואה לכימיה קונבנציונלית של פנטון. ניסויי חילוץ שהשתמשו בדפרוקסאמין ותיוריאה הפחיתו את הפעילות האנטיבקטריאלית, ותומכים בהשערה שפעילות אנטיבקטריאלית קשורה לתהליכים חמצניים המתווכים על ידי ברזל ולתהליכים חמצניים הקשורים לרדיקלים. צביעת פלואורסצנציה חיה/מת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורקים סיפקו תצפיות ויזואליות איכותניות התואמות את תוצאות מניין יחידת יצירת המושבה (CFU). ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שמינון מבוקר של ויטמין C יכול לווסת תגובות חמצון מבוססות פנטון ולשפר את הפעילות האנטיבקטריאלית נגד H. pylori במודל חומצי פשוט וחומצי.

מבוא

H. pylori, חיידק גרם-שלילי בעל צורה ספירלית השייך לסוג Helicobacter, הוכח במחקרי בריאות אוכלוסייה כי יש לו שכיחות גבוהה של זיהום באזורים גאוגרפיים, מין וגיל, עם שיעור שכיחות עולמי של כ-50^%1. הסוכנות הבינלאומית למחקר סרטן (IARC) סיווגה את ההילוקבוק פילורי כמסרטן קבוצה 1, תוך הדגשת הקשר החזק שלו לסרטן הקיבה ולימפומה של רקמת הלימפה הקשורה לריר (MALT). נכון להיום, הניהול הקליני של זיהום H. pylori מתבסס בעיקר על משטרים פרמקולוגיים. החומרים הנחקרים ביותר כוללים מעכבי משאבת פרוטון (PPIs), המדכאים הפרשת חומצות קיבה; תרכובות ביסמוט, המשפרות את יעילות האנטיביוטיקה; ואנטיביוטיקה כמו אמוקסיצילין, קלריתרומיצין ומטרונידאזול. עם זאת, הוכח כי המונותרפיה אינה מספקת להכחדה מוחלטת, מה שהוביל לשימוש נרחב במשטרי שילובים, המכונים בדרך כלל טיפול משולש. גישה זו כוללת בדרך כלל PPI, קלריתרומיצין ואמוקסיצילין או מטרונידזול, הניתנים למשך כשבועיים³. עם העלייה בשכיחותם של זני H. pylori עמידים לאנטיביוטיקה, יעילות הטיפול המשולש ירדה משמעותית, מה שהוביל לאימוץ טיפול מרובע הכולל PPI, ביסמוט ושתי אנטיביוטיקות³. עם זאת, משטרים אלו עדיין תלויים בעיקר באנטיביוטיקה, ועמידות לאנטיביוטיקה נותרה אתגר^{מרכזי בניהול קליני.} כתוצאה מכך, החקירה של אסטרטגיות אנטיבקטריאליות אלטרנטיביות, בלתי תלויות באנטיביוטיקה, משכה עניין גובר.

מעבר להשפעותיו הפתולוגיות הישירות, זיהום H. pylori נקשר גם לשינויים בהומאוסטזיס המיקרונוטריאנטים בקיבה. מחקרים קליניים ואפידמיולוגיים דיווחו על ריכוזים מופחדים של ויטמין C במיץ הקיבה ובסרום^{של אנשים} נגועים, שעשויים להיות קשורים לדלקת רירית, הפרשה לקויה או עלייה בצריכה חמצונית ^7,8,9. במקביל, זיהום ב-H. pylori נקשר למחסור בברזל באמצעות מנגנונים שונים, כולל ירידה בחומציות הקיבה, פגיעה בספיגת ברזל תזונתי ותחרות חיידקית על ברזל זמין¹⁰. תצפיות אלו מדגישות את הסביבה הביוכימית המורכבת המלווה את זיהום ה-H. pylori ומדגישות את הרלוונטיות של תהליכים הקשורים לחמצון רדוקסי וברזל בתנאי קיבה חומציים.

מיני חמצן תגובתי (ROS) זכו לעניין רב במחקר אנטימיקרוביאלי בשל תכונות החמצון של מינים אלו. ROS מתייחסים לסוג של מולקולות תגובתיות כימית שנוצרות במהלך הפחתה חלקית של חמצן, כגון אניון סופר-חמצני (O₂•⁻), מי חמצן מימן (H₂O₂), חמצן יחיד (¹O₂) ורדיקלים הידרוקסיליים (•OH), בין היתר. במערכות ביולוגיות, ROS מעורבים באופן נרחב במטבוליזם פיזיולוגי תקין וחיוניים לפעילויות רגולטוריות תאיות מגוונות¹¹. ראוי לציין כי מחקרים רבים הראו כי ROS מופרז עלול לשבש את ממברנות התאים החיידקיים באמצעות פרוקסידציה של שומן, מה שמוביל לשינויים במבנה ובתפקוד הממברנה, ובסופו של דבר להבאת פעילות חיידקית¹². בהתאם לכך, גישות אנטימיקרוביאליות מבוססות ROS זכו לעניין כאפשרות לחקור השפעות אנטיבקטריאליות שאינן אנטיביוטיות נגד H. pylori 13,14,15,16. מבין שיטות שונות לייצור ROS, תגובת פנטון זכתה לתשומת לב רבה בזכות ייצור רדיקלי יעיל מאוד. תגובת פנטון היא תהליך חמצון מתקדם¹⁷ שבו יוני ברזל (Fe²⁺) מגיבים עם H₂O₂ בתנאים חומציים ליצירת רדיקלים הידרוקסיליים (•OH), בעלי פוטנציאל חמצוני חזק ויכולים לחמצן מולקולות ביולוגיות תוך-תאיות.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+^OH-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

באופן ספציפי, ב-pH של כ-2.8–4.5, H₂O₂ עובר פירוק קטליטי על ידי Fe²⁺, ומייצר •OH בעוד Fe²⁺ מחומצן^{ל-Fe 3}⁺. Fe³⁺ מגיב אז עם H₂O₂ כדי להתחדש Fe²⁺, ויוצר מחזור חמצון אדום Fe²⁺/Fe³⁺ שתומך בייצור ROS רציף¹⁸. עם זאת, ההפחתה של Fe³⁺^{ל-Fe 2}⁺ היא איטית יחסית, ומהווה את שלב הגבלת הקצב ומוריד את היעילות הכוללת של תגובת פנטון. מחקרים מראים כי הכנסת חומר מפחית מתאים למערכת תגובת פנטון יכולה להאיץ את הפחתת Fe²⁺^{ל-Fe 2}⁺, ובכך לשפר את יצירת ROS. לויטמין C יש תפקיד רדוקס תלוי הקשר. במערכות המכילות ברזל, הוא יכול לקדם הפחתת Fe²⁺^{ל-Fe 2}⁺ ובכך לתמוך במחזור פנטון, בעוד שבריכוזים גבוהים יותר או בתנאי תגובה שונים, הוא עשוי לשמש גם כנוגד חמצון או כאוסף רדיקלי¹⁹.

בהתבסס על רקע זה, המחקר הנוכחי בוחן מערכת תגובת פנטון בסיוע ויטמין C כגישה כימית לוויסות פעילות חמצונית תחת תנאי חומציות מוגדרים^{במבחנה 20,21}. ויטמין C שימש כסוכן מפחית לסיוע בהתחדשות Fe²⁺ ובכך לשנות את ההתנהגות החמצונית היעילה של תגובת פנטון. המערכת הניסויית ששימשה כאן הייתה מודל חומצי-אוריאה מלוחית פשוט, ולא נועדה לשחזר במלואו את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית של הקיבה, הכוללת ריר, רכיבי חיפוץ, תאי מארח, גורמי חיסון ומגוון תת-חומרים אורגניים. בתוך מודל מבוקר זה, פעילות החמצונית אופיינה באמצעות קריאות כימיות והוערכה במקביל לתגובות פנוטיפיות של חיידקים, מה שסיפק בסיס ניסיוני לבדיקת השפעות אנטיבקטריאליות הקשורות ל-ROS נגד H. pylori במבחנה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה
מחקר זה היה מחקר חיידקים חוץ-גופיים ולא כלל משתתפים אנושיים, נבדקים בבעלי חיים או חומרים שמקורם במטופלים. לכן, לא נדרשו אישור ועדת ביקורת מוסדית ואישור אתיקה של בעלי חיים.

הערכת פירוק AO7 במערכת פנטון המסייעת בוויטמין C
כדי להעריך את השפעת ויטמין C על ההתנהגות החמצונית הנצפית של תגובת פנטון, נעשה שימוש בפירוק חומצי תפוז 7 (AO7) כקריאה כימית עקיפה של פעילות חמצונית. בדיקה זו אינה מכמת במפורש מיני חמצן ריאקטיביים בודדים. הכנתי 100 מ"ל תמיסת AO7 ב-5 מ"ג/ליטר והתאמתי את התמיסה ל-pH 3. הוספתי H₂O₂ ו-FeSO₄ לריכוזים הסופיים של 2.2 mM ו-0.055 mM, בהתאמה. הוספתי ויטמין C או כבולוס יחיד בתחילת התגובה או בשיטת מינון בת שלושה שלבים. לניסוי המינון-תגובה, נעשה שימוש ביחס מולרי של Vc: Fe²⁺ של 0, 0.12, 0.24, 0.48, 2, 4, 6 ו-8, התואמים לריכוזי ויטמין C הסופיים של 0, 0.0066, 0.0132, 0.0264, 0.110, 0.220, 0.330 ו-0.440 מ"מ, בהתאמה, כאשר FeSO₄ משמש ב-0.055 מ"מ. בתנאי התוספת בת שלושה שלבים, חילקו את אותה כמות ויטמין C לשלושה אליקווטים שווים והוספו אליקו אחד ב-3, 5 ו-7 דקות לאחר תחילת התגובה. לדוגמה, ביחס Vc:Fe²⁺ של 0.48, הוספתי ויטמין C ב-0.0088 מ"מ לכל אליקווט, מה שנותן ריכוז כולל סופי של 0.0264 מ"מ.

ערבבתי את תמיסת התגובה ברציפות בחושך במשך 10 דקות תוך שמירה על טמפרטורה מתחת ל-30 מעלות צלזיוס. אספתי דגימות של 2 מ"ל לפני ואחרי התגובה. מדד את הספיגה ב-483 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis, וחישוב את קצב ההתדרדרות AO7 באמצעות משוואה 1:

קצב התדרדרות (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100% (1)

כאן, A₀ מייצג את הספיגה של הדגימה לפני התגובה, בעוד A₁ מייצג את הספיגה של הדגימה לאחר התגובה.

הערכת אות פלואורסצנציה קשור ל-OH באמצעות גלאי TA
כדי להעריך אותות פלואורסצנציה הקשורים לרדיקלי הידרוקסיל באותם תנאים חומציים במבחנה ששימשו בניסויים האנטיבקטריאליים, הוקם מערכת כימית ללא תאים המשתמשת בדי-סודיום טרפתלטלט (TA, 1 mM) כגלאי פלואורסצנציה. בדיקה זו שימשה כאינדיקטור יחסי להיווצרות מוצר הקשור ל-OH ולא פורשה ככימות מוחלט של יצירת רדיקלי הידרוקסיל. נכללו שבע קבוצות: (1) ריק (1 mM TA רק בבופר תגובה), (2) H₂O₂ בלבד, (3) Fe²⁺ בלבד, (4) Vc בלבד (תוספת מדורגת), (5) פנטון קונבנציונלי (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) פנטון בסיוע ויטמין C עם תוספת בולוס Vc (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, בולוס), ו-(7) פנטון בסיוע Vc עם תוספת מדורגת של Vc (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, מדרגתית). בתנאי החיבור בשלב שלבי, Vc הוכנס ב-3, 5 ו-7 דקות לאחר תחילת התגובה באליקוואטים שווים, בעוד שתנאי הבולוס קיבל את אותה כמות כוללת של Vc כמו תוספת בודדת.

אליקווטים נאספו לאורך תקופת תגובה של 10 דקות, הוסבו מיד לבסיסים עם NaOH כדי לדכא תגובות רדיקליות נוספות ולייצב פלואורסצנציה, ונשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני המדידה. עוצמת הפלואורסצנציה של המוצר שמקורו ב-TA נמדדה באמצעות קורא מיקרופלט (Ex/Em: 315/425 ננומטר). יצירת רדיקלים באה לידי ביטוי בעוצמת פלואורסצנציה לאחר חיסור ריק ושימשה כאינדיקטור יחסי ליצירת רדיקלים. בוצעו לפחות שלושה ניסויים עצמאיים, והנתונים הוצגו כפרופילי זמן-מסלול והשוואות נקודות קצה לאחר 10 דקות.

הערכת ביצועים אנטיבקטריאליים באמצעות ספירת מושבות
זני H. pylori אוחסנו בטמפרטורה של −80 °C במרק עירוי לב מוחי (BHI) שהכיל 25% גליצרול. הזן העיקרי ששימש לבדיקת ספירת המושבות הראשית, מבחן חילוץ, בדיקת התאבכות מטריצה, צביעת פלואורסצנציה חיה/מתה, וניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני סורק היה H. pylori G27. לפני כל ניסוי, חיידקים הועברו על לוחות אגר דם קולומביה ודגרו במשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים מיקרואירופיליים שכללו 5% O₂, 10% CO₂ ו-85% N^₂2.

בדיקת ספירת מושבות בזן הראשוני
השתמשו במניין יחידת יצירת מושבות (CFU) להערכת פעילות אנטיבקטריאלית בתנאי טיפול שונים. כלל את הקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת לא מטופלת, H₂O₂ בלבד, ויטמין C בלבד, תגובה קונבנציונלית של פנטון, ותגובה בסיוע ויטמין C. אם קבוצה של Fe²⁺ בלבד לא נכללה בניסוי המקורי, יש להימנע מפרשנות הבדיקה הראשית כהפרדה מלאה של השפעות ברזל בלבד מהשפעות חמצון בתגובת פנטון. נקטף H. pylori מתורבתים ומחזיר את החיידקים לסליין פיזיולוגי. כווננו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) ל-0.5, והעבירו את המתלה לסליין פיזיולוגי המכיל 3 mM אוריאה מותאמים ל-pH 3. הוספתי H₂O₂, FeSO₄ וויטמין C בהתאם לקבוצת הטיפול שהוקצה. השתמשו בריכוזים סופיים של 2.2 mM H₂O₂ ו-0.055 mM FeSO₄. בטיפול בסיוע ויטמין C בפנטון, הוספתי ויטמין C בשלושה אליקוטים שווים ב-3, 5 ו-7 דקות, עם ריכוז סופי כולל של 0.0264 מ"מ.

לאחר 10 דקות טיפול, כל דגימה דוללה מיד פי 100 בתמיסת מלח מפופר פוספט (PBS, pH 7.4) כדי לנטרל את ההשעיה החומצית ולהפחית את העברת המחמצנים והברזל שנותרו לשלב הציפוי. ציפוי את השעיין החיידקי המדולל על לוחות אגר דם קולומביה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים בתנאים מיקרואירופיליים של 5% O₂, 10% CO₂ ו-85% N₂. ספירת CFU וחישבתי פעילות אנטיבקטריאלית כ-log₁₀ הפחתה CFU ביחס לביקורת שלא טופלה באמצעות משוואה 2:

log₁₀ הפחתת CFU = log₁₀ (_בקרת CFU) − log10(_{CFU טופל}) (2)

מבחן חילוץ
כדי לבדוק האם הפעילות האנטיבקטריאלית של מערכת פנטון המסייעת בוויטמין C קשורה לזמינות ברזל ותהליכים הקשורים לרדיקלים, בוצעו ניסויי חילוץ באמצעות דפרוקסמין (DFO) ככילטור ברזל ותיוריאה כאוסף רדיקלי הידרוקסילי. DFO או תיוראה נוסף לטיפול החיידקי 5 דקות לפני הוספת FeSO₄ ו-H₂O₂. DFO ותיוריאה שימשו בריכוזים סופיים של 100 מיקרומום ו-5 מ"מון, בהתאמה.

שש קבוצות ניסוי נכללו: קבוצת ביקורת לא מטופלת, פנטון בעזרת ויטמין C, פנטון בסיוע ויטמין C עם DFO, פנטון עם ויטמין C עם תיאוראה, DFO בלבד, ותיוריאה בלבד. כל שאר הפרמטרים הניסיוניים, כולל pH, רקע מליחה/אוריאה, ריכוז H₂O₂, ריכוז FeSO₄, לוח זמנים למינון ויטמין C, משך טיפול, דילול/ניטרול לפני הציפוי ותנאי הדגירה, היו זהים לאלו ששימשו במבחן ספירת המושבה הראשונית. הפעילות האנטיבקטריאלית נמדדה על ידי ספירת CFU והובאה לידי ביטוי כהפחתה של log₁₀ CFU ביחס לביקורת שלא טופלה.

אימות מולטי-סטריין
כדי לספק תמיכה מוגבלת בזן הצולב להשפעה האנטיבקטריאלית שנצפתה בזן הראשוני, מבחן ספירת המושבות יושם עוד על שני זני ייחוס נוספים של H. pylori , ATCC 43504 ו-ATCC 26695. לכל זן נכללו שלוש קבוצות ניסוי: ביקורת לא מטופלת, תגובת פנטון קונבנציונלית, ותגובת פנטון בסיוע ויטמין C עם תוספת מדורגת של ויטמין C. התנאים וההליכים הניסיוניים היו זהים לאלו ששימשו בבדיקת ספירת המושבות הראשונית. הפעילות האנטיבקטריאלית הובאה לידי ביטוי כהפחתה של log₁₀ CFU ביחס לבקרה שלא טופלה עבור כל זן. כל ניסוי בוצע עם n = 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים, והנתונים הוצגו כנקודות נתונים בודדות עם סטיית תקן ממוצעת ±.

בדיקת התאבכות מטריצית
כדי להעריך האם רכיבי מטריצה אורגניים יכולים להחליש את הפעילות האנטיבקטריאלית של מערכת פנטון בסיוע ויטמין C, הוקם מודל הפרעות חלבון באמצעות אלבומין בסרום בקר (BSA). BSA נכללה בריכוזים סופיים של 0, 1 ו-3 g· L⁻¹. בכל ריכוז BSA, נכללו שלוש קבוצות ניסוי: (1) ביקורת לא מטופלת, (2) פנטון קונבנציונלי (Fe²⁺ + H₂O₂), ו-(3) פנטון בסיוע ויטמין C עם תוספת מדורגת של ויטמין C. הבדיקה בוצעה באמצעות הזן הראשוני תחת אותו פרוטוקול שתואר במבחן ספירת המושבה הראשונית, עם תנאי pH זהים, רקע של מי מלח/אוריאה, ריכוזי תגובה, משך טיפול (10 דקות) ונהלי ציפוי. הפעילות האנטיבקטריאלית הובאה לידי ביטוי כהפחתה של log₁₀ CFU ביחס לביקורת שלא טופלה בכל ריכוז BSA. כל ניסוי בוצע לפחות שלוש פעמים באופן עצמאי. ההשוואה העיקרית התמקדה בשאלה האם מצב פנטון המשופר נשאר עליון, או לפחות לא חלש יותר, ממצב פנטון הקונבנציונלי בתנאים המכילים חלבון.

צביעת פלואורסצנציה חיה/מת חיידקית
לאחר הטיפול, השעון החיידקי דולל פי 100 ב-PBS כפי שתואר לעיל, כדי להפחית את ההעברה החומצית והחמצנית שנותרה. צנטריפוגה את המתלה ב-1,800 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר וזרקתי את הסופרנטנט. הושעה מחדש את הכדור החיידקי ב-200 מיקרוליטר של מי מלח פיזיולוגיים. הוספתי SYTO9 ויודיד פרופידיום (PI) לריכוזים הסופיים של 6 מיקרומום ו-30 מיקרומון, בהתאמה. דגמתי את המתלה בחושך במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הנחתי 5–10 מיקרוליטר מהמתלה החיידקי המוצבע על מחסנית זכוכית נקייה וכיסיתי אותה בכיסוי. תמונות פלואורסצנציה נרכשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם תעלות פלואורסצנציה ירוקות ואדומות בתנאי חשיפה זהים לכל קבוצות הטיפול. לכד לפחות שלושה שדות שנבחרו באקראי עבור כל קבוצה. השתמשתי בתמונות כהוכחה ויזואלית איכותית לדפוסי צביעה חיים/מתים ולא כמדידה כמותית של חיוניות חיידקים.

ניתוח מורפולוגיה חיידקית באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת
לאחר הטיפול, דגימות החיידקים נאספו וקיבעו בגלוטראלדהיד 2.5% שהוכן בבופר פוספט של 0.1 מ' (pH 7.4) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר הקיבעון, הדגימות נשטפו עם בופר פוספט להסרת קיבוע שאריתי. הדגימות יובשו ברצף בתמיסות אתנול מדורגות של 50%, 70%, 90% ו-100%. לאחר ההתייבשות, בוצעה ייבוש בנקודה קריטית. הדגימות היבשות הורכבו על עמודי SEM וצופו בשכבת זהב דקה של כ-10 ננומטר. מורפולוגיית החיידקים נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק במתח מואץ של 5 קילו-וולט. תמונות מייצגות צולמו בהגדלה נמוכה וגבוהה לכל קבוצת טיפול. תמונות SEM שימשו כתצפיות מורפולוגיות איכותיות ולא כראיות כמותיות למנגנון נזק מוגדר.

ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות גרסה 10.0 של GraphPad Prism. כל הניסויים הכמותיים בוצעו עם n = 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים, והנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). לבדיקות פלואורסצנציה של TA, בוצעו השוואות סטטיסטיות בין קבוצות טיפול מרובות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן השוואות מרובות של טוקי. לבדיקות ספירת מושבות בזן הראשוני הכולל מספר מצבי טיפול, בוצעו השוואות סטטיסטיות באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של טוקי. לבדיקות חילוץ, בוצעו השוואות בין קבוצות באמצעות ANOVA חד-כיווני, ואחריה מבחן ההשוואות המרובות של דאנט, כאשר קבוצת פנטון בסיוע ויטמין C הוגדרה כהפניה. לניסויי אימות צולב מוגבלים, הושוו הפחתות log₁₀ CFU בין קבוצות פנטון קונבנציונליות וקבוצות פנטון בסיוע ויטמין C בכל זן באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג. בבדיקות התאבכות מטריצה, בוצעה ANOVA דו-כיווונית עם טיפול וריכוז BSA כגורמים, כולל מונח האינטראקציה. השוואות זוגיות בין טיפולים בכל ריכוז BSA בוצעו באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של שידאק. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05. רמות המובהקות מצוינות כ-*p < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001, ו-****p < 0.0001.

תוצאות

הערכת פירוק AO7 במערכת פנטון המסייעת בוויטמין C
פירוק AO7 שימש כגלאי כימי לבחינת האופן שבו ויטמין C משפיע על ההתנהגות החמצונית הנצפית של תגובת פנטון בתנאים חומציים. בהיעדר ויטמין C, מערכת פנטון הקונבנציונלית גרמה לפירוק חלקי של AO7 במהלך תקופת תגובה של 10 דקות. כאשר הוצג ויטמין C, היקף פירוק הצבע גדל, כאשר ההשפעה תלויה ביחס המולרי בין ויטמין C ל-Fe2⁺. ביחס ויטמין C נמוך יחסית: Fe²⁺, התדרדרות AO7 עלתה בהשוואה למצב ללא ויטמין C. יעילות פירוק מרבית של כ-73.5% ...

דיון

המחקר הנוכחי בדק האם מינון ויטמין C יכול לווסת את ההתנהגות החמצונית ואת הקריאות האנטיבקטריאליות של מערכת מבוססת פנטון בתנאי חומציות מוגדרים במבחנה . בכל הבדיקות הכימיות והמיקרוביולוגיות, תוסף ויטמין C בהדרגה שינה את התנהגות התגובה הנצפית והיה קשור לפעילות אנטיבקטריאלית גבוהה יותר נגד H. pylori מאשר תגובת פנטון קונבנציונלית בתנאים שנבדקו. חשוב לציין כי יש לפרש מערכת זו כמודל פשוט של חומצית-מלחה-אוריאה ולא כמיקרוסביבה פיזיולוגית קיבתית מלאה. המודל תוכנן לספק סביבה כימית ו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	משמש כצבע מודלי עבור מבחן פירוק AO7.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	משמש למבחן הפרעת מטריצה.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	משמש לגידול חיידקים וקריו-אחסון.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	משמש לגידול חיידקים וספירת CFU.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	משמש להכנת דגימות SEM לאחר התייבשות אתנול מדורגת.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	משמש ככלאי ברזל במבחן החילוץ.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	משמש כחלחל פלואורסצנטי של TA לגילוי אותות •OH.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	משמש להכנת סדרת אתנול מדורגת להתייבשות דגימות SEM.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	משמש לדימות פלואורסצנטי של חי/מת.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	משמש לקיבוע דגימות חיידקים לפני SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	משמש לאחסון חיידקים בקריו בתרחיף BHI.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	משמש לניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	זן הפניה נוסף המשמש לאישור חוצה זנים מוגבל.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	זן הפניה נוסף המשמש לאישור חוצה זנים מוגבל.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	זן ראשוני המשמש לספירת מושבות, מבחן החילוץ, מבחן הפרעת מטריצה, צביעת חי/מת, ו-SEM.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	משמש כמצע הפרוקסיד בבדיקות תגובת פנטון.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	משמש כמקור יון ברזל בתגובת פנטון.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	משמש למדידת פלואורסצנטיה שמקורה ב-TA (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	משמש לדילול/ניטרול שלאחר הטיפול לפני ציפוי ושטיפת דגימות.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	משמש למתלה חיידקים והכנת מודל המלח החומצי-אורה.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	משמש לניתוח מורפולוגיה של חיידקים.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	משמש לאלקלזיה של תמציות בדיקת TA ויציבות הפלואורסצנטיה.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	משמש להחלת ציפוי זהב דק לפני הדמיית SEM.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	משמש לצביעת חיידקים על בסיס פלואורסצנטי.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	משמש כסופג רדיקלים במבחן החילוץ.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	משמש להכנת מודל המלח החומצי-אורה.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	משמש למדידת ספיגה של AO7 ב-483 ננומטר.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	משמש כמחזר במערכת הפנטון עם ויטמין C.