שיטה חצי-אוטומטית לזיהוי הבדלים בקבוצות במספרי נוירונים דופמינרגיים באשכולות המדיאליים הקדמיים במוח הדרוזופילה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה חצי-אוטומטית לכימות מספרי נוירונים דופמינרגיים בצביר המדיאלי הקדמי הקדמי הגדול של דרוזופילה . הגישה הזו, שנועדה במיוחד לזהות ולהשוות הבדלים בין קבוצות ניסוי לביקורת, מפחיתה את התלות בספירה ידנית ומספקת כלי מעשי לניתוחים ברמת הקבוצה.

תקציר

דרוזופילה מלנגסטר משמש כאורגניזם מודל עוצמתי לחקר מחלות ניווניות עצביות, כולל מחלת פרקינסון (PD), בעיקר באמצעות ניתוח של ניוון נוירונים דופמינרגיים (DA) וליקויים בתנועה נלווים. היסטורית, כימות אובדן נוירוני DA במוח הזבוב הוגבל לאשכולות קטנים יותר וניתנים לספירה בקלות, כולל אשכולות פרוטומוח אחורי מדיאלי (PPM) ואשכולות פרוטומוחיים אחוריים לטרליים (PPL). לעומת זאת, אשכול הפרוטומוח הקדמי המדיאלי (PAM) הגדול בהרבה, הכולל מעל 100 נוירונים, מהווה אתגר משמעותי לספירה ידנית, מה שמוביל לייצוג חסר במחקרים כמותיים. עד כה, מחקרים מדווחים עדיין מסתמכים על ספירות ידניות עתירות עבודה דרך מחסניות Z קונפוקליות, שהן גוזלות זמן ונוטות לשונות. כדי להתמודד עם פער מתודולוגי זה, פיתחנו צינור ניתוח תמונות חצי-אוטומטי באמצעות כלי הקוד הפתוח Labkit. פרוטוקול זה מאפשר כימות יעיל יחסי קבוצתי של נוירונים חיוביים לטירוזין הידרוקסילאז (TH) באשכול PAM באותה אצווה ניסויית. השיטה מתחילה בצביעת אימונופלואורסצנציה סטנדרטית ודימות קונפוקלי, ואחריה מדריך מפורט שלב אחר שלב לסגמנטציה וניתוח. גישה זו מתמודדת עם צוואר הבקבוק של כימות אשכולות PAM ומספקת זרימת עבודה מעשית לזיהוי הבדלים בין-קבוצות בפגיעות נוירוני DA במודלים של נוירודגנרציה. המחסור היחסי במחקרי פרקינסון באשכול PAM משקף מחסום טכני היסטורי ולא חוסר רלוונטיות ביולוגית. על ידי התגברות על מחסום זה, השיטה שלנו פותחת דלת לחקירה שיטתית של פגיעות נוירוני PAM בפרקינסון והקשר הפוטנציאלי שלה לתסמינים לא מוטוריים.

מבוא

זבוב החומץ, Drosophila melanogaster, הוא אורגניזם מודל פופולרי לחקר היסודות הגנטיים והמולקולריים של מחלות ניווניות נוירודגנרטיביות, ובמיוחד מחלת פרקינסון (PD)¹. מסלולי האיתות הנוירונים השמורים שלו, ערכת הכלים הגנטית המתקדמת ותוחלת החיים הקצרה הופכים אותה למתאימה במיוחד לחקר פגיעות עצבית תלויה בגיל ולביצוע סקרים גנטיים ופרמקולוגיים בעלי תפוקה גבוהה ^2,3. במרכז המחקרים הללו עומדת ניתוח נוירונים דופמינרגיים (DA), שהניוון הסלקטיבי שלהם הוא סימן פתולוגי של PD⁴. במוח דרוזופילה, נוירוני DA מאורגנים לאשכולות נפרדים וניתנים לזיהוי גנטי ^5,6. האובדן ההדרגתי של נוירוני DA בתוך אשכולות ספציפיים, המוצג על ידי צביעת חיסון TH וכימות באמצעות מיקרוסקופיה, משמש כקריאה פונקציונלית ראשונית להערכת התקדמות המחלה והתערבויות נוירופרוטקטיביות במודלים ניסיוניים ^7,8. לכן, כימות אמין של אובדן נוירוני DA הוא חיוני לתרגום כוח הגנטיקה של דרוזופילה לתוצאות מחקר משמעותיות במחלות פרקינסון.

באופן קונבנציונלי, ניתוח כמותי של אובדן נוירוני DA התמקד בצביעת חיסון טירוזין הידרוקסילאז (TH) של אשכולות קטנים, כולל אשכולות פרוטומוח אחורי מדיאלי (PPM) ואשכולות פרוטומוח אחוריים לטרליים (PPL), כאשר כל אשכול מכיל פחות מ-10 תאים שניתן לספור בקלות על ידי העין⁷. ספירה ידנית באמצעות ערימות Z קונפוקליות, אף שהיא מתישה, הייתה השיטה המבוססת לאשכולות אלו במחקרים רבים של PD באמצעות Drosophila ^9,10,11. לעומת זאת, ספירה ידנית של אשכול הפרוטומוח הקדמי המדיאלי (PAM), קבוצת נוירוני DA הגדולה ביותר במוח הזבובים, הכוללת מעל 100 תאים, מציגה צוואר בקבוק מתודולוגי ממושך ומונע הכללתו ברוב מחקרי PD ^9,10,11. למרות התפקיד הקריטי של נוירוני PAM במעגלי למידה, זיכרון ומוטיבציה, מגבלה זו הובילה לייצוג חסר יחסי בניתוחים כמותיים של ניוון עצבי 12,13,14,15. ראוי לציין שגם חקירות אחרונות ממשיכות להסתמך על גישה לא יעילה זו של ספירה ידנית, מה שמדגיש צורך מתמשך ובלתי מסופק לפתרון סטנדרטי ואוטומטי^בשטח.

כדי להתמודד עם הפער הקריטי הזה, פיתחנו צינור ניתוח תמונה חצי-אוטומטי שמאפשר כימות יעיל יחסי קבוצתי של נוירונים TH-חיוביים (TH⁺) באשכול PAM בתוך ניסוי. פרוטוקול זה מנצל את התוסף Labkit הקוד הפתוח המבוסס על למידת מכונה בפלטפורמת Fiji/ImageJ ותוכנת עיבוד תמונות תלת-ממדית^16,17. תהליך העבודה המרכזי דורש מהמשתמש להוסיף הערות לתת-קבוצה מייצגת של תמונות כדי לאמן מודל סיווג פיקסלים, אשר מיושם לאחר מכן על מאגרי נתונים ניסיוניים של צביעת TH בתהליכי אצווה, ולאחר מכן יצירת נקודות גרעין וסיווג ביחס לאזור ^TH+. גישה זו מאזנת בין אוטומציה לפיקוח מקצועי: היא מפחיתה את העומס והשונות של ספירות ידניות מלאות תוך שמירה על קלט החוקרים להכוונת האלגוריתם ולסקירת התוצאות.

מטרת מאמר זה היא לספק לחוקרים פרוטוקול שלב אחר שלב לכימות יעיל של נוירוני DA באשכול PAM להשוואות קבוצתיות-יחסיות בתוך ניסוי. אנו מדגימים את כל תהליך העבודה, החל מניתוח מוח, צביעת אימונופלואורסצנציה והדמיה קונפוקלית ועד לצינור ניתוח תמונות מפורט בשיטה חצי-אוטומטית. על ידי סטנדרטיזציה של שלב כמותי מרכזי זה, פרוטוקול זה שואף להעצים את קהילת המחקר לשלב באופן עקבי את אשכול ה-PAM הגדול בניתוחים שלהם. שיטה חצי-אוטומטית זו מיועדת במיוחד לאשכול PAM ואינה מתאימה לאשכולות דופמינרגיים אחרים או לנוירונים חיוביים ל-TH באונות הראייה. שיטה זו עשויה לסייע במחקרים ברמת אצווה של פגיעות נוירוני DA באשכולות PAM ולחקירות נוספות בפלסטיות סינפטית, ניוון עצבי וסינון טיפולי באמצעות מודל דרוזופילה .

פרוטוקול

1. הכנת דגימות ודימות קונפוקלי

1. גידול ואיסוף זבובים
   1. זבובים חוצי הורים של הגנוטיפים הרצויים ליצירת צאצאים ניסיוניים. לאחר האקלוזיה, יש לאסוף 20–30 זבובים בכל בקבוקון מזון טרי. שמרו על זבובים בהתאם לעיצוב הניסוי של המשתמש עד לגיל הניסוי הרצוי.
2. הכנה לניתוח
   1. הכינו תבנית נתיחה על ידי מילוי מכסה של צלחת פטרי בעובי 30 מ"מ לגובה חצי באלסטומר סיליקון סילגארד. מלאו את הצלחת במי מלח עם פוספאט (PBS) פעמיים אחד. עליקו 450 מיקרוליטר של קיבוע המכיל 1x PBS ו-4% פאראפורמלדהיד (PFA) בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.6 מ"ל, ואז מניחים את הצינור על קרח.
   2. הרדמה זבובי 10–20 עם פולס של CO₂ של 5–10 שניות, ואז מעבירים אותם מיד לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המונחת על קרח לשמירה על חוסר תנועה.
      זהירות: PFA רעיל וחשוד כמסרטן. הידית עם קפוצ'ון אדים עם כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן. סילוק פסולת בהתאם להנחיות מוסדיות לחומרים מסוכנים.
3. ניתוח מוח זבוב וקיבוע
   1. אחז בזבוב בשורש הכנף בעזרת מלקחיים וטבול אותו בצד הגחון כלפי מעלה בצלחת הניתוח המלאה ב-PBS. חדרו את החזה עם סיכת ניתוח עדינה כדי לעגן את הזבוב על רפידת סילגארד.
   2. כיוון את הגוף אופקית (למשל, ראש שמאלה, בטן ימינה). החזק את בסיס החדק עם מלקחי אחד ושימוש בשני כדי להסיר את כל החדק, וליצור פתח בין העיניים המורכבות.
   3. אחזו בקצוות העין החשופים עם שני מלקחיים ומשכו אותם לאט מאוד לסימטריה, תוך חשיפת המוח תוך שמירה על החיבור שלו לחוט העצב הגחוני.
   4. הסר את שקי קנה הנשימה ואת גוף השומן שמקיף את המוח. חתך את חוט העצבים הגחוני כדי לשחרר את המוח ולאפשר לו להתיישב על הצלחת כשהצד הקדמי פונה כלפי מעלה.
      הערה: אם המוח השקט מראה את החצי הגחוני ממוקם גבוה יותר מהחלק הגבי (איור 1B,C), השתמשו במלקחיים כדי ללחוץ בעדינות על החלק המוגבה.
   5. הרטיב מראש את קצה פיפטת P10 עם 0.1% טריטון X-100 כדי למנוע מהמוח המנותח להידבק לדופן הפנימית של הקצה. בעזרת הקצה הרטוב מראש, העבר כל מוח מנותח לצינור המכיל את הקיבוע, ואז ממשיך לניתוח הבא. אחרי שכל המוחות עברו, הפוך את הצינור 5 פעמים והניח אותו אופקית על הקרח למשך 30 דקות. דגור את הצינור בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה עם ערבוב.
   6. תן למוח להירגע לתחתית למשך דקה. שטוף את המוח במשך 3 פעמים 10 דקות עם תמיסת שטיפה המכילה 1x PBS ו-0.1% Triton X-100 (PBST) עם ערבוב. אחסן את המוח ב-PBS המכיל 0.1% נתרן אזיד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או המשך לצביעת חיסונים.
4. צביעת חיסון
   1. צביעת מוחות ב-300 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית המכילה 1x PBS, 0.1% טריטון X-100, 5% סרום עזים רגיל, 0.1% נתרן אזיד, ונוגדן אנטי-TH של ארנב (דילול 1:500) למשך יומיים בטמפרטורה של 4°C עם ערבובות. שטוף את המוח במשך 3 פעמים 10 דקות עם PBST.
   2. צבעו את המוח בתמיסת נוגדנים משנית המכילה 1x PBS, 0.1% טריטון X-100, 5% סרום עזים רגיל, 0.1% נתרן אזיד, ואנטי-ארנב אלקסה פלור 635 למשך יומיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטוף את המוח פעם אחת עם PBST.
   3. דגמו מוחות ב-PBST עם תוספת 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (דילול 1:1,000) למשך שעתיים ב-RT, ואז שטיפו את המוח ב-PBST למשך שעתיים. אחסן מוח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה או להמשיך להרכבה.
5. הרכבה
   1. טעין 0.5 מ"ל של מתקן על מזרק של 1 מ"ל המצויד במחט דקה. צור תא הרכבה על ידי הצמדת שתי רצועות דבק שקוף מקבילות על מחסנית זכוכית, תוך השארת רווח של 3 מ"מ (איור 1A,D).
      אזהרה: מחטים חדות מהוות סכנת דקירות. תמיד לטפל בזהירות, לחזור בשיטת כף ביד אחת אם צריך, ולהשליך את המחטים המשומשות מיד במיכל חדים מאושר.
   2. העבר מוחות לצלחת פטרי נקייה באמצעות קצה P200 מקוצר. הסר עודף נוזלים מסביב למוחות ושפך 10 מיקרולטר של מנטנט על המוח. מערבבים בעדינות את המוח עם ה-mountant.
   3. פזר שלוש טיפות של מתקן לאורך הפער במחסנית ופרוס באופן שווה על הפער. העבר ומקם את המוחות לאורך הקו המרכזי של הפער באמצעות פיפטת P10 (איור 1A).
   4. מקמו את המוחות באופן שווה לאורך קו המרכז של הפער כשהצד הקדמי פונה כלפי מעלה. כסה לאט את הפער עם קאברסליפ. לחץ קרוב לקצוות הכיסוי עם האגודלים במשך 3 שניות כדי להבטיח מגע יציב.
   5. הנח את הסלייד אופקית בתיקיית סלייד כדי להתייבש בלילה ב-RT בחושך, ואז ב-4 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
6. הדמיה קונפוקלית
   1. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי והמתין 15 דקות לייצוב בלייזר. אתר את המוח בשדה בהיר עם עדשה אובייקטיבית של 10x, ואז עבור לעדשת אובייקטיב טבילה בשמן 100x ונווט לאשכול PAM בתצוגה חיה.
   2. כוון את שלב XY כדי לאתר אשכול PAM אחד במרכז ההדמיה. תצוגה מקדימה עד Z כדי לאשר את הגבולות והכיוון. כוון את הזום והכיוון הדיגיטלי עד שקבוצת PAM תתאים למסגרת התמונה לאורך האלכסון.
   3. הגדר את המיקום העליון והתחתון של הערימה. הגדר את גודל שלב ה-Z ל-0.34 מיקרון ואת רזולוציית התמונה ל-512 על 512. הגדר את חור הסיכות למצב אוטומטי. הגדר את טבלת החיפוש התצוגה (LUT) למד רוויה.
   4. כוונו את עוצמת הלייזר והגבר הגלאי של ערוץ ה-TH עד שכמות מינימלית של פונקטות מפוזרות ודיסקרטיות בתוך נוירוני PAM רוויה. כוון את הגדרות ערוץ ה-DAPI כדי לקבל אות גרעיני בהיר וברור ללא רוויה.
      הערה: גורם הזום האופטימלי משתנה. הבדלים בהתכווצות הרקמות יכולים להתרחש בין קבוצות ניסוי ובין מוחות בודדים בתוך אותה אצווה.
   5. רכוש ושמור תמונות בפורמט גולמי בתיקיית קלט של 12 ביט או 16 ביט (למשל, D:\Confocal\images). חזרו לתצוגה חיה, איפסו את הזום, ודפדפו לאורך הפער כדי למצוא את המוח הבא בלי לעבור להגדלה נמוכה יותר.
      הערה: אל תשמור, תייצא או תמיר את קבצי הנתונים הראשיים לפורמט .tif מעובד בשלב זה. שימור המטא-דאטה הגולמי המקורי חיוני לעיבוד תמונה עתידי.

2. עיבוד תמונה וכימות

1. המרת קובץ תמונה ופיצול ערוץ TH
   1. המרו תמונות גולמיות הממוקמות בתיקיית הקלט לפורמט התואם לתוכנת ניתוח התמונות התלת-ממדית באמצעות ממיר הקבצים המתאים (טבלת חומרים). הנח את הקבצים המומרים בתיקייה המומרת (למשל, D:\Confocal\converted)
   2. פתח את פיג'י ועבור לקובץ | חדש | תסריט. בעורך התסריטים, לחצו על קובץ | פתח לטעינה את קובץ המקרו ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (קובץ משלים 1). לחץ על Run קרוב לתחתית חלון העורך (אם הכפתור מוסתר, לחץ על האייקון המשולש הקטן כדי להראות אותו).
   3. בדו-שיח של ההגדרות, לחץ על דפדף ובחר את התיקייה שהומרה. תחת קונבנציה של שמות, בחר באפשרות 3. תחת ערוץ לייצוא, בחר את אינדקס הערוצים המתאים ל-TH. לחץ על OK כדי לחלק את ערוץ TH; ערימות ה-TH המיוצאות יישמרו אוטומטית בתיקייה שמסתיימת ב-ChannelSplitOut.
2. אימון מסווג Labkit
   1. הכנת מאגר הנתונים של האימון
      1. בחר 20 ערימות מייצגות שתופסות טווח של עוצמות אות וריאציות רקע של דגימות מתיקיית ערימת TH. העתק את הקבצים שנבחרו לתיקיית הבחירה (למשל, D:\Confocal\selection).
      2. הרץ את המאקרו של פיג'י ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (קובץ משלים 2). כאשר מתבקשים, בחר את התיקייה המכילה את תמונות האימון. המאקרו חותך כל מחסנית לאותו מספר של פרוסות Z ומחבר את המחסניות לקובץ TIFF עם זמן קצר לאימון.
   2. אימון אינטראקטיבי של מסווג פיקסלים
      1. השקת Labkit באמצעות תוספים של Fiji | Labkit | פתח תמונה נוכחית עם Labkit (טבלת חומרים). בסרגל הכלים, לחץ על כפתור תיבת התלת-ממד כדי לעבור למצב Slice View לניווט בין Z-slices (מחוון בצד ימין) ובין דגימות (מחוון בתחתית).
      2. לחץ על S כדי לפתוח את לוח הבהירות והניגודיות וכיוון את מחוון ה-Max להמחשה מיטבית של נוירוני ^TH+ . הגדר גודל מברשת מתאים (למשל, 5 פיקסלים). לחץ על הגדרות כדי להרחיב את לוח הכלים. שמור על מצבי התצוגה ברירת המחדל (מאוחד, מקור, קרוב ביותר).
      3. לחץ על ציור. בפאנל התיוג, סמן את הרקע וצייר כמה אזורים שאינם תאיים; הדגישו את הקדמה וציירו את הפנים של כמה נוירוני ^TH+ .
      4. התקרב פנימה והחוצה מהשדה עם Ctrl + Shift + Scroll. נווט ל-Z-slices אחרות באמצעות הסליידר האנכי ולדגימות אימון אחרות באמצעות הסליידר התחתון. חזרו על השרטוטים מספר פעמים כדי להבטיח אימון מסווג חזק.
      5. לחץ על סיווג הפיקסלים. לחץ על משולש Start Training כדי להתחיל אימון וחיזוי עצל, שמספק מאוחר יותר משוב בזמן אמת על סגמנטציה בזמן אמת תוך כדי ניווט בין דגימות, פרוסות או עמדות (קליק ימני וגרירה) בכל עת.
      6. לחץ על ציור כדי להוסיף הערות תיקון שבהן החיזוי אינו מדויק, עם אפשרות להחליף את הנראות של החיזוי והתווית בפאנל המקורות ולהתאמן מחדש. חזור עד שהמסווג מבדיל באופן אמין בין נוירוני ^TH+ לרקע, ואז שמור את המסווג באמצעות סגמנטציה | שמור את המסווג לפני סגירת Labkit.
3. סגמנטציה של Batch Labkit
   1. פתח תמונה אקראית מתיקיית TH Stack בפיג'י. הפעל את Labkit ולחץ על הסר הכל, ואז טען את המסווג המאומן מראש דרך Segmentation | פתח את המסווג כדי לחלק את התמונה. בדוק ויזואלית את האיכות כדי לאמת הכללת מסווגים, ואז סגור את החלון.
   2. חזור על 2.3.1 על כמה תמונות אקראיות נוספות. סגור את החלון אחרי כל בדיקה חוץ מהאחרון.
   3. צור תיקיית פלט של Labkit (למשל, D:\Confocal\LabkitOut). התחל עיבוד אצווה דרך תמונות > מקטעי אצווה אחרים. הגדר את Input Directory לתיקיית ה-TH stack והגדר את Output Directory לתיקיית הפלט של Labkit, ואז לחץ על OK כדי להתחיל עיבוד אצווה.
   4. לניסויים עתידיים עם אותו נוגדן TH והגדרות קונפוקליות דומות, דלג על 2.2 והשתמש שוב במסווג הקודם.
      הערה: אנו מספקים גם מסווג מאומן מראש לצורכי בדיקה (קובץ משלים 3).
4. יצירת נקודות DAPI ו-TH⁺ כימות נוירונים
   1. הנח XT_Jove_Labkit_TH.m (קובץ משלים 4) בתיקיית סקריפטים (למשל, D:\scripts). פתח תוכנת תלת-ממד ועבור לקובץ | העדפות, ואז בחר כלים מותאמים אישית. בפאנל תיקיית XTension , לחץ על 'הוספה...' כדי לבחור את תיקיית הסקריפט ולחץ על אישור.
   2. עבור כל קובץ שהומר, הסקריפט יבצע אוטומטית את הפעולות הסדרתיות הבאות.
      הערה: סעיף הסבר זה אינו מכיל פעולות עבור המשתמש אך חיוני להתקדמות לשלבים הבאים.
      1. ערוץ ה-DAPI מעובד על ידי חיסור רקע וסינון גאוסי כדי להקל על זיהוי נקודות DAPI אופטימלי.
      2. מסכת הסגמנטציה של Labkit משוכללת על ידי הסרת רעש ומילוי חורים ומחוברת כערוץ מסכה למאגר הנתונים. אובייקט משטח TH משופר נבנה מערוץ המסכה. אובייקט פני השטח של TH מייצר עוד מסכה משופרת כדי להחליף את ערוץ המסכה.
      3. ערוץ טרנספורמציית מרחק נוצר מפני השטח של TH, כאשר הווקסלים בתוך המשטח מוגדרים ל-0 והווקסלים מחוץ לפני השטח מקבלים ערכי נקודה צפה המייצגים את המרחק האוקלידי שלהם למשטח ה-TH הקרוב ביותר.
      4. השתמש בפרופיל העוצמה של כל נקודת DAPI בערוץ המרת המרחק כמדד לזיהוי נוירונים ^TH+ . נקודות DAPI הממוקמות בתוך או קרוב לאזורי ^TH+ כוללות ערכי מרחק נמוכים. קריטריון זה מסייע להציל שליליות שגויות, כמו גרעיני נוירוני DA אמיתיים הממוקמים ממש מחוץ אך מיד סמוכים לאזור קדמי שנחזה על ידי Labkit בצורה לא מושלמת.
   3. אופטימיזציה ידנית של איכות ליצירת נקודות DAPI
      1. פתח דגימה אקראית מהתיקייה המומרת בתוכנת תלת-ממד. נווט לעריכה | מאפייני תמונה ואמת האם גודל הווקסל Z בפאנל הקואורדינטות הוא 0.340 מיקרון. אם לא, שנה ידנית ל-0.340 מיקרון.
      2. החלו חיסור רקע לערוץ ה-DAPI על ידי לחיצה על עיבוד תמונה | סף | חיסור רקע. בדו-שיח, סמן רק את ערוץ ה-DAPI, הגדר את רוחב המסנן ל-3, ולחץ על אישור. חזור על שלב זה שוב ואז בצע חזרה שלישית עם רוחב מסנן של 1.
      3. יישם החלקה גאוסיאנית על ידי לחיצה על עיבוד תמונה | החלקה | פילטר גאוסיאני. סמן רק את ערוץ ה-DAPI, הגדר את רוחב המסנן ל-0.2, ולחץ על אישור.
      4. בסצנת Overpass, לחץ על Add New Spots כדי להפעיל את אשף יצירת Spots. בחר את ערוץ ה-DAPI והזן קוטר XY משוער של 1.2 מיקרון. בעקבות הוויזארד, הוסיפו פילטר "איכות מעל" וכיווננו את הסף עד שיקבל נקודה מדויקת לכל גרעין.
      5. חזור על השלבים 2.4.3.1–2.4.3.4 על פני מספר דגימות אקראיות נבחרות, וסיים את ערכי הסף הפועלים באופן אמין בין הדגימות.
   4. פתח את הסקריפט XT_Jove_Labkit_TH.m (קובץ משלים 4) בעורך הטקסט כדי לשנות את הפרמטרים הבאים שהוגדרו על ידי המשתמש.
      1. הגדר ims_Folder לנתיב התיקייה שהומרה; הגדר LabkitOut_Folder לנתיב של תיקיית הפלט של Labkit. הגדר Ch_DAPI לאינדקס ערוצי DAPI עבור כל הקבצים בתיקייה המומרת (למשל, 1 אם DAPI הוא הערוץ הראשון, 2 אם DAPI הוא הערוץ השני).
      2. הגדר reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. אם גדלי הווקסלים נכונים בתכונות תמונה (ראו שלב 2.4.3.1), השאירו את התשובות כסוגריים ריקים []. אחרת, הזן ידנית ערכים מתאימים (למשל 0.130, 0.130, 0.340, בהתאמה) שיוחלו על כל הקבצים בתיקייה שהומרו.
   5. לסיים את פרמטרי יצירת הספוט.
      1. התאם מספר גרסאות של פרמטרים במערך התאים SpotsParameterAss , כאשר כל שורה מציינת גרסה אחת. זה כולל הגדרת קוטר XY משוער (μm) לזיהוי נקודות DAPI בחלק השמאלי של כל שורה, והגדרת מחרוזת סינון המורכבת מפילטר(ים) קריטריונים בחלק הימני של כל שורה, המכילה את סף האיכות משלב 2.4.3.4 ו/או סף עוצמה בערוץ המסכה המשופר משלב 2.4.2.2 או ערוץ מרחק מהמרה משלב 2.4.2.3.
      2. הגדר "מרכז עוצמה Ch=aSizeC+1" מעל 0.5 כדי לשמור רק על נקודות שהמרכז הגיאומטרי שלהן נמצא בתוך ערוץ המסכה המעודן של TH מ-2.4.2.2 (ערך ווקסל > 0.5). זהו הקריטריון הישיר והמחמיר ביותר לסינון נקודות DAPI ב-TH⁺ .
      3. הגדר "Intensity Average Ch=aSizeC+2" מתחת ל[סף] כדי לשמור על נקודות שהעוצמה הממוצעת שלהן בערוץ הטרנספורמציה למרחק משלב 2.4.2.3 יורדת מתחת לסף מוגדר. ספים נמוכים יותר בוחרים נקודות הממוקמות בתוך או קרוב מאוד לפני השטח של ה-TH; ספים גבוהים יותר כוללים כתמים שמתרחקים בהדרגה יותר. זה מאפשר כיול אמפירי של הקרבה המקובלת עבור הקצאת ^TH+ .
      4. דוגמה מוגדרת מראש:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['איכות' מעל 94.5,"מרכז עוצמה Ch=aSizeC+1" מעל 0.5'];
         1.2, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.0001'];
         1.2, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.001'];
         1.2, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.01'];
         ... מספיקים יותר שילובים של מסננים בסקריפט.
         };
      5. לניסויים עתידיים המשתמשים באותם נוגדנים של TH והגדרות קונפוקליות, יש להשתמש שוב בשילובי הפרמטרים הקודמים. מחק את הצירופים הגרועים שמניבים ספירות נקודתיות שסוטות משמעותית מהמספרים האמיתיים, ובכך מפחיתים את העומס החישובי המיותר.
   6. יצירת נקודות באצווה
      1. שמור את כל השינויים לעיל בסקריפט XT_Jove_Labkit_TH.m. פתח חלון תוכנה תלת-ממדי חדש. לחץ על תפריט עיבוד תמונות | PAM_TH_processing לבצע את התסריט בקבוצה.
      2. בהתחלה, שימו לב לכמה דקות שלכל שילוב מסננים, הסקריפט יוצר אובייקט Spots בשם שישקף את הפרמטרים שלו, ושקבצים מהתיקייה המומרת מעובדים ונשמרים כעותקים בתיקיית פלט חדשה עם סיומת "מעובד". ואז תשאיר את המחשב ללא השגחה.
      3. עם סיום העבודה, ייווצר גיליון אלקטרוני. שימו לב לעמודה הראשונה שמכילה את שמות הקבצים, ולעמודות הבאות שמכילות נקודות DAPI מתאימות לכל שילוב מסננים, כאשר כותרות העמודות מציינות את קוטר XY המשוער ואת מחרוזת המסננים בשימוש.
   7. אימות לאחר עיבוד
      1. לאחר סיום שלב 2.4.6, פתח ידנית כמה קבצים אקראיים מתיקיית ה"מעובד" ובדוק את אובייקטי Spots השונים בשכבת ערוץ TH המקורי. בהתבסס על בדיקה ויזואלית, בחרו מסננים אופטימליים אחד או שניים שמספקים את הייצוג הנאמן ביותר של ספירת נוירוני ^TH+ האמיתית. ייצא את העמודות המתאימות מהגיליון האלקטרוני לניתוח סטטיסטי במורד הזרם והכנת תרומות.
      2. כדי לתקן שגיאות ספירת נקודות בשילוב המסננים המועדף, בחר את אובייקט(ים) הנקודות המתאימים בסצנת Overpass ולחץ על לשונית העריכה . הסר ידנית נקודות שגויות או הוסף נקודות שהוחמצו לפי הצורך על ידי לחיצה על Shift ולחיצה על המסך. שמור את העדכונים באמצעות Store as/Export as/Save as כדי להחליף את הקובץ המתאים בתיקיית "מעובד" עם אותו שם קובץ.
         הערה: אין למחוק, להוסיף, לשנות שם או לגרור/לשנות מיקום של אובייקטים ב-Spots—ערוך רק את המקומות המועדפים. אין צורך בשינויים בתסריט; פשוט הרץ מחדש את הסקריפט כדי ליצור מיידית גיליון אלקטרוני מעודכן המשקף שיפורים ידניים. למען עקביות, או להשאיר לא עריכה, או לערוך את אובייקט(ים) הנקודות המועדפות לכל הדגימות בניסוי.

תוצאות

הנתונים הגולמיים שנאספו מהתוכנה הופקדו במאגר ציבורי ונגישים בכתובת DOI הבאה: 10.5281/zenodo.19814348. כדי להדגים את השימוש בצינור הכימות החצי-אוטומטי הזה, יישמנו אותו על מודל דרוזופילה מבוסס היטב של פרקינסון, המשתמש בביטוי פאן-נוירוני של α-סינוקלאין אנושי (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). מטוסי הבקרה החזיקו את נהג nSyb-QF2 בלבד. שני הגנוטיפים הוגבלו ב-29 מעלות צלזיוס במשך 3 שבועות, ולאחר מכן נתתחו המוח, צובעו חיסון ל-TH, וצולמו לאשכול PAM. כפי שמוצג באיור 3E, הצינור החצי-אוטומטי זיהה ירידה משמעותית בספירת נוירוני PAM TH⁺ בזבובים המבטאים סינוקלאין α בהשוואה לביקורת (מבחן ה-t של סטודנט, p < 0.0001), מה שמראה שהשיטה יכולה ללכוד הבדלים תלויים בגנוטיפ בתוך אותה אצווה ניסויית. הסעיפים הבאים מתארים את תצורת ההרכבה (איור 1), ממשק האימון של Labkit (איור 2), ושלבי עיבוד התמונה (איור 3) שמאפשרים כימות זה.

איור 1 ממחיש את התצורה המתגברת של מוחות דרוזופילה מפורקים ואת השפעתה על הדמיית אשכולות PAM. לאחר הניתוח, המוח מציג לעיתים כיפוף או הטיה של הרקמה הסמוכה לחבל העצב הוונטרלי המנותק. הרמה זו בחלק הוונטרלי של המוח משנה את הפרספקטיבה מתחת לסטריאוסקופ, מה שמוביל לשינוי בהקרנה של החריץ הסטריאוטיפי בקונטור הגבי ולהבדל בפרספקטיבה היחסית של סימני הדרך הגחוניים. (איור 1B,C). עיוות זה מתרחש לעיתים קרובות ברגע שהמוח מנותק מהגוף. עיוות כזה משפיע על כיוון אשכול ה-PAM במהלך ההרכבה, ובכך משפיע על עומק ערימת ה-Z הנדרש (איור 1C,D). בתנאי התקנה אופטימליים, מרווח סרט סקוטש חד-שכבתי יוצר דחיסה מספקת באזור המרכזי במוח, וגורם לאשכול ה-PAM הממוקם בגב לקבל כיוון אופקי מיד סמוך לכיסוי הכיסוי. תצורה זו מניבה ערימות Z של 15–25 פרוסות במרווחי 0.34 מיקרון (איור 1D). בתנאי השני, אשכול PAM שומר על מיקום מוטה, מה שמחייב ערימות Z עמוקות יותר (איור 1D). באופן דומה, השימוש במרווח סרט דו-שכבתי אינו מספק דחיסה מספקת, מה שמשאיר את אשכול ה-PAM במבנה המובנה והמוטה שלו, ובאותו אופן מגדיל את עומק ערימת ה-Z (איור 1D). איור 1E מציג תצוגות הקרנה צדדית מייצגות של ערימות Z מוצבעות ב-TH הן בתנאים אופטימליים והן בתנאים מוטים.

איור 2 מציג את ממשק המשתמש של Labkit ואת תהליך העבודה הדרכה מייצג. עם כמה הערות קשקוש דלות בלבד על דגימה אחת (איור 2A), מסווג הפיקסלים הראשוני כבר מייצר סגמנטציה סבירה להפליא (איור 2B). עם זאת, חשוב להדגיש כי הערות מינימליות כאלה אינן מספיקות לביצועים יציבים וניתנים להכללה על פני מאגר נתונים שלם. נדרש תיוג איטרטיבי משמעותי—הכולל מספר פרוסות Z, דגימות וריאציות צביעה—כדי ליצור מסווג שמחלק באופן אמין נוירוני ^TH+ על פני כל מאגר הנתונים. ראוי לציין כי תמונות האימון המרובות מחוברות לאורך ממד הזמן (פריים) ולא נערמות לאורך ציר ה-Z. עיצוב זה שומר על שלמות מרחבית של כל נפח מוח בודד, ומבטיח שגרעינים של מסנן תלת-ממד פועלים אך ורק בתוך — ולא מעבר — לדגימות ביולוגיות. אם הדגימות היו מונחות במקום זאת אנכית לערימת Z עבה אחת, פרוסות Z בגבולות בין דגימות סמוכות היו הופכות לסמוכות במרחב, מה שגרם לווקסלים ממוחות שונים להיות מטופלים כמבנים שכנים, מה שהיה מעלה את הסיכון לתיקונים ידניים מיותרים (איור 2C). שרשור לאורך ציר הזמן מונע זיהום חוצה דגימות כזה ועדיין מאפשר אימון יעיל ורב-דגימות במפגש Labkit אחד.

איור 3 ממחיש את צינור העיבוד לאחר העיבוד ואת הכימות הסופי. מסכות סגמנטציה של Raw Labkit (איור 3A) מכילות נקודות חיוביות שגואות קטנות והרבה חורים פנימיים. לאחר יישום פעולות מורפולוגיות של הסרת רעש ומילוי חורים (איור 3B), נבנה משטח TH חלק ומשמש ליצירת מסכה בינארית מעודנת (איור 3C). השיפור שהושג בשיפור זה מוצג כשכבה המשווה בין המסכות ההתחלתיות והסופיות (איור 3D, עליון). ראוי לציין שאזורים מסוימים של נויריטים עשירים ב-TH נשמרים לעיתים במסכה הסופית; עם זאת, אזורים אלו כמעט תמיד נטולי גרעינים מוצבעים ב-DAPI ולכן תורמים במעט לספירת הנוירונים הסופית. משתמשים מתקדמים יכולים להתאים עוד יותר את הפרמטרים המורפולוגיים בסקריפט עיבוד האצווה שסופק כדי לכוונן את הסרת הארטיפקטים השאריים הללו. איור 3D (תחתון) מציג את כתמי ה-DAPI הסופיים (מג'נטה) המונחים על ערוץ TH (ירוק) מהקרנת עוצמה מקסימלית. איור 3D גם חושף סוג נדיר של חיובי שגוי שנצפה מדי פעם בצינור שלנו: גרעין צבוע ב-DAPI הממוקם באזור נויריט עשיר ב-TH עשוי להיות מסווג בטעות כנקודת TH⁺ כאשר אות הנויריט חופף בחוזקה לגרעין. עם זאת, כפי שמוצג באיור 3C, גרעינים חיוביים ל-DAPI בסביבת הנויריטים בדרך כלל דלים. יתרה מזאת, מעט אותות DAPI הנמצאים בקרבת אזורי נויריטים כאלה לעיתים קרובות נשארים מסווגים נכון כשליליים אמיתיים (כלומר, אינם נספרים כ-TH⁺), שכן הם אינם מזוהים בטעות על ידי הצינור. איור 3E מדגים את התועלת המעשית של השיטה: זבובי nSyb-QF2>SNCA בני 3 שבועות מציגים ירידה משמעותית בספירת נוירוני PAM ^TH+ בהשוואה לבקרות nSyb-QF2 במספר מסננים (מבחן t, p < 0.0001). למרות שספירות הנקודות המוחלטות עשויות להשתנות בין שילובי מסננים שונים והשיטה אינה משיגה דיוק מושלם של נקודה בודדת, ההפרש היחסי בין קבוצות הניסוי לקבוצת הביקורת נשאר יציב. עבור מספר מסננים שנבדקו, התוצאה הסטטיסטית של השוואת קבוצות נשמרת ברובה בין מסננים באותה מחזור ניסוי. בהתאם לכך, יש לפרש את הפלט כקריאה השוואתית בתוך אצווה ולא כספירה מוחלטת ללא שגיאות של נוירוני PAM.

איור 1. דיסקציה מוחית של דרוזופילה ותצורת הרכבה. (א) תרשים סכמטי של מכלול ההרכבה במוח. פסי צהוב מייצגים מרווחי סרט סקוטי. סכמטי מוח מורחב מציין את המיקום המשוער של אשכול PAM (סגול). (B) סכמטי חתך רוחבי צדדיים התואמים למישור המקווקו ב-A המתארים שתי מורפולוגיות מוח נפוצות לאחר ניתוח: ממוקם בצורה אופטימלית (עליון) ומוטה (תחתון). (ג) שני מוחות זבובים מפורקים המוצגים תחת סטריאוסקופ: ממוקם בצורה אופטימלית (שמאל) לעומת מוטה (ימין). חצים צהובים מציינים את החריץ הסטריאוטיפי לאורך קו המתאר הגב. קווים כחולים מקווים מחברים שני נקודות ציון תואמות בצד שמאל וימין של החצי התחתון. חיצים כחולים מדגישים את השינוי שנוצר בפרספקטיבה היחסית של נקודות ציון בטן אלו. פס קנה מידה = 500 מיקרון. (D) איור סכמטי המראה כיצד מורפולוגיית המוח ועובי מרווח הסרט (שכבה אחת לעומת כפולה) משפיעים על המיקום האנכי של אשכול ה-PAM ולכן על עומק ערימת ה-Z הנדרש. (ה) תצוגות צדדיות מייצגות (הקרנת Y) של ערימות Z קונפוקליות מוצבעות ב-TH מתנאי התקנה ממוקמים אופטימליים (עליונים) ומעוותים (תחתונים). פס קנה מידה = 5 מיקרון. קיצור: PAM = פרוטומוח קדמי מדיאלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2. הדרכת Labkit וחלוקה אינטראקטיבית. (A) ממשק משתמש גרפי של Labkit. הערות (שרבוטים) מוצגות בשתי קטגוריות: חזית (אדום) ורקע (כחול). (B) תוצאת סגמנטציה שנוצרה מיד לאחר האימון על השרבוטים המוצגים ב-A. אדום מציין צבע בקדמת הקדמי; כחול מציין צבע רקע. פס קנה מידה = 5 מיקרון. (C) דיבור צולב בין פרוסות Z סמוכות. תמונות חד-פרוסה של מיטוכונדריה מסומנת בחלבון פלואורסצנטי ממוחות זבובים שונים חוברו לאורך ציר ה-Z. פרוסות 1 ו-3 הן עותקים זהים של אותה תמונה, בעוד שפרוסות 2 ו-4 מקורן במוחות שונים. חצים צהובים, תחזית חודרת מפרוסה 2 לפרוסה 1. חצים ירוקים, תחזית חודרת מפרוסה 4 לפרוסה 3. פס קנה מידה = 3 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 3. עיבוד לאחר מסכות סגמנטציה של Labkit וכימות נוירוני ^TH+. (A) מסכת Raw Labkit בינארית (סיאן, עליונה) ושכבה עם ערוץ TH המקורי (תחתון). שימו לב לשפע של נקודות קטנות ומילוי לא שלם של גופי התאים הנוירונים. (ב) מסכה לאחר דה-רעש מורפולוגי ומילוי חורים (מג'נטה, עליון); שכבה על ערוץ TH (נמוך יותר). (ג) מסכה בינארית מעודנת (אדומה, עליונה) משטח TH חלק עבור B ומסכה מחדש; שכבה על ערוץ TH (נמוך יותר). (D) עליון: שכבה של מסכות גולמיות (תכלת) ומעודנות (אדומות), המדגישות אזורים שתוקנו בעיבוד לאחר מכן. נמוך יותר: הקרנת עוצמה מרבית המציגה נקודות DAPI סופיות (מג'נטה) מונחות על ערוץ TH (ירוק). שימו לב ששני הכתמים בפינה הימנית העליונה נובעים מאשכול PAM הנגדי. פילטר 4 שימש לאיור. (ה) אימות כמותי במודל מחלת פרקינסון באמצעות שילובי מסננים מרובים. זבובי nSyb-QF2>SNCA (מודל PD) בני שלושה שבועות מראים ירידה משמעותית בספירת נוירוני PAM ^TH+ בהשוואה לבקרות nSyb-QF2 במספר מסננים (למעלה). הנתונים הגולמיים מסופקים בגיליון אלקטרוני (למטה). פילטר 1: 1.2, ['איכות' מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.0001']; פילטר 2: 1.2, ['איכות' מעל 94.5, "עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.001']; מסנן 3: 1.2, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.01']; מסנן 4: 1.2, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.05']; מסנן 5: 0.6, ['"איכות" מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.001']; פילטר 6: 0.6, ['איכות' מעל 94.5,"עוצמה ממוצעת Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.01']; פילטר 7: 0.9, ['איכות' מעל 94.5,"ממוצע עוצמה Ch=aSizeC+2" מתחת ל-0.01']; n = 57 מוחות (ביקורת), n = 65 מוחות (PD); מבחן ה-t של התלמיד, p < 0.0001 (****). הזבובים גודלו בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס. פסי סולם = 5 מיקרון (A–D). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הנתון.

קובץ משלים 1. Fiji macro לפיצול ערוץ TH מקבצי תמונה שהומרו ושמירת ערימות הפלט.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2. Fiji Macro לחיתוך ערימות Z-stack לאימון לעומק Z-slice משותף וחיבור אותן לקובץ TIFF עם זמן-לאפס לאימון מסווגי Labkit.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3. מסווג Labkit מאומן מראש המשמש לבדיקת תהליך הסגמנטציה של PAM TH.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 4. סקריפט MATLAB לעיבוד אצווה של מסכות Labkit, יצירת נקודות DAPI, יישום שילובי מסננים וייצוא ספירות נוירונים ^TH+ .אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

כימות נוירוני DA באשכול PAM של דרוזופילה היה היסטורית אתגר משמעותי. כאן, אנו מציגים תהליך עבודה חצי-אוטומטי שמשלב סיווג פיקסלים מבוסס למידת מכונה עם תוכנת ניתוח תמונות כדי להתמודד עם בעיה ארוכת שנים זו. שיטה זו מאפשרת גילוי ברמת אצווה של שונות בנוירוני ^TH+ באשכול PAM בין קבוצות באותו ניסוי, ותומכת במחקרים השוואתיים במודלים של מחלת פרקינסון¹⁸.

בעת בחירת המסנן האופטימלי לניסוי נתון, המשתמשים יכולים לבחור את המסנן המתאים ביותר לבדיקה ויזואלית של התמונות הגולמיות, או להתייחס לטווח ו/או לממוצע המדווח של מספרי נוירוני PAM מסוג פראי בספרות^12,13. עם זאת, יש להיזהר: רק שני מחקרים דיווחו על ספירות אשכולות PAM, שאף אחד מהם אינו קשור ל-PD, והערכים המדווחים מראים חוסר עקביות משמעותי. יתרה מזאת, סטיית התקן עשויה לגדול עם הגיל, מה שמסבך עוד יותר את ההשוואות בין המחקרים. לכן, יש להשתמש בהתייחסות מבוססת ספרות רק כמדריך גס, לא כסטנדרט מוחלט. אנו מכירים בכך שצינור זה אינו מניב ספירות מוחלטות ללא שגיאות (איור 3D). עם זאת, כל עוד ההשוואות מוגבלות לקבוצות מתוך אותה אצווה ניסויית (כלומר, לא לאסוף נתונים בין קבוצות שונות בגרף אחד), השיטה יכולה לשמש לזיהוי הבדלים יחסיים בין גנוטיפים או תנאי טיפול בתוך אצווה.

מניסיוננו, יש להימנע מנוגדנים משניים מצומדים ב-AF488 בשל רקע גבוה, ויש להימנע מ-AF546 בשל החלשת אות גבוהה יותר לאורך ציר ה-Z. מצאנו גם כי דגירה ושטיפה יסודית של DAPI הן קריטיות להשגת יחס אות לרעש גבוה ואותות גרעיניים ברורים, המשפיעים ישירות על ביצועי הסגמנטציה האוטומטית. DAPI עדיפה על Hoechst ליישום זה, שכן הצביעה המועדפת של הטרוכרומטין מייצרת נקודות גרעיניות בהירות ומוגדרות יותר, ומקלה על זיהוי מדויק יותר.

דיון על פתרון תקלות במצבי כשל נפוצים

כשלים הקשורים לכתמים. מיומנות הניתוח היא גורם מרכזי לאיכות הנתונים. אשכול ה-PAM ממוקם על פני השטח ונפגע בקלות בעת הסרת שני שקי קנה הנשימה והשומן בגב הגוף לאזור זה. יש לטפל במלקחיים בזהירות כדי למנוע ניקוב או דחיסה באזור ה-PAM. עיוות ונטרלי מתרחש לעיתים קרובות ברגע שבו חוט העצב הוונטרלי נקטע, וגורם למוח להתהפך או להתעקל כאשר הוא מונח על מגלשת זכוכית; עיוות זה יכול להיות קבוע לאחר דגירה של PFA. משתמשים צריכים להתנסות בזוויות מלקחיים במהלך החיתוך כדי למצוא טכניקה מיטבית. אם נצפים נטייה לאחר הניתוח, לחץ עדין על האזור המוגבה עשוי להפוך את העיוות (מקובל אם האזור הדחוס אינו אזור העניין).

כשלים בסגמנטציה. סגמנטציה לקויה נובעת בדרך כלל מנתוני אימון לא מגוונים מספיק. מסווג Labkit חייב להיות מאומן על סט תמונות מייצג הכולל את כל טווח איכות הצביעה בתוך האצווה, כולל הטוב ביותר, הממוצע והגרוע ביותר. במהלך תיקון איטרטיבי, תעדף הערות על חיוביים שגויים ושליליים שגויים שאתה בטוח בהם. הימנע מתיקון אזורים עמומים או לא ודאיים, שכן הדבר עלול להטעות את המסווג ולפגוע בביצועים.

כשלים בזיהוי נקודתי. אופטימיזציה של פרמטרים דורשת חקירה שיטתית על תת-קבוצה קטנה של דגימות מייצגות. בדקו קטרים מוערכים שונים של נקודות וסף מסנני איכות, או אפילו סוגי מסננים מעבר למסנן "איכות מעל" המשמש בפרוטוקול זה. אשף יצירת הנקודות מציע אפשרויות סינון שונות (למשל, עוצמה). מומלץ למשתמשים להתאים את ספי הסינון וסוגי המסננים למאגר הנתונים הספציפי שלהם, ולבצע כוונון אמפירי לפני עיבוד אצווה.

מדוע ספירה ידנית של נוירוני אשכול PAM נשארת קשה במיוחד? אשכול ה-PAM מציג תכונות אנטומיות וצביעה ייחודיות שהופכות שיטות ספירה ידניות מסורתיות לבלתי מספקות. ראשית, אימונופלואורסצנציה של TH בציטוזול של נוירוני דופמינרגיה של דרוזופילה מתייגת בעיקר טבעת ציטופלזמה דקה המקיפה חלל גרעיני גדול ובלתי מוכתם. כתוצאה מכך, הגרעין המוצבע ב-DAPI ולמחלקת הציטופלזמה ^TH+ מציגים חפיפה מרחבית מזערית. היעדר הקולוקליזציה הבסיסי הזה מונע את אסטרטגיית הסיווג הישירה של "נקודת DAPI בתוך מסכת TH". שנית, אשכול PAM כולל מעל 100 נוירונים דחוסים בצפיפות המסודרים בארכיטקטורה תלת-ממדית דמוית ענבים. כאשר מנווטים בין ערימות Z קונפוקליות, נוירונים מופיעים ונעלמים בהדרגה — חלקם נכנסים למישור, אחרים יוצאים — יוצרים עומס קוגניטיבי גבוה ושונות משמעותית בין צופים. המחקר האחרון שמדד את נוירוני DA של PAM הסתמך על ספירה ידנית באמצעות תוסף מונה התאים של ImageJ. למרות שהיא מתאימה לחלוטין לאשכולות קטנים יותר כמו PPM1/2 או PPL1, גישה זו הופכת למוגזמת מאוד כאשר היא מיושמת על אשכול PAM, במיוחד במחקרים הדורשים עשרות או מאות דגימות.

מדוע ארכיטקטורת היער האקראי של Labkit מתאימה במיוחד לסגמנטציה של נוירוני TH? Labkit מיישמת מסווג פיקסלים אקראי מבוסס יער שמותאם היטב לאתגרים הספציפיים של תמונות אשכול PAM מוצבעות ב-TH. האלגוריתם מחשב וקטור תכונה מקיף לכל פיקסל על ידי יישום מפל של מסנני טרנספורמציה, כולל טשטוש גאוסיאני, הפרש גאוסיאנים, גודל גרדיאנט גאוסיאני, לפלסיאן של גאוסיאני, וערכי עצמי הסיאניים — כל אחד מוערך במספר סולמות סיגמא (1, 2, 4, 8). הפקת תכונות רב-קנה מידה זו לוכדת ביעילות את מאפייני הטקסטורה והקצה שמבדילים את פנים הגרעין מהרקע החוץ-תאי. חשוב לציין שמכיוון שיערות אקראיים דורשים סדרי גודל פחותים של נתוני אימון מאשר גישות למידה עמוקה, משתמשים יכולים לחדד את המסווג באופן איטרטיבי עם הערות קשקושיות דלות על 20–40 תמונות מייצגות בלבד. כל איטרציה מוסיפה עצי החלטה חדשים לאנסמבל, שמצביעים יחד לסיווג כל פיקסל. תהליך זה מאפשר באופן מובנה את השונות בין אצווה בתנאי צביעה והדמיה — יתרון קריטי לאור השונות הביולוגית הטבועה בהכלאות גנטיות של דרוזופילה ובמחקרי הזדקנות. באמצעות גישה זו, ניתן לזהות אובדן נוירוני ^TH+ במודלים של פרקינסון המבטאים α סינוקלאין, והשפעות של משפרים ומדכאים גנטיים על ספירת נוירוני אשכולות PAM ניתנות להשוואה בתוך אצווה ניסויית.

חשוב לציין, לצורך האימון, הערימות החתוכות מחוברות לאורך ממד הזמן ולא מונחות לאורך ציר ה-Z. בחירת עיצוב זו קריטית לאימון מסווגים מיטבי. סיווג הפיקסלים התלת-ממדיים של Labkit מתחשב במידע הווקסלים על פני פרוסות Z עוקבות, דבר חיוני לפתרון מדויק של טבעת TH הדקה והציטופלזמית שמגדירה את מורפולוגיית נוירוני PAM. אם הדגימות הבודדות היו מונחות במקום זאת אנכית לערימת Z אחת ועבה במיוחד, פרוסות ה-Z בגבולות בין דגימות סמוכות היו הופכות לרציפות מרחבית בערימה. כתוצאה מכך, ווקסלים השייכים לדגימות ביולוגיות שונות יטופלו כמבנים שכנים בתוך אותו נפח תלת-ממדי. במהלך אימון אינטראקטיבי, שרבוט שצויר קרוב לגבול כזה עלול בטעות ללכוד תכונות משני דגימות שונות בו-זמנית, ולבלבל את המסווג (איור 2B, חצים). יתרה מזאת, אותות חיוביים שגויים שמקורם בדגימה אחת עלולים להקרין אל נפח הדגימה הסמוכה, מה שמוביל לשרבוטים מתקנים שגויים המתפשטים באיטרציות אימון עוקבות, ויוצרים עצי החלטה שמקודדים כללים ביולוגיים חסרי משמעות. חיבור דגימות לאורך ציר הזמן שומר על שלמות מרחבית של כל נפח בודד, ומאפשר לגרעיני המסנן התלת-ממדיים לפעול בלעדית בתוך — לא מעבר — לדגימות ביולוגיות, תוך שמירה על אימון יעיל ורב-דגימות במפגש Labkit אחד.

שיקולים מתודולוגיים ומגבלות

כמה הסתייגויות חשובות שראויות לדיון. ראשית, פרוטוקול זה מותאם במיוחד לאשכול ה-PAM ואינו עשוי להכליל לאשכולות DA אחרים (למשל, PPM1/2/3, PPL1) או לנוירוני ^TH+ באונות הראייה. אזור PAM נהנה מצפיפות DAPI יחסית דלילה, כאשר גרעינים מופרדים היטב במרחב תלת-ממדי, מה שמאפשר זיהוי נקודות DAPI עמיד וברור. לעומת זאת, זרימת עבודה זו אינה ניתנת להעברה בקלות לאשכולות DA אחרים כמו PPL1 או PPM1/2. באזורים אלו, נויריטים נוטים יותר להיות מנוגדים או חופפים לגרעינים מצובעים ב-DAPI של תאים שאינם DA. בהינתן מספר הבסיסי הנמוך מאוד של נוירוני DA באשכולות הקטנים הללו (לעיתים פחות מ-10 תאים בכל אשכול), אפילו כמה סיווגים שגויים עלולים לגרום לשגיאות גדולות יחסית, מה שהופך את השיטה לפחות אמינה ליישומים כאלה. שנית, צביעת חיסון TH גם מסמנת נויריטים והקרנות אקסונליות בתוך הנוירופיל. למרות הערות תיקון במהלך האימון, מסלולי הסיבים הללו לעיתים מייצרים אותות TH חזקים ועלולים להיות מסווגים בטעות כקדמי על ידי המסווג. עם זאת, אזורים אלה באשכול PAM כמעט תמיד נטולי גרעינים צבועים ב-DAPI; לכן, ווקסלים חיוביים שגויים באזור עשיר בנויריטים באשכול PAM תורמים במידה מינימלית לספירת הנוירונים הסופית. שלישית, סיווג הפיקסלים של Labkit פועל על תכונות טקסטורה מקומיות בתוך שכונה סופית (גרעיני מסנן ברירת מחדל מגיבים לכ-16 × 16 פיקסלים). עיצוב זה מבטיח יעילות חישובית ומאפשר סגמנטציה אינטראקטיבית בזמן אמת, אך הוא גם אומר שהמסווג אינו יכול לנצל הקשר אנטומי גלובלי. כתוצאה מכך, ארטיפקטים נדירים או אי-סדירויות בכתמים שסוטים משמעותית מסט ההכשרה עשויים לדרוש אוצרות מקרה-מקרה. לבסוף, צינור עיבוד האצווה המתואר כאן—שילוב סגמנטציה של Labkit עם זיהוי נקודות DAPI והמרת מרחק—יוצר ערוצי פלט ושילובי מסננים מרובים. המשתמשים צריכים לאמת באופן שיטתי את פרמטרי הסינון האופטימליים עבור תנאי הניסוי הספציפיים שלהם במקום לאמץ ללא ביקורת את הספים המוגדרים כברירת מחדל המוצגים בפרוטוקול זה.

יישומים עתידיים

מעבר למודל הפרקינסון המוצג כאן, ניתן ליישם ישירות על כל מודל דרוזופילה הכולל כימות של נוירוני DA באשכול PAM, כולל מחקרים של למידה וזיכרון, מוטיבציה, ויסות שינה וניוון נוירולוגי הקשור לגיל. במיוחד, יכולת עיבוד האצווה של שיטה זו עשויה להתאים אותה ל: (1) בדיקות תרופות בתפוקה בינונית עד גבוהה: בדיקת מספר תרכובות נוירופרוטקטיביות במינונים הופכת לאפשרית יותר ללא עלייה פרופורציונלית במאמץ הספירה הידנית. (2) מסכי שינוי גנטי: כימות ספירות נוירוני PAM במאות הכלאות גנטיות (למשל, קווי RNAi, קווי הבעה יתר) כדי לזהות משפרים או מדכאים של רעילות α-סינוקליאין. (3) מחקרי הזדקנות לאורך זמן: מעקב אחר אובדן נוירוני PAM בנקודות זמן מרובות עם עומס ספירה ידני מופחתת. יתרה מזאת, תהליך הסגמנטציה מבוסס Labkit אינו מוגבל לצביעה ב-TH; באמצעות אימון מחודש מתאים, ניתן להתאים אותו לכימות אוכלוסיות נוירונים אחרות במוח הדרוזופילה , בתנאי שיש להם שתי תכונות מרכזיות חולקות את אשכול ה-PAM: צפיפות נמוכה יחסית של גרעינים מוצבעים ב-DAPI והפרעה מינימלית מצביעת נויריטים. מעבר ל-Labkit ולתוכנת התלת-ממד שבה משתמשים כאן, הלוגיקה הכוללת של צינור זה — סיווג פיקסלים מבוסס למידת מכונה ואחריו זיהוי נקודות והמרת מרחק — יכול להיות מיושם בפלטפורמות ניתוח תמונות תלת-ממדיות נתמכות אחרות, ובכך להגדיל את הנגישות והגמישות שלו עבור קהילת המחקר הרחבה יותר.

לסיכום, אנו מציגים תהליך עבודה חצי-אוטומטי לזיהוי הבדלים בין קבוצות במספרי נוירונים TH⁺ באשכול PAM. על ידי שילוב סיווג פיקסלים מבוסס Labkit עם זיהוי נקודות והמרת מרחק, שיטה זו מאפשרת השוואת מספרי נוירוני TH⁺ בין קבוצות ניסוי וקבוצת ביקורת באותה אצווה, תוך הפחתת עומס הספירה הידנית ככל שגודל המדגם גדל. הגדלה מעשרות למאות דגימות מאריכה את זמן החישוב באופן יחסי, אך המאמץ הידני הנוסף מוגבל בעיקר לארגון קבצים ובדיקת איכות נקודתית. בעוד שאשכול PAM זכה למעט תשומת לב במחקר PD עד כה, הדבר נובע בעיקר ממגבלות טכניות ולא מחוסר רלוונטיות ביולוגית. על ידי מתן כלי כימות מעשי, הפרוטוקול שלנו יקל בעתיד על חקירת האם וכיצד נוירוני PAM מתדרדרים במודלים של PD ויחקור את תרומתם הפוטנציאלית לתסמינים לא מוטוריים, כגון ליקויי ריח וירידה מוטיבציונית. אנו צופים שפרוטוקול זה יקל על מחקרים השוואתיים ברמת אצווה של נוירודגנרציה דופמינרגית, פלסטיות סינפטית וסקר תרופות נוירופרוטקטיביות במערכת מודל דרוזופילה .

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדי - Bitplane Imaris 8.0+	אוקספורד אינסטרומנטס	http://www.bitplane.com/	תוכנת ניתוח תמונות תלת-ממדית ששימשה במחקר זה
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	תרמו פישר סיינטיפיק	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון	600605
דוזיל סילגארד 184	טאט לי הנדסת בע"מ	https://www.tatlee.com.sg/
פינצטה Dumont Styple 3C Dumoxel, 0.04/0.08 מ"מ	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 קונפוקל	אולימפוס	https://www.olympus-global.com/
נוגדן משני מוצלב IgG (H+L) אנטי-ארנב עז, Alexa Fluor 647	תרמו פישר סיינטיפיק	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	פיג'י/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	פיג'י/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
סיכות קטנות, נירוסטה, קוטר 0.15 מ"מ	אוסטרליץ	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
סרום עז רגיל, מוצק ליופילי	סיגמא-אלדריץ'	566380
תוכנת מחשוב נומרי - פייתון	פייתון	3.8+
תוכנת מחשוב נומרי - Matlab	עבודה מתמטית	R2016a+	תוכנת מחשוב נומרי ששימשה במחקר זה
אוקטילפנול אתוקסילט (Triton X-100)	ביו-רד	1610407
תמיסת פאראפורמלדהיד 4% ב-PBS	ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז	SC-281692
צלחת תרבית תאי פוליסטירן	Nest Scientific	706001
מתקן אנטי-פייד ProLong Gold	תרמו פישר סיינטיפיק	P36934
ראביט אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH)	פל פריז	P40101-0
אזיד נתרן	סיגמא-אלדריץ'	S2002
סטריאוסקופ	אולימפוס	SZ51
Sterican Einmalkanü len 27 G grau 0.40 x 12 mm	סטריקן	D-34209
מזרק, 1 מ"ל	טרומו	DVR-5175
סרט דבק שקוף	3M Scotch 600, נקי	600