$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
סקירה כללית של תהליך הניתוח
העיצוב הכולל של הניתוח הטרנסקריפטומי והמבוסס על למידת מכונה במחקר זה מוצג באיור 1, הכולל שלבים מרכזיים: איסוף גנים הקשורים למערכת רנין-אנגיוטנסין (RASRGs); סינון גנים מבוטאים באופן שונה הקשורים ל-RAS (RASRDEGs) מתוך מאגרי נתוני יתר לחץ דם; ניתוח העשרה פונקציונלית (GO/KEGG/GSEA); ניתוח חדירה חיסונית (CIBERSORT); בניית אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) ורשתות רגולטוריות; בחירת גנים מפתח מבוססת למידת מכונה (רגרסיה לוגיסטית, יער אקראי [RF]); והערכת מודל האבחון של יתר לחץ דם. רשימה מלאה של תוכנות, מסדי נתונים וכלים מקוונים ששימשו במחקר זה מוצגת בטבלת החומרים.
הורדת נתונים
מערכי הנתונים של יתר לחץ דם GSE753608 ו-GSE74144 (Homo sapiens) התקבלו באמצעות חבילת R GEOquery9 מתוך מסד הנתוניםGEO10. GSE75360 שמקורו בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (פלטפורמה: GPL10558) כללו 10 דגימות יתר לחץ דם ו-11 דגימות ביקורת; GSE74144 שנגזר מתאי דם לבנים (פלטפורמה: GPL13497) כלל 14 דגימות יתר לחץ דם ו-8 דגימות ביקורת (טבלה 1). RASRGs מקודדי חלבון (1,264) זוהו לראשונה באמצעות GeneCards11 (מילת מפתח: "מערכת רנין-אנגיוטנסין") ו-PubMed (מילת מפתח: "מערכת רנין-אנגיוטנסין")12,13. החיתוך של RASRGs אלה עם גנים ב-GSE75360/GSE74144 הניב 1,159 RASRGs סופיים14. שני מערכי הנתונים עובדו בנפרד מכיוון שנוצרו על פלטפורמות מיקרוארי שונות. אנוטציה בוחרת בוצעה לפי קבצי ההערות של פלטפורמת GPL המתאימים, ומטריצות ביטוי גנים מנורמלות שימשו לניתוחים במורד הזרם. גרפים קופסה שימשו להשוואת התפלגויות ביטויים לפני ואחרי הנרמליזציה.
גנים מבוטאים באופן שונה הקשורים ליתר לחץ דם של רנין-אנגיוטנסין
הדגימות במאגר הנתונים GSE75360 סווגו לקבוצת יתר לחץ דם ולקבוצת הביקורת. תוכנת הלימה שימשה לביצוע ניתוח ביטוי גנים שונה בין שתי הקבוצות14, כאשר גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) זוהו על ידי סף |logFC| > 0.45 וערך p < 0.05. תוצאות הניתוח הדיפרנציאלי הזה הוצגו באמצעות תרשימי הרי געש (שנוצרו באמצעות חבילת R ggplot2).
כדי לקבל RASRDEGs, DEGs שעומדים בסף הנ״ל (|logFC| > 0.45, ערך p < 0.05) הושוו עם גנים הקשורים ל-RAS (RASRGs), ותוצאת החיתוך הוצגה באמצעות דיאגרמת ון. בהמשך, דפוסי הביטוי של ה-RASRDEGs שזוהו הוצגו כמפת חום באמצעות Pheatmap של חבילת R, והמיקום הכרומוזומי של RASRDEGs הוצג באמצעות מפות כרומוזומים שנוצרו באמצעות חבילת R RCircos15.
ביטוי דיפרנציאלי של אימות גנים וניתוח עקומת ROC
נבנתה תרשים בין-קבוצתי לניתוח הבדלים בביטוי RASRDEG בין יתר לחץ דם/ביקורת ב-GSE7536016, וחבילת R pROC שימשה למישום עקומות ROC ולחישוב AUC (0.5–0.7: דיוק נמוך; 0.7–0.9: בינוני; >0.9: גבוה) ליעילות אבחנתית של RASRDEG.
ניתוח קורלציה
ניתוח המתאם של ספירמן בוצע על ביטוי RASRDEG בשנת GSE75360; התוצאות הוצגו באמצעות Heatmap (חבילת R ggplot2) (|r| < 0.3: מתאם לא/חלש; 0.3–0.5: חלש; 0.5–0.8: מתון; >0.8: חזק).
ניתוח העשרה של GO ו-KEGG
GO (Gene Ontology, שחרור 2024, http://geneontology.org/) הוא משאב נפוץ להעשרה פונקציונלית רחבת היקף, המכסה שלושה תחומים: תהליכים ביולוגיים (BP), רכיבים תאיים (CC) ופונקציות מולקולריות (MF)17. KEGG (אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים, גרסה 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) מאחסנת נתונים על גנומים, ביופתיונים, מחלות ותרופות18.
RASRDEGs עברו אנוטציה של GO וניתוח העשרת מסלולי KEGG באמצעות clusterProfiler19 של חבילת R. שיטת מבחן העשרה: מבחן היפר-גאומטריה; שיטת תיקון בדיקות מרובות: שיטת בנג'מיני-הוכברג (BH). קריטריון סינון: ערך p מותאם < 0.05.
ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)
ב-GSEA ברמת הקוהורט, כל הגנים שנבדקו בניתוח הביטוי הדיפרנציאלי של GSE75360 דורגו בסדר יורד לפי logFC ושימשו כרשימת גנים קלט עבור clusterProfiler19. לא הוחל סינון מוקדם של DEG לפני GSEA. אוסף קבוצת הגנים C2 מ-MSigDB20. פרמטרים: זרע = 2022, 10–500 גנים לכל קבוצה; קריטריוני סקר: תוקן p < 0.05 (Benjamini-Hochberg, שיטת BH), FDR < 0.2521.
בניית מודל האבחון של יתר לחץ דם
כדי לזהות גנים מרכזיים הקשורים ליתר לחץ דם, השתמשנו בשני סוגי אלגוריתמים ללמידת מכונה: רגרסיה לוגיסטית ויערות אקראיים (RF). רגרסיה לוגיסטית (משתנה בינארי תלוי: יתר לחץ דם/בקרה) סקרה RASRDEGs עם p < 0.05. יער אקראי (RF, R package randomForest): parameters set.seed(520), ntree = 1000; MeanDecreaseGini (מדד חשיבות משתנה) הוצא, ונבחרו 15 ה-RASRDEGs המובילים. ה-RASRDEGs נבדקו עם ערך p < 0.05 כסטנדרט.
אלגוריתם RF (יער אקראי), שיטת למידה קבוצתית תחת קטגוריית Bagging (אינטגרציה של עצי החלטה מרובים), יושם באמצעות חבילת R randomForest22 (פרמטרים: set.seed(520), ntree = 1000). MeanDecreaseGini (המשקף חשיבות משתנה על ידי ירידה בטוהר ממוצע במהלך פיצול הצמתים) של גני תכונה הופק, ונבחרו 15 ה-RASRDEGs המובילים. לבסוף, צוירה דיאגרמת ון של גנים שנבדקו באמצעות רגרסיה לוגיסטית ו-RF כדי לזהות גנים מרכזיים הקשורים ליתר לחץ דם.
אימות מודל האבחון של יתר לחץ דם
נבנה מודל רגרסיה לוגיסטית המבוסס על גנים מרכזיים; הערך החזוי הליניארי (η) חושב כך:
חבילת R pROC16 שימשה לשרטוט עקומות ROC ולהערכת יעילות המודל בחיזוי סיכון ליתר לחץ דם. נבנתה נומוגרמה באמצעות חבילת R rms23 כדי להמחיש את תרומתו של כל גן מפתח למודל הרגרסיה הלוגיסטית (המשקף את הקשר בין גנים מרכזיים לסיכון ליתר לחץ דם). נוצרו עקומות כיול כדי להעריך את העקביות בין הסתברויות יתר לחץ דם צפויות לבין בפועל; ניתוח עקומת ההחלטה (DCA, R package ggDCA24) בוצע כדי להעריך את התועלת הקלינית (התועלת נטו) של המודל ב-GSE75360 ו-GSE74144.
GSEA חד-גני
GSEA בוחן את תפקידם של גנים הקשורים לגן מסוים בתהליכים/מסלולים/מחלות ביולוגיות על ידי ניתוח ביטוי שלו, המסייע בהבנת תפקידו התפקודי של הגן. לכל גן מוקד ב-GSE75360, הדגימות חולקו במדיאן לקבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך. לאחר מכן בוצע ניתוח ביטוי שונה על כל הגנים שנבדקו, וערכי logFC כלל-גנומיים דורגו מהגבוה ביותר לנמוך ביותר לפני GSEA עם clusterProfiler19. לא הוחל סינון מוקדם של DEG לפני GSEA. פרמטרים: seed = 2020, 10–500 גנים לכל קבוצה (אוסף קבוצות גנים c2 מ-MSigDB21). קריטריוני הסקר: p < 0.05 (תוקן p. בשיטת BH).
ניתוח חדירה חיסונית (CIBERSORT)
אלגוריתם CIBERSORT25 (המבוסס על רגרסיה ליניארית של וקטור תמיכה) פירק את מטריצת הטרנסקריפטום כדי להעריך את הרכב תאי החיסון בדגימות מעורבות (נבחרו נתונים עם ציון העשרת תאי חיסון > 0). מטריצת חדירת תאי החיסון הסופית של GSE75360 הוצגה באמצעות טבלת עמודות פרופורציה. הקורלציה של ספירמן שימשה לניתוח תא חיסון-תא חיסון וקשרים מרכזיים בין גנים לתאי החיסון, כאשר התוצאות הוצגו כמפת חום קורלציה (R package pheatmap) וגרף בועת קורלציה (R package ggplot2), בהתאמה.
רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)
רשתות PPI הן מערכות של חלבונים מקושרים המווסתים תהליכים ביולוגיים באמצעות אינטראקציות. באמצעות מסד הנתונים STRING26, נבנתה רשת PPI לגנים מרכזיים (ציון אינטראקציה מינימלי: 0.150, ביטחון נמוך). גני המרכז הקשורים לרנין-אנגיוטנסין נבחרו על ידי סקר גנים אינטראקטיביים. מאגר הנתונים GeneMANIA27, שמזהה גנים דומים פונקציונלית באמצעות מערכי נתונים גנומיים ופרוטאומיים, שימש לחיזוי גנים פונקציונליים דומים של גנים מרכזיים ב-RAS ולבניית רשת אינטראקציה חלבונים.
בניית רשת רגולטורית
רשת mRNA-TF: גורמי שעתוק (TFs) מווסתים את ביטוי הגנים באמצעות אינטראקציה לאחר שעתוק עם גנים יעדים. TFs המיוקדים לגנים של hub והקשרים הרגולטוריים שלהם נאספו ממאגר ChIPBase28, ורשת mRNA-TF הוצגה באמצעות Cytoscape29.
רשת mRNA-miRNA: miRNA מווסת גנים מטרה מרובים (מטרות בודדות עשויות להיות מוסדות במשותף על ידי מספר miRNAs). StarBase v3.030 שימש לזיהוי miRNA הקשורים ל-RASRDEGs, ורשת mRNA-miRNA הוצגה באמצעות Cytoscape.
רשת mRNA-תרופות:31 מאגרי מידע טוקסוגנומיים שימשו לחיזוי מטרות תרופתיות ישירות/עקיפות של גני האב. רשת mRNA-תרופות (שהראתה אינטראקציות בין גנים לתרופות) הוצגה באמצעות Cytoscape להשלמת בניית הרשת.
מודל HUVEC מושרה על ידי אנג II
תאי אנדותל ורידי הטבור האנושיים (HUVECs) נשמרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%CO2. התאים נשמרו במדיום תרבית תאי אנדותל מלאה בתוספת סרום עוברי ואנטיביוטיקה בהתאם להוראות הספק. כדי לקבוע מודל פגיעות אנדותליות הקשורות ליתר לחץ דם במבחנה, HUVECs טופלו באנגיוטנסין II (אנגיוטנסין II; 100 ננומטר) במשך 48 שעות. תאים שטופלו ברכב שימשו כקבוצת הביקורת.
לניסויי התערבות גנטית, RNA קטן מתערב המכוון ל-CST3 או FURIN (si-CST3 ו-si-FURIN), siRNA ביקורתי שלילי (si-NC), פלסמידים בעלי הבעה יתר של CST3 או FURIN (oe-CST3 ו-oe-FURIN), והבקרה הווקטורית הריקה המתאימה (oe-NC) הועברו ל-HUVECs באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הטרנספקציה, התאים נחשפו לאנג II ואז נקטפו לצורך אימות ביטוי ובדיקות פונקציונליות. יעילות ההדחה וההבעה המופרזת אושרה על ידי qRT-PCR ו-western blotting.
qRT-PCR
RNA כולל בודד מ-HUVECs עם תגובת חילוץ RNA סטנדרטית, ו-DNA משלים נוצר באמצעות ערכת שעתוק הפוך. כימיה SYBR Green שימשה ל-qRT-PCR. רמות הביטוי של LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G, TBXAS1, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ו-eNOS ננורמו ל-GAPDH וחושבו בשיטת 2−ΔΔCt.
בלוט מערבי
לניתוח ווסטרן בלוט, חלבונים הופקו באמצעות בופר ליזיס RIPA וכימות באמצעות מבחן BCA. כמויות חלבון שוות נפתרו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF. לאחר החסימה, הממברנות הוטמעו בנוגדנים ראשוניים נגד CST3, FURIN, TBXAS1 או GAPDH, ולאחר מכן עם נוגדנים משניים מתאימים. רצועות זוהו על ידי כימילומינסנציה, והצפיפות נורמל ל-GAPDH. CST3 המופרש בסופרנטנטים בתרבות נמדד באמצעות ערכת ELISA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
כחיות תאים
כחיות התאים הוערכה באמצעות בדיקת Cell Counting Kit-8 (CCK-8). בקצרה, HUVECs שעברו טרנספקציה וטופלו ב-Ang II הוזרעו בלוחות של 96 בארות, והספיגה ב-450 ננומטר נמדדה ב-0, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הוספת מגיב CCK-8. נדידת התאים הוערכה באמצעות תאי טרנסוול. לאחר ההתערבויות שהומלצו, תאים הוזרעו לתאים העליונים, ותאים מהגרים על פני הממברנה התחתונה נקבעו, צוברו ונספרו תחת מיקרוסקופ בשדות שנבחרו באקראי.
בדיקת דלקת
להערכת הפעלה דלקתית, לחץ חמצוני ותפקוד האנדותל, IL-6, TNF-α, VCAM1, ICAM1 ו-eNOS.רמות mRNA זוהו באמצעות qRT-PCR. רמות תחמוצת החנקן (NO) בסופרנטנט התרבית נמדדו באמצעות ערכת בדיקה מסחרית מסוג NO, ורמות מיני חמצן תוך-תאי (ROS) זוהו באמצעות פלואורסצנציה DCF לפי הוראות היצרן.
ניתוח סטטיסטי
בוצעו עיבוד טרנסקריפטומי ומידול ב-R. משתנים רציפים הוערכו לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק. בהשוואות בין שתי קבוצות, מבחני t במדגמים בלתי תלויים שימשו למשתנים עם התפזרות נורמלית, בעוד שמבחני סכום דירוג וילקוקסון שימשו למשתנים לא נורמליים. לשלוש קבוצות או יותר, נעשה ניתוח חד-כיווני של שונות עם בדיקות פוסט-הוק מתאימות כאשר התקיימו נורמליות והומוגניות של הנחות שונות; אחרת, הוחל מבחן קרוסקאל-ווליס. נתוני זמן-מסלול CCK-8 נותחו באמצעות ניתוח דו-כיווני של שונות. מקדמי מתאם ספירמן חושבו לניתוחי אסוציאציה. אלא אם צוין אחרת, תוצאות הניסוי מוצגות כממוצע ± SD, ו-p דו-זנבי < 0.05 נחשב משמעותי.