טיפול במנהרות והעשרה סביבתית לפליתיסמוגרפיה חוזרת של כל הגוף בעכברים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טיפול במנהרות ונהלי העשרה סביבתית לפליטיסמוגרפיה חוזרת של כל הגוף, במטרה להפחית שונות בדרכי הנשימה הקשורה ללחץ במהלך מחקרים לאורך זמן בעכברים.

תקציר

פלתיסמוגרפיה חוזרת של כל הגוף (WBP) משמשת באופן נרחב להערכה אורכית של תפקוד הנשימה בעכברים. עם זאת, לחץ שנגרם מטיפול עלול להכניס שונות פיזיולוגית שמבלבלת את השפעות הטיפול ומפחיתה את השחזור הניסוי. שיטות מסורתיות של טיפול בזנב עשויות לגרום לתגובות לחץ מתמשכות ולהרגל לקוי לאורך מפגשים חוזרים, מה שעלול להשפיע על תוצאות הניסוי. פרוטוקול זה מתאר שיטות טיפול ואחסון משופרות המשלבות טיפול במנהרות והעשרה סביבתית עבור סשנים חוזרים של WBP. שישה עכברים מסוג 129S1/SvImJ בר (3 זכרים, 3 נקבות) עברו טיפול במנהרות והעשרה סביבתית מתמשכת לאורך מחקר שנמשך 10 שבועות. בעלי חיים עברו מפגשי WBP חוזרים, ותקופות ההסתגלות נותחו בנקודות ההתחלה, המחקר המוקדם, האמצע והמאוחר. תדירות הנשימה במהלך מיקום התא הראשוני (ראשוני F, 0–2 דקות) וקו בסיס יציב (קו בסיס נקודה8–10 דקות) נמדדו כדי להעריך דפוסי הסתגלות לאורך זמן. שינויים הדרגתיים נצפו לאורך ציר הזמן של המחקר בתנאים שיושמו. תדירות הנשימה ההתחלתית הממוצעת ירדה מ-345 ± 111 נשימות SD לדקה בתחילת הדרך ל-267 ± 43 נשימות SD לדקה במהלך מפגשי מחקר מאוחרים, בליווי ירידה במקדם השונות (32% עד 16%). מדידות הנשימה הבסיסיות ירדו גם הן מ-255 ± 67 ל-193 ± 43 נשימות לדקה (p = 0.033), בהתאם לשיפור ביציבות המדידה במפגשים מאוחרים יותר. תצפיות התנהגותיות הראו הסתגלות רגועה עם מינימום טמא, השתנה או עצבנות. פרוטוקול זה מספק גישה מעשית למעבדות המבצעות הערכות נשימתיות חוזרות בעכברים. טיפול במנהרות והעשרה סביבתית היו קשורים להסתגלות הדרגתית ולהפחתת שונות נשימתית במהלך מחקרי WBP לאורך זמן.

מבוא

פלתיסמוגרפיה של כל הגוף (WBP) מאפשרת הערכה לא פולשנית של תפקוד הנשימה במכרסמים מודעים ובלתי מרוסנים, והפכה לכלי חיוני למחקרים אורך בפיזיולוגיה נשימתית, טוקסיקולוגיה בשאיפה ומודלים של מחלות ^1,2. היתרונות העיקריים של הטכניקה, כולל אופייה הלא-פולשני וההתאמה למדידות חוזרות, הופכים אותה לחשובה במיוחד למעקב אחר שינויים נשימתיים בהתקדמות המחלה, התערבויות טיפוליות או מסלולי חשיפה. גלאב ובראון² הדגישו כי פלתיסמוגרפיה לא פולשנית בראש החוצה היא שיטה אמינה למדידות חוזרות של תפקוד הריאות בעכברים מודעים, ומספקת כלים חיוניים למחקר תרגומי במחלות דרכי הנשימה, כולל זיהומים נשימתיים מתפתחים. עם זאת, איכות ויכולת השחזור של מדידות WBP תלויות באופן קריטי בהשגת מצבי תדר נשימה נמוכים התואמים לרגיעה התנהגותית, אשר עלולים להיפגע בשל לחץ שנגרם מטיפול. התמודדות עם לחץ מהווה מקור מוכר היטב אך לעיתים לא מוערך מספיק של שונות ניסיונית, שיכול לבלבל מדידות פיזיולוגיות ולפגוע באיכות הנתונים. נוהג מעבדה סטנדרטי כולל בדרך כלל טיפול בזנב, שבו העכברים נתפסים בזנב לצורך הובלה ומניפולציה ^3,4.

נוהג מעבדה סטנדרטי כולל בדרך כלל טיפול בזנב, שבו העכברים נתפסים בזנב לצורך הובלה ומניפולציה. גוביה והרסט³ הראו כי אחיזת זנב גורמת לחרדה בעכברים, כאשר בעלי חיים שטופלו הראו התנהגות חרדה גבוהה יותר במבוך גבוה במבוך פלוס בהשוואה לבקרות שטופלו במנהרה. תגובת החרדה הזו קשורה לשינויים בפרמטרים פיזיולוגיים. Rasid ואח^' השתמשו ב-WBP כדי לכמת את השפעות הנשימה של הליכים שגרתיים במעבדה, ומצאו כי ריסון וטיפול שינו משמעותית את נפח הזעירות באופן תלוי במין, כאשר ההשפעות נמשכות עד 24 שעות לאחר ההליך. היקף ומשך ההשפעות המושרות על ידי הטיפול מדגישים כי מדידות נשימתיות שמתקבלות זמן קצר לאחר טיפול בזנב עשויות לשקף פיזיולוגיה של לחץ אקוטי ולא תפקוד בסיסי יציב.

הספרות הרחבה יותר על ריסון והתמודדות עם לחץ חושפת השפעות החורגות מעבר לתגובות התנהגותיות מיידיות. בויניצקי ומוסטופסקי⁵ סקרו את ההשפעות הנרחבות של לחץ ריסון על תהליכים פיזיולוגיים, אימונולוגיים, אנדוקריניים והתפתחותיים, והדגישו כי בלבולים הקשורים ללחץ לעיתים קרובות אינם מתועדים מספיק במאמרי מחקר. במחקרים נשימתיים בפרט, הבעיה מחמירה בשל הצורך במדידות חוזרות. כל אירוע טיפול עשוי לאפס את תגובת המאמץ, להגביל את ההרגל ההדרגתי וליצור מדידות בסיסיות לא עקביות לאורך נקודות זמן אורך. דלורם ומוס¹ השוו בין גישות פלתיסמוגרפיה מרוסנת לבלתי מרוסנת בעכברים עם הבדלים פיזיולוגיים ידועים בין זנים, ומצאו שלמרות שמערכות חד-תאיות לא מוגבלות סיפקו ניתוח טוב יותר של תגובתיות דרכי הנשימה, האתגר בהשגת מדידות בסיס שניתנות לשחזור נותר.

טיפול במנהרה, שבו עכברים נכנסים מרצון למנהרה להובלה, הפך לחלופה מבוססת ראיות שמפחיתה משמעותית את החרדה הנגרמת מהטיפול. יעילות השיטה הוכחה במגוון זנים ובהקשרים ניסיוניים. גוביאה והורסט³ הראו שעכברים שמטופלים במנהרה הראו נכונות גבוהה יותר לתקשר עם המטפלים והתנהגות חרדה נמוכה יותר בבדיקות מבוך מוגברות לעומת עכברים עם טיפול בזנב, עם יתרונות שנצפו גם כאשר המנהרות לא היו מוכרות. חשוב לציין, היתרונות הללו חורגים מהתקופה המיידית שלאחר הטיפול. סנסיני ואח^' בחנו את השפעות טכניקת הטיפול ותדירות הטיפול בין המינים, ומצאו כי התנדבות הזנב התכופה הפחיתה התנהגויות הקשורות לרווחה, כמו חפירה, והגברת התנהגות דמוית ייאוש אצל גברים, בעוד שטיפול במנהרות היה מועדף על שני המינים והיה קשור להתנהגויות גישה חיוביות יותר ופחות תגובות הגנתיות. יתרה מזאת, דייוויס ^{ואחרים.7} הראו כי היתרונות של טיפול ללא זנב ממשיכים להתקיים במהלך הליכים מורכבים. עכברים שנחשפו לטיפול בזנב לאורך כל חוויית המעבדה שלהם, כולל במהלך הליכי ריסון, הראו תגובתיות מוגברת לגירויים סביבתיים וירידה בקלות הטיפול בהשוואה לעכברים שטופלו אך ורק באמצעות כוסות או שיטות מנהרה.

מעבר לטיפול בבחירת שיטות, הרגל שיטתי לפרוצדורות ניסיוניות עשוי להפחית עוד יותר את השונות הנגרמת מלחץ. סורלי ואח^' חקרו אימון עכברים לפליטיסמוגרפיה עם ראש החוצה, מערכת מבוססת ריסון, ומצאו שחמישה ימים רצופים של אימון שיפרו את הסבילות, כאשר עכברים הראו שיפור ביציבות התנהגותית ביום השני, אם כי פרמטרי הנשימה התייצבו תוך 5 דקות בכל המפגשים. באופן דומה, Ueno ואח^{' הראו} כי טיפול עדין וחוזר בעכברים זכרים C57BL/6 לפני בדיקות התנהגות הפחית התנהגות חרדתית בבדיקות מבוך מוגברות ושיפר את הקוגניציה המרחבית, מה שמעיד שמגע חוזר עם המטפלים יכול לגרום להשפעות הרגל מדידה. ממצאים אלו מצביעים על כך ששילוב שיטות טיפול לא שליליות עם פרוטוקולי הרגל שיטתי עשוי לספק יתרונות מצטברים להפחתת שונות פיזיולוגית במהלך מדידות חוזרות.

העשרה סביבתית מהווה גורם נוסף שיכול להשפיע על תגובתיות לחץ ופיזיולוגיה בסיסית, אף שההשפעות מורכבות ותלויות בהקשר. בעוד שההעשרה בדרך כלל מקדמת רווחה חיובית, העשרה מופרזת או בלתי צפויה עלולה להגדיל באופן פרדוקסלי את השונות הפיזיולוגית וההתנהגויות הקשורות ללחץ בהקשרים ניסיוניים מסוימים^10,11. גישה מאוזנת השומרת על יסודות ליבה יציבים, כגון חומר מקונן, תוך מתן חידוש שניתן לנהל באמצעות סיבוב תקופתי של פריטי ההעשרה, עשויה למקסם את הרווחה מבלי להכניס שונות מבלבלת¹². האינטראקציה בין העשרה, שיטת הטיפול ופרוטוקולי ההרגל נותרת לא נחקרת בהקשר של מדידות נשימתיות חוזרות, מה שמדגיש את הצורך בפרוטוקולים משולבים המטפלים בכל שלושת הגורמים בו-זמנית.

למרות ההכרה הגוברת בהשפעות הטיפול במדידות פיזיולוגיות, פרוטוקולים סטנדרטיים שנועדו במיוחד למזער לחץ טיפול במהלך מפגשי WBP נשנים נותרו מוגבלים. פרוטוקולי WBP קיימים בדרך כלל מסתמכים על תקופות הסתגלות ממושכות (10–30 דקות למפגש) כדי לאפשר לטכיפניאה הנגרמת מלחץ להירגע, אך לעיתים נדירות מתייחסים לשיטת הטיפול הבסיסית או מעריכים באופן שיטתי האם מתרחשת ההתרגלות הדרגתית לאורך המפגשים. יתרה מזאת, רוב המחקרים אינם מעריכים האם בעלי חיים מגיעים למצבים פיזיולוגיים התואמים לרגיעה התנהגותית, כגון תדירויות נשימה המתקרבות לטווחים שדווחו בספרות כקשורים למצבים שקטים או הקשורים לשינה, או במקום זאת עוברים מלחץ חריף לעוררות כרונית ברמה נמוכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טיפול במנהרות, העשרה סביבתית מאוזנת ומפגשי WBP חזריים לאורך מחקר אורך של 10 שבועות. אנו מתארים גישה הקשורה לשינויים הדרגתיים בתדירות הנשימה התואמים להתרגלות, כולל ירידה בתדירות הנשימה הראשונית לאורך מפגשים ומדידות בסיסיות המתקרבות לטווחים שדווחו בספרות כקשורים למצב שקט או שינה. חשוב לציין כי פרוטוקול זה מוצג לא רק כשיפור רווחת בעלי חיים, אלא גם כשיקול עיצוב ניסויי שעשוי לסייע בהפחתת שונות ושיפור העקביות במהלך מדידות נשימתיות לאורך זמן.

פרוטוקול

לבצע את כל ההליכים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (פרוטוקול IACUC #23-103) באוניברסיטת מיאמי. עכברי בית במתקן ויווריום המוכר על ידי AAALAC עם תנאי סביבה הנשמרים לפי תקנים מוסדיים.

1. בחירת בעלי חיים ותנאי מגורים

1. בחר והכין בעלי חיים למחקר
   1. בחר בעלי חיים ממושבת רבייה מבוססת או רכש אותם מספק מסחרי. למחקר זה, השתמשו בשישה עכברים מסוג בר מסוג 129S1/SvImJ (3 זכרים, 3 נקבות).
   2. לשמור על בעלי חיים בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במתקן המוכר על ידי AAALAC עם ניטור בריאות שגרתי בהתאם לסטנדרטים מוסדיים.
   3. אשר שבעלי החיים הם בערך בני 6 חודשים (צעירים) בתחילת המחקר.
      הערה: עכברים במחקר זה נחשפו בעבר לטיפול במנהרות כחלק מהטיפול השגרתי. לעכברים תמימים, יש ליישם תקופת התניה לפני תחילת מפגשי WBP (ראו שלב 3.2).
2. התחל בהליכים ניסיוניים כאשר העכברים מגיעים לגיל המתאים למטרות המחקר. במחקר זה, העכברים היו בני כ-6 חודשים (מבוגרים צעירים) בתחילת מפגשי WBP. לצורך שחזוריות, השתמשו בעכברים בטווח גילאים מוגדר (למשל, ±חודש אחד) ודווחו על הגילאים הספציפיים, שכן הגיל עשוי להשפיע על פרמטרי הנשימה הבסיסיים וקינטיקת ההרגלים.

2. פרוטוקול העשרה סביבתית

1. ספק חומר קינון קבוע
   1. הניחו ריבוע כותנה דחוס אחד (כ-5 ס"מ × 5 ס"מ, ~2.5 גרם) בכל כלוב בכל החלפת כלוב.
   2. העבר את רוב מבנה הקן הקיים שלם לכלוב החדש במהלך החלפת הכלוב בשתי הידיים.
   3. אם חומר הקינון המצטבר עולה על כ-10 גרם (בערך פי שניים מהמסה המקורית), יש להסיר את החלקים העתיקים והדחוסים ביותר מהתחתית תוך שמירה על מבנה הכיפה החיצוני.
   4. הוסף ריבוע כותנה טרי אחד (5 ס"מ × 5 ס"מ) לכלוב הנקי כדי לתמוך בהמשך בניית הקן ותחזוקתו.
   5. החלפת חומר הקינון רק אם הוא רטוב לעין (זיהום שתן מכסה >25% מהמשטח) או אם הקן נהרס ולא נבנה מחדש בתוך 48 שעות (איור 1A ו-1C).
      הערה: שמרו על מבנה הקן כדי למזער את הלחץ הקשור לשינויים בכלוב ולשמור על רמזים ריחניים ומישושיים עקביים לאורך כל המחקר. איכות הקן משמשת כמדד לרווחת בעלי החיים ומצבו הבריאותי¹³.
2. העריך את בניית הקן מדי שבוע באמצעות ההליך הסטנדרטי הבא
   1. בכל החלפת כלוב, העבירו בזהירות את הקן השלם למשטח נקי בשתי הידיים מבלי להפריע למבנה.
   2. צלמו את הקן ישירות מלמעלה עם המצלמה ממוקמת 30–40 ס"מ בניצב לפני השטח כדי לדמיין את המבנה הכולל ואת היווצרות המכתש.
   3. צלם את הקן מהצד בגובה הקן כדי לתעד את שלמות הקיר ותכונות הכיפה.
   4. דירגו את הקן באמצעות סולם דיקון סטנדרטי בן 5 נקודות¹³, כאשר 1 = חומר קינון כמעט לא נגע בו ו-5 = קן בצורת כיפה עם מכתש שקוף. עיין באיור 1A–1C לדוגמאות לקינים עם ציון 5.
   5. החזיר את הקן בזהירות לכלוב הנקי.
      הערה: תמונות קן שבועיות מספקות תיעוד אובייקטיבי של איכות הקן לאורך כל המחקר. הידרדרות בבניית קן עשויה להעיד על מחלה, לחץ או דאגות רווחתיות אחרות הדורשות טיפול וטרינרי.
3. מתן העשרה מתחלפת שמשתנה שבועית
   1. בחר פריט העשרה אחד והניח אותו בכלוב. השתמש בנייר מגורר (נייר לבן פשוט, מנה בגודל חופן), במגבות נייר (2–3 דפים, ללא ריח, לבן, מקופל או מקומט), או במקלטים מבוססי נייר (צינורות קרטון או קופסאות קטנות).
   2. סובבו פריטי העשרה שבועיים לפי לוח זמנים שנקבע מראש (למשל, שבוע 1: נייר מגורס; שבוע 2: מגבות נייר; שבוע 3: צינור קרטון; שבוע 4: חזור על זה) כדי לשמור על חידוש שניתן לנהל.
      הערה: סיבוב שבועי מספק חידוש בלי להעמיס על העכברים. הימנע מפריטי העשרה מפלסטיק, כמו בקתות פלסטיק, כדורים או מבנים קשיחים, שעשויים להגדיל את השונות הפיזיולוגית¹¹. החלף את כל פריטי ההעשרה בכל החלפת כלוב.

איור 1. יישום הפרוטוקול ומדדי רווחה במהלך מחקרי פלתיסמוגרפיה של כל הגוף (WBP) לאורך זמן. (א) קן איכותי מייצג (ציון דיקון 5) מכלוב נקבה המציג מבנה כיפה מעוצב היטב עם מכתש מוגדר. (ב) מנהרת טיפול בפוליקרבונט שקופה (כ-10 ס"מ אורך × 5 ס"מ קוטר פנימי) המשולבת עם חומר קינון בכלוב הבית. המנהרות נשארו בכלובים קבועים כאמצעי העשרה וטיפול לאורך כל המחקר. (ג) איכות קן מייצגת במחקר מאוחר (שבוע 10) שמראה ציון מתמשך 5 בניית קן בכלובים זכריים ונקביים. (D) ציוני איכות Nest לאורך תקופת המחקר בת 10 השבועות. כל נקודת נתונים מייצגת את ציון הקן השבועי של כלוב באמצעות סולם Deacon הסטנדרטי בן 5 נקודות¹³, שבו 1 = חומר קינון שלא נגע בו ו-5 = קן כיפה מלא עם מכתש. שני הכלובים שמרו על איכות קן עקבית של ציון 5 לאורך כל שלבי המחקר. האזור הירוק המוצל מציין ציונים הקשורים לתנאי רווחה אופטימליים (ציונים 4–5). שלבי המחקר מסומנים על ידי אזורי רקע צבעוניים התואמים לבסיס (שבוע 0), לימוד מוקדם (שבועות 2–3), אמצע הלימוד (שבועות 5–7) ולימודים מאוחרים (שבועות 8–10). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. יישום טיפול במנהרות

1. הכנת מנהרות טיפול
   1. השתמש במנהרות פוליקרבונט שקופות (אורך 100 מ"מ או 130 מ"מ × קוטר פנימי של 50 מ"מ) עם קצוות חלקים ועגולים (איור 1B).
   2. הניחו מנהרה אחת באופן קבוע בכל כלוב ביתי כחלק מהעשרת הכלוב.
   3. אל תסיר מנהרות בין אירועי טיפול.
      הערה: השארת המנהרה בכלוב הבית מאפשרת לה לקבל ריחות מוכרים של הכלוב ולהתחבר לסביבה הביתית במקום לטיפול בנהלים. עכברים משתמשים לעיתים קרובות במנהרות כמקלטים או כאתרי קינון.
   4. בכל החלפת כלוב, נגב את פנים המנהרה עם מעט מצעים משומשים מהכלוב הקודם לפני שמניחים אותו בכלוב הנקי.
   5. מנהרות אוטוקלאב או שטוף אותן עם אותו חומר חיטוי המשמש לתברואה כלובים אם נדרש חיטוי בין שימושים. שטוף היטב ואפשר למנהרות להתייבש באוויר לפני החזרתן לכלוב.
      הערה: שמירה על רצף ריח מסייעת להפחית לחץ הנלוות לריחות לא מוכרים. מנהרות הן אוטוקלביות וניתנות לשימוש חוזר.
2. עכברים במצב לטיפול במנהרה
   1. לעכברים בוגרים תמימים, יש ליישם תקופת התניה של לפחות שבוע עד שבועיים לפני תחילת מפגשי WBP ^14,15.
   2. הניחו מנהרות פוליקרבונט שקופות (ראו שלב 3.1) באופן קבוע בכלוב הביתי ואפשרו 3–7 ימים להיכרות פסיבית.
   3. לאחר חשיפה פסיבית, בצע טיפולים יומיים עדינים בטיפול. עודדו את העכברים להיכנס למנהרה מרצונם, ואז הרימו את המנהרה אופקית למשך 30–60 שניות לפני החזרת העכבר לכלוב.
   4. הערכת הרגל מוצלח באמצעות הקריטריונים הבאים: כניסה רצונית למנהרה בתוך 10–30 שניות, התנהגות רגועה בתוך המנהרה ללא ניסיונות בריחה או קולות, ושימוש ספונטני במנהרה למנוחה או חקירה במהלך תצפיות שגרתיות בכלוב^14,15.
   5. התחילו מפגשי WBP לאחר שכל קריטריוני ההרגלה מתקיימים.
      הערה: עכברים במחקר זה נחשפו בעבר לטיפול במנהרות כחלק מהטיפול השגרתי לפני תחילת מפגשי WBP.
3. ביצוע טיפול לא שלילי
   1. לבשו כפפות ניטריל ללא אבקה לכל הליכי הטיפול.
   2. השתמש בטיפול במנהרות כשיטה עיקרית. אם העכבר בתוך המנהרה, הרם את המנהרה אופקית עם יד אחת שתומכת בבסיס.
   3. אם העכבר מחוץ למנהרה, מקם את פתח המנהרה בטווח של 5–10 ס"מ מהעכבר ואפשר 10–30 שניות לכניסה מרצון ללא רדיפה או כוח.
   4. אם העכבר לא נכנס תוך 30 שניות, עודדו תנועה לכיוון המנהרה באמצעות יד מכוסה הממוקמת מאחורי העכבר מבלי ליצור מגע.
   5. אם העכבר לא נכנס לאחר שתי ניסיונות (סך כולל מקסימלי של 60 שניות), השתמש בשיטת כוסות הכוסות. הנח יד שטוחה ליד העכבר, אפשר גישה רצונית למשך 10–20 שניות, ואז תפס את העכבר בעדינות בשתי הידיים תוך הימנעות מטיפול בזנב.
   6. השתמשו בשיטת הטיפול שמובילה להתנהגות רגועה, המוגדרת כהיעדר קול, ניסיונות בריחה או הטלה הקשורה ללחץ.
4. העברת עכברים לתא הפלתיסמוגרפיה
   1. העבר את העכבר מהמנהרה לידיים מכוסות לפני שמכניסים אותו לתא.
   2. החזק את המנהרה אופקית והטה את הקצה האחורי (צד הזנב) כלפי מעלה בערך 10–20°.
   3. תן לעכבר לצאת מהמנהרה לאחור, רגליים אחוריות קודם, אל הידיים הסגורות.
   4. הורידו את שתי הידיים לתוך התא ואפשרו לעכבר לדרוך מרצונו על רצפת התא בתוך 5–10 שניות.
      הערה: שיטת ההעברה ממנהרה לידיים לתא מספקת שליטה משופרת במהלך מיקום התא.
   5. חלופה נוספת היא להעביר את העכבר ישירות מהמנהרה אל תוך התא על ידי הטיית המנהרה מעל פתח התא.
      הערה: העברה ישירה ממנהרה לתא מספקת פחות שליטה במהלך ההצבה ושימשה פחות במחקר זה.
   6. לעולם אל תהפוך את המנהרה אנכית או תנער אותה.
   7. אטום את מכסה התא מיד לאחר מיקום העכבר והחזר את המנהרה לכלוב הבית.
      שלב קריטי: לעולם אל תתפוס עכברים בזנבם בשום שלב במהלך המחקר. אם עכבר לא נכנס למנהרה תוך 30 שניות או מתקרב ליד מכובדת, עודד תנועה עדינה עם מצע רך מבלי לרדוף או לכפות אינטראקציה. אפשר לעכבר לבחור גישה של מנהרה או יד לפי העדפה אישית. סבלנות במפגשים הראשונים מסייעת לבסס אסוציאציות חיוביות לטיפול לא שלילי ^3,7.

4. פרוטוקול סשן WBP

1. הכינו את מערכת הפלתיסמוגרפיה
   1. כייל את הפלתיסמוגרף של כל הגוף פעם ביום לפני איסוף הנתונים.
   2. כאשר התאים ריקים ואטומים, התחלו את רצף הכיול האוטומטי באמצעות תוכנת ניתוח נשימתי FinePointe (מטרה: 18–22 ס"מ H₂O). אשר כיול מוצלח כאשר טווח היעילות של זרימת הקופסה עולה על ±40 מ"ל לשנייה לכל אתר.
   3. הגדר את זרימת ההטיה ל-1.0 ליטר לדקה לכל תא.
   4. יש לנטר את טמפרטורת התא (22°C–24°C) ואת הלחות באופן רציף באמצעות חיישנים דיגיטליים.
   5. הניחו את התאים במקום שקט עם תאורה עקבית ורעידות מינימליות.
      הערה: שמרו על תנאי תא קבועים בכל המפגשים. תנודות טמפרטורה משנות דפוסי נשימה ומבלבלות השוואות אורך¹.
2. קיים מפגשי WBP במהלך שלב צירקדי עקבי
   1. בצע את כל המדידות באותו חלון זמן במחזור האור.
   2. קיימו אימונים בין 08:00–10:00 (אורות דולקים ב-06:00) והימנעו מהשעתיים הראשונות לאחר הדלקת האורות כאשר הקצב הצירקדי משתנה.
3. העבר עכברים לחדר הניסוי
   1. העבירו כלובים הביתה לחדר הניסוי בעגלה כ-15 דקות לפני תחילת הסשן.
   2. אפשר לעכברים להסתגל לסביבת החדר הניסיוני תוך כדי שהם נשארים בכלוב הביתי המוכר שלהם.
   3. הניחו כלובי בית ליד תאי הפלתיסמוגרפיה.
   4. השתמש בטיפול במנהרה (ראו שלבים 3.3–3.4) כדי להעביר כל עכבר מהכלוב הביתי לידיים הסגורות ואז לתא.
   5. טפל בעכברים ברוגע ומזער תנועות פתאומיות במהלך ההעברה.
      הערה: העברת עכבר בודדת לוקחת רק כמה שניות.
4. שים את העכבר בתא
   1. העבר את העכבר בעדינות מהידיים המכוסות אל התא (ראה שלב 3.4).
   2. סגור את מכסה התא במרחק של 5 שניות ממיקום העכבר.
5. התחל בהסתגלות והקלטה
   1. התחל להקליט אותות נשימתיים באמצעות תוכנת ניתוח נשימתי.
   2. יש להקדיש 10 דקות להסתגלות ללא הפרעה או התערבות.
6. מעקב אחר יציבות התנהגותית במהלך ההסתגלות
   1. צפה בעכבר באופן רציף לאורך כל תקופת ההסתגלות.
   2. תעד תנועות מופרזות, חוסר תנועה מתמשך המלווה בסימני לחץ (למשל, יציבה נוקשה), או ניסיונות בריחה חוזרים ללא תקופות של התנהגות רגועה ביומן המפגש.
   3. להכיר בכך שמפגשים כאלה עדיין עשויים לספק נתונים ראשונייםתקפים; עם זאת, מדידות בסיס של Fעשויות להיות לא אמינות.
   4. דגלו מפגשים ללא תקופות רוגע נראות במהלך חלון ההסתגלות, כדי לאפשר להדרה מהניתוחים הבסיסיים לפי קריטריונים ספציפיים למחקר.
   5. שמרו על כל המפגשים במחקר זה, שכן אף אחד מהם לא עמד בקריטריוני ההדרה המבוססים על התנהגות הסתגלות.
      שלב קריטי: תקופת ההסתגלות של 10 דקות חיונית להערכת ההתרגלות. למרות שחלק מהפרוטוקולים משתמשים בתקופות הסתגלות של 20–30 דקות, עכברים שהתרגלו היטב במחקר זה הגיעו לדפוסי נשימה יציבים בתוך 8–10 דקות, מה שהפך את ההסתגלות הממושכת למיותרת ועלולה להזיק לתנועה מוגברת.
7. התבוננו בהתנהגות העכבר במהלך ההסתגלות
   1. צפו בעכברים ברציפות לאורך כל תקופת ההסתגלות של 10 דקות באמצעות ניטור ויזואלי של התאים.
   2. שימו לב לסימני לחץ גלויים, כולל קלאה, השתנה, ניסיונות בריחה ממושכים או חוסר תנועה ממושך.
   3. רשמו את הנוכחות והכמות המשוערת של כדורי צואה ושתן בתא לאחר כל מפגש.
      הערה: תצפיות אלו מספקות הערכה איכותנית של רמות לחץ והתקדמות ההתרגלות אך לא דורגו באופן רשמי באמצעות אתוגרמה סטנדרטית במחקר זה.
8. ניתוח מדדי נשימה בשלב ההסתגלות
   1. השתמש בתוכנת ניתוח הנשימה כדי לחשב אוטומטית את תדירות הנשימה מאותות לחץ באמצעות אלגוריתם זיהוי נשימה ברירת מחדל והגדרות סף ברירת מחדל בתוכנה זו.
   2. רכישת אותות נשימה בתנאי זרימת אוויר יציבים (ראו שלב 4.1) באמצעות פרמטרי רכישה סטנדרטיים.
   3. חישבו את תדירות הנשימה הממוצעת לשתי תקופות: fהתחלתי (0–2 דקות), המייצגת את תגובת הלחץ הראשונית ואת הפיזיולוגיה המיידית לאחר הטיפול, ו-fקו בסיס (8–10 דקות), המייצג תדירות נשימתית בסיסית יציבה.
   4. החריגו תקופות עם ארטיפקטים גלויים של תנועה, המוגדרים כסטיות לחץ לא נשימתיות או גלים לא סדירים הקשורים לתנועת בעלי חיים או להפרעות בתא.
      הערה: בדקו ויזואלית תת-קבוצה של הקלטות (כ-10%) כדי לאשר זיהוי נשימה מדויק באמצעות האלגוריתם האוטומטי. אימות ידני אישר הסכמה בין זיהוי אוטומטי לדפוסי נשימה שנצפו.
9. המשך עם הפרוטוקול הניסיוני אם רלוונטי
   1. המשך בהתערבויות ניסיוניות לאחר תקופת ההסתגלות של 10 דקות לפי תכנון המחקר (למשל, מתן תרופות באירוסול, אתגר היפוקסיבי, בדיקות אימון).
      הערה: לא בוצעו התערבויות ניסיוניות במהלך מפגשי הערכת ההרגלים במחקר זה. מדדי הנשימה המדווחים (ההתחלה והבסיס של f) התקבלו במהלך מפגשי הסתגלות בלבד ללא הליכים נוספים.
10. החזיר את העכבר לכלוב הבית
    1. השתמש בטיפול מנהרה או בידיים מכוסות כדי להעביר את העכבר מהתא חזרה לכלוב הביתי.
    2. צפו בעכבר במשך 5 דקות לאחר המפגש כדי לוודא התנהגות נורמלית, כולל תנועה ספונטנית, טיפוח, אינטראקציה עם בני הכלוב וחקירת מזון ומים.
    3. האריך את תקופת התצפית והתייעץ עם צוות הווטרינר אם התנהגות חריגה נמשכת מעבר ל-15 דקות, כולל חוסר תנועה ממושך (>5 דקות), נשימה כבדה, יציבה כפופה או אי אינטראקציה עם בני הכלוב.
       הערה: לא נצפו התנהגויות חריגות לאחר הפגישה במחקר זה.
11. שמור על תדירות סשן עקבית
    1. קיימו מפגשי WBP באופן קבוע לאורך תקופת המחקר האורכית (10 שבועות בפרוטוקול זה).
    2. בצע מפגשים במרווחים שבועיים כדי לעקוב אחרי התקדמות ההתרגלות.
    3. קבעו מפגשים בשעות קבועות ביום (ראו שלב 4.2) לשמירה על עקביות צירקדית ופרוצדורלית.

תוצאות

יישום טיפול במנהרות ופרוטוקול העשרה סביבתית זה על שישה עכברים מסוג 129S1/SvImJ בר (3 זכרים, 3 נקבות) במהלך מחקר WBP אורך בן 10 שבועות הניב עדויות להתרגלות הדרגתית ושיפור ביציבות פיזיולוגית. מדידות תדירות נשימתיות הושגו במהלך מפגשי WBP חוזרים שנערכו במרווחי אורך קבועים, כאשר הנתונים נותחו מארבעה שלבי מחקר: בסיס (שבוע 0), מחקר מוקדם (שבועות 2–3), אמצע מחקר (שבועות 5–7) ומחקר מאוחר (שבועות 8–10). איור 2 מציג את מהלך הזמן הכמותי של שינויים בתדירות הנשימה, ומדגים...

דיון

פרוטוקול זה מתאר גישה משולבת המשלבת טיפול במנהרות, העשרה סביבתית וחשיפה חוזרת בהקשר של WBP לאורך זמן. בתנאים אלו, מדידות תדירות הנשימה הראו ייצוב הדרגתי לאורך מפגשים חוזרים, בהתאם לירידה בעוררות ובהתרגלות הדרגתית. מספר גורמי יישום נראים חשובים לביצועי פרוטוקול מוצלחים. ראשית, יש להכניס טיפול במנהרות לפני תחילת ההליכים הניסיוניים. במחקר זה, עכברים נחשפו קודם לטיפול במנהרות; עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יתרונות יכולים להתרחש גם בתקופות התניה קצרות יותר. סורלי ואח^{' דיווחו...}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	Aspen wood chip bedding. Autoclaved prior to use; placed to approximately 1 cm depth on cage floor.
Autoclaved Water	Facility-provided	Not applicable	Autoclaved municipal water provided ad libitum via standard water bottles.
Cardboard Tube	Facility-generated	Not applicable	Plain cardboard toilet paper roll. Used as rotated enrichment and shelter item.
Crink-I-Nest (Irradiated)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	Shredded paper enrichment material. Gamma-irradiated. Provided as rotated enrichment on an alternating-week basis.
FinePointe Software	Data Sciences International	No catalog number	Respiratory data acquisition and analysis software, version 3.0. Used for WBP data collection and parameter calculation.
Individually Ventilated Cage (IVC) Rack	Allentown	EP5000E	Exhaust pak IVC rack, 140-cage capacity. Double-sided high-density system with automatic ventilation connections.
Irradiated Rodent Chow	Envigo	T.2918.15	Standard irradiated rodent diet. Provided ad libitum via wire-bar hopper.
Mouse Transfer Tunnel	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Clear polycarbonate tunnel, 100 mm length × 50 mm internal diameter. Autoclavable and reusable. Used for low-stress animal transfer procedures.
Nestlets (Irradiated)	Lab Supply	IRR	Compressed cotton nesting squares (~5 cm × 5 cm, ~2.5 g each). Gamma-irradiated. Provided as constant enrichment; one per cage.
Nitrile Gloves, Powder-Free	Kimberly-Clark	KC500	Purple nitrile powder-free exam gloves. Worn during all animal-contact procedures.
Non-Woven Gauze Sponge	Pivetal	21295040	Non-sterile, non-woven gauze sponge, 4-ply, 4 in × 4 in (10.16 cm × 10.16 cm). Used as enrichment material.
Paper Towel	Tork (Essity)	MB 540A	White multifold hand towel. Used as rotated enrichment material.
Smartphone Camera	Apple	No catalog number	iPhone smartphone camera. Used for weekly nest scoring documentation.
Whole-Body Plethysmography System	Data Sciences International	10222C (2-site); 770621 (4-site)	FinePointe FP Series unrestrained whole-body plethysmography system for mice. Available in 2-site and 4-site configurations.