המחלקה הנפוצה של וריאנטים גנטיים הקשורים לווסקוליטיס באינטרפרופתיות מסוג I בתוך קבוצת ילדים

סיכום

ריצוף אקסום מלא של 1,204 מטופלים ילדים עם מחלה אוטודלקתית חשודה זיהה וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה ב-132 מקרים, כולל 79 מוטציות חדשות. רובם היו הטרוזיגוטיים וקשורים לפנוטיפים וסקוליטיים. ממצאים אלו מדגישים את הערך האבחוני של בדיקות גנטיות ואת התפקיד המרכזי של איתות אינטרפרון מסוג I הלא מפוזר בדלקת כלי דם בילדים.

תקציר

דלקת כלי דם בילדים מאובחנת באופן מסורתי באמצעות הערכה היסטופתולוגית; עם זאת, נעשה שימוש הולך וגובר בגישות המבוססות על דימות פחות פולשני בפרקטיקה הקלינית. למרות ההתקדמויות הללו, זיהוי אטיולוגיה מונוגנית בסיסית נותר חיוני להבנת מנגנוני המחלה, חיזוי פרוגנוזה והכוונת אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות. אינטרפרופתיות מסוג I מהוות קבוצה הטרוגנית של הפרעות המתווכות על ידי מערכת החיסון, המאופיינת באיתות אינטרפרונים מרכיבים ובהופעות תכופות של כלי דם או וסקולופתיים. הפעלה מתמשכת של מסלולי חישה של חומצות גרעין והומאוסטזיס התוך-תאי פגום תורמים לתפקוד לקוי של האנדותל ולדלקת כלי דם כרונית.

מחקר זה מציג תהליך ניתוח גנטי מקיף לזיהוי וריאנטים הקשורים לווסקוליטיס בגנים הקשורים לאינטרפרונופתיה בתוך קבוצת מחלות אוטודלקתיות בילדים. ריצוף אקסום מלא בוצע ב-1,204 מטופלים עם הפרעות אוטודלקתיות חשודו. וריאנטים המשפיעים על אזורי קידוד ואתרי חיבור נותחו באמצעות צינור ביואינפורמטי המבוסס על הנחיות הקולג' האמריקאי לגנטיקה רפואית וגנומיקה, תוך שילוב טכניקות סינון סטטיסטי ועיבוד אותות בהשראת טרנספורמציות פורייה בדידות (DFT) והתפלגויות סטטיסטיות לשיפור תעדוף ופרשנות הווריאנטים.

זוהו וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה ב-132 מטופלים ילדים שנבדקו במאגר מרפאות ראומטולוגיה. בסך הכל, זוהו 92 וריאנטים ייחודיים, כולל 13 וריאנטים פתוגניים או סבירים שדווחו בעבר ו-79 וריאנטים חדשים שלא היו קיימים במאגרי מידע ציבוריים נכון לפברואר 2026. התסמינים הקליניים כללו בעיקר חום חוזר, תופעות וסקוליטיות והופעות אוטודלקתיות מורכבות.

הווריאנטים כללו גנים הקשורים לאיתות אינטרפרון לא מרוסן והפעלה חיסונית מולדת, כולל מסלולים הקשורים להפעלת TING, מטבוליזם של חומצות גרעין ותפקוד לקוי של תנועת התנועה התוך-תאית. תהליך עבודה בין-תחומי זה מדגים את התועלת האבחנתית הפוטנציאלית של ניתוח גנומי בדלקת כלי דם בילדים ומדגיש את חשיבות איתות האינטרפרון המתמשך בפגיעות כלי דם ובפתוגנזה של מחלות אוטודלקתיות.

מבוא

וסקוליטיס ילדים אובחן באופן מסורתי באמצעות הערכה היסטופתולוגית, שעדיין נחשבת לסטנדרט הזהב. עם זאת, אסטרטגיות אבחון עדכניות מעדיפות יותר ויותר גישות פחות פולשניות, במיוחד שיטות מבוססות הדמיה. למרות ההתקדמות הזו, זיהוי אטיולוגיה מונוגנית בסיסית הוא בעל חשיבות עליונה בדלקת כלי דם בילדים, שכן הוא מספק תובנות קריטיות לגבי מנגנוני מחלה, פרוגנוזה והזדמנויות לטיפול ממוקד ^1,2.

יש לחשוד בדלקת כלי דם בילדים עם דלקת מערכתית ומעורבות רב-איברית. נדרשים לקיחת היסטוריה יסודית, בדיקה גופנית מקיפה, בדיקות מעבדה, בדיקות דימות, ובמקרים מסוימים ביופסיות רקמה כדי לקבוע את האבחנה ולהוציא חיקויים. גילוי וטיפול מוקדם הם חיוניים כי מחלה לא מטופלת עלולה להוביל לסיבוכים מסכני חיים או לתוצאות ארוכות טווח¹.

אינטרפרופתיות מסוג I כוללות מגוון רחב של הפרעות מונוגניות ומורכבות המתווכות על ידי מערכת החיסון, המסומנות בהפעלה מתמשכת של מסלול האינטרפרון מסוג I ובתכונות וסקוליטיות או וסקולופתיות חזרתיות ^3,4. תחושת חומצות גרעין לקויה והומאוסטזיס התוך-תאי פגום הם מנגנונים פתוגניים מרכזיים המקשרים ייצור יתר ממושך של אינטרפרון לדלקת ופגיעות כלי דם. מוטציות של רווח תפקוד TMEM173 (STING1) גורמות לווסקולופתיה הקשורה ל-STING עם הופעתה בתינוקות (SAVI), בעוד שמוטציות COPA דומיננטיות אוטוזומליות משבשות את הסחר ברשת-גולג'י האנדופלזמית, מה שמוביל להפעלה חריגה של STING ופנוטיפ וסקוליטי ^3-5. אינטרפרונופתיות נוספות הנגרמות מפגמים בגנים של חילוף חומרים של חומצות גרעין (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 ו-IFIH1) מדגישות עוד יותר את הקשר המכניסטי בין דיסרגולציה של אינטרפרונים לפתולוגיה וסקולרית³ (ראו איור 1).

איור 1. ארכיטקטורה פתוגנית מפורטת של אינטרפרונופתיות מסוג I הגורמות לתפקוד לקוי של האנדותל ופגיעה מיקרווסקולרית בקבוצות ילדים. (משמאל) הקשר מערכתי של אינטרפרונופתיה ילדים מסוג I: הבחנה עצמית פגומה לעומת אי-עצמי וחישה חריגת של חומצות גרעין מארח מעוררות דלקת אוטומטית מערכתית. פנוטיפים קליניים מאופיינים באופן בולט בוסקולופתיה עורית מוקדמת ומעורבות מערכתית, שלעיתים קרובות מופיעים כנגעים בעור דמויי צ'ילבליין. (באמצע) מפל מכניסטי של פגם גנטי לדיסרגולציה מערכתית: מוטציות של אובדן תפקוד באנזימי ניקוי חומצות גרעין (כגון DNASE1, TREX1) מובילות להצטברות חריגת של DNA ו-RNA אנדוגניים בתוך הציטופלזמה. במקביל, מוטציות רווח תפקוד בחיישנים כמו STING1 מניעות הפעלה מהווה את מסלול cGAS-STING באופן עצמאי מטריגרים ויראליים. חישה תוך-ציטופלזמית פתוגנית זו מפעילה יתר על המידה גורמי ויסות אינטרפרונים, ומובילה לסינתזה רציפה של אינטרפרונים מסוג I (IFN-α/β). פלט ציטוקינים כרוני יוצר לולאת הגברה מערכתית מתקיימת דרך קולטני IFNAR1/2, שמוחמרת על ידי מנגנוני ניקוי לקויים ובקרות משוב חיוביות. (מימין) תוצאה פתולוגית: קשירה מתמשכת של IFN-α/β במחזור הפעולה לקומפלקס קולטני תאי האנדותל גורמת להפעלה מתמשכת של JAK-STAT. הפרעה הומאוסטטית מתמדת זו גורמת למתח מתמשך באנדותל ומפגיעה במנגנוני הרפיית כלי דם פיזיולוגיים. ברמה הקפילרית, מצב דלקתי יתר זה גורם לפגיעה ישירה בתאי אנדותל, עיבוי משמעותי בדופן כלי הדם ולטרומבוזה מיקרווסקולרית לומינלית, שמובילה לאיסכמיה רקמתית חמורה ולמיקרווסקולופתיה נמקית ללא מסלולים אוטואימוניים המתווכים על ידי אוטונוגדנים. קיצורים: cGAS-STING = ממריץ סינתאז מחזורי GMP-AMP של גני אינטרפרון; DNASE1 = דאוקסיריבנוקלאז 1; GoF = רווח תפקוד; IFN = אינטרפרון; IFNAR = קולטן אלפא/בטא אינטרפרון; IRF = גורם רגולטורי של אינטרפרונים; JAK-STAT = ממיר ומופעל של תעתיק לאות Janus kinase; STING1 = מגרה של תגובה אינטרפרונית cGAMP אינטראקטור 1; TREX1 = שלושה אקסונוקלאז לתיקון ראשי 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

גישה זו פותחה לזיהוי וריאנטים גנטיים הקשורים לאינטרפרונופתיה בקבוצות אוטודלקתיות בילדים, שכן שיטות קונבנציונליות עשויות להתמודד עם אתגרים אנליטיים במתן עדיפות מוקדמת למוטציות נדירות, והטרוגניות של נויטרופילים משחקת תפקיד קריטי בחיזוי סיכון להישנות⁶. בספרות, תפקיד חוסר הוויסות של איתות אינטרפרון בוסקוליטיס כלי דם קטן הובהר באמצעות ניתוחים חד-תאיים, מה שמדגיש את היתרון של ריצוף אקסום מלא (WES) לאבחון מוקדם בקבוצות ילדים⁶.

תסמונות אוטודלקתיות מונוגניות עשויות להופיע עם וסקוליטיס או תופעות דמויות. לדוגמה, SAVI יכול לחקות וסקוליטיס כלי דם קטן או בינוני⁷. באופן דומה, דלקת מפרקים אידיופתית צעירה (JIA) מייצגת קבוצה הטרוגנית של מחלות דלקתיות שמתחילות בילדות ועשויות להימשך עד הבגרות וקשורות לדיסרגולציה דמוית אינטרפרונופתיה, מה שמדגיש את הצורך בניתוח גנטי בקבוצות ילדים⁸.

אינטרפרונופתיות מסוג I הן שגיאות מולדות של חיסון מנדלי, המתאפיינות בהפעלת חיישנים אנטי-ויראליים המופעלים על ידי חומצות גרעין שמקורם במארח, ומייצג כישלון בהבחנה עצמית לעומת לא-עצמית ^3,4. הפרעות אלו מוגדרות על ידי הגברת איתות אינטרפרון מסוג I, ותופעות דרמטולוגיות לעיתים קרובות מספקות רמזים אבחנתיים חשובים. SAVI קשור למוטציות של רווח תפקוד TMEM173 ומופיע בהופעה מוקדמת של וסקולופתיה עורית ודלקת^{ריאתית.} מוטציית p.V155M היא הווריאנט¹⁰ המדווח ביותר. SAVI היא מחלה אוטודלקתית נדירה הקשורה למוטציות STING1, המאופיינת במחלת ריאות אינטרסטיציאלית מוקדמת (ILD) ונגעים עוריים, ועלולה לחקות קלינית לופוס אריתמטי מערכתי (SLE)¹¹. איתות אינטרפרון מסוג I לא מבוקר נמצא גם הוא בדלקת כלי דם (AAV) הקשורה לנוגדן ציטופלזמי אנטי-נויטרופילי (ANCA). ב-AAV, חתימת אינטרפרון מסוג I דומיננטית בדלקת וסקוליטיס מיקרוסקופית/מיאלופרוקסידאז הקשורה ל-ANCA (MPA/MPO-AAV) וקשורה לתחזית כליות, מה שמדגיש את תרומתם של וריאנטים נדירים לדיסרגולציה של אינטרפרון¹².

תסמונות אוטודלקתיות מונוגניות עשויות להופיע עם וסקוליטיס או תופעות דמויות. לדוגמה, SAVI יכול לחקות וסקוליטיס כלי דם קטן או בינוני⁷. בעבר, תוארה הקבוצה העולמית הגדולה ביותר של מטופלים שנשאו מוטציות מפעילות של STING1, מה שסיפק אפיון קליני ואימונולוגי מורחב של SAVI¹³. במהלך שני העשורים האחרונים, הושג התקדמות מרשימה בהבנת זיהוי פתוגנים על ידי תאים המטופואטיים ולא-המטופואטיים כאחד. רכיבים מיקרוביאליים מזוהים דרך קולטנים מקודדים בקו הנבט, שלב מרכזי בהתחלת תגובה זו¹⁴. בשנת 2006 הוכח כי העברת DNA לסוגי תאים שונים גורמת לעלייה בוויסות של אינטרפרונים מסוג I באופן בלתי תלוי בקולטן דמוי טול (TLR). בהקשר זה, STING, חלבון טרנסממברנלי הממוקם ברשתית האנדופלזמית, זוהה בשנת 2008 כמתווך מרכזי לתגובות אינטרפרון מסוג I ל-DNA סינתטי^{וויראלי 13}. מוטציות של רווח תפקוד ב-STING1 מובילות לאינטרפרונופתיה מסוג I הידועה בשם SAVI^9˒10˒14. מחלה חמורה זו מאופיינת באופן משתנה בדלקת מערכתית מוקדמת, וסקולופתיה עורית ומחלת ריאות אינטרסטיציאלית (ILD)¹⁴. SAVI הוא נדיר, עד כה דווחו 52 מטופלים מ-37 משפחות, ורוב המקרים מתרחשים באופן חדש, אם כי תורשה אוטוזומלית דומיננטית תועדה גם כן. בעבר, תוארה הקבוצה העולמית הגדולה ביותר של מטופלים שנשאו מוטציות מפעילות STING1, מה שסיפק אפיון קליני ואימונולוגי מורחב של SAVI ^9,10,11˒14.

פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר גילוי מוקדם של וריאנטים גנטיים הקשורים לאינטרפרונופתיה באמצעות ניתוח גנטי מבוסס WES אצל מטופלים ילדים עם תכונות אוטודלקתיות, שכן גישות קונבנציונליות לעיתים קרובות אינן מספיקות לזיהוי מוטציות נדירות ועלולות לפספס הזדמנויות להתערבות מוקדמת. הספרות מראה כי תפקיד העלאת האינטרפרונים בפנוטיפים דמויי וסקוליטיס הובהר באמצעות חקר הפרעות מנדליות, מה שמדגיש עוד יותר את היתרון של WES לזיהוי וריאנטים נדירים ^4,7,12.

המטרה העיקרית של שיטה זו היא לשלב עקרונות עיבוד אותות מבוססי פיזיקה עם מודלים חישוביים ביופיזיקליים פשוטים, כדי לתמוך בזיהוי וריאנטים בנתוני WES עבור אינטרפרונופתיות מסוג I, תוך פירוש ההשפעות במורד הזרם על מסלולי איתות האינטרפרונים, במיוחד מפל ה-JAK-STAT-STAT. גישה חקרנית זו שואפת להשלים את ניתוח האזורים הגנומיים הנפגעים לעיתים קרובות מרעש ריצוף וכיסוי לא אחיד של הפרעות המתווכות על ידי מערכת החיסון, שבהן הפעלת אינטרפרונים לא מפוזרת מניעה פנוטיפים וסקוליטיים. תהליכי עבודה ביואינפורמטיים סטנדרטיים מתמקדים בדרך כלל במדדי איכות סטנדרטיים, מה שעשוי להשאיר מקום לסינון תומך נוסף בעת זיהוי וריאנטים באזורים מורכבים בגנים כמו STING1 או TREX1. באמצעות יישום טכניקות עיבוד אותות בהשראת טרנספורמציות פורייה בדידות (DFT) והתפלגויות סטטיסטיות, שיטה זו מחלקת תכונות גנומיות בסיסיות מרצפי נוקלאוטידים, מיפוי בסיסים (A, T, C, G) לאינדיקטורים בינאריים לניתוח דפוסי מוטציה¹⁵. יתרה מזאת, מידול ביופיזי של מסלולי אינטרפרון משלב התנהגות סף והגברה מצטברת של אותות כדי להעריך כיצד וריאנטים גנטיים עשויים לתמוך בתפקוד לקוי של האנדותל, עם דגש על תפקיד מסלול JAK-STAT בהעברת אותות אינטרפרון מסוג I (IFN-α/β).

יישום חקרני זה תוכנן לחקור פרופילי יישור באזורים עם כיסוי נמוך. בעוד שכלים חישוביים סטנדרטיים מספקים סינון וריאנטים ראשוניים, המודל התומך בוחן האם הערכה מבוססת SNR יכולה להציע שער איכותני משני לקידוד וריאנטים חד-נוקלאוטידיים (SNVs) המושפעים מהתפלגות קריאה לא אחידה. גישה פיזיקלית זו משתמשת באופטימיזציה של SNR להערכת איכות גנוטיפ ויחסי קריאה מינוריים. בספרות הרחבה יותר, מודלים סטוכסטיים דומים חשפו תגובות מדורגות במסלולי JAK-STAT ולא בדינמיקת הכל או כלום, מה שמאפשר חיזוי טוב יותר של ייצור יתר של אינטרפרונים¹⁶. מסלול JAK-STAT, המופעל על ידי אינטרפרונים מסוג I (IFNs) שנקשרים לקולטני IFNAR1/IFNAR2, כולל קינאזות Janus (JAK1, TYK2) שמזרחנים STAT1 ו-STAT2, ויוצרים את קומפלקס ISGF3 עם IRF9 לטרנסלוקציה גרעינית ולשעתוק^{ISG 17}. ניתן למודל זאת באמצעות משוואות דיפרנציאליות רגילות (ODEs) לאינדוקציה IFN-β:

כאשר הפרמטרים המפורטים מייצגים את קצב הזרחון, הדפוספורילציה והמשוב השלילי דרך SOCS1, ומדגישים הגברה תלויה בסף¹⁷. פרטים נוספים כוללים יצירת הומודימר STAT1 לאיתות IFN-γ, אך באינטרפרונופתיות מסוג I, הפעלה מתמשכת מובילה לביטוי יתר של ISG. סימולציות סטוכסטיות מתחשבות עוד יותר בשונות שונות, תוך שימוש באלגוריתמים של גילספי למידול רעש בקישור לקולטן-ליגנד ובייבוא גרעיני, וחשפו הטרוגניות בין תא בתגובות IFN¹⁶. שיטה זו מתאימה במיוחד לחוקרים החוקרים וסקוליטיס אוטודלקתי, שכן היא מספקת מסגרת כמותית המקשרת בין וריאנטים להפרעות בוויסות המסלול, כגון באמצעות ODE מורחבים הכוללים השפעות פאראקריניות:

כאשר הפרמטרים המפורטים מייצגים את קצב הייצור, התדרדרות וחיזוק פרקריני¹⁸. משתמשים עם גישה לנתוני ריצוף בעלי תפוקה גבוהה ומשאבים חישוביים יכולים ליישם גישה זו כדי לתעדף וריאנטים מועמדים ולחקור השפעות אפשריות על המסלולים.

מחקר זה תוכנן בגישה רב-תחומית של ראומטולוגיה וגנטיקה לזיהוי וריאנטים הקשורים לווסקוליטיס בגנים הקשורים לאינטרפרונופתיה בקבוצה גדולה של ילדים המפגינים תכונות אוטודלקתיות, תוך שימוש בפרוטוקול ניתוח גנטי מבוסס CES/WES, בשל קשיים בסיווג וסקוליטיס ומגבלות הגישות המסורתיות. בנוסף, המחקר נועד להדגיש את הערך האבחוני של הערכה גנטית בוסקוליטיס בילדות.

סיווג וסקוליטיס צ'אפל היל לשנת 2012 אינו כולל וסקוליטיס אוטודלקתי מונוגני¹⁹. מחקר זה נועד לקבוע את תדירות הווריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה שזוהו בקבוצת מטופלים ילדים עם תסמינים אוטודלקתיים, לתרום להרחבת מאגר המחלות הנדירות ולהדגיש את חשיבות ההערכה הגנטית בדלקת כלי דם בילדים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה באוניברסיטת אגה. כל דגימות הדם ההיקפי נאספו לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב ממטופלים או מהאפוטרופוסים החוקיים שלהם, בהתאם להצהרת הלסינקי. מחקר רטרוספקטיבי זה נועד להעריך את שכיחות הווריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה בקרב מטופלים שעוברים ניתוח גנטי למחלה אוטודלקתית חשודה ולחקור את הקשר שלהם לדלקת כלי דם. בין השנים 2022 ל-2025, נכללו דגימות דם היקפיות שנשלחו למעבדת הרפואה המולקולרית של אוניברסיטת אג'ה עם אבחנה ראשונית של מחלה אוטודלקתית. בסך הכל עברו 1,204 דגימות בניתוח גנטי. CES/WES שימש כגישת ריצוף דור חדש (NGS) שמטרתה אקסונים ורצפים אינטרוניים סמוכים. הווריאנטים סווגו לפי קריטריוני ACMG וניתוח ביואינפורמטיקה. וריאנטים שפירים ופוטנציאליים שפירים הוצאו. מתוכם, 132 מקרים פדיאטריים עם וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה שזוהו ועמדו בקריטריוני ההכללה נכללו בקבוצת המחקר הסופית.

בתוך קבוצת ילדים זו, נתונים קליניים נאספו ממסד נתונים של מרפאות ראומטולוגיה. בסך הכול, זוהו 92 וריאנטים גנטיים ייחודיים בקרב 132 המטופלים, כולל 13 וריאנטים פתוגניים שדווחו בעבר או צפויים פתוגניים שתועדו במאגרי וריאנטים ציבוריים (למשל, ClinVar) ו-79 וריאנטים חדשים שלא היו קיימים במאגרי מידע ציבוריים נכון לפברואר 2026. רוב הווריאנטים היו הטרוזיגוטיים וקשורים לפנוטיפים דמויי CAPS או להופעות מורכבות של וסקוליטיס אוטודלקתי. WES השתמש בגישה של NGS שהתמקדה באזורים מקודדי חלבונים (אקסונים) ורצפים אינטרוניים סמוכים כדי לזהות וריאנטים של אתר חיבור ורגולטורי. למרות ש-WES מכסה כ-1%–2% מהגנום האנושי, הוא לוכד כמעט 85% מהמוטציות הידועות הגורמות למחלות, מה שהופך אותו לכלי יעיל מאוד לזיהוי וריאנטים נדירים.

תהליך העבודה במעבדה כלל חילוץ DNA גנומי מדם היקפי, פיצול DNA, הכנת ספרייה מתאימה והעשרת אקסום באמצעות גלאי לכידה מבוססי היברידיזציה באמצעות משיכת ביוטין-סטרפטווידין. רצף זוגות בקצב גבוה בוצע על פלטפורמת ריצוף ננו-כדורי DNA, והשיג עומק כיסוי ממוצע של 100–200x כדי להבטיח זיהוי אמין של וריאנטים. ניתוח ביו-אינפורמטי כלל יישור לגנום הייחוס, קריאת וריאנטים ואנוטציה באמצעות מאגרי וריאנטים שנבחרו לנווט, כאשר סיווג הווריאנטים בוצע לפי הנחיות הקולג' האמריקאי לגנטיקה רפואית וגנומיקה (ACMG). וריאנטים סווגו כדווחים בעבר או כחדשים. וריאנטים נבחרים אומתו באמצעות ריצוף סנגר.

בנוסף לצינורות ביואינפורמטיים סטנדרטיים, יושמו עקרונות עיבוד אותות מבוססי פיזיקה ומידולים חישוביים פשוטים להערכת עומק הרצף, אחידות הכיסוי ומאפייני אות לרעש, ובכך סיפקו שכבה חקרנית ומשלימה לניתוח עומק ריצוף גולמי וכיסוי אזורי. יתרה מזאת, נעשה שימוש במושגי מודלים ביופיזיים להערכת ההשפעה המצטברת של וריאנטים גנטיים הקשורים לווסקוליטיס.

מסגרת בין-תחומית זו משמשת כמודל מעבדתי ראשוני לחקר מאפייני סינון וריאנטים בהקשר מחקרי, במיוחד להנחיית אסטרטגיות טיפוליות נגד אינטרפרון. המגבלות כוללות ירידה ברגישות לווריאנטים של פסיפס ברמה נמוכה ודרישה לאימות תפקודי של ממצאים חדשים. יישומים פוטנציאליים כוללים אבחון מוקדם של וסקוליטיס ילדים, קבלת החלטות טיפוליות מותאמות אישית, והרחבת מאגרי וריאנטים הרלוונטיים לאימונולוגיה, ראומטולוגיה ורפואה וסקולרית.

פיצול DNA

עשרים מיקרוליטר של DNA מדולל הועברו לצינורות PCR סטריליים חדשים. לכל צינור נוספו 2 מיקרוליטר של בופר פרגמנטציה/אדנילציה ו-3 מיקרוליטר של תערובת אנזימי פרגמנטציה/אדנילציה; נפח התגובה הכולל היה 25 מיקרוליטר. התערובת עורבבה בעדינות, בצנטריפוגה קצרה, ותוכנית הפיצול הופעלה על המחזור התרמי. מיד לאחר סיום הבנייה, הצינורות צונטריפוגים לזמן קצר והונחו על קרח. התוצאה הצפויה הייתה גודל ממוצע של קטע DNA של 200–300 bp.

קישור מתאם

לכל מוצר פרגמנטציה נוסף 2.5 מיקרוליטר של מתאם ריצוף, ואחריו 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ליגציה (ללא מערבולת). התערובת עברה פיפט עדין להבטחת הומוגניות, צנטריפוגה לזמן קצר, ודגרה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם מכסה המחזור התרמי פתוח. לאחר הדגירה, הצינורות עברו צנטריפוגה לזמן קצר והוחזקו על הקרח.

טיהור מבוסס חרוזים

שלושים מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים נוספו לכל דגימה וערבבו היטב באמצעות פיפטינג עד שהושגה השעיה הומוגנית. התערובת דגרה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, והצינורות הונחו על מעמד מגנטי למשך 3 דקות. לאחר שהסופרנטנט נוקה, הוא הוסר בזהירות. הגלולה נשטפה פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 80% אתנול, והאתנול שנותר הוסר לאחר השטיפה הסופית. החרוזים יובשו באוויר על המעמד המגנטי למשך עד 5 דקות. נוספו תשעה מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז, הכדור הושעה מחדש באמצעות פיפטינג ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הפרדה מגנטית למשך 3 דקות, 7.5 מיקרוליטר של סופרנטנט הועברו לצינור PCR חדש מסומן.

הגברת PCR

פריימרים של שעתוק חוץ-גופי (IVT) מדוללים (20 מיקרוליטר של פריימר + 80 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז). לתגובה PCR (נפח כולל 17.5 מיקרוליטר), נוספו 2.5 מיקרוליטר פריימר IVT 1, 2.5 מיקרוליטר של פריימר IVT 2, ו-12.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר הגברה של ספרייה. התערובת נמחקה בעדינות בפיפטה, ובוצעה תוכנית PCR-3.

טיהור לאחר PCR

לכל מוצר PCR נוספו עשרים וחמישה מיקרוליטר של חרוזי מגנטיות. לאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר ובהפרדה מגנטית, החרוזים נשטפו פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 80% אתנול. לאחר ייבוש באוויר עד 5 דקות, נוספו 11 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. עשרה מיקרוליטרים של סופרנטנט הועברו לצינור חדש. נמדדה ריכוז הספרייה; יעד: >25 ng/μL.

איגום והיברידיזציה (דגימות לכל מאגר)

הספריות אוחדו עם שמונה דגימות מטופלים בכל בריכה (93.75 ng לדגימה, סך הכל 750 ng). הנפח הותאם ל-12.5 מיקרוליטר עם מים ללא נוקלאז במידת הצורך. תערובת ההיברידיזציה הועברה לדגירה מוקדמת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תמיסת חסימה, אוליגונוקלאוטידים חוסמים אוניברסליים, גלאי לכידת אקזום, מים ללא נוקלאז ומגביר היברידיזציה נוספו ברצף. תוכנית ההיברידיזציה של 16 שעות הושקה (18:00–10:00).

לכידת מטרות היברידיות על חרוזי סטרפטווידין

חרוזי סטרפטווידין נשטפו שלוש פעמים באמצעות בופר קשירה. לאחר ההיברידיזציה של 16 שעות, התערובת נוספה לחרוזים ודגרה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב עדין כל 5 דקות. השטיפה בוצעה עם בופר לכידת שטיפה 1 בטמפרטורת החדר, ואחריה שלוש שטיפות עם בופר לכידת לכידה 2 מחומם מראש (48°C), כולל דגירה בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה הסופית, הכדור הושתה מחדש ב-23 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.

הכנת DNA חד-גדילי (ssDNA)

נוספו עשרים וארבעה מיקרוליטרים של בופר TE, והתערובת עברה דנטור בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואז הונחה מיד על הקרח. נוספה תערובת ראשית שכללה בופר קשירת סד וליגז DNA מהיר, ותוכנית SS-2 (37 °C, 30 דקות) הופעלה כדי לעיגול את ה-DNA חד-גדילי. נוספו בופר לעיכול ותערובת אנזימי עיכול, ותוכנית SS-3 (37°C, 30 דקות) הופעלה. לאחר מכן נוספו 3.75 מיקרוליטר של בופר עצירת עיכול. נוספו שמונים וחמישה מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים, ואחריהם טיהור חרוזים סטנדרטי. חמישה עשר מיקרוליטרים של סופרנטנט הועברו לצינור חדש; הריכוז הצפוי היה 0.8–2 ng/μL.

הכנת ננו-כדורי DNA (DNB)

מוצרי ssDNA שימשו ליצירת DNB. נוספו בופר ליצירת DNB, בופר TE עם EDTA נמוך, ותערובות אנזימי DNB 1 ו-2. תוכניות DNB-1 ו-DNB-2 הופעלו ברצף. לאחר השלמה, נוספו 20 מיקרוליטר של בופר עצירת תגובה DNB וערבבו בעדינות (5–8x) באמצעות קצות פיפטות רחבות; הריכוז הצפוי היה 8–40 ננוגרם. ה-DNBs המוכנים נטענו על פלטפורמת ריצוף הננו-כדורי DNA לצורך ריצוף בתפוקה גבוהה.

עיבוד נתוני ריצוף וניתוח אותות

קריאות רצף גולמי נבקרו באיכות באמצעות FastQC (v0.11.9) ו-fastp (v0.23.1). סף יחס אות לרעש (SNR) של 20 dB אופטימיזם באמצעות ניתוח עקומת מאפייני הפעלה של מקלט (ROC) מול מערך נתונים מדד של וריאנטים אוטודלקתיים ידועים, תוך איזון בין שיעור גילוי שגוי (FDR) של <1% לרגישות יעד של >95% עבור וריאנטים בתדר נמוך; קריאות שירדו מתחת לסף זה של 20 דציבלים בוטלו. יישור לגנום הייחוס של Genome Consortium Human Build 38 (GRCh38) וקריאת וריאנטים ראשונית בוצעו באמצעות BWA-MEM (v0.7.17) וערכת Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6).

בשלבי עיבוד האותות המבוססים על פיזיקה, רצפי נוקלאוטידים הומרו לאותות נומריים בינאריים (0 מייצג פורין; 1 מייצג פירימידינים). כדי לחשב את ה-DFT, האות הבינארי עובד עם חלון החלקה של N = 512 זוגות בסיסים וחפיפה של 50% (גודל שלב של 256 bp) לשמירה על רזולוציה גנומית מקומית. ה-DFT הוגדר כך:

כדי לסנן ארטיפקטים של ריצוף בתדר גבוה מבלי להחליק יתר על המידה של וריאנטים אמיתיים של נוקלאוטידים בודדים (SNVs), המתבטאים במעברים מקומיים חדים ובתדר גבוה, מסנן דיגיטלי במעבר נמוך כויל באופן תכנותי. תדירות החיתוך המנורמל האופטימלי (fc) נקבעה באופן איטרטיבי על ידי סריקת טווח של 0.05–0.25 מחזורים לבסיס. אלגוריתם האופטימיזציה בחר את fc = 0.15 מחזורים לבסיס, שהוגדרה כנקודת המפנה שבה ספקטרום עוצמת האות שומר על ≥85% מהשונות הכוללת של וריאנטים ידועים של בקרה חיובית אמיתית, תוך ביטול רעש טכני רקע. סינון מבוסס DFT יושם באמצעות סקריפטים מותאמים שנכתבו בפייתון (v3.9), תוך שימוש ספציפי בספריות NumPy (v1.23.0) ו-SciPy (v1.9.1), כדי להפחית רעש בתדר גבוה תוך שמירה על תכונות ספקטרליות הקשורות למוטציה. פרמטרי הסינון כויללו באופן איטרטיבי באופן פרוגרמטי כדי למנוע החלקה יתר של אותות נדירים וריאנטים. זרימת העבודה המשולבת לעיבוד אותות ומידול ביופיזיקלי מסוכמת באיור 2.

מודלים ביופיזיים וסטוכסטיים של איתות אינטרפרונים

כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של וריאנטים מזוהים, דינמיקת מסלולי JAK–STAT דומה באמצעות משוואות דיפרנציאליות רגילות (ODEs) שהוגדרו כך:

סימולציות ODE דטרמיניסטיות בוצעו באמצעות COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) ואומצו באמצעות סקריפטים מותאמים אישית בפייתון באמצעות מודול scipy.integrate.solve_ivp. נקבעו תנאים ראשוניים ביולוגיים ריאליסטיים, ובוצעו ניתוחי רגישות על קבועי קצב הגברה באמצעות SALib (ספריית ניתוח רגישות בפייתון, v1.4.5). קינטיקת איתות IFN-α בתיווך TYK2 שולבה לסימולציה של הגברת STAT2 המונעת על ידי רווח תפקוד.

השפעות סטוכסטיות הוכנסו באמצעות נוסחת לנג'בין:

dX = f(X) dt + g(X)dW

בנוסף, בוצעו סימולציות סטוכסטיות של גילספי תוך שימוש בספריית Python של GillesPy2 (v1.7.0) למידול התפרצויות שעתוק והפעלה הטרוגנית של גנים מונע אינטרפרון (ISG) בהשראת IFN-β. פונקציות עיכוב מבוזרות שמיוצגות על ידי ניסוחי ליבת גמא יושמו בפייתון באמצעות אינטגרציה נומרית לסימולציה של מנגנוני משוב שעתוק מושה. כל צינורות החישוב, כולל סינון אותות ומידול מתמטי, בוצעו בסביבת מחשוב ביצועי גבוה (HPC) מבוססת לינוקס.

איור 2. מסגרת משולבת לעיבוד אותות ומידול ביופיזיקלי של איתות JAK-STAT. 1: שלב עיבוד אותות: מיפוי בינארי של רצפי נוקלאוטידים (פורינים = 0, פירימידינים = 1) ואחריו סינון מבוסס DFT. שימו לב לסף ה-SNR הקריטי ב-20 dB לקריאה מדויקת של וריאנטים. 2: מידול ביופיזיקלי: סימולציה מבוססת ODE של קצבי הגברה כאשר הפרעות קטנות בתנאים התחלתיים מובילות לשינויים בסף באיתות מתמשך. 3: פנוטיפ ביולוגי: מידול של וריאנטים של רווח תפקוד TYK2 במסלול IFN-α, מה שהוביל להגברת ההפעלה של STAT2 ולפנוטיפים של אינטרפרונופתיה שנוצרה. קיצורים: DFT = טרנספורם פורייה בדיד; IFN-α = אינטרפרון אלפא; JAK-STAT = ממיר ומופעל של תעתיק לאות Janus kinase; ODE = משוואה דיפרנציאלית רגילה; SNR = יחס אות לרעש; STAT2 = ממיר אותות ומפעיל השעתוק 2; TYK2 = טירוזין קינאז 2. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2 מסכם את האינטגרציה של עיבוד אותות מבוסס DFT עם רכיבי מודלינג ODE וסטוכסטי המשמשים בזרימת העבודה החישובית החוקרת. פרוטוקול מקיף זה משלב גנטיקה מולקולרית מתקדמת, טכנולוגיות ריצוף בקצב גבוה, אלגוריתמים לעיבוד אותות ומודלים ביופיזיקליים, כדי לתמוך בזיהוי ופרשנות פונקציונלית של וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה בוסקוליטיס אוטודלקתי בילדים.

מסגרת סטטיסטית והתפלגות הסתברות למיפוי אותות

כדי לפורמליזציה של מיפוי דיגיטלי של רצפים גנומיים לפני סינון אותות, הוקמה מסגרת המרה בינארית המבוססת על ביוכימיה של נוקלאוטידים. לכל חלון גנומי מבני נתון באורך N, פורינים {A, G} ממופים לערך דיגיטלי של 0, ופירימידינים {C, T} ממופים ל-1. על פי השערת האפס (H0) של התפלגות גנומית רקע אחידה ובלתי מוטה, המרה בינארית זו פועלת לפי מסגרת ניסוי ברנולי. פונקציית מסת ההסתברות (PMF) של האות הממופה X מוגדרת כך:

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x עבור x ∈ {0,1}

כאשר p = 0.5 מייצג את ההסתברות להיתקל בשארית פירימידין על פני מסלול רקע לא נבחר. בעת הרחבת ההמרה הזו על בסיסים סדרתיים לחישוב צפיפות ספקטרום הספק (PSD) באמצעות ה-DFT, התפלגות רעש הרקע המצטברת מתנהגת כהליכה אקראית, ומתכנסת להתפלגות רעש לבן גאוסי לפי משפט הגבול המרכזי. כתוצאה מכך, ספקטרום ההספק המנורמל של התפלגות אפס זו עוקב אחרי התפלגות חי-בריבוע (χ²) עם 2 דרגות חופש. כדי לשמור על סף מובהקות סטטיסטי קפדני (α = 0.05), סף עוצמת ההספק הקריטית להגדרת זינוק אות וריאנט פתוגני אמיתי חושב אנליטית באמצעות אינטגרציית צפיפות הסתברות הבאה:

סף = - In(a) x a²

כאשר σ² מייצג את השונות התפעולית של רצפת רעש הרקע הגנומי המקומית. כל שיא ספקטרלי שחרג מסף זה (p < 0.05, שווה ערך ל-SNR > 20 dB) קיבל עדיפות לשערי סינון סילקו במורד הזרם, מה שמבטיח שקריאות ווריאנט מונעות נתונים ופחות מושפעות מרעש ריצוף סטוכסטי.

יעילות תפעולית וניתוח עלויות (איור 3)

מבחינת יישום תרגומי וקליני, היעילות התפעולית, זמן הפעולה הקליני (TAT) והיתכנות הכלכלית של הפרוטוקול המשולב הזה הושוו למסלולי אבחון מסורתיים, כגון ריצוף סנגר רציף או פאנלים גנים ממוקדים מוגבלים. בעוד שמסעות אבחון קונבנציונליים לדלקת וסקוליטיס ילדים או אינטרפרונופתיות מסוג I חשודים נמשכים לעיתים 8–12 שבועות עקב בדיקות חד-גנטיות איטרטיביות, זרימת העבודה היעילה — הכוללת WES בקצב גבוה, היברידיזציה אופטימלית של 16 שעות וסינון אות DFT מקבילי על אשכול חישוב ביצועים גבוהים (HPC) — משיגה TAT קליני כולל מדווח של 10–14 ימים מקבלת הדגימה הראשונית ועד לדוח המולקולרי הסופי. יתרה מזאת, בשל ריבוב דגימות יעיל (איסוף שמונה דגימות מטופלים לכל בלוק היברידיזציה), עלות התגובה והריצוף מדווחת בכ-250–300 דולר למטופל, בהשוואה לפאנלים מקיפים מסורתיים שלעיתים עולים על 1,200–1,800 דולר. דחיסה זו של מסגרות לוח הזמנים האבחנתיות והעלות מרמזת כי תהליך העבודה המוצע של ביואינפורמטיקה בהשראת פיזיקה עשוי להיות ישים וניתן להרחבה עבור מעבדות גנטיקה קלינית שגרתיות.

תוצאות

בקבוצה זו, שכללה 132 מטופלים עם וריאנטים הקשורים לאינטרפרונפתיה, זוהה מגוון רחב של וריאנטים גנטיים (טבלה 1). מתוך המטופלים, 53 (40.2%) היו נשים, ו-79 (59.8%) היו גברים. הגיל הממוצע היה 10.2 שנים (טווח: 0–18 שנים). הנתונים ברמת המטופל התואמים לקבוצה הסופית מסופקים בטבלה משלימה S1.

טבלה 1: התפלגות וסיווג של וריאנטים גנטיים מסוג I הקשורים לאינטרפרונופתיה שזוהו בתוך קבוצת האוטודלקת הילדים (n = 132). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו

הגנים שנפגעו הכי הרבה היו ADAR (25 מטופלים, 18.94%) ו-DNASE1 (24 מטופלים, 18.18%). וריאנטים של DNASE1 היו בלעדיים מחלקה 3 (100% בתוך הגן; 18.18% מכלל הקבוצה). באופן דומה, רוב הווריאנטים של ADAR היו מחלקה 3 (24 מטופלים, 96.00%; 18.18% מהקבוצה), עם וריאנט אחד בלבד מסוג 2 (4.00% בתוך הגן; 0.76% מהקבוצה) (טבלה 2).

טבלה 2: וריאנטים שזוהו בפאנל המחלה הנדירה NGS. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו

וריאנטים ב-STING1 (20 מטופלים, 15.15%) ו-RNASEH2B (14 מטופלים, 10.61%) היו גם הם נפוצים. כל גרסאות STING1 היו מדרגה 3 (100%). במהלך RNASEH2B, 10 מטופלים (71.43%) היו עם וריאנטים מחלקה 3 (7.58% מהקבוצה), בעוד 4 מטופלים (28.57%) היו עם וריאנטים מחלקה 2 (3.03% מהקבוצה).

RNASEH2A מוטציות זוהו ב-13 מטופלים (9.85%), כולם נשאו וריאנטים מחלקה 3 (100%). מוטציות TREX1 הופיעו ב-10 מטופלים (7.58%), כולל 8 וריאנטים מחלקה 3 (80.00%; 6.06% מהקבוצה) ו-2 וריאנטים מחלקה 2 (20.00%; 1.52% מהקבוצה).

זוהו וריאנטים של SAMHD1 ב-9 מטופלים (6.82%), כאשר 7 מטופלים נשאו וריאנטים מחלקה 3 (77.78%; 5.30% מהקבוצה), 1 מטופל שנשא וריאנט מחלקה 1 (11.11%; 0.76%), ומטופל אחד נשא וריאנט מחלקה 2 (11.11%; 0.76%).

RNASEH2C מוטציות נמצאו ב-8 מטופלים (6.06%), כולם בדרגה 3. זוהו מוטציות DNASE1L3 ב-6 מטופלים (4.55%), כולל 5 וריאנטים מחלקה 3 (83.33%; 3.79% מהקבוצה) ו-1 וריאנט מחלקה 2 (16.67%; 0.76%). מוטציות PSMB8 ו-COPA זוהו כל אחת ב-5 מטופלים (3.79%), כאשר כל הווריאנטים היו מחלקה 3 (100%). מוטציות DNASE2 ו-STAT4 היו נוכחות כל אחת ב-3 מטופלים (2.27%), כאשר כל הווריאנטים סווגו כמחלקה 3.

בסך הכול, וריאנטים מסוג 3 היוו את מחלקת הווריאנטים הדומיננטית כמעט בכל הגנים בקבוצה. אתרי הווריאנטים הספציפיים, כולל החלפות מפורטות בנוקלאוטידים ושינויים תואמים בחומצות האמינו בין הגנים הממוקדים, מתוארים בטבלה 3.

ניתוח חקרני של ביצועי עיבוד אותות

כדי לבחון את החוסן והרגישות של צינור עיבוד האותות המבוסס DFT, נערך מדד השוואתי מול זרימת העבודה הסטנדרטית לקריאת וריאנטים ב-GATK, תוך התמקדות במיוחד באזורים גנומיים בעלי כיסוי נמוך (עומק < 30x). במבחן הביצועים הראשוני, פריסת הסינון המשולב של DFT הראתה מגמה פוטנציאלית לשיפור בתעדוף באזורים נבחרים עם כיסוי נמוך, מה שמרמז על הערכת התאוששות חקרנית של עד 96.8% בתנאי בקרה מעבדתיים ספציפיים אלה. חשוב לציין שפרמטרים אלו ומדדי היעילות המספרית מייצגים ממצאים ראשוניים וחקירתיים שמכוילים בהקשר המוסדי הספציפי, ולא בצינור קליני מאומת באופן אוניברסלי. הצינור גם שיחזר וריאנטים חיוביים אמיתיים שהושלכו בעבר באזורים עם רעש גבוה. יתרה מזאת, ה-FDR הופחת מ-6.4% ל-1.2%, מה שמדגיש את העמידות הפוטנציאלית של מסנן המעבר הנמוך בהסרת ארטיפקטים של ריצוף בתדרים גבוהים. מבין הווריאנטים החדשים שזוהו בקבוצה, 14 וריאנטים (המהווים 17.7% מהממצאים החדשים), בעיקר באזורים עם כיסוי לא אחיד ב-STING1 ו-TREX1, סווגו בתחילה כארטיפקטים באיכות נמוכה על פי ספי אלגוריתם סטנדרטיים אך הוחזרו ואומתו בהצלחה באמצעות ריצוף סנגר בהתאם לפרוטוקול שיפור אות לרעש. תצפית אנליטית זו מצביעה על כך שהערכת מאפייני אותות פיזיים עשויה להיות כלי מועיל בתהליכי מחקר חקרניים.

השוואה לעומת תהליכי עבודה סטנדרטיים

כדי להעריך את הביצועים ההשוואתיים של מסגרת משולבת זו, בוצע ניתוח בנצ'מרקינג צמוד מול שני צינורות קריאה סטנדרטיים בגרסאות: זרימת העבודה של GATK Best Practices (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) ו-DeepVariant (גרסה 1.5). מדדי הביצועים חושבו באמצעות תת-קבוצה של קוהורטה עם אימות ביטחון גבוה, שהוערכה באזורים גנומיים עם כיסוי נמוך (עומק < 30x) ואזורים גנומיים בעלי רעש גבוה. הארכיטקטורה ההשוואתית מסוכמת בטבלה 4.

פרמטריזציה כמותית ואימות של מודלים חישוביים

כדי לבסס את המסגרות הביופיזיות והסטוכסטיות במונחים כמותיים, ה-ODE וסימולציות גילספי עברו פרמטריות באמצעות ערכים קינטיים אמפיריים שמכוילים מול תנאי בקרה ניסיוניים. סימולציות ODE רציפות עוקבות אחרי הריכוז המוחלט של STAT2 המזרחן ([STAT2p]) לאורך מסלול של 720 דקות לאחר חשיפה מדומה לאינטרפרון מסוג I. במודל החישובי מסוג פראי (WT), מפל האיתות הדגים החלשה הומאוסטטית מהירה, המאופיינת בשיא הפעלה ב-t = 45 דקות ואחריו ניקוי מהיר המונע על ידי משוב שלילי מתוכנת (k3 = 0.45 דקות-1) באמצעות ביטוי SOCS1 מדומה. לעומת זאת, מידול שינויים בשיפור תפקוד (GoF) במסלולי STING1 ו-TYK2 חשף שינויים חמורים בסף, שהובילו למצב דלקתי יתר מתמשך ובלתי מחליש. מחצית חיי האות (t1/2) ושינויים בקיפול במצב יציב מסוכמים בטבלה 5.

הצהרת זמינות נתונים

הנתונים הקליניים https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level המתאימים לקבוצה הסופית מסופקים בטבלה המשלימים S1. ספי עיבוד אותות דיגיטליים בדידים, ניסוחים מתמטיים, הגדרות סביבת תוכנה ופרמטרים חישוביים הנדרשים לשכפול סינון DFT וסימולציות מסלולים ביופיזיקליים (ODE ומודלים סטוכסטיים) הפכו לזמינים לציבור. כדי להבטיח גישה קבועה וללא הפרעה לקוראים, מסגרת השכפול הזו הופקדה ב-GitHub ונשמרה באופן קבוע ב-Zenodo דרך DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. ספריות תוכנה בקוד פתוח סטנדרטיות ופלטפורמות מחשוב נומריות המשמשות בזרימת עבודה זו, כגון NumPy, SciPy ו-COPASI, נגישות לציבור.

איור 3. סטוריבורד תפעולי וארכיטקטורת צינור מונחית נתונים לזיהוי ומידול ביופיזי של וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה מסוג I. הסכימה מתארת תהליך ניסויי וחישובי כרונולוגי בן ארבע שכבות, המשלב ניתוח קוהורט קליני עם עיבוד אותות ביולוגי. (א) סטרטיפיקציה של קוהורטים וצינור NGS: תהליך עבודה עבור קבוצת הילדים האוטודלקתית (n = 132) העוברת WES. החלק מציג מסלולי דירוג גולמיים של FastQ לבקרת איכות של FastQ, המעבר לקריאת וריאנטים של GATK/DeepVariant וליצירת מטריצת VCF סופית. (B) עיבוד אותות מבוסס DFT: תרגום אלגוריתמי של טקסט גנומי לאותות גנומיים נומריים להפחתת רעש. הגרף המוטמע מונחה נתונים מציג התפלגות ספקטרום הספק, ומזהה תדירויות שונות פתוגניות (קפיצות אות) מול רעש רקע גנומי עם סף SNR של >20 dB. (ג) בשער סילקו לשימור: משפך עדיפות רב-שכבתי הכולל הנחיות פתוגניות ACMG 5-שכבות, HGMD ובדיקות Infevers כדי לתעדף את 79 הווריאנטים החדשים ו-13 המדווחים. (D) אימות מודלים ביופיזיקליים פונקציונליים: שכבת אימות ביולוגית. מסגרת ה-ODE הדטרמיניסטית ועקומות הסימולציה הסטוכסטיות של גילספי משולבות כרכיבים גרפיים, המציגים את תהליך ההתאוששות של 720 דקות ואת האיתות המתמשך של קינטיקה תאית מסוג פרא לעומת קינטיקה תאית מוטנטית מדומה. קיצורים: ACMG = הקולג' האמריקאי לגנטיקה וגנומיקה; DFT = טרנספורם פורייה בדיד; GATK = ערכת כלים לניתוח גנום; HGMD = מאגר מוטציות גנטיות אנושי; NGS = רצף דור הבא; ODE = משוואה דיפרנציאלית רגילה; SNR = יחס אות לרעש; VCF = פורמט קריאה משתנה; WES = רצף אקסום שלם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 3: ביקורת מקיפה על מאגר נתונים של וריאנטים גנטיים מסוג I הקשורים לאינטרפרונופתיה בתוך קבוצת הילדים (n = 132). קריטריוני ACMG (מההנחיות של ACMG/AMP לשנת 2015): קודי הראיות של ACMG/AMP קובצו לפי עוצמת הראיות. ראיות חזקות כללו PVS1, המתייחס לווריאנטים צפויים של אובדן תפקוד בגנים שבהם אובדן תפקוד הוא מנגנון מחלה מבוסס. ראיות חזקות כללו את PS1–PS4, שכללו שינויים בחומצות האמינו שהוכחו בעבר, הופעות מאומתות מחדש, ראיות תפקודיות תומכות, ותדירות וריאנטים מוגברת בקרב נפגעים. עדויות בינוניות כללו PM1–PM6, כולל מיקום בתחום קריטי או מוקד חם מוטציוני, היעדר או תדירות נמוכה מאוד במאגרי אוכלוסייה, הופעות טרנס בהפרעות רצסיביות, שינויים באורך החלבון, שינויים חדשים בחוסר תחושה בשאריות עם שונות פתוגנית ידועה, והנחה של התרחשות דה נובו. הראיות התומכות כללו PP1–PP5, כולל קוגזרגציה, מגבלת חוסר תחושה ספציפית לגן, ראיות בסיליקו , ספציפיות פנוטיפית, ודיווחים קודמים אמינים על פתוגניות כאשר לא היו ראיות עצמאיות. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו

טבלה 4: השוואת ביצועים זו לצד של צינורות קריאת וריאנטים באזורים גנומיים בעלי רעש גבוה. הערכת בנצ'מרקינג בוצעה באזורים עם כיסוי נמוך (<30x) כדי להעריך את ביצועי מסנן DFT הנמוך המבוסס פיזיקה בהסרת רעשי רצף והגנה על אותות חיוביים אמיתיים בהשוואה לתצורות אלגוריתמיות סטנדרטיות. קיצורים: DFT = טרנספורם פורייה בדיד. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו

טבלה 5: פרמטרים קינטיים כמותיים ושינויים במצב יציב של איתות JAK-STAT במורד הזרם. סיכום של גבולות סימולציה של גילספי ODE וסטוכסטית לאורך מסלול של 720 דקות, המדגיש את כישלון ההחלשה ההומאוסטטית התאית במודלים הנושאים וריאציות פתוגניות של STING1 ו-TYK2. קיצורים: JAK-STAT = מתמר וגורם מפעיל שעתוק לאות Janus kinase; ODE = משוואה דיפרנציאלית רגילה; STING1 = מגרה של תגובה אינטרפרונית cGAMP אינטראקטור 1; TYK2 = טירוזין קינאז 2. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו

טבלה משלימה S1. מערך נתונים ברמת המטופל עבור קבוצת ילדים עם וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה. הטבלה מספקת את הנתונים ברמת המטופל התואמים לקבוצה הסופית של 132 מטופלים שנותחה בכתב היד. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים פיצול DNA, קשירת מתאם, הגברת PCR ומעגליות DNA חד-גדילי (ssDNA). בשלבים אלו, ביצוע קפדני הוא חיוני לצמצום סיכון הזיהום. שטיפות אתנול מדויקות וזמני דגירה מגנטיים מתאימים במהלך טיהור מבוסס חרוזים הם חובה, שכן סטיות עלולות להוביל להפחתת תפוקת המוצר או לפספוס זיהוי וריאנטים. במהלך הכנת הספרייה המשולבת, נדרשים חישוב מדויק של 93.75 ng למטופל והתאמת נפח קפדנית.

לאופטימיזציה של פרוטוקול ולפתרון תקלות, מדידות כימות פלואורומטריות נמוכות, במיוחד ריכוזי ssDNA מתחת לסף 0.8–2 ng/μL, עשויות לדרוש הגדלת עומק הריצוף או קיצור זמני ייבוש החרוזים כדי לשפר את רגישות קריאות הווריאנט. במקרים של וריאנטים חשודים לפסיפס, שילוב של טכנולוגיות ריצוף לקריאה ארוכה עשוי לשפר את דיוק הזיהוי. בנוסף, העברה מהירה של דגימות לקרח לאחר עיכול אנזימטי היא קריטית לשמירה על יציבות המוצר^12,13. במהלך הכנת DNB, פיפטינג איטי ועדיין, יחד עם תוספת זהירה של בופר עצירה, שומר על שלמות ננו-כדור. זה חשוב במיוחד לקביעת קורלציות גנוטיפ-פנוטיפ באינטרפרונופתיות מוקדמות, כגון SAVI ^6,11.

ניתוח גנטי מבוסס WES זה מספק מסגרת להערכת וריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה אצל ילדים עם תכונות אוטודלקתיות ווסקוליטיס. על ידי זיהוי וריאנטים בגנים מרכזיים כגון DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 ו-COPA, המחקר מדגיש את ההטרוגניות הגנטית שמאחורי הפנוטיפים הוסקוליטיים המונעים על ידי אינטרפרון. השכיחות של וריאנטים במטבוליזם של חומצות גרעין ובגנים החישה, במיוחד DNASE1 ו-ADAR, בקבוצה זו תואמת את התפקיד המרכזי של איתות אינטרפרון מסוג I הלא מרוסן בפתוגנזה של וסקוליטיס ילדים ומחלות אוטודלקתיות. ממצאים אלו תואמים לדיווחים קודמים שקישרו גנים אלו לאינטרפרונופתיות ולתופעות וסקוליטיות ^4,5,7.

על ידי הבהרת הופעות דמויות וסקוליטיס של תסמונות אוטודלקתיות מונוגניות, כגון מעורבות ריאה עורית ואינטרסטיציאלית שנצפתה ב-SAVI, גישה זו עשויה להקל על אבחון מוקדם ולסייע בהנחיית טיפולים ממוקדים נגד אינטרפרון ^4,5,7. אינטרפרופתיות מונוגניות יכולות לחקות קלינית וסקוליטיס הקשור ל-ANCA ווסקוליטידים אחרים בילדות, מה שמדגיש את חשיבות הבדיקות הגנטיות במקרים לא טיפוסיים או עמידים לטיפול ^9,10,11. אבחון גנטי מוקדם עשוי גם לאפשר התחלה מהירה של טיפולים ממוקדים כגון מעכבי JAK, שהראו תועלת קלינית אצל מטופלים עם STING1 ומוטציות נוספות הקשורות לאינטרפרון ^7,13,14.

מחקר זה גם מחזק שחלק משמעותי מהמטופלים הילדים עם וסקוליטיס אוטודלקתי מורכב נושאים וריאנטים נדירים או חדשים בגנים הקשורים לאינטרפרונפתיה. זיהוי 79 וריאנטים חדשים בקבוצה הגדולה הזו מרחיב את הספקטרום הגנטי הידוע ועשוי לתרום לקורלציות טובות יותר בין גנוטיפ לפנוטיפ בוסקוליטיס בילדים.

שיקול תפעולי בתהליך החקר הזה כולל הערכת גבולות סף, שכן סטיות בפרמטרי SNR החקרניים עשויות לשנות את פלט הסינון. לדוגמה, סינון מבוסס DFT של התפלגויות נוקלאוטידים מסייע בקריאות דה-רעש אך דורש כיול כדי למנוע החלקה יתר של אותות מוטציה; פתרון תקלות כולל התאמה איטרטיבית של פרמטרי המיפוי הבינארי (0 עבור פורינים, 1 עבור פירימידינים) כדי לייעל את חילוץ התכונות¹⁵. במודלים ביופיזיקליים, הגדרת תנאי התחלה ל-ODE היא חיונית, שכן הפרעות קטנות בקצב ההגברה עלולות לשנות את התנהגויות הסף, ואף להעריך פחות מדי את איתות האינטרפרונים המתמשך. פרטים משופרים של JAK-STAT כוללים מידול של תפקיד TYK2 באיתות IFN-α, שבו וריאנטים של רווח תפקוד מגבירים את הפעלת STAT2, מה שמוביל לפנוטיפים של אינטרפרונופתיה²⁰.

שינויים בשיטה עשויים לכלול אינטגרציה של אלמנטים סטוכסטיים לסביבות תאיות רועשות, כגון הוספת מונחי רעש לנגווין ל-ODEs:

dX = f(X)dt + g(X)dW

כאשר dW המונח המוזכר מייצג רעש תהליך וינר, ומגביר את הריאליזם בסימולציה של שונות JAK-STAT²¹. סימולציות סטוכסטיות של מסלולי אינטרפרון, באמצעות אלגוריתמים של גילספי, תופסות הטרוגניות בביטוי IFN-β עקב לולאות משוב שליליות, שבהן הבדלים בין תא ברמות פקטורי השעתוק גורמים להתפלגויות בימודליות של הפעלת ISG^22,23. פתרון תקלות במודלים של מסלולים כולל אימות מול נתוני IFN-β ניסיוניים; אם ההגברה מתפצלת, ניתן לכייל מחדש בקרות שליליות כמו קצב הפעלה של פוספטאז, או לשלב עיכובים מבוזרים לשעתוק:

עם גרעין גמא לתהליכים מושהים.

בהשוואה לריצוף גנום מלא (WGS), גישה ממוקדת WES זו עשויה להיות חסכונית אך פחות מקיפה באזורים לא אקסוניים^24,25. היקף המסגרת הראשונית הזו מוגבל לספק מודל סימולציה ביוכימי תומך להערכת התייחסות לשינויים מתמטיים עם התנהגות איתות אינטרפרונים משוערת, כפי שנראה במודלים סף שבהם השפעות מצטברות חורגות מערכים קריטיים המובילים לפגיעה וסקולרית. מגבלות השיטה כוללות את האפשרות להתעלם מווריאציות פסיפס ברמה נמוכה והצורך באימות פונקציונלי של ממצאים^חדשים.

לטכניקה זו יש יישומים פוטנציאליים באימונולוגיה וברפואה וסקולרית, כולל הנחיית טיפולים אנטי-אינטרפרונים על ידי סימולציה של השפעות וריאנטים על מסלולים והעשרת מאגרי מידע לאבחון מחלות נדירות¹⁹. הרחבות סטוכסטיות עשויות לאפשר חיזוי תגובות הטרוגניות באינטרפרונופתיות, ולסייע ברפואה מותאמת אישית.

במחקר זה, מודגש הערכה גנטית בדלקת כלי דם בילדים לצד כלים אבחנתיים קונבנציונליים כגון היסטופתולוגיה ושיטות דימות. בסך הכול, מחקר זה מדגיש את חשיבות ההערכה הגנטית בדלקת כלי דם בילדים, תוך הדגשת תדירות הווריאנטים הקשורים לאינטרפרונופתיה שזוהו בקרב מטופלים שעוברים ניתוח גנטי למחלות אוטודלקתיות חשודו. על ידי הערכת השפעת וריאנטים אלו על מסלולי איתות האינטרפרונים והדגשת חשיבות האבחון המוקדם בדלקת כלי דם בילדים, עבודה זו תורמת להעשרת מאגרי מידע של מחלות נדירות הקשורים להפרעות כלי דם ודלקתיות ואוטודלקתיות ומספקת תובנות למחקרים עתידיים החוקרים פתוגניות וריאנטים ופולימורפיזמים ספציפיים לאוכלוסייה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Pipettes מתכווננות (P2, P10, P20, P200, P1000)	כל ספק		לטיפול מדויק בנוזלים
צנטריפוגה שולחנית	כל ספק		לצנטריפוגה קצרה של צינורות PCR
תערובת ספריית Equinox Amp	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (או מקבילה)	תערובת אדונית לגיבוש PCR
אתנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית)	כל ספק		משמש להכנת תמיסת שטיפה 80% אתנול
IVT פריימר 1 & IVT פריימר 2	MGI Tech	כלול בערכה או נפרד	פריימרים להגברת ספריה
צינורות PCR נטולי קשירה (0.2 מ"ל)	כל ספק		צינורות PCR סטריליים
מעמד מגנטי / מתקן מגנטי	כל ספק		להפרדת חרוזים מגנטיים
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	רצף שולחן עבודה דור הבא המשתמש בטכנולוגיית DNBSEQ (רצף DNA Nanoball); תומך באורכי קריאה מרובים (למשל, SE50 עד PE300); תפוקה גבוהה של עד 1440 ג'יגה-בתים בריצה; אידיאלי ליישומי WES, WGS ורצף ממוקד.
ערכת MGIEasy Circularization	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (ברקוד כפול, 16 RXN) או 1000005260 (V2.0)	ערכת סיבוב לייצור DNA מעגלי חד-גדילי (ssCirDNA); גרסת ברקוד כפול מפחיתה את קפיצת האינדקס; שלב חיוני לאחר הכנת הספריה ליצירת DNB בזרימת הרצף של MGI.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	חרוזים מגנטיים לטיהור DNA
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (משולב עם סיבוב ברקוד כפול) או DNB Make קשור (למשל, 940-000036-00 Onestep DNB)	מודול הכנת DNA Nanoball (DNB); כולל סיבוב ויצירת ננו-כדורים לטעינת תא זרימה; השלב הסופי בעיבוד הספריה עבור רצפי DNBSEQ (לעיתים קרובות משולב עם ערכת הסיבוב).
ערכת אביזרים לכידת אקסום MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (או מקבילה)	מכיל פתרון חוסם, חוסמי אוניברסל MGI, מחזק, מאגר קישור, מאגר שטיפה 1 & 2, וחרוזי סטרפטאבידין
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (או Twist CES Probes, תואמים ל-MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (ל-MGIEasy) או Twist Bioscience (ל-Twist)	1000007745 (ערכת חלקיקים V4, 16 RXN) או 1000007740 (חלקיקים); Twist: מותאם אישית / ספציפי ללוח (מבוסס הזמנה, ללא מספר סטנדרטי)	חלקיקים לכידת אקסום שלם מבוססי הכלאה; מכוונים לכ-59 מגה-בתים של אזורי קידוד (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); מיועדים להעשרה בעלת יעילות גבוהה בזרימות WES בפלטפורמות DNBSEQ; משמשים עם ערכת האביזרים MGIEasy להכלאה (טרום-דגירה 65°C, 16 שעות בלילה ב-65°C), הוספת חוסם, לכידת חרוזי סטרפטאבידין (מאגר קישור, מאגר שטיפה 1/2 ב-48°C), שחרור והגברת PCR לאחר הכלאה (תואם לערכת Equinox).
ערכת Hybridization ו-Wash מהירה של MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	חומרי רגנטים להכלאה ושטיפה
ערכת הכנת ספריה FS DNA של MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (סט 16 RXN) או 1000005256 (ערכת ליבה 96 RXN)	ערכת הכנת ספריה DNA מבוססת פיצול מהיר; פיצול אנזימטי עם 5–400 נג gDNA קלט; תואמת לפלטפורמות DNBSEQ לבניית ספריות WGS/WES יעילה.
מים ללא נקלאז	כל ספק		דרגת ביולוגיה מולקולרית
ערכת Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q32851	להגברת ספריה
ערכת Qubit ssDNA (אופציונלית)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	להגברת ssDNA לאחר סיבוב
חרוזי סטרפטאבידין מגנטיים	MGI Tech	כלול בערכת האביזרים	להכלאה היברידית
מאגר TE (pH 8.0)	כל ספק		לצעד הדנטורציה
תרמו ציקלר	שונים (Bio-Rad, Thermo וכו')		משמש לפיצול, ליגציה, PCR ותכניות DNB
מיקסר Vortex	כל ספק		לערבוב ד