הערכה בזמן אמת, לא פולשני, של תפקוד מיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית רמאן תהודה

סיכום

אנו מציגים שיטה לא פולשנית בזמן אמת למעקב אחר בריאות המיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן תהודה (RRS). השתמשנו ב-RRS לכימות מצבי רדוקושן במיטוכונדריה ופיתחנו מדד לבריאות המיטוכונדריה, יחס המיטוכונדריה המופחת של רזוננס ראמן (3RMR), שמראה תגובה מהירה יותר לשינויים בחמצון מאשר אנליטים מסורתיים של גזי דם.

תקציר

למרות שהמיטוכונדריה היא מרכזית לפתוגנזה ולהתקדמות המחלה, תובנה מכנית לגבי דינמיקת בריאות המיטוכונדריה נותרת יקרה ובלתי נגישה. כדי להתמודד עם הפער הזה, מחקר זה משתמש בספקטרוסקופיית רזוננס ראמן (RRS) להערכת תפקוד המיטוכונדריה, באמצעות מערכת ניידת המספקת מדידות בזמן אמת, לא פולשניות וכמותיות של מצבי רדוקס ציטוכרום בכבד של חולדות. בפרוטוקול זה אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיה זו, כולל הגדרה, איסוף נתונים ועיבוד נתונים. מחקר זה מציג ניסוי הוכחת היתכנות המדגיש את יכולת RRS למדוד שינויים בזמן אמת במצב החמצון האדום המיטוכונדריאלי – ובהרחבה גם את תפקוד המיטוכונדריה. לזמן קצר, מכשיר ה-RRS חובר למשאבת לייזר וכן למחשב איסוף נתונים, והוצב במרחק של ס"מ אחד מכבד העכברוש.  פרמטרי הרכישה נבחרו בהתאם לפרוטוקול כבד העכברוש; מצבי רדוקס נמדדו בתנאים מחומצנים ואיסכמיים באמצעות בדיקת מאמץ חמצן. שינויים במצבי רדוקס מיטוכונדריאלי נעקבו לאורך כל בדיקת מאמץ החמצן.

מבוא

מיטוכונדריה ממלאה תפקיד מרכזי בתפקוד התאים ובהומאוסטזיס. מיטוכונדריה היא המניעים העיקריים למטבוליזם תאי, ומווסת יצירת ATP באמצעות פוספורילציה חמצנית. הם גם משמשים כאברונים איתותיים שמכתיבים את גורל התא על ידי ויסות מסלולי אפופטוטיה, וכן כאותות ROS ו-Ca^{+2 1}. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עלול להוביל^למחלות נוירודגנרטיביות, שריריות וכלי דם ^שונות. למרות התפקיד הקריטי של המיטוכונדריה בהתקדמות המחלה, הערכת תפקוד המיטוכונדריה יכולה להיות פולשנית, יקרה ומוגבלת.

מדדים מרכזיים לתפקוד המיטוכונדריה, כגון קצב צריכת חמצן, פוספורילציה חמצונית ופעילות של קומפלקסים שונים בשרשרת העברת האלקטרונים (ETC), נמדדים באמצעות רספירומטריה. ה-ETC מורכב מארבעה קומפלקסים (I–IV) המשובצים בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה (IMM). קומפלקסים אלו, בעזרת קו-אנזימים אחרים, מעבירים אלקטרונים מסובסטרטים מצומצמים, כגון NADH ו-FADH2, למקבל האלקטרונים הסופי, O₂, שהופך למים. רוב בדיקות הספירומטריה העכשוויות, כמו Seahorse ו-Orobros O2k, דורשות עיבוד רקמות, מה שמגביל את יישמתן למחקר תרגומי ^4,5. מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית (MMP) היא שיטה נוספת להערכת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, המשתמשת בפלואורופורים ליפופיליים קטיוניים, כגון JC-1, יחד עם הדמיה מיקרוסקופית, כאשר הפיצוץ של מיטוכונדריה (בריאה) ובלתי מזווגת (פגועה) עם אורכי גל שונים⁶. עם זאת, בדיקות אלו יכולות להיות בעלות רגישות נמוכה⁵. הצבע עצמו יכול גם להיות בעל ציטוטוקסיות גבוהה בריכוזים גבוהים⁵. לבסוף, בדומה למדידות רספירומטריה, גם טכניקה זו דורשת עיבוד רקמה. טכניקות מבוססות ספקטרוסקופיה שימשו לאחרונה כשיטות לא פולשניות להערכת בריאות המיטוכונדריה. לדוגמה, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית זרחן (P-MRS), שיטה שמעריכה את חילוף החומרים התאים על ידי מדידת ריכוזי מטבוליטים המכילים זרחן, שימשה לאפיון רקמות אדיפוגניות מהונדסות העוברות התמיינות⁷. עם זאת, טכניקה זו דורשת גם ציוד מיוחד והכשרה.

הקבוצה שלנו הדגימה לאחרונה טכניקה בזמן אמת, לא פולשנית ומאוד ספציפית למדידת מצב חמצון רדוקסי מיטוכונדריאלי כסמן לחיותם של איברים באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן תהודה (RRS). RRS משתמש בפיזור לא אלסטי של פוטונים לכימות מצבי רדוקס של ציטוכרומים מיטוכונדריאליים. טבעות פורפירין בקטעי המים של מולקולות כמו ציטוכרומים מיטוכונדריאליים, המוגלובין ומיוגלובין מייצרות ספקטרום ראמן אופייני בהתאם למצב החמצון שלהן כאשר הן מעוררות^{עם לייזר} באורך גל של 441 ננומטר. למרות שמערכת RRS עושה שימוש באורך גל של 441 ננומטר, ניתן להשתמש גם בלייזרים עם אורכי גל של 420 ננומטר ו-405 ננומטר, שכל אחד מהם מחזק באופן מועדף קומפלקס ציטוכרום שונה. הספקטרום המתקבל מדגימה לא ידועה מושווה לספריות מוקלטות מראש של מיטוכונדריה שלמה מחומצנת לחלוטין או מופחתת, ומניבה את היחס בין מיטוכונדריה מצומצמת לכלל או את מצב הרדוקס הממוצע של ציטוכרומים ETC במקום . יחס זה מוגדר כיחס מיטוכונדריה מופחת של רמאן רזוננס (3RMR).

ישנם 3 חישובים/סוגים מובחנים של 3RMR: 3RMR מיטוכונדריאלי (mito-3RMR), 3RMR מרוכב III (cIII-3RMR), ו-3RMR מרוכב IV (cIV-3RMR). כל אחד מהאינדקסים הללו מחושב דרך השבר של המוקטן למספר הכולל של רכיב נתון. לדוגמה, ה-3RMR של cIII יהיה היחס בין cIII מופחת למספר הכולל של cIII ברקמה (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). אותו דפוס חל גם על cIV. לכן, 3RMR-cIII מתייחס ליחס בין cIII מופחת לכמות הכוללת של cIII, ו-3RMR-cIV מתייחס ליחס בין cIV המופחת לכמות הכוללת של cIV. באמצעות ניתוח רגרסיה, או שמצבי רדוקס מיטוכונדריאלי (מיטו-3RMR) מחושבים באמצעות ספריות ספקטרליות של מיטוכונדריה שלמה, או שמצבי רדוקס מורכבים בודדים (cIII-3RMR ו-cIV-3RMR) מחושבים באמצעות ספריות ספקטרליות cIII ו-cIV. פרסום עדכני^{בשם 9} הראה שמיטו-3RMR מייצג את הממוצע המשוקלל של מצבי החמצון האדום cIII ו-cIV (או cIII-3RMR ו-cIV-3RMR). חשוב לציין ש-cI ו-cII אינם פעילים ברמן או מוגברים בתהודה לאורך הגל של 441 ננומטר. כתוצאה מכך, הם אינם מחושבים בעת חישוב ה-mito-3RMR.

בהסתמך על סוגי 3RMR אלו, הגדרנו את טווח האופטימלי של 3RMR. באיברים "בריאים", המיטוכונדריה שלמה ויש לה אספקת חמצן מספקת. לעומת זאת, איברים פגועים עלולים לספק או לנצל חמצן בצורה לא מספקת, מה שגורם להצטברות אלקטרונים בקומפלקסים של ETC. הצטברות אלקטרונים גורמת ל"מאמץ רדוקטיבי," שמעביר את המיטוכונדריה ממצב מחומצן למצב מופחת ומעלה ערכי 3RMR. מספר מחקרים ^8,9,10,11,12 הנעים מלב וכבד במודלים של מכרסמים וחזיר, החלו להאיר את טווח ה"בריא" האופטימלי ל-3RMR, שמוצע להיות בין 10 ל-30. לדוגמה, פרי ואח' חשפו היפוקסיה בלבבות יונקים, כאשר 3RMR של 30% הוכח כמספק את האיזון האופטימלי לרגישות ולספציפיות לזיהוי רקמה היפוקסית⁸. מגמה זו אושרה עוד יותר במחקרים נוספים עם רקמת לב^11,12, ושתלי כבד¹⁰. בנוסף, ניוגן ואח' הראו שערכי 3RMR יורדים לערכים נמוכים מאוד (מחומצנים) ברקמות שבהן המטבוליזם נעצר, עם רמות 3RMR (7.667 ±± 4.926) של כבדים חמים-איסכמיים שאינם ניתנים להשתלה לאחר 3 שעות של פרפוזיה נורתורמית במכונה, לעומת ערכי 3RMR מעל 10 (~12–15) עבור כבדים חמים-איסכמיים טריים^{וניתנים} להשתלה 9.

מעבר להדגמות אלו של האופן שבו 3RMR יכול למדוד את חיוניות הרקמות, הרגישות, הספציפיות והקלות בשימוש ב-RRS הופכים אותו לרלוונטי מאוד לסוגי מחקר רבים אחרים שבהם מטבוליזם תאי ותפקוד מיטוכונדריה מושפעים. במחקרים קודמים, RRS שימש לזיהוי ניוון מקולרי וגלאוקומה בעכברים באמצעות הערכת הפעילות המטבולית של אקסונים לא מיאליניים של תאי גנגליון רשתית בראש עצב הראייה¹³. בנוסף, הוא שימש לזיהוי קוארקטציה של האאורטה (CoA) במודל חולדה של מחלת לב מולדת, אבחנה שלעיתים קרובות מתפספסת בסריקות לב של תינוקות¹². טכנולוגיה זו נוצלה להבנת תפקוד האיברים וחיוניותם בתנאים ניסיוניים שונים הרלוונטיים בתחום השתלת איברים, כולל מחקרים שהעריכו את חיוניות האיברים במכשיר ex vivo ^10,11, מעריכים חמצון מחדש לאחר אחסון קר סטטי¹⁴, או מפחיתים פגיעת רפרפווזיה בכבד חם-איסכמי⁹.

מאמר זה שואף לבסס את RRS ככלי רגיש בזמן אמת להערכת בריאות המיטוכונדריה. כבד שלם ממודל עכברוש עבר רמות שונות של איסכמיה וריפרפוזיה של חמצן כמבחן מאמץ להערכת תגובת המיטוכונדריה. בבדיקת לחץ חמצן זו, כבד טרי עובר 5 דקות של זרימת פרפוזיה ראשונית, 5 דקות של איסכמיה ו-5 דקות של רפרוזיה. 3RMR, וכן מדידות לקטט, K+, לחץ חלקי של חמצן (pO2) נערכו לאורך כל מבחן המאמץ. תגובה מהירה יותר לשינויים בחמצון נצפתה עם 3RMR בהשוואה לאנליטים מסורתיים של גזי דם. בניסויים אלו, השימוש ב-RRS מודגש לא רק למחקרים מכניים, אלא גם כשיטה אבחנתית וכבסיס ניסוי טיפולי. לכן, הפרוטוקול המשותף עשוי להיות שימושי למגוון חוקרים העובדים עם מיטוכונדריה. בסך הכל, RRS, בשל אופיו הלא-פולשני, בזמן אמת וספציפי מאוד, עשוי להשפיע משמעותית על חילוף החומרים התאי.

פרוטוקול

כל בעלי החיים לניסויים תוחזקו בהתאם להנחיות המועצה הלאומית למחקר ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס (בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב).

1. הקמה וניצול RRS

1. תיאור המכשיר:
   הערה: מערכת RRS הניידת (Pendar Technologies; המוצר מיועד למטרות מחקר בלבד) משתמשת בלייזר 441 ננומטר בעקבות שיפור תהודה של ספקטרום הרמן של ציטוכרומים מיטוכונדריאליים עם אורך גל זה. הלייזר פועל בין 4 מיליוואט ל-8 מיליוואט.
   1. חבר מקור גירוי לייזר לגלאי מותאם אישית באמצעות כבל סיב אופטי. הגלאי מאיר נקודה לייזרית בקוטר 2 מ"מ על הרקמה, ואוסף את הספקטרום הנפלט. הספקטרום עובר דרך מסנן מעבר פס ונאסף על ידי מערך התקן עם מטען (CCD). הספקטרום נאסף כל שנייה לאורך מסגרת זמן של 180 שניות וממוצע ליצירת ספקטרום גולמי ומופחת רעש לניתוח.
   2. התוכנה משווה את הספקטרום שהושג לספריות ספקטרליות שנמדדו מראש באמצעות ניתוח רגרסיה.
2. הליך לספריות טרום-הקלטה
   הערה: בניסויים שהוצגו במאמר זה, נוצרו ונעשה שימוש בספריות של צורות מצומצמות ומחומצנות של מיטוכונדריה, קומפלקס III, ומוגלובין IV, המוגלובין ומיוגלובינים. אותות ה-RRS של כל הספריות נלקחו בקופסה שחורה בטמפרטורת החדר (21 מעלות צלזיוס). קבצי הספרייה הללו מסופקים בנפרד עם תוכנת הניתוח. עם זאת, בהתאם לרקמה המעניינת ולנוכחות מולקולות נוספות הפעילות ברמן, ניתן ליצור ספריות נוספות על ידי התאמת הפרוטוקול הבא. ספקטרום RRS גולמי של המוגלובין, המיוגלובין וספריות III/IV מורכבות מחומצנות/מוקטנות מסופקות ב איור משלים 1.
   1. ספריות המוגלובין (איור משלים 1C):
      1. לאסוף דם מכרסמים טרי באמצעות הדמם של בעלי חיים. חמצן את הדם שנאסף באמצעות 100% חמצן, או דה-חמצן באמצעות 100% חנקן, בקובט זכוכית, תוך הוספת נתרן דיתיונאט.
      2. מדדו את ה-RRS של כל מצב דרך קיר הזכוכית של הקובט למשך 10 דקות, כאשר הגשוש ממוקם 9 מ"מ מהקובטה הזכוכיתית.
      3. השתמשו בשיאים ספקטרליים ב-1356 ס"^מ-1 כדי לאמת את המצב הנטול חמצן, והשתמשו בשיאים ב-1376 ס"^מ-1 כדי לאשר את המצב המחומצן.
   2. ספריות מיטוכונדריאליות מוקטנות/מחומצנות (איור 1)
      1. לבודד מיטוכונדריה מלבבות מכרסמים הומוגניים ומטוהרים בתוך קובטה מזכוכית. הניחו את הגשוש רמאן במרחק 9 מ"מ מהקובטה הזכוכיתית ומדדו את הספקטרום של המיטוכונדריה דרך קיר הזכוכית.
      2. ליצור תנאים מחומצנים לחלוטין על ידי מתן זרימת חמצן של 100% למיטוכונדריה. אמת את המצב המחונן דרך היעדר שיא RR מופחת ב-1357 ס"^מ-1.
      3. ליצור תנאים מצומצמים לחלוטין על ידי חשיפת המיטוכונדריה ל-100% חנקן עם כמויות קטנות של מימן גופריתי. אמת את התנאים המופחתים באמצעות היעדר שיא סמן RR מחומצן ב-1371 ס"^מ-1.
   3. קומפלקס מחומצן/מופחת III/IV (איור משלים 1A,B):
      1. בודדו את קומפלקס III ו-IV כפי שמתואר במקומות אחרים ^9,15,16,17. בקצרה, השתמשו בדגימה סטנדרטית של מיטוכונדריה מבודדת (התואמת ל-200 ננומולים של ציטוכרום a) כחומר ההתחלה.
      2. דילל את המיטוכונדריה ל-10 ננומול ציטוכרום A/mL בבופר קר C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8.45). לאחר מכן, הוסיפו 10% w/v n-β-D-dodecyl maltoside (DM) טיפה אחר טיפה לריכוז סופי של 1%, תוך ערבוב עדין על קרח.
      3. צנטריפוגה את התמצית ב-40,000 × גרם למשך 40 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מרח את הסופרנטנט על עמוד זכוכית בקוטר 2.5 ס"מ × 20 ס"מ שנארז בעבר בשרף החלפה מאוזן עם 5 נפחי בופר C (המכיל 0.02% w/v DM).
      4. לאחר שטיפה עם שני נפחי עמודות של בופר C, מבצעים קומפלקסים מיטוכונדריאליים נלוטים על ידי יישום גרדיאנט NaCl ליניארי של 0–400 מ"מ באותו בופר ואוספים את האלוט בשברים של 4 מ"ל.
      5. שברים ירוקים המכילים את קומפלקס IV יצאו קרוב לאמצע הגרדיאנט (~180 מ"ל NaCl), לפני השברים האדמדמים המכילים את קומפלקס III. ריכזו את החלקים המאוגדים המכילים כל קומפלקס ל-20–30 ננומולים ציטוכרום a/mL.
      6. לאחר בידוד הקומפלקסים הבודדים, חשפו כל אחד לתנאים מחמצנים ומפחיתים. הפחתת דגימה של 11 מ"מ של קומפלקס III בבופר טריס באמצעות 2 מ"ל אסקורבט (1 מ') להפחתת ציטוכרום c1 ו-2 מ"ל HS (הידרוסולפיט) להפחתה מלאה של ציטוכרומים b_L ו-b_H.
      7. הפחתת דגימה של 18.67 מ"מ של קומפלקס IV בבופר טריס במספר שלבים, שכן קומפלקס IV עובר תהליך חמצון קטליטי רב-שלבי. כדי להפחית את קומפלקס IV במלואו, יש להוסיף שני 2 מ"ל H₂O₂ (10 מ"מ), ואחריהם 2 מ"ל HS.
      8. אסוף ספקטרום ספרייה אחרי כל תוספת כדי ללכוד כל שלב במחזור. הוסיפו ספקטרום מחומצן ומצומצם לחלוטין לספריית הייחוס הסופית כדי לייצג את המצבים היציבים של קומפלקס IV.
      9. הכינו את כל הדגימות בבקבוקון זכוכית בנפח 1 מ"ל והחזקו אותן במיקום קבוע במרחק 9 מ"מ מעדשת הגשש, והכניסו אותן לקופסה שחורה כדי למנוע זיהום אור. אסוף ספקטרום RRS למשך 600 שניות לכל קומפלקס ומצב חמצון.
      10. אימות טוהר ה-cIII וה-cIV המבודדים כפי שתואר קודם¹⁷, ואמת את הספקטרום המבודד של cIII ו-cIV בהסבר הספקטרום המיטוכונדריאלי המלא כפי שתואר^{במאמר 9}.
   4. ספריות מיוגלובינים (איור משלים 1D):
      1. באמצעות זרימות דומות של חמצן וחנקן (עם נתרן דיתיוניט מומס), ניתן לשנות את רוויית האוקסימיוגלובין של תמצית המיוגלובין של שריר הלב בין 0% ל-100%. אמת את ספקטרום רמאן דרך שיאי הסמן ב-1355 ס"^מ-1 ו-1376 ס"^מ-1.

הערה: רוב הרכיבים הספקטרליים שתוארו לעיל, כמו המוגלובין או מיטוכונדריה מחומצנת/מופחתת, הם מולקולות המכילות ההם ומונעות על ידי אותו אורך גל. מערכת RRS זו מונעת חפיפת אותות על ידי יצירת ספריית רגרסיה לכל מולקולה המבוססת על האות הספקטרלי הייחודי שלה. הספקטרום המפוזר שמתקבל מועבר דרך אלגוריתם רגרסיה מול הספריות הנבחרות. אלגוריתם הרגרסיה נותן גורם לכל ספקטרום ספרייה שמייצג את ההערכה הטובה ביותר של תרומתו היחסית לספקטרום המתועמד, ולכן את הריכוז היחסי שלו ברקמה. מכיוון שהאלגוריתם משתמש בהתאמה הטובה ביותר בטווח של מספרי גלים, הבדלים קטנים במיקום או בעוצמת השיאים הספקטרליים של רכיבי הספרייה השונים מאפשרים לרגרסיה להבחין גם בכרומופורים קרובים זה לזה. באמצעות אלגוריתם הרגרסיה וספריות ספקטרליות, מערכת RRS יכולה לפרק את האות הכולל המפוזר לרכיבים שונים בהתאם לשיאים הספקטרליים הייחודיים שלהם, ולמנוע חפיפת אות ממולקולות המכילות הם. כדי להראות את הקשר בין המוגלובין למיטוכונדריה, מצורף איור משלים 2 , המספק תמונות של ספקטרום שנלקחו מפרפוזיה בכבד, מחוברים לאות הנמדד, קו ההתאמה הטובה ביותר, והשאריות הבלתי מוסברות הנובעות מהבדלים בשיאים הספקטרליים הבודדים. בפאנל A נבחרות ספריות רגרסיה של המוגלובין מופחת ומחומצן ושל מיטוכונדריה מופחתת ומחומצנת. קו ההתאמה הטובה ביותר שנבחר דרך הספריות וניתוח הרגרסיה חופף בצורה מסודרת לאות הנמדד, וכמעט ואין שאריות בלתי מוסברות. בפאנל B, נבחרות רק ספריות מיטוכונדריה מחומצנות ומוקטנות. מכיוון שיש מבנה שאריתי גדול ובלתי מוסבר, שיא הספקטרום של המיטוכונדריה מוזז במספר מספרי גל מזה של ההמוגלובין, שלא נכלל בניתוח הרגרסיה. יתרה מזאת, באיורים המשלימים של נגויין ^{ואח' 9}, המחברים מסבירים את הקשר בין מיטוכונדריה לבין הקומפלקסים הבודדים (cIII ו-cIV), וכן את הקשר בין קומפלקסים¹⁶ בודדים, שבהם קומפלקס III מציג שיאים חדים בתדר נמוך, בעוד שקומפלקס IV מציג פסים רחבים ומוזרים כלפי מעלה. יתרה מזאת, המחברים מראים כי ספריות Complex III ו-Complex IV המופחתת מסבירות במלואן את הספקטרום הנמדד של מיטוכונדריה שלמה מופחתת, מה שמוביל לשאריות מינימליות בלתי מוסברות.

איור 1: ספריות ספקטרליות של מיטוכונדריה מחומצנת ומצומצמת לחלוטין. ספקטרום ספריית RRS הושגו לאחר שהמיטוכונדריה המבודדת סופקה (A) 100% חמצן, או 100% חנקן (B) כדי להגיע למצבים מחומצנים ומופחתים, בהתאמה. מצבים אלו אושרו בנוכחות שיאי סימנים מחומצנים ומצומצמים (D) RR (C). ההזזה בפסגות אלו תואמת לשינויים במצבי רטט מולקולריים בנוכחות חמצן. עוצמת כל שיא מנורמלת ליחידת עוצמה שרירותית אחת (AU), שכן ההגברה של המצב המופחת גדולה יותר באמצעות אורך גל העירור של 441 ננומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. איסוף נתונים באמצעות RRS

1. הגדרת המכשיר:
   1. חבר את יחידת הספקטרומטר (הממוקמת בתוך קופסה קומפקטית) לספק הזרם הישר (DC) ולמתאם הכוח באמצעות הכבלים המסופקים. ליחידת הספקטרומטר יש פקק עגול אחד עם שקעי יישור.
   2. יישר את השקעים של השקע העגול עם אלו של הכבל שמחובר למתאם הכוח. אין צורך בניקוי לפני חיבור היציאה (איור 2).
   3. חבר את המחשב שמבצע את הניתוח לאותו מתאם כוח שמחבר את הספקטרומטר לספק הכוח באמצעות הכבלים שסופקו.
   4. הנח את גלאי הלייזר במחזיק הגשוש. כוון את מיקום הגשוש בתחילת הניסוי.
   5. פתח את תוכנת הבקרה של הספקטרומטר (תוכנת אנרגטיקה תאית).
2. הגדרת תוכנה:
   הערה: קבצי הגדרות וספריות רגרסיה לסוגים שונים של רקמות מסופקים במערכת. קבצים אלו כוללים מידע על אילו ספריות מערכת RRS צריכה לכלול ברגרסיה, כמה ספקטרום כלולים בחלון הרגרסיה, ופרמטרים נוספים כגון עוצמת לייזר. ניתן לשנות את הגדרות ברירת המחדל ולשמור קובץ הגדרות חדש לשימוש בניסויים עתידיים. צילומי מסך של התוכנה המפורטות להלן מוצגים באיור משלים 3.
   1. עם פתיחת תוכנת בקרת הספקטרומטר, יופיע גרף המציג אחוז 3RMR, רוויית חמצן (StO₂) ורוויית מיוגלובין. מסך זה הוא המקום שבו המדדים הללו יוצגו, אם ייבחרו, בזמן אמת לאורך כל המדידות. לחצו על לשונית ההגדרות בפינה השמאלית התחתונה של הדף.
   2. בלשונית המידע , הזן מידע על סשן תחת שם הסשן, וכל הפרטים הנדרשים בלשונית תיאור הסשן .
   3. ישנם שני מצבי איסוף נתונים. השתמש במצב בדיקת נקודות לצבירת ספקטרות עד שמטרות איכות מוגדרות (למשל, סיגמה יעד או חלון רגרסיה/מספר ספקטרות), ואז עצור את הקלטה. השתמש במצב רציף כדי להקליט ספקטרות עד ללחיצה על כפתור העצירה. בשני המצבים, כל הנתונים, הן תוצאות 3RMR והן ספקטרום בודד, נשמרים אוטומטית. ניסוי זה עושה שימוש במצב רציף.
   4. לאחר שכל המידע על הסשן מוזן, לחץ על לשונית המערכת .
   5. תחת קובץ הגדרות, בחרו את הפרוטוקול המתאים לפרויקט (עבור פרפוזיה בכבד חולדה ללא תאים, בחרו בפרוטוקול כבד חולדות ). זה יתאים אוטומטית את סוג המדידה, אורך המדידה הממוצע (חלון רגרסיה), וכן את הסיגמה המטרה.
      1. כדי ליצור קובץ הגדרות חדש, התאימו כל אחד מהרכיבים שצוינו למעלה, ואז לחצו על כפתור השמירה . זה אמור לשמור את הפרמטרים האלה כקובץ הגדרות נפרד שניתן לייבא למערכת.
      2. כדי לייבא קובץ הגדרות חדש, לחץ על התפריט הנפתח ליד ברירת מחדל (מוד) ובחר ייבוא קובץ הגדרות חדש. לחץ על קובץ ההגדרות החדש כדי לייבא.
   6. בספריות רגרסיה, בחרו ואשרו את שילוב הספריות שישמשו לרכישת נתונים וניתוחים. הספריות למיטוכונדריה מצומצמת ומחומצנת [רק מיטו] נבחרו לניסוי זה. משתמשים אחרים עשויים לבחור להשתמש בספריות הכוללות גם המוגלובין, מיוגלובין או קומפלקסים אחרים שנמצאים תחת Advanced Library.
   7. בחר ואשר את מצב רוחב החלון המועדף.
      1. מצב רוחב אדפטיבי: השתמשו במצב רוחב אדפטיבי כדי להוסיף ספקטרום בודד לספקטרום הממוצע עד שמגיעים ליעד הסיגמה המקסימלי. אם יעד הסיגמא לא מושג, ההקלטה תיפסק כאשר היא מגיעה לגבול העליון של חלון הרגרסיה הקבוע (כלומר, מספר הספקטרום המרבי שנאמר לה להקליט). תוצאות המדידה יוצגו על המסך לאחר השגת יעד הסיגמא המינימלי.
      2. מצב רוחב קבוע: השתמש במצב רוחב קבוע כדי להוסיף ספקטרום בודד לספקטרום הממוצע עד שמספר הספקטרום היעד ייכלל (מוגדר מתחת לאורך ממוצע).
   8. לאחר שההגדרות של המערכת מסתיימות, לחצו על לשונית העלילה .
   9. תחת הסדרה הראשית, בחרו את הרכיבים שיש להציג ולהציג על המסך במהלך המדידות.
   10. אשר שכל רכיבי המדידה שנבחרו תואמים לפרוטוקול הרלוונטי.
3. רכישת נתונים:
   הערה: מדידות ראמן צריכות להתבצע בחלל חשוך. לפני תחילת איסוף הנתונים, ודאו שסביבת העבודה מוגנת ככל האפשר מאור. אם החדר לא יכול להיות מוגן לחלוטין מהאור, מערכת RRS מגיעה עם כיסוי שחור עם פתח מלבני במרכז (מוצג ב- איור 2), דרכו ניתן להניח את גשוש הלייזר. הקופסה יכולה לכסות את הדגימה/החלק של האורגן שממנו נלקחות מדידות RRS. בעת עבודה עם לייזר RRS, הימנעו מחשיפה ישירה או ממושכת לעיניים. אל תאיר לייזר ישירות לעין או על משטחים מחזירי אור. הפעילו את הלייזר רק כאשר הוא ממוקם ישירות על הרקמה הרלוונטית. לייזר RRS הוא לייזר מחלקה 3R כאשר הוא בשימוש בהספק של 4 mW, ו-Class 3B כאשר הוא בשימוש בהספק של 10 mW. הלייזר בטוח למגע רקמה.
   1. בחר את ההגדרות המתאימות והשמורות מראש, פרמטרי ההקלטה וקבצי הספרייה.
   2. הנח את גלאי הלייזר ישירות מעל הרקמה/האיבר הרלוונטי. מקם את הגשוש בניצב האפשרי ובמרחק של ס"מ אחד מהרקמה. השתמש בסרגל כדי למדוד בדיוק 1 ס"מ מפני האורגן. כוון את הגשוש כך שיהיה קרוב יותר מ-1 ס"מ אם האות לא ברור. עם זאת, ודאו שהגשוש לעולם לא נוגע ברקמה.
      הערה: הגשש יכול להיות ביד, אך מומלץ להשתמש במחזיק/מעמד לבדיקה שניתן לכוונן ולשמור על יציבות. מקם את הגשוש בניצב האפשרי ובמרחק של ס"מ אחד מהרקמה. סרגל יכול היה לשמש למדידה מדויקת של 1 ס"מ מפני האורגן. ניתן היה לכוון את הגשוש כך שימקם קרוב יותר מ-1 ס"מ אם האות אינו ברור. עם זאת, הגשוש לעולם לא צריך לגעת ברקמה.
   3. וודא שנקודת הלייזר נמצאת באונה השמאלית הצידית, קרוב ככל האפשר לווריד הפורטלי.
   4. אשר שכל הספריות הנבחרות, הגדרות הרגרסיה, סיגמא היעד, חלון הרגרסיה ומצבי הרכישה נכונים וכפי שרצוי.
      1. תוודא שהחדר חשוך ככל האפשר. ודאו שהגשושית אינה מכילה זיהום, במיוחד דם, על החלון. במקרה של זיהום, השתמש במגבון ללא סיבים ולא שוחק עם אלכוהול איזופרופיל 70% לניקוי חלון הקוורץ, ולאחר מכן ייבוש יסודי עם מגבון יבש לפני הממשיך.
      2. במקרה של זיהום כבד, נגב את הגשוש ביסודיות ככל האפשר, כפי שתואר לעיל. לאחר מכן, כייל את המכשיר על ידי הנחת הלייזר במארז כהה עם סרט שחור ולחיצה על כפתור Take Dark . הכיול נמשך כ-5–10 דקות. בלי קשר לזיהום, כייל את המכשיר פעם בחודש, והוא ישלח הודעות תזכורת אוטומטיות.
         הערה: ההסברים של כל מדד בקרת איכות, דוגמאות למדדי בקרת איכות כאלה, והאות הספקטרלי הגולמי שהתקבל מהקלטות אופטימליות ופחות אופטימליות (קובץ משלים 1, איור 3, איור משלים 3). קריטריוני בקרת האיכות הללו הותאמו לכבד שלמים מתוך מודל העכברים. כל פרוטוקול חדש שפותח המשתמש במודל איבר/חיה שונה אמור לחדד ולהתאים את המדדים הללו בהתאם.
   5. בעמוד הראשי, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל לאסוף נתונים. בהתאם להגדרות שנבחרו, התוכנה תיקח הקלטות עד שערך השגיאה היעד (סיגמא) או 180 שניות. איסוף הנתונים הושלם.
      1. הסיק את איכות אות RRS מהגרפים והערכים הללו כדי לאפשר התאמת מיקום הגשוש או תנאי המדידה (איור 3). אם אות ה-RRS שהתקבל לא עומד בקריטריוני בקרת האיכות הללו, כוונו את הגלאי להיות מאונך ככל האפשר וכ-9 מ"מ מהמשטח לחלון הגשוש.
   6. לאחר סיום פרוטוקול איסוף הנתונים/הניסוי, זרקו את כל הכבד/רקמה לתוך מיכל ביו-סיכון. נקה כל מערכת או משטח שהיה במגע עם האיבר/הרקמה עם 70% אתנול.
      1. אם עובדים עם מערכת פרפוזיה, יש להפעיל מי DI מעורבב עם חומר ניקוי אנזימטי (7.8 מ"ל מדולל ב-1 ליטר מים מנותק [DI]), ואחר כך מים נקיים עם DI.
         הערה: כל הקלטה תישמר כקובץ ניתוח נפרד תחת קובץ סשן חדש. תוצאות של 3RMR ועוצמת האות המיטוכונדריאלית (r3RMR) מוצגות בחלון הראשי. ניתן גם להציג את הספקטרום הגולמי. מדדי בדיקת איכות נוספים, כגון עוצמת אות שארית ועוצמת אות כוללת, יוצגו תחת לשונית הספקטרום .
4. ניתוח נתונים:
   1. לאחר סיום איסוף הנתונים, לחץ על תיקיית הסקירה בתחתית המסך כדי לפתוח את קובץ הניסוי ולראות את התוצאות.
   2. חלופה נוספת היא לפתוח קובץ טקסט שמכיל את התוצאות. בחר את קובץ הסשן שמעניין אותו. קובץ ניתוח הכולל את כל המדידות שהושגו ייפתח. לכל פרמטר וערך הסיגמא שלו יהיו עמודה משלו. לדוגמה, ערכי 3RMR שמתקבלים בכל שנייה יופיעו תחת העמודה "3RMR", וערך הסיגמא שלו יופיע תחת "sigma_3RMR".
   3. השורה האחרונה בכל עמודה תכיל את הערכים הסופיים של כל פרמטר בקובץ הסשן הזה. השתמש בערך זה כדי לשרטט.
   4. חזור על השלבים עבור כל קובץ סשן/כל הקלטה. הגרף קיבל ערכים לפי הרצון.

איור 2: הגדרת מכשיר RRS. סכמטיקה של מערכת RRS. הגשוש מחובר באמצעות כבל סיב אופטי למערכת RRS, הכוללת את מקור ההתעוררות בלייזר ואת הספקטרומטר. הגדרה זו מתחברת לכל מחשב נייד שמכיל את אפליקציית בקרת הספקטרומטר לאיסוף וניתוח נתונים. גם המחשב וגם יחידת הספקטרומטר מחוברים לשקע חשמל. מדידות RRS צריכות להתבצע בחושך. אם החדר לא יכול להיות מוגן לחלוטין מאור, מערכת RRS מגיעה עם כיסוי שחור עם פתח מלבני במרכז, שבו ניתן למקם את גלאי הלייזר. הקופסה מכסה את הדגימה/החלק של האיבר ממנו נלקחות מדידות ה-RRS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: דוגמאות למעקבים ומדדי בקרת איכות של עקבות איכות תת-אופטימלית ואיכות אופטימלית. האות השאריתי (הרעש) מסומן בסוגר כתום, והאות המיטוכונדריאלי מסומן בסוגר ירוק. (א) דוגמה למעקב מאות ראמן תת-אופטימלי. האות השאריתי גדול מדי כדי להבדיל אותו מהאות המיטוכונדריאלי. פסגות ספקטרליות אינן ניתנות להבחנה בכל האות הנמדד. (B) דוגמה לעקבות מאות ראמן אופטימלי. האות המיטוכונדריאלי נראה גדול יותר ומובחן מהאות השאריתי. פסגות ספקטרליות מהמדידה שהושגה ניתנות להבחנה. (ג) מדדי בקרת איכות שהושגו מכל אות. בסך הכול, האות הכולל שמתקבל בקריאה תת-אופטימלית קטן מהקריאה האופטימלית. יותר אות מיטוכונדריאלי נמדד בהקלטה האופטימלית בהשוואה להקלטה תת-אופטימלית, כאשר אות מיטוכונדריה מהווה 17% ו-14% מסך האות, בהתאמה. האות נמדד עם 4.3% שגיאה בקריאה האופטימלית, לעומת 18.5% שגיאה בקריאה הלא אופטימלית. באופן דומה, אות שאריתי בלתי מוסבר מהווה 11% מסך האות בהקלטה הלא אופטימלית, בעוד שהוא מהווה 3.6% בהקלטה האופטימלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הערכת בריאות המיטוכונדריה באמצעות RRS

הערה: טכנולוגיית ספקטרוסקופיית רזוננס ראמן (RRS) שימשה לפיתוח מדד חיוניות מיטוכונדריאלי (3RMR) שמצביע על כדאיות איברים מושתלים. מחקר זה שואף להראות כיצד שינויים בחמצון – ובהרחבה גם בנשימה התאית – משתקפים במגמות 3RMR בהשוואה לסמנים ביולוגיים מסורתיים של נזק, כגון לקטט ו-K⁺. כאן נעשה שימוש במבחן מאמץ חמצן, שבה, לאחר 5 דקות של זרימה רציפה, זרימת הדפק המחומצן נעצרת ל-5 דקות, ואז ממשיכה ל-5 דקות. מדידות RRS, וכן דגימות פרפוזאט נכנס ויוצא, נלקחות לאורך כל מבחן המאמצ.

1. רכישת כבד:
   1. הרגעת בעלי חיים בתא השראה באמצעות איזופלורן של 3%–5%. סנן אדים עודפים עם פחם פעיל.
   2. בצע כריתת כבד מלאה על זכרי חולדות לואיס (150 גרם). לחבר את ענפי וריד הפורטל. הזריק 50 U של סודיום הפארין דרך ה-IVC. במהלך הניתוח קנול את וריד הפורטל עם קטטר של 16G ושטוף את הכבד ב-50 מ"ל של מי מלח.
   3. מניחים את הכבד שנרכש על קרח בצלחת פטרי המכילה 30 מ"ל תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW).
2. הגדרת פרפוזיה מכונה תת-נורמתרמית (SNMP) ומדידות ראמן תהודה:
   1. הגדר את מכשיר ה-RRS כפי שתואר קודם. הגדר את פרוטוקול כבד העכברוש האסלולרי בתוכנת בקרת הספקטרומטר, שמגדירה אוטומטית את מצב הרוחב לרוחב אדפטיבי, אורך ממוצע ל-180, וסיגמא יעד ל-1.5. הוא גם בוחר 3RMR ופלואורסצנציה כפרמטרי מדידה, וכן ב-Mito בלבד כספריית רגרסיה. הגדר את מצב הרכישה למצב רציף.
   2. הגדר את מערכת SNMP כפי שמתואר במקום אחר¹⁸.
      1. בקצרה, ודא שמערכת הפרפוזיה כוללת תא פרפוזיה, משאבה פריסטלטית, חמצן ממברנה ומלכודת בועות.
      2. לספק חמצן עם תערובת אטמוספירית (95% חמצן₂ ו-5%_CO2); שמור על_{pO 2} בין 400–500 מ"מ כספית. יש לנטר את הלחץ התוך-כבדי עם חיישן לחץ ולשמור על עוצמה שבין 3–5 מ"מ כספית. אסוף את הדגימות דרך פורטי דגימה.
   3. לאחר שהתוכנה ומערכת הפרפוזיה מוגדרות, חבר את הקנולה החודרת ל-PV לצינור הזרימה של מכונת הפרפוזיה. שמרו על האיבר, הפרפוזאט והפרפוזיה בטמפרטורת החדר (21 מעלות צלזיוס), ללא עזרה באמבט מים.
   4. העבירו את הפרפוזאט לאיבר דרך הקנולה ב-PV באמצעות משאבה פריסטלטית.
      1. להכנת הפרפוזאט, ערבבו 500 מ"ל של Williams' Medium ללא פנול אדום עם 5 גרם אלבומין סרום בקר (BSA), 12 מ"ג דקסמתזון מסיס במים, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 5 מ"ל L-גלוטמין, 2.5 מיקרוליטר אינסולין ו-1000 U הפארין.
      2. ערבב את כל הרכיבים על צלחת ערבוב במשך כ-20 דקות, או עד שכל הרכיבים נמסים. הגבר את זרימות הפרפוזיה ללחצים של 3–5 מ"מ כספית.
   5. לאחר מכן, מניחים את מקור הלייזר של RRS במחזיק הגשוש ומקמו אותו בגובה 1 ס״מ מעל האונה הגדולה ביותר של הכבד, קרוב ככל האפשר ל-PV. הפסק את זרימת הפרפוזיה ב-5 דקות (T₅) והמשך ב-10 דקות (T₁₀). בצע את מבחן המאמץ ב-15 דקות (T₁₅).
   6. בצע מדידות RRS לאורך כל מבחן המאמץ; בצע מדידות זרימה נכנסת ויוצאת כל 5 דקות, החל מ-T₀ (איור 4). צייר את ערכי 3RMR, וכן רמות K⁺ ויציאות לקטט עבור T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (איור 5).
   7. חישבו את קצב צריכת החמצן (OCR) ב-T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15} על ידי הכפלת לחץ חלקי של הזרימה והיציאה של החמצן (pO₂) במקדם המסיסות של חמצן בפלזמה (0.00314). שרטט את ה-OCR עבור T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (איור 5).
      הערה: מוצגים עקבות ספקטרליות של ראמן תהודה במצבים מופרדים (T₅), איסכמיים (T₁₀) ומזורזים (T₁₅) מאחד הכבד (איור 6)

איור 4: דיאגרמה המתארת זרימה ניסויית. בוצעה כריתת כבד מלאה על נקבות חולדות לואיס. הכבד שהושג הונח על פרפוזיה מכונית תת-נורמית וסופק לו פרפוזאט מחומצן במשך חמש הדקות הראשונות. הפרפוזאט זורם לכבד דרך וריד הפורטל ומחזור דרך המשאבה הפריסטלטית (זרימת פרפוזיה המתוארת בחצים כחולים). ההזרמת החמצן הופסקה לחמש הדקות הבאות ב-T5 וחודשה לעוד 5 דקות ב-T10. מדידות 3RMR נלקחו לאורך מבחן המאמץ (המוצגות כלייזר). דגימות פרפוזאט נאספו ב-T0, T5, T10 ו-T15. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

כבדים טריים עברו תקופות של איסכמיה וריפרפוזיה באמצעות בדיקת עומס חמצן. לאחר מכן, השינויים בזמן אמת ב-3RMR הושוו לאורך מבחן המאמץ לקצב צריכת חמצן, זרימת לקטט ויציאה ואשלגן שהתקבלו מניתוח פרפוזאט ב-T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15}. בתנאים בריאים, ערכי 3RMR צפויים להיות בין 10% ל-30% (איור 5A). כצפוי, ערכי 3RMR ב-T_{0 ו-T 5} נמצאים בטווח זה, שכן הכבד סופק ברציפות בפרפוזאט מחומצן בין נקודות הזמן הללו (איור 5A). עם זאת, ערך 3RMR בסוף התקופה האיסכמית (T₁₀) נמצא מחוץ לטווח האופטימלי (איור 5A). עלייה זו מצביעה על כך שהמיטוכונדריה עוברת למצבם המופחת, כאשר האלקטרונים מצטברים לאורך שרשרת ההובלה בעקבות דה-חמצון. _{ב-T 10,} הזרימה המחומצנת מתחדשת; מתחילה תקופת ההחזרה. בסיום תקופת ההחזרה (T₁₅), ערכי 3RMR חוזרים לרמות האופטימליות (איור 5A) כאשר פעילות ה-ETC מתחדשת עם החזרת החמצן כמקבל האלקטרונים הסופי. שינויים אלו בזרימת החמצן נראים גם בספקטרום הגולמי. ספקטרום RRS גולמי ב-T_{0 ו-T 15} בעלי תכונות ספקטרליות דומות לאלו של מיטוכונדריה מחומצנת (איור 6A,C), כמו שיא סמן ספקטרלי ב-1371 ס"^מ-1 (איור 6D,F). באופן דומה, ספקטרום הרמן הגולמי ב-T₁₀ (איור 6B) מציג סימני RR מופחתים, כגון שיא סמן ספקטרלי ב-1357 ס"^מ-1 (איור 6E). לסיכום, RRS מזהה את ההזזות במצבי רדוקשן מיטוכונדריאלי בזמן אמת, כפי שמודגם הן באות הספקטרלי הגולמי והן כמדד לבריאות המיטוכונדריה (3RMR).

RRS יכול גם לחשב ערכי 3RMR בהתבסס על מצבי החמצון האדום של cIII ו-cIV. דפוס דומה נצפה בערכי cIII ו-cIV 3RMR (איור 5B). ב-T₀ נצפו ערכי 3RMR מחומצנים לחלוטין עבור cIV, וערכי 3RMR בטווח האופטימלי ל-cIII. איזון החמצון בין הקומפלקסים הוא פיזיולוגי, שכן אלקטרונים זורמים מ-cIII ל-cIV כדי לעבור חמצון מהיר. עם הופעת האיסכמיה, נצפתה עלייה ברמות 3RMR בכל קומפלקס. במהלך התקופה האיסכמית, הצטברות אלקטרונים דרך ה-ETC מגבירה את המאמץ הרדוקטיבי על cIII ו-cIV, מה שמעלה את cIII-3RMR ו-cIV-3RMR. עם זאת, עם החזרת החמצן, ערכי 3RMR של שני הקומפלקסים יורדים חזרה לרמות האופטימליות: cIV מחומצן במלואו ו-cIII מופחת פיזיולוגית (איור 5B). מגמות 3RMR בשני הקומפלקסים מראות כי הפסקת החמצן משפיעה על כל ETC, ואף קומפלקס בודד אינו פגיע במיוחד לאיסכמיה ללא זרימה.

מצד שני, השינויים בדינמיקת החמצון לא השתקפו בסמנים ביולוגיים של נזק ובאנליטים של גזי דם שהתקבלו מניתוח פרפוזאט. עם הופעת איסכמיה, צפויים לעלייה של לקטט ו-K⁺ , שכן התא מתחיל להסתמך על נשימה אירובית, ומתפרק בהדרגה כדי לשחרר את K⁺ הבין-תאי. אנו גם מצפים ש-OCR ירד, כי התאים אינם מייצרים מספיק אנרגיה להמשיך בנשימה תאית. גם לאחר תקופה של איסכמיה ללא זרימה, קצבי צריכת החמצן לא הראו סימני נזק. רמות הזרימה היוצאת של לקטט ^ו-K+ נשארות יחסית עקביות לאורך כל מבחן המאמץ, למרות השינויים בחמצון (איור 5D–E).

איור 5: שינויים ב-3RMR ונזק לסמנים ביולוגיים לאורך מבחן מאמץ החמצן. תחילת האיסכמיה ותקופות הרפרפוזיה מוצגות דרך קווים מנוקדים בדקות 5 ו-10, בהתאמה. בנוסף, תקופות של זרימה מחומצנת מתוארות בקווים כחולים, ותקופות של איסכמיה מתוארות בקווים אדומים. (A) ערכי 3RMR לאורך כל הבדיקה המיטוכונדריאלית. ערכי 3RMR עולים כאשר הזרימה המחומצנת מופסקת ויורדים חזרה לרמות אופטימליות כאשר הזרימה מתחילה מחדש. (B) ערכי 3RMR של קומפלקס III ומורכב IV. הפסקת הזרימה מובילה להפחתה בשני הקומפלקסים. (C) ערכי זרימה יציאה ממוצעים K⁺ לאורך כל מבחן המאמץ. ערכי K⁺ נשארים עקביים לאורך כל מבחן המאמץ, למרות שינויים בדינמיקת החמצון. (D) רמות לקטט ממוצעות לאורך כל מבחן המאמץ. תפוקת הלקטט נשארת עקבית לאורך כל מבחן המאמץ. (ה) קצב צריכת חמצן_{ב-T 0},_{T 10},_{T 15}. מכיוון שערכי_{pO 2} הם מדידות מבוססות זרימה, לא ניתן היה לחשב OUR עבור תקופת איסכמיה ללא זרימה. לא נצפו שינויים משמעותיים (ערך p: 0.2500) (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: עקבות ספקטרליות גולמיות מופתיות של כבד עכבר טרי לאורך כל מבחן המאמץ. פרופילים ספקטרליים מלאים של כבד במצבים (A) מחומצן, (B) איסכמיים, ו-(C) מחודש. המעבר מסמן RR מחומצן לסמן RR המופחת נראה כאשר מתקרבים לשיא הספקטרלי של המיטוכונדריה, המסומן בתיבה אדומה בכל פרופיל ספקטרלי. (D–F) שיאי סימון RR מחומצנים (1371 ס"^מ-1) נמצאים במצבים (D) מחומצנים ו-(F) מחודשים, ומסומנים בקו אדום מנוקד. שיא סימון RR מופחת (1357 ס"^מ-1) נמצא במצב איסכמי (E) ומסומן בקו כחול מקוויק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: עקבות ספקטרליות של קומפלקס III, קומפלקס IV, המוגלובין ומיוגלובין. (א) Complex III, (B) קומפלקס IV, (C) המוגלובין, ו-(D) מיוגלובין. ניתוח הרגרסיה מריץ את הספקטרום שנאסף מול ספריות ספקטרליות אלו (אם נבחר), ומניב גורם לכל ספקטרום ספרייה שמייצג את ההערכה הטובה ביותר של תרומתו היחסית בספקטרום המתועד ומכאן את ריכוזו היחסי ברקמה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: דוגמה לשימוש בספריות רגרסיה לפירוק מולקולות המכילות ההמו (המוגלובין ומיטוכונדריה מחומצנת/מופחתת). (א) נבחרו עקבות ספקטרליות גולמיות מרקמת כבד שמופרזת בפרפוזאט תאי, עם כל ספריות הרגרסיה הנדרשות, כגון המוגלובין, המוגלובין מחומצן, מיטוכונדריה מופחתת ומיטוכונדריה מחומצנת. ברור שקו ההתאמה הטובה ביותר, שמקורו בספריות ומניתוח הרגרסיה, חופף בצורה מסודרת לאות הנמדד, עם מעט מאוד שאריות בלתי מוסברות. (B) עקבות ספקטרליות גולמיות מאותה רקמה, אך עם ספריות מיטוכונדריה מחומצנות ומוקטנות בלבד שנבחרו בה. מכיוון שיש מבנה שאריתי גדול ובלתי מוסבר, ברור ששיא הספקטרום המיטוכונדריאלי הוסט מספר מספרי גל מזה של ההמוגלובין, שלא נכלל בניתוח הרגרסיה. איור זה מראה כי ספקטרומטר ברזולוציה גבוהה וניתוח רגרסיה מול כל הספקטרום מסוגלים להבחין בין ספקטרומים קרובים זה לזה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: צילום מסך של התוכנה. (A) חלון ראשי שמציג ערכי מדידה לאורך זמן. 3RMR, StO2 וכל סדרה נבחרת אחרת יוצגו כאן במהלך המדידה. בנוסף, עוצמת האות של כל סדרה תוצג כשורה מקווקו בגרף, וערך מתחתיו בצד ימין של המסך. לדוגמה, הקו המוצק שנלכד כאן מייצג את 3RMR של רקמה, והקו המקווקוק מייצג r3RMR (עוצמת אות של 3RMR). אם רצו לראות את איכות הספקטרום המוקלט, אפשר היה ללחוץ על לשונית Show spectrum (מסומנת בסגול). (ב) מסך שמציג את הספקטרום הגולמי של הרקמה. זו הלשונית שבה ניתן להעריך את איכות האות דרך עוצמת הספקטרום הנמדד לעומת הרעש השארי. (C) לשונית שמציגה מגמות בסדרות לאורך הניסוי. אם נבצע, למשל, מספר מדידות 3RMR במהלך ניסוי, כל מדידה תוצג לאורך זמן בלשונית זו. מגמות בסדרות אחרות, אם ייבחרו, יוצגו כאן גם כן. ניתן היה לגשת ללשונית זו על ידי לחיצה על כפתור המגמות במסך הראשי (מסומן בירוק ב-A). (D) לשונית מידע , שבה ניתן להזין מידע ניסיוני, כגון שם סשן ותיאור. (E) לשונית מערכת , שבה ניתן להעלות פרוטוקולים טעונים מראש. לדוגמה, אם בוחרים את הפרוטוקול LiverContAcell, פרוטוקול זה יקבע את ספריית הרגרסיה, חלון הרגרסיה המטרה וסיגמא בהתאם לפרוטוקול הפרפוזיה הא-תאית לכבד חולדות. כדי לייבא פרוטוקול, ניתן ללחוץ על ייבוא הגדרות מקובץ ולייבא את הפרוטוקול הרצוי. אם מישהו רוצה ליצור פרוטוקול משלו, הוא יכול לבחור ספריות נחוצות מתפריט הנפתח (F) Regression Library , להתאים את חלון ה-Target sigma והרגרסיה, כמו גם אזעקות, וללחוץ על השמירה (שמיוצגת בדיסק) בפינה השמאלית התחתונה. (ו) לשונית העלילה , שבה ניתן לבחור איזו סדרה להציג בחלון הראשי. אם מנתחים ספקטרום מחדש, ורוצים להוסיף סדרות נוספות למדידות הקודמות שלהם, ניתן לבחור את הסדרה המעניינת מתוך סעיף Recal . במהלך כיול מחדש (Recal), התוכנה תנתח מחדש את הספקטרום הגולמי הנמדד ותציג את תוצאות הסדרות החדשות שנבחרו. ניתן גם לבחור להציג את עוצמת האות של סדרות נבחרות מתוך לשונית זו. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

קובץ משלים 1: הסברים על כל מדד בקרת איכות.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מחקר זה מדגיש שיטה לא פולשנית, בזמן אמת ורגישה מאוד לכמת את בריאות המיטוכונדריאה באמצעות מערכת ספקטרוסקופיית רמאן תהודה ניידת, המורכבת מלייזר בתוך גלאי קומפקטי, המחובר בכבל סיב אופטי למשאבת לייזר. שיטה זו השתמשה בלייזר של 441 ננומטר כדי לעורר מיטוכונדריה, שמייצרת אותות ספקטרליים ייחודיים בהתאם למצב החמצון שלהן. לכן, RRS מסוגל לכמת כל מצב של מיטוכונדריה באמצעות חתימות ספקטרליות ולהשוות את הספקטרום הנפלט לספריות ספקטרליות שנמדדו מראש באמצעות ניתוח רגרסיה. לאחר מכן נוצר מדד בריאות מיטוכונדריאלי המבוסס על היחס בין מיטוכונדריה מצומצמת לסך הכולל: יחס רטוכונדריה ראמן מופחת בתהודה (3RMR).

מאמר זה מתמקד בהדגמת שינויים בזמן אמת ב-3RMR כפונקציה של חמצון עם רקמה טבעית ללא צורך בעיבוד דגימה. זה הושג באמצעות בדיקת מאמץ חמצן: לאחר 5 דקות של זרימה מחומצנת רציפה, זרימת הפרפוזיה נעצרת ל-5 דקות ומתחילה מחדש לעוד 5 דקות. נלקחות מדידות 3RMR לאורך כל מבחן המאמץ. מודל מבחן מאמץ, שבו אנו עוברים בין תקופות איסכמיות לתקופות מחומצנות, מאפשר לנו לעקוב אחר שינויים רציפים במצבי רדוקס-חמצון מיטוכונדריאלי – ובהרחבה גם אחר תפקוד המיטוכונדריה. במילים אחרות, מבחן מאמץ החמצן מאפשר לנו לעקוב אחרי המגמות ב-3RMR כפונקציה של חמצון. הקבוצה שלנו ייחסה את העלייה בערכי 3RMR לתנאים איסכמיים, מה שמפריע לזרימת הפרפוזיה, מה שגורם להצטברות אלקטרונים העוברים דרך ה-ETC, שכן_O 2 אינו זמין כמקבל האלקטרונים הסופי. הצטברות אלקטרונים זו גורמת למצב מופחת, שמתורגם לעלייה בערכי 3RMR. עם זאת, עם החזרת החמצן₂, מצפים שהמיטוכונדריה הבריאה תחזור לפעילות ETC ותחזור למצבי חמצון פיזיולוגי, שכן האלמנטים המבניים והפונקציונליים שלהן נשארים שלמים.

כצפוי, במאמר הנוכחי נצפתה עלייה רציפה בזמן אמת ב-3RMR לאורך כל התקופה האיסכמית (איור 5A). באופן דומה, 3RMR חוזר בהדרגה לרמות אופטימליות לאורך תקופת ההחזרה (איור 5A). שינוי זה בזמן אמת במצבי החמצון האדום המיטוכונדריאלי נראה גם בגרף הספקטרלי, כאשר שיא המיטוכונדריאלי משתנה ממצבים מחומצנים (1371 ס"^מ-1) למצבים מצומצמים (1357 ס"^מ-1) לאורך התקופה האיסכמית, וחוזר למחומצן בסיום ההזרמה (איור 6). שיאים נוספים של סמן RR מופחת מופיעים גם הם במהלך התקופה האיסכמית. בניגוד לבדיקות בריאות מיטוכונדריות מסורתיות, רזוננס ראמן רגיש מספיק כדי לכמת את מצבי החמצון של קומפלקס III ומורכב IV, מה שיכול לספק תובנות מכניות לגבי ההשפעה הספציפית של פגיעות איסכמיה-רפווזיה על ה-ETC. במיטוכונדריה בריאה, אלקטרונים עוברים דרך קומפלקסים שונים ב-ETC, החל ממתחם I, עד שהם מגיעים_{ל-O 2} כמקבל האלקטרונים הסופי. הפסקה בזרימת החמצן יכולה להזיז כל קומפלקס למצב מוקטן, כאשר אלקטרונים מצטברים לאורך ה-ETC. כצפוי, נצפה עלייה בזמן אמת בערכי 3RMR של cIII ו-cIV עם הופעת האיסכמיה. זה מצביע על כך שהיעדר O₂ משפיע על כל ה-ETC, ולא על קומפלקס מסוים (איור 5B). כפי שנדון בהמשך, הרגישות של RRS מקלה על מחקרים מכניים מפורטים ומנחה פיתוח טיפולים ממוקדים ל-IRI.

מסורתית, אנו מצפים גם להבחין ברמות לקטט גבוהות באיברים איסכמיים, שכן הם מסתמכים על מטבוליזם אנאירובי בהיעדר חמצן לייצור ATP. באופן דומה, ציפו לעלייה ברמות K⁺ באיברים פגועים, שכן שלמות הממברנה של התאים מופרעת, מה שמאפשר פליטה של K⁺ בין-תאי. לבסוף, תאים שנפגעו קשה עשויים להיות בעלי מטבוליזם נמוך יותר, שכן מסלולי המטבוליזם שלהם מושפעים מפסולת מטבולית ו-ROS הנגרמות מאיסכמיה, מה שמוביל לצריכת חמצן מופחתת. עם זאת, לא נצפים שינויים בצריכת לקטט, K⁺ או חמצן במהלך או לאחר התקופה האיסכמית. למעשה, ערכים אינם מצביעים על הפסקת זרימת החמצן, שכן הם נשארים יחסית עקביים לאורך כל מבחן המאמץ (איור 5B–D). בעצם, באמצעות בדיקת לחץ חמצן, מחקר זה מראה שערכי 3RMR משקפים שינויים במצבי רדוקס מיטוכונדריאלי במהלך איסכמיה-רפווזיה מהר יותר, בזמן אמת, ורגישות רבה יותר מאשר סמנים ביולוגיים מסורתיים של נזק (איור 5). אנו מכירים בכך שמחקר זה השווה בין דינמיקת 3RMR לבין אינדיקטורים עקיפים לבריאות מיטוכונדריה, כגון לקטט ו-OCR, במקום משווים ישירים יותר במורד הזרם, כמו NAD+/NADH ו-ATP. למרות שמחקר זה אינו מקשר במפורש שינויים ב-3RMR לריכוזי ATP/NADH, מחקרים קודמים ^9,14 הראו ש-3RMR מנבא שינויים בסמנים הביולוגיים במורד הזרם. לדוגמה, נגויין ואח^{' הראו} כי כבדים חמים-איסכמיים (WI) של 3 שעות עם ערכי 3RMR נמוכים (<10%) בעלי ריכוזי ATP ויחסים NAD/NADH נמוכים משמעותית לעומת כבדים ב-WI בשעה אחת (ערכי 3RMR של ~15%). בנוסף, ג'יין ואח' ¹⁴ לא ראו הבדלים משמעותיים ביחס NAD+/NADH או EC בקבוצות שלא היו להן הבדלים משמעותיים ב-3RMR שלהן. הם גם הבחינו ביחס NAD+/NADH ו-EC כשונים באופן מובהק בכבדים עם איסכמיה קרה (CI) במשך 24 שעות בעת פרפוזיה תאית, לעומת פרפוזיה תאית, שגם היא הראו ערכי 3RMR מובהקים סטטיסטית. ביחד, תוצאות אלו מראות שערכי 3RMR משקפים שינויים במדדים ישירים יותר של תפקוד המיטוכונדריה ו-ETC.

למרות שמאמר זה משתמש ב-RRS לאורך פרפוזיה של 15 דקות כדי להדגים את ביצועי המערכת, מחקרים אחרים שפורסמו הוכיחו את השימושיות של RRS במחקרים אורכיים. באופן מדויק יותר, בעבודה קודמת הראינו כי RRS משלים את הסמנים הביולוגיים המסורתיים במהלך פרפוזיות איברים ארוכות יותר, שכן הוא מספק תובנות על בריאות ותפקוד המיטוכונדריה השונה משמעותית מהשיטות המסורתיות. לדוגמה, המחקר השתמש ב-RRS כדי להעריך את היתכנותם של כבד עכברים איסכמיים קר הניתנים להשתלה (24 שעות SCS) וללא השתלה (72 שעות SCS) לאורך פרפוזיה תת-נורמית¹⁰. למרות שהתגובה הראשונית לחמצון בשתי הקבוצות הייתה דומה, ה-3RMR של כבדים שאינם ניתנים להשתלה עלה עם הפרפוזיה, בעוד ש-3RMR של כבד מושתל נשאר עקבי דרך SNMP. באופן דומה, רמות האשלגן והעלייה הכוללת במשקל בכבדים עם רווח בר-סמך של 72 שעות היו גבוהות יותר לאורך כל SNMP בהשוואה לכבדים עם רווח בר-סמך של 24 שעות. המחקר הראה את השימושיות של RRS בהשלמת סמנים ביולוגיים מסורתיים במהלך פרפוזיה ארוכה. במחקר נוסף, השתמשנו ב-RRS כדי להבין את דינמיקת החמצון מחדש והתאוששות מטבולית של כבד עכברושים-איסכמיים (CI)¹⁴. העברנו פרפיוז של כבד איסכמיה מינימלית (15 דקות של איסכמיה קרה) ו-24 שעות עם פרפוזאט א-תאלי או עם פרפוזאט מלא ב-RBC (pRBC). כאשר כבדים עם רווח מרחבי 24 שעות הוזנחו בפרפוזאט א-תארי, ראינו ירידה סמויה ב-3RMR בהשוואה לפרפיוז עם pRBC. המחקר ייחס את העלייה המאוחרת ב-3RMR להצטברות אלקטרונים בציטוכרום המיטוכונדריאלי במהלך איסכמיה קרה, שניתן להעביר במהירות למולקולות החמצן השופעות במקרה של הפרפוזאט המבוסס על pRBC. עם זאת, בשילוב עם סמנים נוספים לפציעה, אנו מבחינים בנזק כבדי גבוה יותר בכבד עם רווח רוח של 24 שעות שזכור ב-pRBC. המחקר סיכם כי מדידת חמצון מיטוכונדריאלי בזמן אמת באמצעות RRS יכולה לספק תובנות לגבי התאוששות המיטוכונדריה, מה שיכול להיות מועיל לאופטימיזציה של אסטרטגיות פרפוזיה ארוכות. בעצם, הממצאים מצביעים על כך ששילוב סמנים ביולוגיים מסורתיים (כגון לקטט, OCR, ATP) עם תובנות מונעות RRS לגבי מצבי רדוקס ומינמיקת חמצון מיטוכונדריאלי מספק הערכה מקיפה יותר של התאוששות המיטוכונדריאה.

מחקרים אחרים השתמשו ב-RRS כבסיס ניסוי לטיפולים שעשויים להקל על פגיעת איסכמיה-רפווזיה ל-ETC⁹. בתקופות ממושכות של איסכמיה, האלקטרונים מצטברים בתוך ה-ETC, עם היכולת של אלקטרונים לברוח דרך הקומפלקסים השונים, במיוחד במהלך ריפרפוזיה. הבנת מצב החמצון האדום של קומפלקסים בודדים כפונקציה של איסכמיה-רפרפוזיה יכולה להציע הבנה עמוקה יותר של מיקום הפציעה עם פוטנציאל להתערבויות ממוקדות יותר. לדוגמה, הקבוצה שלנו השתמשה ב-RRS לפיתוח התערבויות טיפוליות לתפקוד לקוי של קומפלקס-III בכבד חזיר חם-איסכמי. במחקר שנערך על ידי נגויין ואח' (2026)⁹, כבדים של 1 ו-3 שעות ב-WI הונחו על SNMP למשך 3 שעות. כפי שצוין קודם, ידוע כי כבד ב-WI של שלוש שעות סובל מנזק ל-ETC, מה שמוביל לחמצון יתר וירידה במטבוליזם. למרות שערכי 3RMR לכבד טרי וכבד של 1 שעות WI היו בטווח האופטימלי לאורך כל הפרפוזיה, ראינו ערכי 3RMR של כבד 3 שעות WI יורדים ברציפות והגיעו מתחת לטווח האופטימלי (10%) ב-3 שעות. בנוסף, לא ראינו הבדלים בערכי 3RMR של cIV בין שתי הקבוצות, כאשר cIV היה מחומצן לחלוטין בכל קבוצה. ההיפראוקסידציה של cIII, בשילוב עם מצב רדוקס בריא שנצפה ב-cIV, מעידה על חמצון יתר שנגרם מהפרפוזיה במתחם III. מצוידים בידע זה, ניוגן ואחרים (2026)⁹הצליחו לבחור טיפול שיכול להתגבר על תפקוד לקוי של cIII: מתילן כחול (MB), הפועל כמעבורת אלקטרונים בין cI לציטוכרום c, עוקף את cIII ומעביר אלקטרונים ישירות ל-cIV. תוצאות 3RMR שיקפו את ההשפעה הטיפולית של MB על המיטוכונדריה, כאשר ערכי 3RMR במהלך SNMP של כבד 3 שעות WI עלו כדי לשקף העברת אלקטרונים ישירות ל-cIV, והתחלת חילוף החומרים של הכבד. ההשפעה המפחתת של MB אושרה גם על ידי הפחתת זרימת הלקטט ושיפור קצב צריכת החמצן. בעצם, הספציפיות של RRS אפשרה פיתוח מסלול טיפולי המותאם לצרכים המיטוכונדריאליים לאחר איסכמיה חמה.

במהלך מאמר זה אנו מציגים את ספקטרוסקופיית רמאן רזוננס כשיטה לא פולשנית, בזמן אמת ומאוד ספציפית למדידת בריאות המיטוכונדריה. המחקר מדגים כיצד RRS יכול למדוד שינויים עדינים במצבי החמצון מבלי להפריע לרקמה לפני ששינויים פיזיולוגיים אלו משפיעים בהמשך. עם זאת, חשוב לציין את המגבלות הרבות של מערכת רזוננס ראמן. ראשית, RRS דורש שכל המולקולות המוגברות בתהודה ברקמה יזוהו ויוקלטו ברגרסיה, כאשר לכל מולקולה יש גורמי שיפור שונים כדי להתחשב בעוצמות האות היחסיות. למרות שיצרנו ספריות ספקטרליות לכל הרכיבים הללו באורך גל ורקמה נתונים, ייתכן שהמשתמש יצטרך ליצור ולאמת ספריות חדשות לכל רקמה ואורך גל רלוונטי. יתרה מזאת, ייתכן שלחלק מהרקמות יש יסודות ספקטרליים מורכבים, מה שמקשה על מדידת ציטוכרומים מיטוכונדריאליים הקיימים בריכוזים נמוכים יותר. לדוגמה, כבד חזיר או אדם מכיל בטא-קרוטן, והדם מכיל המוגלובין, שלשניהם יש אותות ספקטרליים חזקים שמוסיפים למספר החתימות הספקטרליות ש-RRS צריך לקחת בחשבון ברגרסיה. לבסוף, לייזר 441 ננומטר המשמש למדידות אלו בעל קוטר קרן של 2 מ"מ ועומק חדירה של פחות מ-1 מ"מ. מדידות שטחיות מקומיות כאלה עשויות לקדם שגיאות דגימה, שכן הבדלים במצב החמצון האדום בחלקים אחרים של האיבר עלולים להתעלם. כדי להתגבר על אתגרים כאלה, ניתן היה לבצע מדידות מביופסיות שנלקחו מליבת האיבר, או שמערכת רב-לייזרית תאפשר מדידות על שטח פנים גדול יותר כדי לספק הבנה מלאה יותר של בריאות האיבר השלם.

לסיכום, אנו מראים כי ספקטרוסקופיית רמאן רזוננס רגישה לשינויים עדינים בדינמיקה המיטוכונדריאלית בהשוואה לאנליטים של גזי דם. כאן ניתן הסבר מפורט על הקמה והפעלת המערכת. אנו מדגישים את האופי הלא-פולשני, הספציפי וההערכה בזמן אמת של RRS, ומסבירים כיצד ניתן להשתמש בו כגישה אבחנתית ומכנית. אנו גם מדגישים את השימוש בה בפיתוח מסלולים טיפוליים ספציפיים לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה. מחקרים עתידיים עשויים להתמקד בהתאמת מערכת RRS להערכת בריאות המיטוכונדריה מביופסיות, פרוסות רקמה חתוכות מדויקות או מוצרים אחרים שמקורם ברקמה, כולל רקמות אנושיות למחקר תרגומי. אימוץ RRS מציע גישה עוצמתית במחקר מטבולי, המשפר את הבנתנו של תהליכים ביואנרגטיים תאיים בקלות רבה יותר מאשר שיטות מסורתיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	משמש לקנולציה של וריד הפורטל
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	משמש לסינון אדים עודפים במהלך הרדמה
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	הרכב תמיסת השטיפה
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	הרכב תמיסת השטיפה
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	הרכב תמיסת השטיפה
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	משמש לזרימת תמיסת השטיפה דרך הכבד
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	משמש לזרימת תמיסת השטיפה דרך הכבד
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	משמש לחמצון תמיסת השטיפה.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	הרכב תמיסת השטיפה
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	לניתוח גזים בדם
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	פנה ל-Pendar Technologies לשאלות בנוגע למוצר זה