הערכה בזמן אמת, לא פולשני, של תפקוד מיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית רמאן תהודה

Yasemin Altug; Rohil Jain; Khanh T. Nguyen; Padraic Romfh; Shannon N. Tessier

doi:10.3791/71290

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה בזמן אמת, לא פולשני, של תפקוד מיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית רמאן תהודה

96 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 באוגוסט 2026

Yasemin Altug¹^,² , Rohil Jain¹^,² , Khanh T. Nguyen¹^,² , Padraic Romfh³ , Shannon N. Tessier¹^,²

¹Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Shriners Hospital for Children, ³Pendar Technologies

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה לא פולשנית בזמן אמת למעקב אחר בריאות המיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן תהודה (RRS). השתמשנו ב-RRS לכימות מצבי רדוקושן במיטוכונדריה ופיתחנו מדד לבריאות המיטוכונדריה, יחס המיטוכונדריה המופחת של רזוננס ראמן (3RMR), שמראה תגובה מהירה יותר לשינויים בחמצון מאשר אנליטים מסורתיים של גזי דם.

תקציר

למרות שהמיטוכונדריה היא מרכזית לפתוגנזה ולהתקדמות המחלה, תובנה מכנית לגבי דינמיקת בריאות המיטוכונדריה נותרת יקרה ובלתי נגישה. כדי להתמודד עם הפער הזה, מחקר זה משתמש בספקטרוסקופיית רזוננס ראמן (RRS) להערכת תפקוד המיטוכונדריה, באמצעות מערכת ניידת המספקת מדידות בזמן אמת, לא פולשניות וכמותיות של מצבי רדוקס ציטוכרום בכבד של חולדות. בפרוטוקול זה אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיה זו, כולל הגדרה, איסוף נתונים ועיבוד נתונים. מחקר זה מציג ניסוי הוכחת היתכנות המדגיש את יכולת RRS למדוד שינויים בזמן אמת במצב החמצון האדום המיטוכונדריאלי – ובהרחבה גם את תפקוד המיטוכונדריה. לזמן קצר, מכשיר ה-RRS חובר למשאבת לייזר וכן למחשב איסוף נתונים, והוצב במרחק של ס"מ אחד מכבד העכברוש. פרמטרי הרכישה נבחרו בהתאם לפרוטוקול כבד העכברוש; מצבי רדוקס נמדדו בתנאים מחומצנים ואיסכמיים באמצעות בדיקת מאמץ חמצן. שינויים במצבי רדוקס מיטוכונדריאלי נעקבו לאורך כל בדיקת מאמץ החמצן.

מבוא

מיטוכונדריה ממלאה תפקיד מרכזי בתפקוד התאים ובהומאוסטזיס. מיטוכונדריה היא המניעים העיקריים למטבוליזם תאי, ומווסת יצירת ATP באמצעות פוספורילציה חמצנית. הם גם משמשים כאברונים איתותיים שמכתיבים את גורל התא על ידי ויסות מסלולי אפופטוטיה, וכן כאותות ROS ו-Ca⁺² ¹. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עלול להוביל^למחלות נוירודגנרטיביות, שריריות וכלי דם ^שונות. למרות התפקיד הקריטי של המיטוכונדריה בהתקדמות המחלה, הערכת תפקוד המיטוכונדריה יכולה להיות פולשנית, יקרה ומוגבלת.

מדדים מרכזיים לתפקוד המיטוכונדריה, כגון קצב צריכת חמצן, פוספורילציה חמצונית ופעילות של קומפלקסים שונים בשרשרת העברת האלקטרונים (ETC), נמדדים באמצעות רספירומטריה. ה-ETC מורכב מארבעה קומפלקסים (I–IV) המשובצים בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה (IMM). קומפלקסים אלו, בעזרת קו-אנזימים אחרים, מעבירים אלקטרונים מסובסטרטים מצומצמים, כגון NADH ו-FADH2, למקבל האלקטרונים הסופי, O₂, שהופך למים. רוב בדיקות הספירומטריה העכשוויות, כמו Seahorse ו-Orobros O2k, דורשות עיבוד רקמות, מה שמגביל את יישמתן למחקר תרגומי ^4,5. מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית (MMP) היא שיטה נוספת להערכת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, המשתמשת בפלואורופורים ליפופיליים קטיוניים, כגון JC-1, יחד עם הדמיה מיקרוסקופית, כאשר הפיצוץ של מיטוכונדריה (בריאה) ובלתי מזווגת (פגועה) עם אורכי גל שונים⁶. עם זאת, בדיקות אלו יכולות להיות בעלות רגישות נמוכה⁵. הצבע עצמו יכול גם להיות בעל ציטוטוקסיות גבוהה בריכוזים גבוהים⁵. לבסוף, בדומה למדידות רספירומטריה, גם טכניקה זו דורשת עיבוד רקמה. טכניקות מבוססות ספקטרוסקופיה שימשו לאחרונה כשיטות לא פולשניות להערכת בריאות המיטוכונדריה. לדוגמה, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית זרחן (P-MRS), שיטה שמעריכה את חילוף החומרים התאים על ידי מדידת ריכוזי מטבוליטים המכילים זרחן, שימשה לאפיון רקמות אדיפוגניות מהונדסות העוברות התמיינות⁷. עם זאת, טכניקה זו דורשת גם ציוד מיוחד והכשרה.

הקבוצה שלנו הדגימה לאחרונה טכניקה בזמן אמת, לא פולשנית ומאוד ספציפית למדידת מצב חמצון רדוקסי מיטוכונדריאלי כסמן לחיותם של איברים באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן תהודה (RRS). RRS משתמש בפיזור לא אלסטי של פוטונים לכימות מצבי רדוקס של ציטוכרומים מיטוכונדריאליים. טבעות פורפירין בקטעי המים של מולקולות כמו ציטוכרומים מיטוכונדריאליים, המוגלובין ומיוגלובין מייצרות ספקטרום ראמן אופייני בהתאם למצב החמצון שלהן כאשר הן מעוררות^{עם לייזר} באורך גל של 441 ננומטר. למרות שמערכת RRS עושה שימוש באורך גל של 441 ננומטר, ניתן להשתמש גם בלייזרים עם אורכי גל של 420 ננומטר ו-405 ננומטר, שכל אחד מהם מחזק באופן מועדף קומפלקס ציטוכרום שונה. הספקטרום המתקבל מדגימה לא ידועה מושווה לספריות מוקלטות מראש של מיטוכונדריה שלמה מחומצנת לחלוטין או מופחתת, ומניבה את היחס בין מיטוכונדריה מצומצמת לכלל או את מצב הרדוקס הממוצע של ציטוכרומים ETC במקום . יחס זה מוגדר כיחס מיטוכונדריה מופחת של רמאן רזוננס (3RMR).

ישנם 3 חישובים/סוגים מובחנים של 3RMR: 3RMR מיטוכונדריאלי (mito-3RMR), 3RMR מרוכב III (cIII-3RMR), ו-3RMR מרוכב IV (cIV-3RMR). כל אחד מהאינדקסים הללו מחושב דרך השבר של המוקטן למספר הכולל של רכיב נתון. לדוגמה, ה-3RMR של cIII יהיה היחס בין cIII מופחת למספר הכולל של cIII ברקמה (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). אותו דפוס חל גם על cIV. לכן, 3RMR-cIII מתייחס ליחס בין cIII מופחת לכמות הכוללת של cIII, ו-3RMR-cIV מתייחס ליחס בין cIV המופחת לכמות הכוללת של cIV. באמצעות ניתוח רגרסיה, או שמצבי רדוקס מיטוכונדריאלי (מיטו-3RMR) מחושבים באמצעות ספריות ספקטרליות של מיטוכונדריה שלמה, או שמצבי רדוקס מורכבים בודדים (cIII-3RMR ו-cIV-3RMR) מחושבים באמצעות ספריות ספקטרליות cIII ו-cIV. פרסום עדכני^{בשם 9} הראה שמיטו-3RMR מייצג את הממוצע המשוקלל של מצבי החמצון האדום cIII ו-cIV (או cIII-3RMR ו-cIV-3RMR). חשוב לציין ש-cI ו-cII אינם פעילים ברמן או מוגברים בתהודה לאורך הגל של 441 ננומטר. כתוצאה מכך, הם אינם מחושבים בעת חישוב ה-mito-3RMR.

בהסתמך על סוגי 3RMR אלו, הגדרנו את טווח האופטימלי של 3RMR. באיברים "בריאים", המיטוכונדריה שלמה ויש לה אספקת חמצן מספקת. לעומת זאת, איברים פגועים עלולים לספק או לנצל חמצן בצורה לא מספקת, מה שגורם להצטברות אלקטרונים בקומפלקסים של ETC. הצטברות אלקטרונים גורמת ל"מאמץ רדוקטיבי," שמעביר את המיטוכונדריה ממצב מחומצן למצב מופחת ומעלה ערכי 3RMR. מספר מחקרים ^8,9,10,11,12 הנעים מלב וכבד במודלים של מכרסמים וחזיר, החלו להאיר את טווח ה"בריא" האופטימלי ל-3RMR, שמוצע להיות בין 10 ל-30. לדוגמה, פרי ואח' חשפו היפוקסיה בלבבות יונקים, כאשר 3RMR של 30% הוכח כמספק את האיזון האופטימלי לרגישות ולספציפיות לזיהוי רקמה היפוקסית⁸. מגמה זו אושרה עוד יותר במחקרים נוספים עם רקמת לב^11,12, ושתלי כבד¹⁰. בנוסף, ניוגן ואח' הראו שערכי 3RMR יורדים לערכים נמוכים מאוד (מחומצנים) ברקמות שבהן המטבוליזם נעצר, עם רמות 3RMR (7.667 ±± 4.926) של כבדים חמים-איסכמיים שאינם ניתנים להשתלה לאחר 3 שעות של פרפוזיה נורתורמית במכונה, לעומת ערכי 3RMR מעל 10 (~12–15) עבור כבדים חמים-איסכמיים טריים^{וניתנים} להשתלה 9.

מעבר להדגמות אלו של האופן שבו 3RMR יכול למדוד את חיוניות הרקמות, הרגישות, הספציפיות והקלות בשימוש ב-RRS הופכים אותו לרלוונטי מאוד לסוגי מחקר רבים אחרים שבהם מטבוליזם תאי ותפקוד מיטוכונדריה מושפעים. במחקרים קודמים, RRS שימש לזיהוי ניוון מקולרי וגלאוקומה בעכברים באמצעות הערכת הפעילות המטבולית של אקסונים לא מיאליניים של תאי גנגליון רשתית בראש עצב הראייה¹³. בנוסף, הוא שימש לזיהוי קוארקטציה של האאורטה (CoA) במודל חולדה של מחלת לב מולדת, אבחנה שלעיתים קרובות מתפספסת בסריקות לב של תינוקות¹². טכנולוגיה זו נוצלה להבנת תפקוד האיברים וחיוניותם בתנאים ניסיוניים שונים הרלוונטיים בתחום השתלת איברים, כולל מחקרים שהעריכו את חיוניות האיברים במכשיר ex vivo ^10,11, מעריכים חמצון מחדש לאחר אחסון קר סטטי¹⁴, או מפחיתים פגיעת רפרפווזיה בכבד חם-איסכמי⁹.

מאמר זה שואף לבסס את RRS ככלי רגיש בזמן אמת להערכת בריאות המיטוכונדריה. כבד שלם ממודל עכברוש עבר רמות שונות של איסכמיה וריפרפוזיה של חמצן כמבחן מאמץ להערכת תגובת המיטוכונדריה. בבדיקת לחץ חמצן זו, כבד טרי עובר 5 דקות של זרימת פרפוזיה ראשונית, 5 דקות של איסכמיה ו-5 דקות של רפרוזיה. 3RMR, וכן מדידות לקטט, K+, לחץ חלקי של חמצן (pO2) נערכו לאורך כל מבחן המאמץ. תגובה מהירה יותר לשינויים בחמצון נצפתה עם 3RMR בהשוואה לאנליטים מסורתיים של גזי דם. בניסויים אלו, השימוש ב-RRS מודגש לא רק למחקרים מכניים, אלא גם כשיטה אבחנתית וכבסיס ניסוי טיפולי. לכן, הפרוטוקול המשותף עשוי להיות שימושי למגוון חוקרים העובדים עם מיטוכונדריה. בסך הכל, RRS, בשל אופיו הלא-פולשני, בזמן אמת וספציפי מאוד, עשוי להשפיע משמעותית על חילוף החומרים התאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים לניסויים תוחזקו בהתאם להנחיות המועצה הלאומית למחקר ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס (בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב).

1. הקמה וניצול RRS

תיאור המכשיר:
הערה: מערכת RRS הניידת (Pendar Technologies; המוצר מיועד למטרות מחקר בלבד) משתמשת בלייזר 441 ננומטר בעקבות שיפור תהודה של ספקטרום הרמן של ציטוכרומים מיטוכונדריאליים עם אורך גל זה. הלייזר פועל בין 4 מיליוואט ל-8 מיליוואט.
1. חבר מקור גירוי לייזר לגלאי מותאם אישית באמצעות כבל סיב אופטי. הגלאי מאיר נקודה לייזרית בקוטר 2 מ"מ על הרקמה, ואוסף את הספקטרום הנפלט. הספקטרום עובר דרך מסנן מעבר פס ונאסף על ידי מערך התקן עם מטען (CCD). הספקטרום נאסף כל שנייה לאורך מסגרת זמן של 180 שניות וממוצע ליצירת ספקטרום גולמי ומופחת רעש לניתוח.
2. התוכנה משווה את הספקטרום שהושג לספריות ספקטרליות שנמדדו מראש באמצעות ניתוח רגרסיה.
הליך לספריות טרום-הקלטה
הערה: בניסויים שהוצגו במאמר זה, נוצרו ונעשה שימוש בספריות של צורות מצומצמות ומחומצנות של מיטוכונדריה, קומפלקס III, ומוגלובין IV, המוגלובין ומיוגלובינים. אותות ה-RRS של כל הספריות נלקחו בקופסה שחורה בטמפרטורת החדר (21 מעלות צלזיוס). קבצי הספרייה הללו מסופקים בנפרד עם תוכנת הניתוח. עם זאת, בהתאם לרקמה המעניינת ולנוכחות מולקולות נוספות הפעילות ברמן, ניתן ליצור ספריות נוספות על ידי התאמת הפרוטוקול הבא. ספקטרום RRS גולמי של המוגלובין, המיוגלובין וספריות III/IV מורכבות מחומצנות/מוקטנות מסופקות ב איור משלים 1.
1. ספריות המוגלובין (איור משלים 1C):
  1. לאסוף דם מכרסמים טרי באמצעות הדמם של בעלי חיים. חמצן את הדם שנאסף באמצעות 100% חמצן, או דה-חמצן באמצעות 100% חנקן, בקובט זכוכית, תוך הוספת נתרן דיתיונאט.
  2. מדדו את ה-RRS של כל מצב דרך קיר הזכוכית של הקובט למשך 10 דקות, כאשר הגשוש ממוקם 9 מ"מ מהקובטה הזכוכיתית.
  3. השתמשו בשיאים ספקטרליים ב-1356 ס"^מ-1כדי לאמת את המצב הנטול חמצן, והשתמשו בשיאים ב-1376 ס"^מ-1כדי לאשר את המצב המחומצן.
2. ספריות מיטוכונדריאליות מוקטנות/מחומצנות (איור 1)
  1. לבודד מיטוכונדריה מלבבות מכרסמים הומוגניים ומטוהרים בתוך קובטה מזכוכית. הניחו את הגשוש רמאן במרחק 9 מ"מ מהקובטה הזכוכיתית ומדדו את הספקטרום של המיטוכונדריה דרך קיר הזכוכית.
  2. ליצור תנאים מחומצנים לחלוטין על ידי מתן זרימת חמצן של 100% למיטוכונדריה. אמת את המצב המחונן דרך היעדר שיא RR מופחת ב-1357 ס"^מ-1.
  3. ליצור תנאים מצומצמים לחלוטין על ידי חשיפת המיטוכונדריה ל-100% חנקן עם כמויות קטנות של מימן גופריתי. אמת את התנאים המופחתים באמצעות היעדר שיא סמן RR מחומצן ב-1371 ס"^מ-1.
3. קומפלקס מחומצן/מופחת III/IV (איור משלים 1A,B):
  1. בודדו את קומפלקס III ו-IV כפי שמתואר במקומות אחרים ^9,15,16,17. בקצרה, השתמשו בדגימה סטנדרטית של מיטוכונדריה מבודדת (התואמת ל-200 ננומולים של ציטוכרום a) כחומר ההתחלה.
  2. דילל את המיטוכונדריה ל-10 ננומול ציטוכרום A/mL בבופר קר C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4,pH 8.45). לאחר מכן, הוסיפו 10% w/v n-β-D-dodecyl maltoside (DM) טיפה אחר טיפה לריכוז סופי של 1%, תוך ערבוב עדין על קרח.
  3. צנטריפוגה את התמצית ב-40,000 × גרם למשך 40 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מרח את הסופרנטנט על עמוד זכוכית בקוטר 2.5 ס"מ × 20 ס"מ שנארז בעבר בשרף החלפה מאוזן עם 5 נפחי בופר C (המכיל 0.02% w/v DM).
  4. לאחר שטיפה עם שני נפחי עמודות של בופר C, מבצעים קומפלקסים מיטוכונדריאליים נלוטים על ידי יישום גרדיאנט NaCl ליניארי של 0–400 מ"מ באותו בופר ואוספים את האלוט בשברים של 4 מ"ל.
  5. שברים ירוקים המכילים את קומפלקס IV יצאו קרוב לאמצע הגרדיאנט (~180 מ"ל NaCl), לפני השברים האדמדמים המכילים את קומפלקס III. ריכזו את החלקים המאוגדים המכילים כל קומפלקס ל-20–30 ננומולים ציטוכרום a/mL.
  6. לאחר בידוד הקומפלקסים הבודדים, חשפו כל אחד לתנאים מחמצנים ומפחיתים. הפחתת דגימה של 11 מ"מ של קומפלקס III בבופר טריס באמצעות 2 מ"ל אסקורבט (1 מ') להפחתת ציטוכרום c1 ו-2 מ"ל HS (הידרוסולפיט) להפחתה מלאה של ציטוכרומים b_L ו-b_H.
  7. הפחתת דגימה של 18.67 מ"מ של קומפלקס IV בבופר טריס במספר שלבים, שכן קומפלקס IV עובר תהליך חמצון קטליטי רב-שלבי. כדי להפחית את קומפלקס IV במלואו, יש להוסיף שני 2 מ"ל H₂O₂ (10 מ"מ), ואחריהם 2 מ"ל HS.
  8. אסוף ספקטרום ספרייה אחרי כל תוספת כדי ללכוד כל שלב במחזור. הוסיפו ספקטרום מחומצן ומצומצם לחלוטין לספריית הייחוס הסופית כדי לייצג את המצבים היציבים של קומפלקס IV.
  9. הכינו את כל הדגימות בבקבוקון זכוכית בנפח 1 מ"ל והחזקו אותן במיקום קבוע במרחק 9 מ"מ מעדשת הגשש, והכניסו אותן לקופסה שחורה כדי למנוע זיהום אור. אסוף ספקטרום RRS למשך 600 שניות לכל קומפלקס ומצב חמצון.
  10. אימות טוהר ה-cIII וה-cIV המבודדים כפי שתואר קודם¹⁷, ואמת את הספקטרום המבודד של cIII ו-cIV בהסבר הספקטרום המיטוכונדריאלי המלא כפי שתואר^{במאמר 9}.
4. ספריות מיוגלובינים (איור משלים 1D):
  1. באמצעות זרימות דומות של חמצן וחנקן (עם נתרן דיתיוניט מומס), ניתן לשנות את רוויית האוקסימיוגלובין של תמצית המיוגלובין של שריר הלב בין 0% ל-100%. אמת את ספקטרום רמאן דרך שיאי הסמן ב-1355 ס"^מ-1ו-1376 ס"^מ-1.

הערה: רוב הרכיבים הספקטרליים שתוארו לעיל, כמו המוגלובין או מיטוכונדריה מחומצנת/מופחתת, הם מולקולות המכילות ההם ומונעות על ידי אותו אורך גל. מערכת RRS זו מונעת חפיפת אותות על ידי יצירת ספריית רגרסיה לכל מולקולה המבוססת על האות הספקטרלי הייחודי שלה. הספקטרום המפוזר שמתקבל מועבר דרך אלגוריתם רגרסיה מול הספריות הנבחרות. אלגוריתם הרגרסיה נותן גורם לכל ספקטרום ספרייה שמייצג את ההערכה הטובה ביותר של תרומתו היחסית לספקטרום המתועמד, ולכן את הריכוז היחסי שלו ברקמה. מכיוון שהאלגוריתם משתמש בהתאמה הטובה ביותר בטווח של מספרי גלים, הבדלים קטנים במיקום או בעוצמת השיאים הספקטרליים של רכיבי הספרייה השונים מאפשרים לרגרסיה להבחין גם בכרומופורים קרובים זה לזה. באמצעות אלגוריתם הרגרסיה וספריות ספקטרליות, מערכת RRS יכולה לפרק את האות הכולל המפוזר לרכיבים שונים בהתאם לשיאים הספקטרליים הייחודיים שלהם, ולמנוע חפיפת אות ממולקולות המכילות הם. כדי להראות את הקשר בין המוגלובין למיטוכונדריה, מצורף איור משלים 2 , המספק תמונות של ספקטרום שנלקחו מפרפוזיה בכבד, מחוברים לאות הנמדד, קו ההתאמה הטובה ביותר, והשאריות הבלתי מוסברות הנובעות מהבדלים בשיאים הספקטרליים הבודדים. בפאנל A נבחרות ספריות רגרסיה של המוגלובין מופחת ומחומצן ושל מיטוכונדריה מופחתת ומחומצנת. קו ההתאמה הטובה ביותר שנבחר דרך הספריות וניתוח הרגרסיה חופף בצורה מסודרת לאות הנמדד, וכמעט ואין שאריות בלתי מוסברות. בפאנל B, נבחרות רק ספריות מיטוכונדריה מחומצנות ומוקטנות. מכיוון שיש מבנה שאריתי גדול ובלתי מוסבר, שיא הספקטרום של המיטוכונדריה מוזז במספר מספרי גל מזה של ההמוגלובין, שלא נכלל בניתוח הרגרסיה. יתרה מזאת, באיורים המשלימים של נגויין ^{ואח' 9}, המחברים מסבירים את הקשר בין מיטוכונדריה לבין הקומפלקסים הבודדים (cIII ו-cIV), וכן את הקשר בין קומפלקסים¹⁶ בודדים, שבהם קומפלקס III מציג שיאים חדים בתדר נמוך, בעוד שקומפלקס IV מציג פסים רחבים ומוזרים כלפי מעלה. יתרה מזאת, המחברים מראים כי ספריות Complex III ו-Complex IV המופחתת מסבירות במלואן את הספקטרום הנמדד של מיטוכונדריה שלמה מופחתת, מה שמוביל לשאריות מינימליות בלתי מוסברות.

figure-protocol-1
איור 1: ספריות ספקטרליות של מיטוכונדריה מחומצנת ומצומצמת לחלוטין. ספקטרום ספריית RRS הושגו לאחר שהמיטוכונדריה המבודדת סופקה (A) 100% חמצן, או 100% חנקן (B) כדי להגיע למצבים מחומצנים ומופחתים, בהתאמה. מצבים אלו אושרו בנוכחות שיאי סימנים מחומצנים ומצומצמים (D) RR (C). ההזזה בפסגות אלו תואמת לשינויים במצבי רטט מולקולריים בנוכחות חמצן. עוצמת כל שיא מנורמלת ליחידת עוצמה שרירותית אחת (AU), שכן ההגברה של המצב המופחת גדולה יותר באמצעות אורך גל העירור של 441 ננומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. איסוף נתונים באמצעות RRS

הגדרת המכשיר:
1. חבר את יחידת הספקטרומטר (הממוקמת בתוך קופסה קומפקטית) לספק הזרם הישר (DC) ולמתאם הכוח באמצעות הכבלים המסופקים. ליחידת הספקטרומטר יש פקק עגול אחד עם שקעי יישור.
2. יישר את השקעים של השקע העגול עם אלו של הכבל שמחובר למתאם הכוח. אין צורך בניקוי לפני חיבור היציאה (איור 2).
3. חבר את המחשב שמבצע את הניתוח לאותו מתאם כוח שמחבר את הספקטרומטר לספק הכוח באמצעות הכבלים שסופקו.
4. הנח את גלאי הלייזר במחזיק הגשוש. כוון את מיקום הגשוש בתחילת הניסוי.
5. פתח את תוכנת הבקרה של הספקטרומטר (תוכנת אנרגטיקה תאית).
הגדרת תוכנה:
הערה: קבצי הגדרות וספריות רגרסיה לסוגים שונים של רקמות מסופקים במערכת. קבצים אלו כוללים מידע על אילו ספריות מערכת RRS צריכה לכלול ברגרסיה, כמה ספקטרום כלולים בחלון הרגרסיה, ופרמטרים נוספים כגון עוצמת לייזר. ניתן לשנות את הגדרות ברירת המחדל ולשמור קובץ הגדרות חדש לשימוש בניסויים עתידיים. צילומי מסך של התוכנה המפורטות להלן מוצגים באיור משלים 3.
1. עם פתיחת תוכנת בקרת הספקטרומטר, יופיע גרף המציג אחוז 3RMR, רוויית חמצן (StO₂) ורוויית מיוגלובין. מסך זה הוא המקום שבו המדדים הללו יוצגו, אם ייבחרו, בזמן אמת לאורך כל המדידות. לחצו על לשונית ההגדרות בפינה השמאלית התחתונה של הדף.
2. בלשונית המידע , הזן מידע על סשן תחת שם הסשן, וכל הפרטים הנדרשים בלשונית תיאור הסשן .
3. ישנם שני מצבי איסוף נתונים. השתמש במצב בדיקת נקודות לצבירת ספקטרות עד שמטרות איכות מוגדרות (למשל, סיגמה יעד או חלון רגרסיה/מספר ספקטרות), ואז עצור את הקלטה. השתמש במצב רציף כדי להקליט ספקטרות עד ללחיצה על כפתור העצירה. בשני המצבים, כל הנתונים, הן תוצאות 3RMR והן ספקטרום בודד, נשמרים אוטומטית. ניסוי זה עושה שימוש במצב רציף.
4. לאחר שכל המידע על הסשן מוזן, לחץ על לשונית המערכת .
5. תחת קובץ הגדרות, בחרו את הפרוטוקול המתאים לפרויקט (עבור פרפוזיה בכבד חולדה ללא תאים, בחרו בפרוטוקול כבד חולדות ). זה יתאים אוטומטית את סוג המדידה, אורך המדידה הממוצע (חלון רגרסיה), וכן את הסיגמה המטרה.
  1. כדי ליצור קובץ הגדרות חדש, התאימו כל אחד מהרכיבים שצוינו למעלה, ואז לחצו על כפתור השמירה . זה אמור לשמור את הפרמטרים האלה כקובץ הגדרות נפרד שניתן לייבא למערכת.
  2. כדי לייבא קובץ הגדרות חדש, לחץ על התפריט הנפתח ליד ברירת מחדל (מוד) ובחר ייבוא קובץ הגדרות חדש. לחץ על קובץ ההגדרות החדש כדי לייבא.
6. בספריות רגרסיה, בחרו ואשרו את שילוב הספריות שישמשו לרכישת נתונים וניתוחים. הספריות למיטוכונדריה מצומצמת ומחומצנת [רק מיטו] נבחרו לניסוי זה. משתמשים אחרים עשויים לבחור להשתמש בספריות הכוללות גם המוגלובין, מיוגלובין או קומפלקסים אחרים שנמצאים תחת Advanced Library.
7. בחר ואשר את מצב רוחב החלון המועדף.
  1. מצב רוחב אדפטיבי: השתמשו במצב רוחב אדפטיבי כדי להוסיף ספקטרום בודד לספקטרום הממוצע עד שמגיעים ליעד הסיגמה המקסימלי. אם יעד הסיגמא לא מושג, ההקלטה תיפסק כאשר היא מגיעה לגבול העליון של חלון הרגרסיה הקבוע (כלומר, מספר הספקטרום המרבי שנאמר לה להקליט). תוצאות המדידה יוצגו על המסך לאחר השגת יעד הסיגמא המינימלי.
  2. מצב רוחב קבוע: השתמש במצב רוחב קבוע כדי להוסיף ספקטרום בודד לספקטרום הממוצע עד שמספר הספקטרום היעד ייכלל (מוגדר מתחת לאורך ממוצע).
8. לאחר שההגדרות של המערכת מסתיימות, לחצו על לשונית העלילה .
9. תחת הסדרה הראשית, בחרו את הרכיבים שיש להציג ולהציג על המסך במהלך המדידות.
10. אשר שכל רכיבי המדידה שנבחרו תואמים לפרוטוקול הרלוונטי.
רכישת נתונים:
הערה: מדידות ראמן צריכות להתבצע בחלל חשוך. לפני תחילת איסוף הנתונים, ודאו שסביבת העבודה מוגנת ככל האפשר מאור. אם החדר לא יכול להיות מוגן לחלוטין מהאור, מערכת RRS מגיעה עם כיסוי שחור עם פתח מלבני במרכז (מוצג ב- איור 2), דרכו ניתן להניח את גשוש הלייזר. הקופסה יכולה לכסות את הדגימה/החלק של האורגן שממנו נלקחות מדידות RRS. בעת עבודה עם לייזר RRS, הימנעו מחשיפה ישירה או ממושכת לעיניים. אל תאיר לייזר ישירות לעין או על משטחים מחזירי אור. הפעילו את הלייזר רק כאשר הוא ממוקם ישירות על הרקמה הרלוונטית. לייזר RRS הוא לייזר מחלקה 3R כאשר הוא בשימוש בהספק של 4 mW, ו-Class 3B כאשר הוא בשימוש בהספק של 10 mW. הלייזר בטוח למגע רקמה.
1. בחר את ההגדרות המתאימות והשמורות מראש, פרמטרי ההקלטה וקבצי הספרייה.
2. הנח את גלאי הלייזר ישירות מעל הרקמה/האיבר הרלוונטי. מקם את הגשוש בניצב האפשרי ובמרחק של ס"מ אחד מהרקמה. השתמש בסרגל כדי למדוד בדיוק 1 ס"מ מפני האורגן. כוון את הגשוש כך שיהיה קרוב יותר מ-1 ס"מ אם האות לא ברור. עם זאת, ודאו שהגשוש לעולם לא נוגע ברקמה.
  הערה: הגשש יכול להיות ביד, אך מומלץ להשתמש במחזיק/מעמד לבדיקה שניתן לכוונן ולשמור על יציבות. מקם את הגשוש בניצב האפשרי ובמרחק של ס"מ אחד מהרקמה. סרגל יכול היה לשמש למדידה מדויקת של 1 ס"מ מפני האורגן. ניתן היה לכוון את הגשוש כך שימקם קרוב יותר מ-1 ס"מ אם האות אינו ברור. עם זאת, הגשוש לעולם לא צריך לגעת ברקמה.
3. וודא שנקודת הלייזר נמצאת באונה השמאלית הצידית, קרוב ככל האפשר לווריד הפורטלי.
4. אשר שכל הספריות הנבחרות, הגדרות הרגרסיה, סיגמא היעד, חלון הרגרסיה ומצבי הרכישה נכונים וכפי שרצוי.
  1. תוודא שהחדר חשוך ככל האפשר. ודאו שהגשושית אינה מכילה זיהום, במיוחד דם, על החלון. במקרה של זיהום, השתמש במגבון ללא סיבים ולא שוחק עם אלכוהול איזופרופיל 70% לניקוי חלון הקוורץ, ולאחר מכן ייבוש יסודי עם מגבון יבש לפני הממשיך.
  2. במקרה של זיהום כבד, נגב את הגשוש ביסודיות ככל האפשר, כפי שתואר לעיל. לאחר מכן, כייל את המכשיר על ידי הנחת הלייזר במארז כהה עם סרט שחור ולחיצה על כפתור Take Dark . הכיול נמשך כ-5–10 דקות. בלי קשר לזיהום, כייל את המכשיר פעם בחודש, והוא ישלח הודעות תזכורת אוטומטיות.
    הערה: ההסברים של כל מדד בקרת איכות, דוגמאות למדדי בקרת איכות כאלה, והאות הספקטרלי הגולמי שהתקבל מהקלטות אופטימליות ופחות אופטימליות (קובץ משלים 1, איור 3, איור משלים 3). קריטריוני בקרת האיכות הללו הותאמו לכבד שלמים מתוך מודל העכברים. כל פרוטוקול חדש שפותח המשתמש במודל איבר/חיה שונה אמור לחדד ולהתאים את המדדים הללו בהתאם.
5. בעמוד הראשי, לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל לאסוף נתונים. בהתאם להגדרות שנבחרו, התוכנה תיקח הקלטות עד שערך השגיאה היעד (סיגמא) או 180 שניות. איסוף הנתונים הושלם.
  1. הסיק את איכות אות RRS מהגרפים והערכים הללו כדי לאפשר התאמת מיקום הגשוש או תנאי המדידה (איור 3). אם אות ה-RRS שהתקבל לא עומד בקריטריוני בקרת האיכות הללו, כוונו את הגלאי להיות מאונך ככל האפשר וכ-9 מ"מ מהמשטח לחלון הגשוש.
6. לאחר סיום פרוטוקול איסוף הנתונים/הניסוי, זרקו את כל הכבד/רקמה לתוך מיכל ביו-סיכון. נקה כל מערכת או משטח שהיה במגע עם האיבר/הרקמה עם 70% אתנול.
  1. אם עובדים עם מערכת פרפוזיה, יש להפעיל מי DI מעורבב עם חומר ניקוי אנזימטי (7.8 מ"ל מדולל ב-1 ליטר מים מנותק [DI]), ואחר כך מים נקיים עם DI.
    הערה: כל הקלטה תישמר כקובץ ניתוח נפרד תחת קובץ סשן חדש. תוצאות של 3RMR ועוצמת האות המיטוכונדריאלית (r3RMR) מוצגות בחלון הראשי. ניתן גם להציג את הספקטרום הגולמי. מדדי בדיקת איכות נוספים, כגון עוצמת אות שארית ועוצמת אות כוללת, יוצגו תחת לשונית הספקטרום .
ניתוח נתונים:
1. לאחר סיום איסוף הנתונים, לחץ על תיקיית הסקירה בתחתית המסך כדי לפתוח את קובץ הניסוי ולראות את התוצאות.
2. חלופה נוספת היא לפתוח קובץ טקסט שמכיל את התוצאות. בחר את קובץ הסשן שמעניין אותו. קובץ ניתוח הכולל את כל המדידות שהושגו ייפתח. לכל פרמטר וערך הסיגמא שלו יהיו עמודה משלו. לדוגמה, ערכי 3RMR שמתקבלים בכל שנייה יופיעו תחת העמודה "3RMR", וערך הסיגמא שלו יופיע תחת "sigma_3RMR".
3. השורה האחרונה בכל עמודה תכיל את הערכים הסופיים של כל פרמטר בקובץ הסשן הזה. השתמש בערך זה כדי לשרטט.
4. חזור על השלבים עבור כל קובץ סשן/כל הקלטה. הגרף קיבל ערכים לפי הרצון.

figure-protocol-2
איור 2: הגדרת מכשיר RRS. סכמטיקה של מערכת RRS. הגשוש מחובר באמצעות כבל סיב אופטי למערכת RRS, הכוללת את מקור ההתעוררות בלייזר ואת הספקטרומטר. הגדרה זו מתחברת לכל מחשב נייד שמכיל את אפליקציית בקרת הספקטרומטר לאיסוף וניתוח נתונים. גם המחשב וגם יחידת הספקטרומטר מחוברים לשקע חשמל. מדידות RRS צריכות להתבצע בחושך. אם החדר לא יכול להיות מוגן לחלוטין מאור, מערכת RRS מגיעה עם כיסוי שחור עם פתח מלבני במרכז, שבו ניתן למקם את גלאי הלייזר. הקופסה מכסה את הדגימה/החלק של האיבר ממנו נלקחות מדידות ה-RRS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-3
איור 3: דוגמאות למעקבים ומדדי בקרת איכות של עקבות איכות תת-אופטימלית ואיכות אופטימלית. האות השאריתי (הרעש) מסומן בסוגר כתום, והאות המיטוכונדריאלי מסומן בסוגר ירוק. (א) דוגמה למעקב מאות ראמן תת-אופטימלי. האות השאריתי גדול מדי כדי להבדיל אותו מהאות המיטוכונדריאלי. פסגות ספקטרליות אינן ניתנות להבחנה בכל האות הנמדד. (B) דוגמה לעקבות מאות ראמן אופטימלי. האות המיטוכונדריאלי נראה גדול יותר ומובחן מהאות השאריתי. פסגות ספקטרליות מהמדידה שהושגה ניתנות להבחנה. (ג) מדדי בקרת איכות שהושגו מכל אות. בסך הכול, האות הכולל שמתקבל בקריאה תת-אופטימלית קטן מהקריאה האופטימלית. יותר אות מיטוכונדריאלי נמדד בהקלטה האופטימלית בהשוואה להקלטה תת-אופטימלית, כאשר אות מיטוכונדריה מהווה 17% ו-14% מסך האות, בהתאמה. האות נמדד עם 4.3% שגיאה בקריאה האופטימלית, לעומת 18.5% שגיאה בקריאה הלא אופטימלית. באופן דומה, אות שאריתי בלתי מוסבר מהווה 11% מסך האות בהקלטה הלא אופטימלית, בעוד שהוא מהווה 3.6% בהקלטה האופטימלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הערכת בריאות המיטוכונדריה באמצעות RRS

הערה: טכנולוגיית ספקטרוסקופיית רזוננס ראמן (RRS) שימשה לפיתוח מדד חיוניות מיטוכונדריאלי (3RMR) שמצביע על כדאיות איברים מושתלים. מחקר זה שואף להראות כיצד שינויים בחמצון – ובהרחבה גם בנשימה התאית – משתקפים במגמות 3RMR בהשוואה לסמנים ביולוגיים מסורתיים של נזק, כגון לקטט ו-K⁺. כאן נעשה שימוש במבחן מאמץ חמצן, שבה, לאחר 5 דקות של זרימה רציפה, זרימת הדפק המחומצן נעצרת ל-5 דקות, ואז ממשיכה ל-5 דקות. מדידות RRS, וכן דגימות פרפוזאט נכנס ויוצא, נלקחות לאורך כל מבחן המאמצ.

רכישת כבד:
1. הרגעת בעלי חיים בתא השראה באמצעות איזופלורן של 3%–5%. סנן אדים עודפים עם פחם פעיל.
2. בצע כריתת כבד מלאה על זכרי חולדות לואיס (150 גרם). לחבר את ענפי וריד הפורטל. הזריק 50 U של סודיום הפארין דרך ה-IVC. במהלך הניתוח קנול את וריד הפורטל עם קטטר של 16G ושטוף את הכבד ב-50 מ"ל של מי מלח.
3. מניחים את הכבד שנרכש על קרח בצלחת פטרי המכילה 30 מ"ל תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW).
הגדרת פרפוזיה מכונה תת-נורמתרמית (SNMP) ומדידות ראמן תהודה:
1. הגדר את מכשיר ה-RRS כפי שתואר קודם. הגדר את פרוטוקול כבד העכברוש האסלולרי בתוכנת בקרת הספקטרומטר, שמגדירה אוטומטית את מצב הרוחב לרוחב אדפטיבי, אורך ממוצע ל-180, וסיגמא יעד ל-1.5. הוא גם בוחר 3RMR ופלואורסצנציה כפרמטרי מדידה, וכן ב-Mito בלבד כספריית רגרסיה. הגדר את מצב הרכישה למצב רציף.
2. הגדר את מערכת SNMP כפי שמתואר במקום אחר¹⁸.
  1. בקצרה, ודא שמערכת הפרפוזיה כוללת תא פרפוזיה, משאבה פריסטלטית, חמצן ממברנה ומלכודת בועות.
  2. לספק חמצן עם תערובת אטמוספירית (95% חמצן₂ ו-5%_CO2); שמור על_{pO 2} בין 400–500 מ"מ כספית. יש לנטר את הלחץ התוך-כבדי עם חיישן לחץ ולשמור על עוצמה שבין 3–5 מ"מ כספית. אסוף את הדגימות דרך פורטי דגימה.
3. לאחר שהתוכנה ומערכת הפרפוזיה מוגדרות, חבר את הקנולה החודרת ל-PV לצינור הזרימה של מכונת הפרפוזיה. שמרו על האיבר, הפרפוזאט והפרפוזיה בטמפרטורת החדר (21 מעלות צלזיוס), ללא עזרה באמבט מים.
4. העבירו את הפרפוזאט לאיבר דרך הקנולה ב-PV באמצעות משאבה פריסטלטית.
  1. להכנת הפרפוזאט, ערבבו 500 מ"ל של Williams' Medium ללא פנול אדום עם 5 גרם אלבומין סרום בקר (BSA), 12 מ"ג דקסמתזון מסיס במים, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 5 מ"ל L-גלוטמין, 2.5 מיקרוליטר אינסולין ו-1000 U הפארין.
  2. ערבב את כל הרכיבים על צלחת ערבוב במשך כ-20 דקות, או עד שכל הרכיבים נמסים. הגבר את זרימות הפרפוזיה ללחצים של 3–5 מ"מ כספית.
5. לאחר מכן, מניחים את מקור הלייזר של RRS במחזיק הגשוש ומקמו אותו בגובה 1 ס״מ מעל האונה הגדולה ביותר של הכבד, קרוב ככל האפשר ל-PV. הפסק את זרימת הפרפוזיה ב-5 דקות (T₅) והמשך ב-10 דקות (T₁₀). בצע את מבחן המאמץ ב-15 דקות (T₁₅).
6. בצע מדידות RRS לאורך כל מבחן המאמץ; בצע מדידות זרימה נכנסת ויוצאת כל 5 דקות, החל מ-T₀(איור 4). צייר את ערכי 3RMR, וכן רמות K⁺ ויציאות לקטט עבור T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (איור 5).
7. חישבו את קצב צריכת החמצן (OCR) ב-T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15} על ידי הכפלת לחץ חלקי של הזרימה והיציאה של החמצן (pO₂) במקדם המסיסות של חמצן בפלזמה (0.00314). שרטט את ה-OCR עבור T₀, T₅, T₁₀, T₁₅(איור 5).
  הערה: מוצגים עקבות ספקטרליות של ראמן תהודה במצביםמופרדים (T₅), איסכמיים (T₁₀) ומזורזים (T₁₅) מאחד הכבד (איור 6)

figure-protocol-4
איור 4: דיאגרמה המתארת זרימה ניסויית. בוצעה כריתת כבד מלאה על נקבות חולדות לואיס. הכבד שהושג הונח על פרפוזיה מכונית תת-נורמית וסופק לו פרפוזאט מחומצן במשך חמש הדקות הראשונות. הפרפוזאט זורם לכבד דרך וריד הפורטל ומחזור דרך המשאבה הפריסטלטית (זרימת פרפוזיה המתוארת בחצים כחולים). ההזרמת החמצן הופסקה לחמש הדקות הבאות ב-T5 וחודשה לעוד 5 דקות ב-T10. מדידות 3RMR נלקחו לאורך מבחן המאמץ (המוצגות כלייזר). דגימות פרפוזאט נאספו ב-T0, T5, T10 ו-T15. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כבדים טריים עברו תקופות של איסכמיה וריפרפוזיה באמצעות בדיקת עומס חמצן. לאחר מכן, השינויים בזמן אמת ב-3RMR הושוו לאורך מבחן המאמץ לקצב צריכת חמצן, זרימת לקטט ויציאה ואשלגן שהתקבלו מניתוח פרפוזאט ב-T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15}. בתנאים בריאים, ערכי 3RMR צפויים להיות בין 10% ל-30% (איור 5A). כצפוי, ערכי 3RMR ב-T₀ _{ו-T 5} נמצאים בטווח זה, שכן הכבד סופק ברציפות בפרפוזאט מחומצן בין נקודות הזמן הללו (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מדגיש שיטה לא פולשנית, בזמן אמת ורגישה מאוד לכמת את בריאות המיטוכונדריאה באמצעות מערכת ספקטרוסקופיית רמאן תהודה ניידת, המורכבת מלייזר בתוך גלאי קומפקטי, המחובר בכבל סיב אופטי למשאבת לייזר. שיטה זו השתמשה בלייזר של 441 ננומטר כדי לעורר מיטוכונדריה, שמייצרת אותות ספקטרליים ייחודיים בהתאם למצב החמצון שלהן. לכן, RRS מסוגל לכמת כל מצב של מיטוכונדריה באמצעות חתימות ספקטרליות ולהשוות את הספקטרום הנפלט לספריות ספקטרליות שנמדדו מראש באמצעות ניתוח רגרסיה. לאחר מכן נוצר מדד בריאות מיטוכונדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על אינטרסים מתחרים. ל-S.N.T ול-P.R. יש בקשות פטנט זמניות הרלוונטיות למחקר זה. P.R. הוא עובד ובעלי מניות של Pendar Technologies. שירותי S.N.T מנוהלים על ידי MGH ו-Partners HealthCare בהתאם למדיניות ניגוד העניינים שלהם. האינטרסים המתחרים של ג'.נ.ק מנוהלים על ידי מדיניות ניגוד העניינים של BCH. הטכנולוגיות הפטנטיות הבאות שימשו במחקר זה: US2020/0281474A1 ניטור Invivo של אנרגטיקה תאית באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן (יישום). הוגשו בקשות פטנט נוספות לשימוש באופתלמולוגיה, חיוניות רקמות והערכת פציעות כוויות באמצעות ספקטרוסקופיית רזוננס ראמן, כאשר ר.ג'יי. הוא גם ממציא.

תודות

עבודה זו נתמכה במימון נדיב ל-S.N.T. מהמכון הלאומי לבריאות של ארה"ב (R01DK134590). אנו גם מודים בהכרת תודה למימון ל-S.N.T מהמכון הלאומי לבריאות ארה"ב (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), הקרן הלאומית למדע (EEC 1941543), קרן משפחת פולסקי, ו-Shriners Children's Boston (מענק #BOS-85115). בנוסף, אנו מודים במימון ל-R.J. באמצעות Grant #LIFER23-263034 מקרן האגודה האמריקאית לחקר מחלות כבד. המחברים מביעים תודה עמוקה על התמיכה המומחית מליבת הפתולוגיה בבית הספר לרפואה של הרווארד ללימודי היסטולוגיה. ברצוננו להביע את תודתנו לד"ר רוברט בלבן וד"ר ארמל פמנו מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של NIH על מומחיותם באנרגטיקה מיטוכונדריאלית ועל סיורם החשוב בפיתוח ספריית RRS של קומפלקסים בודדים למיטוכונדריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	משמש לקנולציה של וריד הפורטל
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	משמש לסינון אדים עודפים במהלך הרדמה
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	הרכב תמיסת השטיפה
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	הרכב תמיסת השטיפה
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	הרכב תמיסת השטיפה
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	משמש לזרימת תמיסת השטיפה דרך הכבד
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	משמש לזרימת תמיסת השטיפה דרך הכבד
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	משמש לחמצון תמיסת השטיפה.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	הרכב תמיסת השטיפה
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	לניתוח גזים בדם
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	פנה ל-Pendar Technologies לשאלות בנוגע למוצר זה

מקורות

San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

234 234

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

עדכנו אותי: