מאמר שיטה

בניית אורגנואידים של סרטן השד האנושי וכימות נזק DNA שנגרם על ידי דוקסורוביצין מבוסס בדיקת שביט

66 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

28 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מקים מודל אורגני של סרטן השד (BCOs) ומעריך באופן כמותי נזק DNA שנגרם על ידי דוקסורוביצין באמצעות בדיקת השביט. הוכחת היתכנות יישום מבחן השביט על BCOs, ומסופקת זרימת עבודה ניתנת לשכפול, הרחבה ותפעולית לזיהוי נזק DNA שנגרם על ידי DOX ב-BCOs.

תקציר

סרטן השד הוא הממאירות השכיחה ביותר בקרב נשים ברחבי העולם ומציג הטרוגניות משמעותית. דוקסורוביצין (DOX) נמצא בשימוש נרחב בטיפול בסרטן השד, ומנגנון הפעולה העיקרי שלו הוא גרימת שברים כפולי גדילי DNA והפעלת מוות תאי. בפרוטוקול זה, הוקם מודל BCO אנושי להערכת נזק DNA שנגרם על ידי DOX באופן כמותי. תאי סרטן השד הראשוניים בודדו מרקמות גידול שמקורן במטופל באמצעות דיסוציאציה מכנית ואנזימטית, ולאחר מכן תורבדו במטריצה תלת-ממדית ליצירת BCO. אורגנואידים טופלו לאחר מכן ב-8 מיקרומום DOX למשך 2 שעות. נזקי DNA הוערכו לאחר שעתיים של טיפול. לאחר הטיפול, אורגנואידים פורקו לתאים בודדים, הוטמעו באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה, ואלקטרופורזה בתנאים בסיסיים. לאחר האלקטרופורזה, דפוסי נדידת ה-DNA הוצגו כמבני שביטים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונותחו כמותית באמצעות תוכנת OpenComet כדי לקבוע את אחוז ה-DNA בזנב (% DNA בזנב). בדיקת השביט זיהתה בהצלחה נזק ל-DNA ב-BCOs. בהשוואה לקבוצת הביקורת, BCO שנחשפו ל-8 מיקרומול DOX במשך שעתיים הראו זנבות שביטים מוארכים לאחר פירוק אורגנואידים ואלקטרופורזה. ניתוח כמותי גילה שאחוז ה-DNA בזנב היה גבוה משמעותית בקבוצה המטופלת, מה שמעיד על השראת נזק DNA. שיטה רגישה זו תומכת במחקרים טוקסיקולוגיים ופרמקודינמיים של DOX ומספקת פלטפורמה טכנית איתנה להערכת נזק DNA במערכות BCO שמקורן במטופלים.

מבוא

סרטן השד הוא גידול ממאיר שנוצר מרקמות אפיתל של השד עקב שינויים גנטיים, חוסר ויסות הורמונלי וגורמים פתוגניים נוספים. זהו הממאירות הנפוצה ביותר בקרב נשים ברחבי העולם ומציג דפוסים אפידמיולוגיים ייחודיים והטרוגניות תוך-גידולית משמעותית 1,2. DOX, חומר כימותרפיה קו ראשון, משתלב ב-DNA, מעכב את פעילות טופויזומרז II וגורם לשבירת גדילי DNA, ובסופו של דבר גורם לאפופטוזיס בתאי הגידול3. מערכות תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות מוגבלות ביכולתן לשחזר את הארגון התאים המורכב וההטרוגניות של גידולי השד. לעומת זאת, BCOs הם מבנים תלת-ממדיים שמקורם ברקמות הגידול של המטופל ושומרים על המאפיינים המרכזיים של הגידול המקורי, כולל הרכב תאי, ארכיטקטורת הרקמה ופנוטיפים מולקולריים. ראוי לציין כי מודלים של BCO מראים התאמה גבוהה לתגובות קליניות לתרופות; עבור סוכן טיפולי מסוים, ההתאמה השלילית בתגובה מגיעה ל-100%, והתאמה חיובית מגיעה ל-98% בין BCOs למטופל המתאים4.

BCOs משמשים כמודל מתקדם במבחנה המשקף תכונות מבניות ותפקודיות מרכזיות של גידולים ראשוניים ומשמשים באופן נרחב לחקר גידולים, התקדמות מחלה ועמידות טיפולית5. התחלת גידול בסרטן השד מתבססת בדרך כלל על השבתה שיתופית של גנים מדכאי גידולים מרובים, כגון TP53, PTEN, RB1 ו-NF1, שכן שינויים בגן יחיד אינם מספיקים כדי להניע טרנספורמציה ממאירית של אפיתל שד תקין. תהליך זה מלווה באובדן קוטביות תאים, בלבול ארכיטקטוני והתרבות בלתי מבוקרת 6,7,8.

מבחן השביט (המכונה גם אלקטרופורזה ג'ל חד-תאית, SCGE) היא שיטה קלאסית להערכת נזק ל-DNA ברמת התא היחיד. הטכניקה הוצגה לראשונה על ידי רידברג ויוהנסון בשנת 1978, ולאחר מכן שופרה על ידי אוסטלינג ויוהנסון, שהקימו את מבחן השביט הנייטרלי לזיהוי שבירות כפולות של DNA. בשנת 1988, סינג ועמיתיו שילבו תנאי אלקטרופורזה אלקלית, שאפשרו זיהוי שברים חד-גדיליים ב-DNA, אתרים א-בסיסיים ונגעים אלקליים-גמישים, מה שהרחיב משמעותית את יישום הבדיקה9. העיקרון הבסיסי של מבחן השביט הוא שניידות האלקטרופורטית של DNA תלויה בשלמות ה-DNA. לאחר הטמעת אגרוז ופירוק להסרת ממברנות וחלבונים תאיים, קטעי DNA פגומים נודדים לעבר האנודה במהלך האלקטרופורזה ויוצרים "זנב שביט", בעוד ש-DNA שלם נשאר קרוב לאתר הטעינה ויוצר את "ראש השביט"10. פרמטרים כמו אורך הזנב, אחוז ה-DNA של הזנב (% DNA בזנב) ומומנט זנב הזית מאפשרים הערכה חצי-כמותית או כמותית של נזק DNA, וניתן להשתמש בעיצובים ניסיוניים לאורך זמן להערכת יכולת תיקון DNA. עקב רגישותו הגבוהה, דרישות הקלט הדגימה הנמוך והפשטות הפרוצדורלית היחסית, מבחן השביט שימש רבות בטוקסיקולוגיה גנטית, ביולוגיה של סרטן ומחקרי תגובת תרופות, במיוחד להערכת נזק ל-DNA הנגרם על ידי תרופות כימותרפיות וקרינה, וכן למנגנוני עמידות לתאי הגידול. הבדיקה רגישה מאוד לתנאי ניסוי ולשונות פרוצדורלית, והשחזוריות וההשוואה בין מעבדות תלויות בתהליכי עבודה סטנדרטיים וניתוח תמונות אוטומטי11. בשנים האחרונות, שילוב תוכנות הדמיה בתפוקה גבוהה, מודלים אורגנואידיים ומערכות עריכת גנים שיפר עוד יותר את השימושיות של מבחן השביט בחקר נזקי DNA ומנגנוני תיקון ובהערכת תגובות לטיפול בגידולים.

בהשוואה לבדיקות נזק DNA מסורתיות כמו צביעת אימונופלואורסצנציה γ-H2AX או ציטומטריית זרימה, בדיקת השביט מספקת אמצעי ישיר לכימות שבירות פיזיות של גדילי DNA ברמת תא יחיד. מכיוון ששיטה זו פועלת באופן עצמאי מביטוי חלבונים ספציפיים או ספציפיות נוגדנים, היא למעשה מבטלת תוצאות שליליות שגויות הנובעות משינויים במצבי מחזור התא או סטיות במסלולי תגובה לנזק DNA12. יתרה מזאת, בניגוד לתרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות קונבנציונליות, המודל האורגנואידי התלת-ממדי ששימש במחקר זה מסכם בצורה נאמנה יותר את הארכיטקטורה המרחבית המורכבת, האינטראקציות המטריצות החוץ-תאיות וגרדיאנטים לחדירת התרופות של גידולים בתוך החיים. בעוד שמודלים מסורתיים של קווי תא לעיתים מעריכים יותר מדי גנוטוקסיות עקב חשיפה מופרזת לתרופות מלאכותיות, פלטפורמת האורגנואיד מעריכה נזק DNA המושרה על ידי DOX בתוך מיקרו-סביבה המזכירה תנאים פיזיולוגיים קליניים, ובכך משפרת משמעותית את האמינות והערך התרגומי של פרדיגמת הסינון13.

למרות היתרונות המשמעותיים של מבחן השביט המשולב אורגנואידים שהוקם במחקר זה להערכת נזק DNA, היישום המעשי שלו דורש התייחסות קפדנית של מספר מגבלות טכניות ופרמטרי יישום הקשורים לקלט הדגימה. הפרוטוקול דורש פירוק אנזימטי יסודי אך עדין של האורגנואידים כדי להפיק תלייה חד-תאית יעילה מאוד. צפיפות זריעה של 15,000–20,000 תאי סרטן שד ראשוניים לכל 100 מיקרוליטר של מטריצת הממברנה הבסיסית (~200 תאים/1 מיקרוליטר) שומרת על האיתות הפרקריני הבין-תאי הנדרש להיווצרות כדורים עמידים תוך מניעת נמק מרכזי הנגרם על ידי צפיפות יתר ודלדול מהיר של חומרי המזון. לגבי חלון הטיפול, בדיקה זו דורשת כיול מדויק של ריכוז ה-DOX ומשך החשיפה כדי למנוע מוות תאים מופרז (>20–30%). חשיפה לתרופות על-קטלניות יוצרת שפע של שביטים "קיפודים", שמסתירים אותות נזק DNA אמיתיים ומבלבלים את פרשנות הנתונים. לגבי מגבלות הבדיקה, התפוקה הנמוכה מטבעה של מבחן השביט האלקלי הסטנדרטי הופכת אותה לבלתי מספקת לסקר סמים בתפוקה גבוהה. יתרה מזאת, טכניקה זו דורשת תקנון קפדני של פרוצדורות ניסוי — כולל יציבות היצמדות לג'ל, משך ההתפתחות האלקלית ואחידות אלקטרופורטית — שכן סטיות תפעוליות זעירות עלולות לגרום לטעויות מערכתיות משמעותיות.

לסיכום, פרוטוקול זה קובע BCOs אנושיים ומדגים את היתכנות יישום מבחן השביט לכימות נזק DNA שנגרם על ידי DOX. לאחר טיפול DOX של 8 מיקרומום ב-BCOs מבוססים במלואם, הוערך נזק DNA באמצעות מבחן השביט. גישה זו מאפשרת הערכה יציבה וישירה של נזק DNA שנגרם על ידי DOX.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העם של סוז'ואו ווז'ונג (אישור מס' 20251w03) ונערך בהתאם לסטנדרטים אתיים רפואיים. כל הנבדקים במחקר זה סיפקו הסכמה מדעת בכתב.

1. בניית יחידות ה-BCO האנושיות

  1. הובלה ואחסון של רקמת סרטן השד
    1. יש להניח מיד את רקמת סרטן השד האנושית שנכרתה זה עתה לתמיסת שימור רקמה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס).
      הערה: ודאו שהרקמה נשארת שקועה לחלוטין במהלך ההובלה.
  2. דיסוציאציה מכנית של רקמת סרטן השד
    1. בצע את כל ההליכים בארון בטיחות ביולוגית. הניחו את רקמת סרטן השד בצלחת תרבית בקוטר 6 ס"מ והסירו רקמת שומן נראית לעין באמצעות סכינים ומלקחיים.
    2. הוסיפו 3 מ"ל PBS לצלחת התרבית של 6 ס"מ ושטפו את הרקמה שלוש פעמים.
    3. שאופים והשליכו את המלח המאופר בפוספאט (PBS).
    4. חזור על שלבים 1.2.2 ו-1.2.3 פעמיים נוספות.
    5. העבר את רקמת סרטן השד לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים וחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות בגודל של כ-2 על 5 מ"מ.
  3. עיכול אנזימטי של רקמת סרטן השד
    1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת פירוק אורגנואידי לצינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל והעבר את המתלה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    2. הוסיפו 8 מ"ל נוספים של תמיסת פירוק אורגנואידי לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל.
    3. דגרו את צינור הצנטריפוגה בנפח 15 מ"ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    4. ערבבו את הצינור על שייקר למשך דקה אחת כל 10 דקות במהלך העיכול.
    5. לאחר 40 דקות, מוסיפים 6 מ"ל PBS לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל כדי לסיים את העיכול.
      הערה: הוסף PBS ישירות לתערובת העיכול כדי לעצור פעילות אנזימטית.
  4. בידוד תאי גידול ראשוניים בשד והטמעת אורגנואיד
    1. הניחו מסננת תאים של 100 מיקרון על צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
    2. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים מלאה למסננת התאים.
      הערה: יש להכין את מדיום תרבית התאים המלא באמצעות 500 מ"ל מדיום בסיסי, 50 מ"ל סרום בקר עוברי, ו-5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
    3. שאיבת 1 מ"ל של תליית רקמה מעוכלת מצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל ומרחה אותה על מסננת התא.
    4. חזור על שלב 1.4.3 עד שהמתלה כולו עובר דרך המסננת.
    5. שטפו את מסננת התא עם תוספת של 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים מלא.
    6. צנטריפוגה את צינור הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל ב-350 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
    8. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל של מדיום תרבית תאים מלאה והעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    9. צנטריפוגה את המתלה ב-370 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    10. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
    11. הוסיפו 100 מיקרוליטר מטריצת ממברנת הבסיס לצינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וערבבו היטב.
      הערה: שמרו על צפיפות זריעה של 15,000–20,000 תאי סרטן השד ראשוניים לכל 100 מיקרוליטר של מטריצת ממברנת הבסיס (200 תאים/1 מיקרוליטר). זה שומר על איתות פאראקריני בין-תאי ליצירת כדורים חזקים ומונע נמק מרכזי.
    12. פזר 25 מיקרוליטר מתערובת מטריצת-תא ממברנת הבסיס לכל באר של פלטת 24 בארות.
    13. הפוך את לוח ה-24 בארות ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר פולימריזציה של מטריצת ממברנת הבסיס.
    14. הוסף 500 מיקרולטר של מדיום גידול BCO לכל באר של צלחת 24 בארות.
      הערה: גידול BCOs המשתמש במדיום מסחרי מוכן לשימוש עם נוסחה קניינית.
    15. דגרו את הפלטה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
      הערה: לאחר הזרעה במטריצה החוץ-תאית, ה-BCOs גודלו במשך 7–10 ימים כדי לאפשר התפתחות מבנית תלת-ממדית תקינה. האורגנידים נחשבו מבוססים לחלוטין ומוכנים לטיפול תרופתי כאשר הראו מורפולוגיות תלת-ממדיות צפופות וכדוריות והגיעו לקוטר ממוצע של כ-50–100 מיקרון, ללא סימני נמק מרכזי. לאחר עמידה בקריטריונים אלו לנקודת הסיום, ה-BCOs טופלו לאחר מכן ב-DOX.

2. זיהוי נזק DNA שנגרם על ידי DOX ב-BCOs באמצעות מבחן השביט

הפרוטוקול הניסויי הותאם מההנחיות שנקבעו ואופטימיזציה נוספת כדי להתאים לתנאי מעבדה ספציפיים14.

זהירות: בצע את כל נהלי הטיפול ב-DOX—כולל שקילת אבקה יבשה, הכנת תמיסת מלאי ודילול סדרתי של תמיסות עובדות—אך ורק בתוך ארון בטיחות ביולוגי מוסמך מסוג Class II או מכסה אדים כימי. הימנע בקפדנות מכל מניפולציה על ספסלי מעבדה פתוחים. לבש כפפות ניטריל כפולות ולהגן על הסם מאור לאורך כל ההליך. לבסוף, להפריד את כל הצרכנים המזוהמים ב-DOX (למשל, קצות פיפטות וצינורות מיקרוצנטריפוגה) אך ורק כ'פסולת ציטוטוקסית' להשמדה מיוחדת; לעולם אל תערבב את הפריטים האלה עם פסולת ביולוגית מסוכנת שגרתית.

  1. טיפול DOX ב-BCOs
    1. שאפו וזרקו את מדיום התרבות המנוצלת.
    2. הוסיפו 500 מיקרול מדיום תרבית טרי של BCO לכל באר
    3. הסר והשליך 4 מיקרו ליטר מהתווך מכל באר
    4. הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסת DOX של 1 mM לכל באר.
      הערה: כדי לקבוע ריכוז עבודה סופי של 8 מיקרומטר, יש לקבוע את נפח המלאי הנדרש באמצעות משוואת הדילול הסטנדרטית: C1V1 = C2V2. כאשר C1 מייצג את ריכוז מלאי DOX ההתחלתי (1 mM), C2 הוא ריכוז היעד (8 מיקרומון), ו-V2 הוא נפח הבאר הסופי (500 מיקרוליטר). פתרון עבור V1 מניב 4 מיקרוליטר. לכן, הפרוטוקול דורש הוספת 4 מיקרוליטר ממאגר DOX של 1 mM ל-496 מיקרו-ליטר של מדיום תרבית שנותרו בכל באר, ואז ערבוב יסודי כדי להבטיח התפלגות הומוגנית.
    5. דגרו את הפלטה באינקובטור של 37°C עם 5% CO₂ למשך שעתיים.
  2. ניתוק ה-BCOs
    1. שאפו והשליכו את מדיום התרבות של BCO מהצלחת עם 24 בארות.
    2. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פירוק אורגנואידי לכל באר.
    3. פיפט למעלה ולמטה שוב ושוב כדי לשבש לחלוטין את מטריצת הממברנה הבסיסית ואת המבנים האורגנואידיים.
    4. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 10 דקות.
    5. העבר 500 מיקרוליטר מהמתלה המתקבל מכל באר לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את המתלים ב-350 × גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    7. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
    8. הוסיפו 1 מ"ל מדיום תרבית מלא לצינור הצנטריפוגה בנפח 15 מ"ל כדי להחזיר את כדור התא, ולאחר מכן להעביר את המתלה שנוצר לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    9. צנטריפוגה את המתלים ב-350 × גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    10. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
      הערה: לאחר הצנטריפוגה, הכדור האורגנואידי נשאר בצינור הצנטריפוגה.
  3. השעיית תאים מחדש והטמעת אגרוז
    1. חממו מראש את בלוק החימום המתכתי ל-95 מעלות צלזיוס.
    2. הניחו 1 מ"ל של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה (LMP) בתוך בלוק חימום מתכתי ודגרו במשך 10 דקות כדי להבטיח התכה מלאה.
    3. פיפט 100 מיקרוליטר של אגרוז מותך בעל נקודת התכה נמוכה 0.5% לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל BCOs.
    4. העבר מיד את הדגימות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ותן להן להתאזן למשך 10 דקות.
    5. ערבבו היטב ומיד פיפטה של 50 מיקרולטר של תליית התא-אגרוז על סלייד מיקרוסקופ.
  4. ניתוק תאים ופירוק DNA
    1. טבלו את השקופיות בתמיסת פירוק קרה ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 12 שעות.
    2. הסר את השקופיות מתמיסת הליזיס וטבול אותן מיד בתמיסת פירוק אלקלינית.
      הערה: להכנת תמיסת הסלילה הבסיסית, יש להמיס 0.6 גרם NaOH ב-4.975 מ"ל מים אולטרה-טהורים, ואז להוסיף 250 מיקרוליטר של 200 מ"מ EDTA. להכנת בופר האלקטרופורזה הבסיסי, יש להמיס 12 גרם NaOH ב-995 מ"ל מים אולטרה-טהורים, ואז להוסיף 5 מ"ל של 200 מ"מ EDTA.
      אזהרה: NaOH בבופר הבדיקה של השביט הוא בסיס חזק וקורוזיבי מאוד, המסוגל לגרום לכוויות קשות בעור ובעיניים. במהלך הכנת התמיסה, הוסף את כדורי ה-NaOH המוצקים למים לאט, בהדרגה ובערבוב מגנטי רציף. לעולם אל תשפוך מים ישירות על הכדורים היבשים, שכן התגובה האקסותרמית האלימה עלולה לגרום לרתיחה ולהתיזות הנוזל הקאוסטי. בנוסף, יש לבצע את כל האבקה היבשה המשקללת אך ורק בתוך מכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפת אבק קורוזיבי.
    3. טבלו את השקופיות בתמיסת ליזיס ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה.
  5. אלקטרופורזה
    1. העבר את המחסניות מתמיסת הסלייפינג האלקלית לתא האלקטרופורזה.
    2. הוסיפו 1 ליטר של בופר אלקטרופורזה אלקליני למיכל האלקטרופורזה כדי להבטיח טבילה מלאה של המחסניות.
    3. בצע אלקטרופורזה ב-25 וולט ו-300 מיליאמפר למשך 30 דקות.
  6. שטיפת שקופיות וקיבוע
    1. טבלו את השקופיות ב-5 מ"ל של 70% אתנול ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אתנול מהווה סיכון חמור לדליקות. בעת ביצוע הכנות בנפח גדול או התייבשות רקמות, שמרו על אוורור חזק בסביבה הניסיונית. יש לבודד בקפדנות את אזור הפעולה מכל מקורות ההצתה, כולל להבות פתוחות (כגון מבערי אלכוהול) וניצוצות אלקטרוסטטיים. לאחר השימוש, אטום מיד את מיכלי התגובות ואבטח אותם בארון אחסון ייעודי עמיד לפיצוצים ודליק.
    2. הניחו את המחסניות בתנור של 37 מעלות צלזיוס ותנו להן להתייבש במשך 15 דקות.
  7. צביעת DNA והדמיה
    1. הוסיפו 1 מיקרולטר של צבע פלואורסצנטי של חומצה גרעינית ל-10 מ"ל מים אולטרה-טהורים.
      זהירות: התייחסו לסוכנים האינטרקולטיביים לחומצות גרעין כמוטגנים פוטנציאליים ולטפל בהם באמצעי זהירות מחמירים. כדי למנוע זיהום צולב במרחבי עבודה שגרתיים, הקים אזור ייעודי לצביעת חומצות גרעין המצויד בפיפטות ייעודיות. אם מוסיפים צבעי אגרוז מותך, אפשר לג'ל להתקרר לכ-60 מעלות צלזיוס לפני הוסיפו כדי למנוע שאיפת אדים מסוכנים ועמוסים בצבע. לבסוף, השליכו את כל תמיסות הצביעה המשומשות והג'לים הפסולת אך ורק לתוך מיכלי סיכון לחומצה גרעין ייעודית.
    2. טבלו את השקופיות בתמיסת הצביעה שהוכנה בשלב 2.7.1 ודגרו אותה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    3. בצע שטיפה אחת של 5 דקות עם 5 מ"ל מים אולטרה-טהורים.
    4. ייבשו את המחסניות באוויר במשך 15 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. הצג מבני שביטים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מסנן עירור ירוק וזיהוי פלואורסצנציה אדומה.

3. עיבוד נתונים

  1. בצע ניתוח כמותי אוטומטי של תמונות בדיקת שביטים באמצעות תוסף OpenComet בפיג'י (הפצה רשמית) כדי לקבל פרמטרים הקשורים לנזק DNA.
    הערה: לגבי הניתוח הסטטיסטי, עבודה זו כללה אך ורק שביטים ברזולוציה גבוהה וברורים שמציגים מורפולוגיה שלמה וללא חפיפה. לעומת זאת, פרוטוקול הסינון כלל שביטים 'קיפוד' או 'רוח רפאים' (שמציגים ראש מוקטן וזנב נרחב, המצביעים על אפופטוזיס חמור או נמק), וכן תמונות עם קצוות מטושטשים, אשכולות תאים או ארטיפקטים ברקע.
    1. פתח את תוכנת פיג'י (איור משלים 1A).
    2. לחצו על תוספים בשורת התפריט (איור משלים 1A).
    3. בחר ב-OpenComet (איור משלים 1B).
    4. לחץ על דפדף תחת קבצי קלט ובחר את תמונות מבחן השביט לניתוח (איור משלים 1C).
    5. לחץ על Browse תחת תיקיית Output והגדר את תיקיית היעד לקבצי פלט (איור משלים 1C).
    6. לחץ על רץ כדי להתחיל את הניתוח האוטומטי (איור משלים 1C). שלב זה מסיים את תהליך עיבוד וניתוח הנתונים.
      הערה: עבור כל קבוצת ניסוי, מחקר זה כימת את אחוז DNA הזנב (%DNA זנב) מתוך בחירה אקראית של לפחות 50 תאים. ניתוח סטטיסטי מאוחר יותר השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) להשוואת ממוצעי קבוצות, כאשר p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמת BCOs

מחקר זה הצליח לקבוע אורגנואידים של סרטן השד מדגימות רקמת גידול ראשוניות. בשלב הראשוני של התרבית, נצפו בבירור מספר רב של תאים בודדים או אשכולות תאים קטנים, כאשר התאים היו מפוזרים יחסית וחסרי ארגון כדורי תלת-ממדי ברור. חלק מהתאים הציגו מורפולוגיות עגולות או כמעט עגולות, מה שמעיד שתאים שמקורם בגידול שרדו והסתגלו למטריצה החוץ-תאית אך טרם הקימו מבנים אורגנואידיים יציבים (איור 1A–C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת השביט מייצגת התקדמות משמעותית בשיטות הערכת גנוטוקסיות. בזכות רזולוציה חד-תאית והדמיה ישירה של דפוסי נזק ל-DNA המבוססים על נדידה אלקטרופורטית, טכניקה זו מציעה יתרונות ברורים על פני בדיקות גנוטוקסיות קונבנציונליות15.

מספר שלבים קריטיים במהלך ההליך הניסויי משפיעים על השחזוריות ופרשנות הנתונים. ראשית, תנאי הליזה ומשך הליזה חייבים להישאר עקביים כדי למזער שונות בין אצוות. בעת טיפול בתאי סרטן השד הראשוניים, החוקרים צריכים להימנע מחשיפה ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט מרכז המחקר ההנדסי של מחוז ג'יאנגסו לטיפול מולקולרי ואבחון ליווי באונקולוגיה (SGK2202319), צוות המחקר החדשני של מוסד ההשכלה הגבוהה בג'יאנגסו למדע וטכנולוגיה (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי להנדסה במכללה המקצועית של ג'יאנגסו (2023), קרן המרכזית למדעי הטבע של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו בסין (מענק מס' 24KJA310008). התוכניות המרכזיות של המכללה לבריאות מקצועית בסוז'ואו (szwzy202406), פרויקט המעבדה הממלכתית המרכזית לרפואה והגנה מפני קרינה, אוניברסיטת סוצ'או (מס' GZK1202506), תוכנית הכישרונות הבריאותית של דונגוו (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

מקורות

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233

מאמרים קשורים