מאמר שיטה

שתיית אלכוהול לסירוגין אוטומטית בעכברים המאושרים חברתית באמצעות מערכת בדיקות האינטליקטאז'

151 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71345

⸱

5 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטות להערכה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה של התנהגויות שתיית אלכוהול בעכברים המגורים חברתית, המופעלת באמצעות מערכת הבדיקות IntelliCage. מסופקת מתודולוגיה מפורטת לפרדיגמת שתיית אלכוהול לסירוגין, יחד עם קבצי הניסוי והקוד לניתוח הנתונים שהתקבלו.

תקציר

למרות הבלבולים הידועים של בידוד חברתי בהתנהגות מכרסמים, חוקרים רבים מסתמכים על עכברים היחידים כדי להעריך את העדפת האלכוהול במודלים פרה-קליניים של הפרעת שימוש באלכוהול (AUD). פרוטוקול זה מתאר משימת שתיית אלכוהול חברתית המאפשרת הערכה אוטומטית ויעילה של התנהגויות שתיית אלכוהול בעכברים, ללא ההשפעות המבלבלות של לחץ שנגרם מבידוד חברתי. מערכת הבדיקות IntelliCage מאפשרת לחוקרים להעריך בו-זמנית התנהגות שתיית אלכוהול אופרטואלית בעד 16 עכברים מאותו מין, שכל אחד מהם מזוהה באופן ייחודי עם משדר זיהוי תדר רדיו (RFID) שהושתל תת-עורית. הגישה לבקבוקי שתייה נשלטת בתוכנה וניתנת לכוונון בנפרד לכל עכבר. בפרדיגמת שתיית אלכוהול כרונית ומזדמנת זו, עכברים מבצעים מרצון את האף האופרנטי כדי לגשת לבקבוקי שתייה המכילים 20% אלכוהול במשך שישה שבועות רצופים. בקבוקי אלכוהול זמינים רק כל יומיים למשך 24 שעות בכל פעם, וניתן להזייף אותם עם כינין כדי להעריך שתייה חסרת רגישות לעונש. ביקורים בכל פינה של אופרנט, נזפוקים ונתוני ליקוק נרשמים אוטומטית עבור כל עכבר. שיטות ניסוי מפורטות וקוד קוד פתוח לניתוח הנתונים המוקלטים יאפשרו לחוקרים להעריך התנהגויות שתיית אלכוהול הרלוונטיות ל-AUD בצורה יעילה ורלוונטית אתולוגית יותר ויותר.

מבוא

מחקרים במודלים פרה-קליניים הם חיוניים לפיתוח הבנה עמוקה יותר של המנגנונים הנוירוביולוגיים שמאחורי הפרעות השימוש באלכוהול (AUD). עם זאת, מדדים מסורתיים רבים לשתיית אלכוהול אצל מכרסמים, כמו שני בקבוקי בחירה 1,2 ובדיקות שתייה בחושך 3,4,5, דורשים מדידה ידנית של נפחי נוזלים בקרב מכרסמים חד-ביתיים, שיטה בעלת תפוקה נמוכה ורגישה לטעויות. האימוץ האחרון של מערכות ליקומטר בקוד פתוח המשתמשות בטכנולוגיות קיבוליות 6,7,8,9,10 או פוטואלקטריות 11,12 לאוטומציה של ספירת ליקוק מהווה התקדמות משמעותית בתפוקה, בדיוק וברגישות הטכנית של שיטת שתיית אלכוהול. עם זאת, רוב מערכות הליקומטר בכלוב ביתי עדיין דורשות שמכרסמים יהיו חד-ביתיים, מה שגורם ללחץ בידוד 13,14. למרות שהממצאים המדווחים משתנים במידה רבה15,16, מכרסמים בדרך כלל מעדיפים אלכוהול יותר כאשר הם בבית-יחיד 17,18,19,20. עם זאת, השפעות הבידוד החברתי על שתיית אלכוהול משתנות בהתאם לגיל בעלי החיים, מין, סביבת מגורים וחשיפה קודמת ללחץ 20,21,22. לבידוד חברתי יש פוטנציאל לאינטראקציה משמעותית עם מניפולציות ניסיוניות כדי להגביל את תוקף התוצאות ההתנהגותיות הדמויות AUD שהוערכו.

מערכות ניטור כלוב ביתיות חדשות ואוטומטיות לחלוטין, כמו מערכת הבדיקה IntelliCage (TSE Systems 23,24,25) או אלטרנטיבות קוד פתוח, LIQ PARTI 20 ו-FARESHARE26, פותרות בעיה זו על ידי שילוב ליקומטריה עם זיהוי תדר רדיו (RFID) של בעלי חיים מרובים בבתי קבוצות. מערכות ניטור בכלוב ביתי אלו מאפשרות כימות יעיל וניתן לשחזור של התנהגויות שתיית אלכוהול, ללא הבלבולים של לחץ שנגרם מבידוד חברתי. לכן, הם אידיאליים למחקרים מאשרים ובעלי תפוקה גבוהה של מניפולציות ניסיוניות המשפיעות על פגיעות להתנהגויות דמויות AUD. מבין אלה, מערכת הבדיקות IntelliCage ייחודית בשילוב פינות מתוכנתות ואופרטיות לגישה לבקבוקי שתייה בשער, ומאפשרת לחוקרים להעריך התנהגויות חיפוש בהיעדר גישה לתרופות, לווסת את יחסי האופרנטים לבעלי חיים בודדים ועוד.

כאן, המחברים מציגים פרדיגמת שתיית אלכוהול לסירוגין אופרנטית המופעלת באמצעות מערכת הבדיקות IntelliCage בקרב עכברים בעלי בית חברתי27,28. פרדיגמה זו מאפשרת הערכה אוטומטית ארוכת טווח של שתיית אלכוהול בעד 16 עכברים מאותו מין, שכל אחד מהם מזוהה באופן ייחודי באמצעות משדרי RFID שהושתלו תת-עורית. כמתואר להלן, עכברים מאומנים לפעול את האף ביחס קבוע (FR)-3 כדי לגשת לבקבוקי שתיקה. לאחר תקופת אימון קצרה, בקבוקי שתייה בשניים מתוך ארבעת הפינות האופרנטיות מוחלפים ב-20% אלכוהול (95% אתנול [190 proof] במי ברז, v/v). לעכברים יש גישה רציפה למים, אך לאלכוהול לסירוגין כל יומיים למשך תקופות של 24 שעות (12:30 עד 12:30). ליקוק אלכוהול נמדד לאורך שישה שבועות, עם מבחן זיוף כינין בן יומיים (0.5 מ"מ, 1.0 מ"מ) באמצע הניסוי כדי להעריך שתייה חסרת רגישות לעונש. נתוני ביקור, nosepoke ו-lick נרשמים עבור כל עכבר (איור 1), מופקים באמצעות התוכנה הקניינית של TSE, ומנותחים לאחר מכן באמצעות צינור הקודהפתוח 29 כדי לקבל תובנות על התנהגויות דמויות AUD.

פרוטוקול זה משלים שימושים נוספים שפורסמו במערכת הבדיקות IntelliCage להערכת התנהגויות דמויות AUD 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, וכן התנהגויות דמויות-הפרעות שימוש בחומרים 40,41,42. בהתאם לדיווחים המצביעים על לוחות זמנים לגישה לסירוגין מגבירים את צריכת האלכוהול מרצון בקרב מכרסמים 1,43,44,45,46,47, פרוטוקול זה מניב רמות גבוהות של צריכת אלכוהול מרצון ברוב העכברים. עם זאת, כפי שהמחברים מציינים לאורך כל הפרוטוקול, ניתן לשנות בקלות פרמטרים ניסיוניים כדי לענות על שאלות ניסוי. בסך הכול, מתודולוגיה זו מספקת פתרון יעיל וגמיש לחוקרים לחקור את המנגנונים שמאחורי AUD.

figure-introduction-1
איור 1: מעקב אוטומטי מלא אחרי ביקורי עכברים, דקירות אף וליקוקים באמצעות זיהוי RFID ייחודי. (א) דיאגרמת מצויר של השתלת משדר RFID בעכברים. משדרי RFID מושתלים תת-עורית באזור הגבי-צווארי כדי לאפשר מעקב אישי במערכת ניטור אוטומטית של כלוב ביתי. (ב) סכמטי שלבי איסוף הנתונים במהלך הפרדיגמה האוטומטית של אלכוהול לסירוגין. נקרא זהות בעל חיים, וביקור בפינה מוקלט באמצעות אנטנת טבעת RFID כפולה וקריאות חיישני טמפרטורה, ששניהם חייבים להיות חיוביים כדי להקליט ביקור (משמאל). לאחר מכן, העכברים מאומנים לדקור את האף לפי לוח זמנים של FR-3 כדי לגשת לבקבוקי שתייה (באמצע). דקירה מוצלחת מעניקה 5 שניות של גישה לבקבוק שתיקה, ואז ליקוקי העכבר נרשמים באמצעות מד ליקומטר מבוסס קיבול (מימין). סרטים מצוירים שנעשו מתבניות BioRender מותאמות על ידי לוסי אנדרסון, ברישיון תחת CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של NIH (IACUC) ועמדו במדיניות שירות הבריאות הציבורי בנוגע לטיפול ושימוש הומני בבעלי חיים במעבדה.

1. הכנת המכשיר

הערה: כל מערכת בדיקה של IntelliCage מורכבת מכלוב ביתי גדול מפלסטיק (39 ס"מ x 58 ס"מ x 21 ס"מ) שבו יכולים להתגורר עד 16 עכברים מאותו מין. הקבוצות הקודמות נעו בגודל של 8–16 עכברים לכלוב. המכשיר מצויד בארבע פינות אופרטיות, שכולן מתחברות למיקרופרוססור מרכזי במכסה העליון. אוכל מכרסמים נגיש ממיכל מתכת גדול במרכז המכסה. בתוך הכלוב, העכברים משוטטים בחופשיות בין פינות אופרטיביות לחלל מגורים מרכזי, המצויד במצעים וחומרי העשרה. לכל פינה אופרנטית יש כניסה עגולה קטנה שמאפשרת כניסה פיזית רק על ידי עכבר אחד בכל פעם. זהות העכבר נקראת ומוקלטת בהתבסס על אנטנת טבעת RFID כפולה וקריאות חיישני טמפרטורה, שתיהן חייבות להיות חיוביות כדי להקליט ביקור. בכל פינה מפעילה, לעכברים מוצגים שני פתחי נזפוק, שכל אחד מהם שולט בגישה לאחת משתי דלתות ממונעות. דלתות מתוכנתות וממונעות אלו מספקות גישה לאחד משני בקבוקי שתיקה. החוקרים מתכנתים ידנית תנאים לגישה לבקבוקי שתיה, וכן את רגישות הליקומטרים מבוססי קיבול. נתוני ביקור, nosepoke וליקוק מוקלטים בנפרד עבור כל עכבר ומועברים דרך מיקרו-מעבד מרכזי למחשב שעליו נטענת מערכת התוכנה הקניינית של TSE. למרות שלא יידונו בפרוטוקול זה, כל תא אופרנט מכיל גם שסתום אוויר מתוכנת לשימוש בהתניה שלילית.

  1. ציידו כלוב בית מפלסטיק בחמישה רפידות סיבי כותנה דחוסה (15.24 x 25.4 ס"מ), שני ריבועי כותנה קטנים (5.08 x 5.08 ס"מ), וארבעה מבני חפירה מפלסטיק למיטה והעשרה.
    הערה: מומלץ להשתמש בכריות סיבי כותנה דחוסה משתי סיבות: (1) כדי למנוע אבק או פתיתי חומרים נפוצים שיפריעו למכניקת הדלתות, ו-(2) כדי לאפשר זיהוי קל יותר של קרבות בין בעלי חיים.
  2. הניחו את המכסה העליון עם פינות אופרטיביות בתוך כלוב הפלסטיק של הבית.
  3. אם מנותקים, חבר את כל הפינות האופרנטיות למיקרופרוססור המרכזי באמצעות הכבלים שסופקו ואז חבר את המיקרופרוססור המרכזי למחשב טעון מראש בתוכנת TSE באמצעות כבלי CAN.
    1. אם משתמשים בכמה מכשירים, חבר את כל הכלובים לאותו מחשב באופן סדרתי.
  4. חבר את המיקרופרוססור למקור הכוח וודא שנורות ה-LED בכל פינה נדלקות ושכל שמונת הדלתות הממונעות זזות.
  5. מלאו שמונה בקבוקי שתייה ב-~250 מ"ל כל אחד של מי ברז (או נוזל אחר), לחצו היטב על הפקקים כדי להבטיח אטימה תקינה, ואז סובבו בעדינות לתוך פתחי הליקומטר, כדי להבטיח חיבור הדוק לליקומטר.
    הערה: רגישות חיישנים לביקור, נזפוק וליקוק ניתנות לאופטימיזציה אופציונלית באמצעות ניסוי פיילוט. כדי לכוון את הרגישות של כל פינה, יש לעקוב אחרי הוראות היצרן המתוארות בקובץ "עזרה" של תוכנית "Controller". כל המחקרים השתמשו בהגדרות הבאות: ביקור - 816 ON/768 OFF; nosepoke - 21 ON/26 OFF; ליקומטר - 69 הופעה/80 הפסקה/15 פסק זמן.
  6. מלאו את המזון באוכל מכרסמים.
  7. הפעל את המחשב, פתח את אפליקציית "Controller" וטען את קובץ הניסוי הרצוי.

2. הכנת בעלי חיים

הערה: יש להשתיל בבעלי חיים משדרי RFID לפחות שבוע לפני תחילת בדיקות ההתנהגות כדי לאפשר זמן החלמה מספק. השתמש בעכברים בני לפחות ~50 יום, עם משקל גוף מעל 15 גרם. השתלת עכברים קטנים מעלה את הסיכון לפגוע בעכבר במהלך ההזרקה. בהתאם לקו העכברים, תוקפנות עלולה להפוך לבעיה בתנאים של מגורים קבוצתיים, במיוחד בקרב זכרים. הפחיתו את הסיכון הזה על ידי אירוח כל העכברים יחד במהלך גיל ההתבגרות. המחברים לא הבחינו בתוקפנות משמעותית במחקרים עם עכברים בוגרים (~PND 80–150) מסוג פראי C57BL/6, אך הדבר אינו מבטיח את הכללת הפרוטוקול הזה לגנוטיפים אחרים, גילאים או סידורי מגורים אחרים.

  1. השתלת עכברים תת-עורית עם משדרי RFID באזור הדורסוצרביק לזיהוי ייחודי.
    1. הדפיסו טבלת נתונים שמפרטת את כל בעלי החיים הניסיוניים עם רווח ליד כל מזהה בעל חיים כדי להציב מדבקת ברקוד עם קוד ה-RFID שלהם.
    2. אסוף את כל בעלי החיים והציוד הנדרש: משדרי RFID, מזרק משדר RFID נטען מחדש, ומערכת השראה איזופלורן.
    3. הניחו את העכבר הראשון בתא ההשראה והרדימו באמצעות איזופלורן שהתאדה (מד זרימת חמצן: 1.5 מ"ל לדקה, איזופלורן 1.5–3.5%) עד שהעכבר לוקח נשימות גדולות ומקוטעות ואינו מגיב לצביטה באצבע.
      1. בזמן ההמתנה לעכבר להרדמה, טען את משדר ה-RFID על המזרק על ידי הברגת המחט הטעונה מראש לבסיס המזרק, ואז הוצאת המזרק באיטיות עד שרואים את המיקרוצ'יפ זז.
      2. החלו את הברקוד שמזהה את קוד ה-RFID על טבלת הנתונים המודפסת ליד מזהה החיה המתאימה.
    4. הוציאו את העכבר מתא האינדוקציה והשתלו את משדר ה-RFID הטעון מראש תת-עורית באזור הדורסוצרביקלי.
      1. לאחר אימות ראשוני שהעכבר אינו מגיב לצביטה באצבע, השתמש באגודל ובאצבע המורה של היד הלא דומיננטית כדי ללחוץ את זקן העכבר ישירות מעל השכמות.
      2. באמצעות היד הדומיננטית, הכנס את מחט המזרק תת-עורית לקצה האחורי של העורף של העכבר, תוך שמירה על המחט מורמת מעל ומקבילה לעמוד השדרה כדי למנוע פגיעה בעכבר.
      3. עם קצה המזרק בתוך זקן העכבר ומייצב היטב בין האגודל לאצבע, הזז בזהירות את היד הדומיננטית כדי שאדם יוכל ללחוץ על הבוכנה של המזרק.
      4. הוציא את משדר ה-RFID, תוך שמירה על אצבעות היד הלא-דומיננטית לחוצות סביב הזקף כדי שתוכל להרגיש כשהשבב יצא מקצה המזרב.
      5. תוך שמירה על השרוול לחוץ, הסר את המזרק בהדרגה. שחרר את השרוול רק לאחר שהמזרק הוסר לחלוטין כדי למנוע נפילת המשדר.
        הערה: באופן אופציונלי, ניתן להוסיף קשר תפר יחיד לסגירת העור בזמן שהעכבר בהרדמה.
    5. החזירו את העכבר לכלוב הבית שלו ועקוב אחרי ההחלמה מההרדמה ועד להליכה מלאה.
    6. עקבו אחרי העכבר לכל סימן לפגיעה פיזית, כולל שיתוק חלקי, צליעה או סיבוב, שעשויים להעיד על זריקה לא מדויקת. אם הליקויים נמשכים יותר מ-24 שעות או משפיעים קשות על רווחת בעלי החיים, יש לבצע המתת חסד באופן הומני.
      1. כוון את קורא המשדר RFID מעל האזור הדורסוקרוויקלי של העכבר וסרוק כדי לאשר מיקום מוצלח.
    7. באופן אופציונלי, לקחת דגימת רקמה לגנוטיפינג.
      1. חזור על זה עם כל העכברים הניסיוניים.
  2. יום אחד לאחר ההשתלה הראשונית של משדר ה-RFID, השתמשו בקורא המשדר RFID כדי לוודא שאף עכבר לא איבד את משדרי ה-RFID שלהם. אם עכברים איבדו את המשדרים שלהם, חזרו על ההליך עם משדר חדש ועדכנו את הרשומות בהתאם.
    הערה: בדרך כלל, אם העכבר עומד ליפול את משדר ה-RFID שלו, זה יקרה בתוך 24 שעות מההשתלה. זה יכול לקרות בגלל מיקום לא נכון של משדר RFID ו/או טיפוח או שריטות של העכבר באתר ההזרקה. הימנעו מהזרקה חוזרת לפצעי הזרקה קודמים והרחקו עכברים לאחר שלוש השתלות RFID שנכשלו.
  3. לפני שמכניסים עכברים למכשיר IntelliCage, ודאו שכל משדרי ה-RFID ניתנים לקריאה מוצלחת. שקלו ורשמו את משקלי הגוף של כל העכברים.

3. הכנת קבצים ניסיוניים

הערה: מערכת הבדיקות IntelliCage נשלטת ומופעלת באמצעות ממשקי משתמש גרפיים המסופקים על ידי TSE. ישנם שלושה יישומים המשמשים להרצת ניסויי IntelliCage: "מעצב", "בקר" ו"אנלייזר". שלבים שונים של הניסוי פועלים דרך קבצי ניסוי שונים, אשר מעוצבים באפליקציית "Designer" ואז פועלים באפליקציית "Controller". מידע מפורט על איך לעצב ולהתאים קבצי ניסויים תואר קודם לכן48,49. תבניות של ארבעת קבצי הניסויים ששימשו במחקר (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment) סופקו כדי לסייע בשכפול הפרוטוקול. בקבצים אלו, שינויים בפאזה מתרחשים בשעה 12:30 בצהריים. המחברים בחרו בתזמון זה כי בעלי החיים שוכנו במחזור אור בין 6:00 ל-18:00. זה אפשר שלב חשוך רציף למדידת התנהגויות השתייה. עם זאת, חוקרים עשויים לרצות לשנות את התזמון הזה כך שיתאים לשיטות שתיית אלכוהול אחרות, כמו הליכי "שתייה בחושך"50.

  1. הגדר קבצי ניסוי באפליקציית "Designer".
    הערה: אם עובדים עם קבצי התבנית, מחק את ארבעת בעלי החיים לדוגמה לפני הכניסה לקבוצה הנוכחית. כמו כן, שנה את שמות הקבוצות לעיצוב הניסוי והוסף קבוצות לפי הצורך. ודא שכל הקבוצות החדשות מתחילות מאותו אשכול כמו אלו שבתבנית האלה.
    1. פתח את קובץ Habituation.experiment באפליקציית "Designer" והזן בזהירות את מזהה החיה, קוד המשדר RFID וקבוצת הניסוי/גנוטיפ לכל עכבר. שמור את הקובץ עם שם חדש כדי לשמור על קובץ התבנית.
      הערה: אם קודי משדר RFID מסווגים בטעות, הנתונים לא יירשמו. שיוך בעלי חיים לקבוצות ניסוי רלוונטיות יסייע במעקב אחר התנהגותם ובסופו של דבר בניתוח הנתונים.
    2. ייצא את מידע החיות כקובץ חיות.
    3. לכל שלב בניסוי, פתח את קובץ הניסוי המתאים וטען את קובץ החיות. שמור ושינה שם מתאים.
    4. אם מעצבים קבצים במחשב נפרד, הורד קבצי ניסוי לכונן פלאש נייד להעברה לחדר ההתנהגות.
  2. הורד את כל קבצי הניסויים למחשב המחובר למכשיר(ים) של IntelliCage ופתח את הקובץ הראשון באפליקציית "Controller". ודא שכל המידע נטען כראוי.
  3. על נייר או אלקטרונית, צור קובץ יומן ניסיוני שבו רושם את התאריך והשעה שבהם ניתן להתחיל/להפסיק שלבים שונים של הניסוי. דבר זה יסייע מאוד בניתוח, שכן מצבים מסוימים של סמים (כגון אלכוהול מזויף בכינין) אינם מתועדים בארכיון IntelliCage.

figure-protocol-1
איור 2: ציר זמן ניסיוני לפרדיגמת שתיית אלכוהול אופרנטית ומזדמנת. (א) סכמטי של מכשיר IntelliCage עם בקבוקי שתייה המכילים אלכוהול בשתי פינות מתוך ארבע. (ב) ציר זמן ניסויי המתאר את לוח הזמנים של כל שלבי הניסוי, כפי ששימש בפרסום הקודם23. קבוצה 1 ביצעה בדיקת אלכוהול מזויף בכינין לאחר שהסיקו שתיית אלכוהול לסירוגין, בעוד שקבוצות 2 ו-3 חזרו לשתיית אלכוהול לסירוגין לאחר זיוף. (ג) לוח ניסוי מפורט המתאר שינויים בתוכנה לכל שלבי הניסוי: התרגלות, אימון מים, שתיית אלכוהול לסירוגין, בדיקת אלכוהול מזויף בכינין, ו"בר פתוח"/שתיית אלכוהול בגישה חופשית. החלפת כלובים מתוזמנת לפחות פעם בשבוע לאחר סיום מודול "גישה לאלכוהול ON". סרטים מצוירים שנעשו מתבניות BioRender מותאמות על ידי לוסי אנדרסון, ברישיון תחת CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. ניהול הניסוי

הערה: פרדיגמת שתיית האלכוהול האופרנטית והלסירוגית מורכבת מחמישה שלבים: (1) התרגלות, (2) אימון מים, (3) שתיית אלכוהול לסירוגין, (4) בדיקת אלכוהול מזויף בכינין, ו-(5) שתיית אלכוהול "בר פתוח"/גישה חופשית. כל שלב בניסוי מתבצע על קבצי ניסוי שונים, למעט שתיית אלכוהול לסירוגין ובדיקת אלכוהול מזויף בכינין, ששניהם משתמשים בפרמטרים המפורטים בקובץ Intermittent Alcohol.experiment . מלבד החלפת הכלובים, על הניסויים לבדוק עכברים לפחות שלוש פעמים בשבוע כדי להעריך את רווחת בעלי החיים ולוודא שהתוכנה פועלת כראוי. כל עכברוש שנמצא פצוע/חולה צריך להיות מוסר מהניסוי. למערכת זמנים ניסיונית לדוגמה, ראו איור 2.

  1. החלפות כלוב
    הערה: יש לבצע החלפת כלוב לפחות פעם בשבוע. במהלך שתיית אלכוהול, יש לבצע את השינויים הללו רק אחרי 12:30 בצהריים במהלך "גישה למים בלבד" כדי להימנע מהפרעה לשתיית אלכוהול. כדי להקל על כך, קבצי Intermittent Alcohol.experiment ו-Open Bar.experiment תמיד יתחילו ב-"Water Access ONLY." בגלל גודל הכלובים, קשה להתמודד עם כלובים מאוכלסים לבד. המחברים ממליצים לבקש לפחות חוקר נוסף שיסייע בהחלפת כלובים. בדוק את העכברים 24 שעות אחרי כל החלפת כלוב כדי לוודא שהתוכנה פועלת כראוי ושלא התרחש תוקפנות/מריבות בתגובה ללחץ של החלפת הכלוב.
    1. לפני שמתחילים להחליף כלוב, הכינו כלוב פלסטיק נקי חדש עם מצעים וחומרי קינון חדשים. מלאו כל אחד משמונה בקבוקי שתיקה/כלוב ב~250 מ"ל מים מהברז או 20% אלכוהול (95% אתנול [190 proof] במי ברז, v/v).
      הערה: באופן אופציונלי, חוקרים יכולים להוסיף כמות קטנה מחומר המיטה הישן לכלוב החדש והנקי. זה ממזער את ההפרעה בהיררכיות קבוצתיות מבוססות ועלול להפחית את הסיכון לקרבות.
    2. הפסק את הניסוי באפליקציית "Controller". לאחר שווידא שאין עכברים בפינות האופרטיביות, הסר את מיכל המזון המתכתי. תן לאדם אחד להרים את מכשיר המיקרופרוססור המתכתי גבוה מספיק כדי שהאדם השני יוכל להחליק את הכלוב הפלסטי מתחתיו. אמת את מספר העכברים הנכון.
    3. הוציאו עכברים אחד אחד מהכלוב המלוכלך, סרקו את משדר ה-RFID, והקלטו את משקל הגוף. בדקו כל עכבר באופן חזותי לסימני פציעה או מחלה.
      הערה: המחברים ממליצים לרשום את משקל הגוף בגיליון אלקטרוני (csv) כדי שניתן יהיה לקרוא אותו בקלות בצינור הניתוח.
    4. הניחו את העכברים זמנית במיכל נקי לאחר רישום משקל הגוף.
    5. נקה את החלק העליון ואת הפינות עם מגבת רטובה ספוגה בחומר חיטוי. הקפד במיוחד לנגב את המשטח ואת הרכס התחתון של לוח הפינה, מבלי לתת לנוזלים לדלוף על החלקים האלקטרוניים.
    6. הרם את מכשיר המיקרופרוססור המתכתי גבוה מספיק כדי להכניס את הכלוב הפלסטיק הנקי והחדש למקומו.
    7. סובבו בעדינות בקבוקי שתייה חדשים לפתחי הליקומטר, כדי להבטיח חיבור הדוק לליקומטר.
    8. העבר עכברים למכשיר חדש ונקי.
    9. החליפו את הופר המזון בקופר אוכל נקי חדש ואוכל מכרסמים טרי.
    10. להפעיל מחדש את אותו ניסוי באפליקציית "Controller" או לטעון ולהתחיל קובץ ניסוי חדש.
    11. ודאו שהתוכנית פועלת כראוי ושכל העכברים עוברים ביקורים, דקירות אף וליקוקים מתועדים כראוי.
      הערה: תוכנית "Controller" תציג אזהרות אוטומטית כאשר החיה לא נרשמה בליקות בתוך תקופה של 12 שעות.
    12. לנקות ציוד מלוכלך. כלובים מפלסטיק, בקבוקי שתייה ומבני חפירה מפלסטיק ניתנים בדרך כלל לשטיפה באמצעות מערכות שטיפה טיפוסיות של כלובים.
  2. יום 0: התרגלות
    הערה: שלב ההרגלים מתבצע באמצעות קובץ Habituation.experiment . בשלב זה, כל בקבוקי השתייה מכילים מים מהברז. לעכברים יש גישה חופשית לכל הבקבוקים ללא נזפוקים אופרנטיים. דלתות ממונעות נפתחות כאשר עכברים נכנסים לפינה אופרנטית, וחושפות גישה לפיות בקבוק שתיקה.
    1. לאחר אימות נוכחות משדר ה-RFID ורישום משקל גוף העכבר, מלאו את כל שמונת בקבוקי ה-Sper ב~250 מ"ל מים מהברז וסובבו בעדינות לתוך פתחי ליקומטר.
    2. הכניסו עד 16 עכברים מאותו מין במכשיר IntelliCage המוכן.
    3. טען את קובץ Habituation.experiment לאפליקציית "Controller" והתחל להקליט.
    4. ודאו שכל הדלתות הממונעות נפתחות כראוי כאשר עכבר נכנס לפינה האופרנטית ושכל הביקורים, הדקירות והליקוקים מתועדים בהצלחה עבור כל עכבר. אם לא נרשמו ביקורים, דקירות אף או ליקוק לעכבר בתוך תקופה של 6 שעות, בדוק את קובץ ה-.animal לאיתור טעויות.
  3. ימים 1-3: אימון מים
    הערה: שלב האימון במים מתבצע באמצעות קובץ Water Training.experiment . כל בקבוקי השתייה צריכים להמשיך להכיל מים מהברז בלבד. שלב זה יאמן עכברים לנוזפוק על FR-1 ולאחר מכן על לוח זמנים של FR-3 כדי לגשת לפיות בקבוק השתיה. לאחר דקירה מוצלחת, דלתות ממונעות ייפתחו כדי לאפשר גישה לבקבוק לגימה למשך 5 שניות. כאשר עכבר בודד מגיע לשיעור הצלחה של 60% ומעלה, הוא מועבר ללוח זמנים של FR-3 לשארית תקופת התוכנית. בדרך כלל, עכברים עוברים ללוח זמנים של FR-3 בתוך 24–72 שעות. לעקוב אחרי ביצועי החיות ב"קונטרולר". אם בעל חיים לא מגיע ללוח זמנים של FR-3 בתוך 72 שעות, יש להוציא אותו מהמשך ניסויים נוספים.
    1. אם כל העכברים נראים מיובשים ולא פצועים לאחר 24 שעות של התרגלות, הפסיקו להריץ את קובץ Habitatuation.experiment והתחילו להריץ את קובץ Water Training.experiment .
    2. ודא שהביקורים, האף והליקוקים מתועדים בהצלחה על ידי התוכנה של כל עכבר ושכל הדלתות הממונעות נפתחות כראוי.
  4. יום 4+: שתיית אלכוהול לסירוגין
    הערה: שלב שתיית האלכוהול לסירוגין מתבצע באמצעות קובץ Intermittent Alcohol.experiment . בשלב זה, בקבוקי שתייה בשניים מתוך ארבע הפינות האופרנט מוחלפים ב-20% אלכוהול. פינות מים מול אלכוהול מוגדרות מראש דרך תכונת "אשכולות" בקובץ הניסוי. בתבנית, המים מועברים בפינות אחת ושלוש (מסומנים כ"נייטרלי") בעוד שאלכוהול נמצא בפינות שתיים וארבע (מסומנים כ"שגוי"). לעכברים יש גישה מתמשכת למים, אך גישה לאלכוהול לסירוגין למשך תקופות של 24 שעות (12:30 עד 12:30) כל יומיים. 5 שניות של גישה לבקבוק שתייה מסופק ב-FR-3 לכל הפינות. בשלב זה של הניסוי, יש לבצע החלפת כלובים בתקופות "גישה למים בלבד" כדי להימנע מהפרעות לשתיית אלכוהול. החוקרים צריכים לוודא שקבוצות הניסוי מגלות העדפה דומה לכל ארבע הפינות במהלך אימון המים לפני הקצאת פינות אלכוהול לשתיית אלכוהול לסירוגין. בכל אחת מהקבוצות, קבוצות ניסוי הציגו ביקורים וליקוקים דומים בכל ארבע הפינות במהלך אימוני מים. מסיבה זו, המחברים שמרו על משימות פינה קבועות בין קבוצות שונות. החוקרים יכולים לצפות בקלות ביחס הליקוקים והביקורים בפינות דרך תוכנת "Controller". ודאו לעקוב אחרי נתוני ביקור וליקוק באופן קבוע לאורך כל הניסוי כדי לוודא שלא מתעוררות בעיות (למשל, תקלות בציוד או עכברים ש"תופסים" פינות מסוימות).
    1. לאחר שכל העכברים השיגו בהצלחה לוח זמנים FR-3 לגישה לבקבוקי שתיקה, יש להכין 20% אלכוהול (95% אתנול [190 proof] במי ברז, v/v; ~250 מ"ל לבקבוק).
    2. תפסיק להריץ את קובץ ה-Water Training .experiment .
    3. הסר בקבוקי שתייה בפינות האופרנט שתיים וארבע (או בפינות שציינת בקובץ הניסוי, אם שונות) והחלף כל אחת ב-~250 מ"ל של 20% אלכוהול.
    4. סובבו בעדינות בקבוקי שתייה חדשים המכילים אלכוהול לתוך פתחי ליקומטר, כדי להבטיח חיבור הדוק לליקומטר.
    5. טען את קובץ Intermittent Alcohol.experiment והתחל להקליט.
    6. ודא שהביקורים, האף והליקוקים מתועדים בהצלחה על ידי התוכנה של כל עכבר ושכל הדלתות הממונעות נפתחות כראוי.
    7. לאחר השעה 12:30 בצהריים ביום הבא, יש לוודא שהתוכנית עברה בהצלחה ממודול "גישה למים בלבד" למודול "גישה אלכוהולית ON" וכי נרשמו ליקים בפינות האופרנט המכילות אלכוהול.
  5. יום 16+: בדיקת אלכוהול מזויף עם כינין
    הערה: שלב בדיקת האלכוהול המזויף בכינין מתבצע באמצעות קובץ Intermittent Alcohol.experiment. בשלב זה, בקבוקי השתייה בשתי פינות אופרטיות שהכילו בעבר 20% אלכוהול מוחלפים ב-0.5 מ"מ, ובהמשך 1 מ"מ קינין מזויף עם 20% אלכוהול להערכת שתייה חסרת רגישות לעונש. ריכוזי הכינין הללו, המהווים 0.016% ו-0.032% כינין (ביחס לכינון), בהתאמה, נמצאו בעבר כשליליים בבדיקות שבוצעו על ידי קבוצת27,28 ואחרים31 עכברים בעלי גישה רציפה למים, אך גישה לסירוגין לאלכוהול מזויף בקינין למשך תקופות של 24 שעות כל יומיים (כלומר, יום אחד של 0.5 מ"מ כינין, יום אחד של גישה למים בלבד, יום אחד של 1.0 מ"מ כינין). הגישה ניתנת לפי לוח זמנים של FR-3 לכל הפניות. במחקר זה, עכברים ביצעו שלב זה לאחר 16 או 24 ימים רצופים של שתיית אלכוהול לסירוגין טהורה. החלפת כלובים לא בוצעה ביום המים בין בדיקות זיוף כדי למנוע השפעות מבלבלות. לאחר שלב זה של הניסוי, עכברים יכולים להתחיל לשתות אלכוהול "בר פתוח"/גישה חופשית או לחזור לשתייה לסירוגין כדי להעריך שתייה חוזרת לאחר זיוף.
    1. הכינו 0.5 מ"מ ו-1 מ"מ אלכוהול מזויף בכינין (95% אתנול [190 proof] במי ברז, v/v; ~250 מ"ל לבקבוק).
    2. בצע החלפת כלוב, הסרת כל בקבוקי השתייה.
    3. מלאו כל בקבוק לגימה בפינות אלכוהול ב-~250 מ"ל של תמיסת אלכוהול 0.5 מ"מ מייל עם 20% אלכוהול מזויף בכינין.
    4. סובבו בעדינות בקבוקי שתייה חדשים המכילים אלכוהול לתוך פתחי ליקומטר, כדי להבטיח חיבור הדוק לליקומטר.
    5. טען את קובץ Intermittent Alcohol.experiment והתחל להקליט.
    6. ודא שהביקורים, האף והליקוקים מתועדים בהצלחה על ידי התוכנה של כל עכבר ושכל הדלתות הממונעות נפתחות כראוי.
    7. לאחר השעה 12:30, יש לוודא שהתוכנית עברה בהצלחה ממודול "גישה למים בלבד" למודול "Alcohol Access ON" ושהליקונים נרשמו בפינות האופרנט המכילות אלכוהול.
    8. לפני השעה 12:30 בצהריים ביום האלכוהול הבא, החליפו כל בקבוק בפינת האלכוהול ב-~250 מ"ל של 1 מ"מ קינין עם תמיסת 20% אלכוהול. אין צורך לעצור את הניסוי בשביל מתג הבקבוק.
    9. לפני השעה 12:30 בצהריים ביום האלכוהול הבא, הסר בקבוקי שתייה המכילים אלכוהול מזויף והחלף כל אחד מהם ב-~250 מ"ל של אלכוהול טהור ו-20%.
  6. יום 20+: "בר פתוח"/גישה חופשית לשתיית אלכוהול
    הערה: ניתן לנהל יום אחד של "בר פתוח"/שתיית אלכוהול חופשית כדי לשמש כבקרה לא פעילה. שלב זה מופעל באמצעות קובץ Open Bar.experiment . בשלב זה, בקבוקי שתייה בשניים מתוך ארבע הפינות המפעילים מכילים 20% אלכוהול, שלעכברים יש גישה לתקופה של 24 שעות (12:30 עד 12:30 בצהריים). ביקור בפינה יפתח את הדלתות בלי צורך בדקירות אף. במחקר זה, עכברים ביצעו שלב זה של המשימה לאחר שלבי בדיקת שתיית אלכוהול לסירוגין או בדיקת אלכוהול מזוהם בכינין.
    1. במידת הצורך, יש להכין 20% אלכוהול (95% אתנול [190 proof] במי ברז, v/v; ~250 מ"ל לבקבוק).
    2. לפני 12:30 בצהריים ביום האלכוהול הבא, תפסיק להריץ את קובץ הניסוי הנוכחי.
    3. אם צריך, הסר בקבוקי שתייה מפינות אלכוהול והחלף כל אחד ב-~250 מ"ל של 20% אלכוהול.
    4. סובבו בעדינות בקבוקי שתייה חדשים המכילים אלכוהול לתוך פתחי ליקומטר, כדי להבטיח חיבור הדוק לליקומטר.
    5. טען את קובץ Open Bar.experiment והתחל להקליט.
    6. בדוק שביקורים, דקירות לאף וליקוקים מתועדים בהצלחה על ידי התוכנה לכל עכבר, ושכל הדלתות הממונעות פתוחות בחופשיות.
    7. לאחר השעה 12:30, יש לוודא שהתוכנית עברה בהצלחה ממודול "גישה למים בלבד" למודול "Alcohol Access ON" ושהליקונים נרשמו בפינות האופרנט המכילות אלכוהול.

5. ניתוח נתונים

הערה: הנתונים של כל ניסוי נשמרים פנימית עד שהתוכנית נעצרת. באותו זמן, קובץ ארכיון נתונים דחוס נוצר ונשמר על הכונן הקשיח המקומי ב-C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. שם הקובץ כולל את התאריך והשעה בהם התוכנית התחילה ומסתיים ב-.zip.  קבצי ארכיון הנתונים מכילים את כל המידע הרלוונטי על הניסוי, כולל ביקורי פינות (זמן התחלה, זמן סיום, משך, רצף ביקורים), nosepokes (זמן התחלה, זמן סיום, משך), ליקים (זמן התחלה, זמן סיום, משך), זמני אור וחושך, ונתוני טמפרטורה. ניתן לקרוא ולנתח את ארכיון הנתונים הזה באמצעות תוכנת "Analyzer". למרות שקיימות חבילות קוד פתוח נוספות לניתוח פלטי נתוני IntelliCage (Ruffini ואח', 2021; Gastaldi ואחרים, 2025), המחברים יצרו צינור ניתוח נתונים ב-R המשתמש בחבילות זמינות לציבור מ-tidyverse לניתוח נתונים מפרדיגמת שתיית אלכוהול לסירוגין. הצינור כולל מספר שלבי בקרת איכות, כולל ניתוח תפוסה בפינה לכל עכבר; ביקור ממוצע, נזפוק וליקוק בתדירות לאורך הקצב הצירקדי; קצב רכישת ליק FR-3 לכל עכבר; וספירת ליקוק יומית לעכבר. בנוסף, המחברים מספקים ניתוחים בסיסיים של מדדי שתיית אלכוהול. הבסיס הוא קובץ תבנית מחברת R המשתמש בשפת הסימון Quarto שמעבדת את קבצי הנתונים וניתנת להתאמה לוריאציות ייחודיות לקבוצת בעלי חיים. הניתוח מתבצע באמצעות הגרסה החינמית של RStudio. קובץ תבנית פרויקט עבור R נמצא במאגר GitHub29.

  1. קומפל את כל הנתונים, כולל קבצי zip שהופקו על ידי אפליקציית "Controller" וקובץ CSV המכיל נתוני משקל גוף העכבר.
    הערה: המשקלים נדרשים כדי לאזן את הצריכה לפי משקל גוף. בתהליך עבודה זה, היה הגיוני יותר לאסוף את נתוני המשקל בקובץ נפרד מאשר להוסיף אותם לכל קובץ ניסוי. העמודה הראשונה צריכה להתאים לזיהוי החיה מקבצי הארכיון.
  2. הורד את תבנית פרויקט R ממאגר GitHub.
    1. שנה את שם הפרויקט כך שיתאים לניסוי.
    2. התבנית מגיעה עם קבצי נתונים לדוגמה שמדגימים כיצד הניתוח עובד, הממוקמים בתיקיית ה-data/C1. החלף את קבצי הארכיון בארכיוני נתונים מותאמים אישית.
  3. השיק את RStudio ופתח את הפרויקט.
    1. בחלק הקבצים של החלון בפינה הימנית התחתונה של RStudio, עבור לתיקיית qmd ופתח את קובץ IC_template.qmd.
    2. שכפל את קובץ התבנית ושינה את השם כך שיתאים לניסוי.
    3. כוון את המטא-דאטה בחלק כותרת YAML של הקובץ המשוכפל ובחלק הקוד הראשוני.
    4. התאימו את שמות הקבוצות בקובץ IC_Commons.R בתיקיית R כדי להתאים לקבוצות הניסוי. (התבנית משתמשת בשתי קבוצות: Control ו-LBN.)
  4. הרץ את קובץ המחברת.
    הערה: הוראות מפורטות יותר ניתנות עם קבצי README.md במאגר GitHub.

figure-protocol-2
איור 3: גישה דומה לפינות אופרטיות בקרב כל העכברים במהלך שלבי האימון ושתיית האלכוהול לסירוגין. בקרב עכברי קבוצה ראשונה23, מפת חום המציגה את סך הזמן שהוקדש בכל פינה ביום לעכבר במהלך (א) הרגל ואימון מים, לעומת (ב) ארבעת הימים הראשונים של שתיית אלכוהול לסירוגין (n = 15 פרנהייט, 16 מ'). צבעים אדומים כהים מסמנים יותר זמן בפינה ביום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-3
איור 4: עכברים מבצעים ביקורים, דקירות לאף וליקוקים בהתאם לקצב הצירקדי ומצליחים לקבל גישה לבקבוק שתייה אופרנטית לפי לוח זמנים של FR-3. בקרב עכברים בקבוצה הראשונה23, הצפיפות הממוצעת של ביקורי פינה (A) מפעילים, (B) nosepokes, ו-(C) ליקוקים לאורך זמן המפגש במהלך שמונת הימים הראשונים של הבדיקה. (D) זמן עד שכל עכבר מלקק בהצלחה יחס FR-3 במהלך אימון מים. (ה) שיעור הצלחה בביקורים (= אחוז הביקורים שמובילים לליקוק/ביקורים כוללים) בקרב עכברים במהלך ההרגל ואימון במים (משמאל) לעומת ארבעת הימים הראשונים של שתיית אלכוהול לסירוגין (מימין). סמלי המעגל מציינים נקבות (n = 15); סמלים ריבועיים מציינים זכרים (n = 16). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-4
איור 5: עכברים עוסקים בקצב ליקוק יומי דומה במהלך האימון ותקופות שתיית האלכוהול לסירוגין. בקרב (א) נקבות (n = 15) ו-(B) זכר (n = 16) קבוצה אחת של עכברים23, סך כל הליקוקים היומיים של מים (כחול) ואלכוהול (אדום) במהלך ההרגל ואימון במים (יום -4–0) לעומת שתיית אלכוהול לסירוגין (יום 1–4). C מציין הרמת בקרה; L מציין גידול ב-LBN. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-5
איור 6: עכברים שנחשפו לקשיים בגיל צעיר שותים יותר אלכוהול מאשר בקרים בפרדיגמת שתיית אלכוהול אופרטית ומזדמנת. (א) ממוצע ליקוק אלכוהול ליום שנורמל לפי משקל גוף (g; נמדד שבועית) במהלך 8 ימי גישה לסירוגין לאלכוהול בין עכברים שגודלו על ידי LBN (ורוד; מימין). (ב) ממוצע ליקוק אלכוהול ביום שנורמל לפי משקל גוף לפני, במהלך ואחרי זיוף כינין (0.5 מ"מ, 1 מ"מ). (ג) תרשים צפיפות המראה ממוצע ליקוק אלכוהול ליום, מנורמל לפי משקל גוף במהלך יום גישה לאלכוהול יחיד מסוג FR-0 "בר פתוח". סמלי המעגל מציינים נקבות (n = 15); סמלים ריבועיים מציינים זכרים (n = 16). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

המחברים השתמשו בבדיקות אוטומטיות של כלוב בית באמצעות IntelliCages כדי להעריך כיצד קשיים בגיל צעיר (ELA) משנים פגיעות להתנהגויות דמויות AUD27. כדי לגרום לקשיים, הם השתמשו בפרדיגמת המיטות והקינון המוגבלים (LBN), מודל של מחסור במשאבים שגורם לטיפול אימהותי בלתי צפוי ומפוצל 51,52,53,54,55,56. המחקר היה חדשני בהערכת השפעות ELA על התנהגויות שתייה של אלכוהול בקרב עכברים הביתיים, ללא ההשפעות המבלבלות של לחץ שנגרם מבידוד חברתי. דבר זה היה חשוב בהתחשב בכך שבידוד חברתי בבגרות ידוע כמשפיע באופן שונהעל עכברים חשופים ל-ELA. כדי להשיג תפוקה מקסימלית, המחברים מדדו בו-זמנית התנהגויות שתיית אלכוהול בארבעה מכשירי IntelliCage, שניים לכל מין.

המחברים התחילו את צינור הניתוח על ידי ביצוע בקרת איכות יסודית של הנתונים הגולמיים. הגרפים הכלולים כאן מציגים נתונים מייצגים מקבוצה אחת (n = 15 F, 16 M) של המחקרשפורסם 23. התסריט לכל הניתוחים והעלילה כלול במאגר GitHub29. יום הניסוי 0 הוצא בעקבות שינוי כלוב, שהפריע לאיסוף הנתונים. בין השיקולים לחקירת נתונים ובקרת איכות, המחברים הבטיחו שלכל העכברים תהיה גישה שווה לכל הפינות האופרטיביות הן בשלב האימון (איור 3A) והן בשלבי שתיית אלכוהול לסירוגין (איור 3B). דבר זה שולל השפעות משמעותיות של עכברים ש"תפסו" פינות אופרנט, ומונע מעכברים אחרים לגשת לבקבוקי השתייה (sper). המחברים אימתו לאחר מכן כי העכברים ביצעו ביקורים, דקירות אף וליקוקים בקצב צירקדי צפוי לאורך ימי הניסוי (איור 4A–C) ושכל העכברים הצליחו לבצע את הליקוק הראשון ביחס FR-3 תוך שש שעות מתחילת המודול (איור 4D). בסיום שלב האימון במים, כל העכברים השיגו שיעור הצלחה ליקוק גבוה יחסית (= אחוז הביקורים שהובילו לליקוק / סך כל הביקורים), מה שמאשר עוד יותר שהאימון הצליח בסיום האימון במים (איור 4E).

במהלך ההתרגלות, אימון מים ותחילת שתיית אלכוהול לסירוגין, העכברים שמרו על מספר דומה של ליקוק יומי (איור 5A–B). למרות שחלק מהעכברים הפגינו ירידה בסך הליקוקים היומיים בתחילת אימוני המים האופרנטיים ביום הניסוי -3 (למשל, P241260-1), רוב העכברים קיבלו לוח זמנים של FR-1 ו-FR-3 לאף פוק במהירות מספקת כדי לשמור על קצב הליקוק הבסיסי. לכן, לא סביר שעכברים חוו התייבשות מופרזת במהלך אימון מים. כל העכברים למדו את לוח הזמנים של FR-3 בקצב סביר. כאשר החלה שתיית אלכוהול לסירוגין ביום הניסוי הראשון, כמעט כל העכברים בחרו לשתות אלכוהול, אם כי בקצב משתנה. באופן כללי, עכברים לא העלו משמעותית את סך הליקוקים היומיים בעת שתיית אלכוהול. במקום זאת, העכברים עשו פחות ליקוק מים כדי להתאים לצריכת האלכוהול המוגברת.

בכל ימי שתיית האלכוהול לסירוגין, עכברים בקבוצה אחת השתנתה מאוד בכמות הליקוקים היומיים של האלכוהול ביחס למשקל הגוף (איור 6A). המחברים מצאו כי עכברים שעברו את פרדיגמת LBN היו בעלי משקל גוף נמוך משמעותית מעכברים שהיו מאומצים בהשוואה23. לכן, כאשר בחנו את ההבדלים הקבוצתיים בשתיית אלכוהול, הם בחרו לנרמל את הליקוקים היומיים של האלכוהול לפי משקל גוף, מה שהעריכו המחברים מדי שבוע במהלך החלפת כלובים. עכברים שגודלו ב-LBN שתו בדרך כלל יותר אלכוהול לגרם משקל גוף מאשר בני הביקורת במהלך שתייה לסירוגין (איור 6A) וזיוף כינין (איור 6B). מגמה זו נמשכה במשך יום אחד של גישה פתוחה לא פעילה (איור 6C). ממצאים אלה מהקבוצה הראשונה תואמים לתוצאות שפורסמו, שבהן המחברים מדווחים שעכברים שנחשפו ל-ELA שתו בעקביות יותר אלכוהול לגרם משקל גוף מאשר בני הביקורת שהיו מאומצים במהלך גישה לסירוגין, אפקט שהיה בולט במיוחד אצל גבריםבני 23.

בהשראת יעילות מערכות ניטור אוטומטיות בכלובים ביתיים, המחקר שפורסם אישר עלייה בשתיית אלכוהול בקרב מכרסמים חשופים ל-ELA בגדלי מדגמים חזקים במיוחד, כולל שני המינים (n = 54 ביקורת, 43 LBN)23. תוצאות אלו מהוות צעד קדימה במידול ההתנהגויות הדמויות AUD שנצפו אצל מטופלי AUD עם היסטוריה של חוויות לילות בילדות 58,59,60,61,62, ופותחות דלת למחקרים מכניים עתידיים שיזהו את הנוירוביולוגיה שמאחורי העלייה בפגיעות AUD לאחר ELA.

דיון

כפי שניתן לראות בשימוש המחברים ב-IntelliCages להערכת התנהגויות דמויות AUD בעכברים שנחשפו ל-ELA27 וכן בעבודות הקודמות בקווי טרנסגניים28, מערכות ניטור אוטומטיות בכלוב ביתי מציעות פתרון יעיל וגמיש לחקר מודלים פרה-קליניים של AUD. ההערכה הסימולטנית של עד 16 עכברים משותפים מגדילה משמעותית את קצב שיטת שתיית האלכוהול, תוך הימנעות מההשפעות המבלבלות של לחץ הנגרם מבידוד חברתי. פרדיגמת שתיית האלכוהול האופרנטית והלסירוגין מאפשרת לניסויים לבחון היבטים שונים של התנהגות דמוית AUD לאורך תקופה אחת ~5–6 שבועות, כולל שתייה מופרזת, הסלמה לאורך זמן, ושתייה חסרת רגישות לעונש. למרות שהפרדיגמה מציעה שיטה אחת להערכת התנהגות דמוית AUD, ניתן להתאים את העיצוב בקלות למדידת שתייה לסירוגין באופן כרוני יותר, לבדוק שתייה חסרת רגישות לעונש בתגובה לשאיפה אווירית, או להוסיף יחס משתנה של אופרנט, בין אפשרויות נוספות. בסך הכול, מערכות ניטור אוטומטיות בכלוב ביתי מגדילות משמעותית את קצב התפוקה והספציפיות שבהן חוקרים יכולים להעריך התנהגויות דמויות AUD, ומזינות זיהוי מעגלים וטיפולים חדשים מתחת לפני השטח.

כמו בכל טכנולוגיה, גם סופרים חווים לעיתים תקלות מכניות וטכניות. למרות הפיתוי לאפשר למערכת לפעול ללא פיקוח, חשוב שהחוקרים ימשיכו לעקוב אחרי המכשיר באופן קבוע כדי להבטיח תפקוד תקין. תקלות מכניות מזדמנות בדלתות המגנטיות גרמו לכך שבקבוקי שתייה הפכו לבלתי נגישים לעכברים. זה קרה לעיתים רחוקות עם ניקוי ותחזוקה נכונים, ובדרך כלל הפריע לאיסוף הנתונים במידה מזערית. כדי לזהות טעויות במהירות, חשוב לעקוב אחרי בקבוקי השתייה לירידה דומה בנוזלים ולבדוק באופן קבוע את אפליקציית "Controller" כדי לוודא שהליקוקים נרשמים בכל הפינות עבור כל בעלי החיים. לקבלת ייעוץ מעמיק יותר, מסודה ועמיתיו מציגים תיאור מצוין של איך להקים ולבצע תחזוקה ב-IntelliCages48.

חשוב גם לעקוב באופן קבוע אחר התנהגות בעלי החיים כדי לעקוב אחר התנהגויות לחימה או מבלבלות. למרות שהמחברים לא נתקלו בבעיות משמעותיות במאבק כאשר הרצו את הפרדיגמה הזו עם עכברי C57/BL6, מגורים משותפים לזכרים בעלי גנוטיפים אגרסיביים יותר גרמו לבעיות משמעותיות. עקבו באופן קבוע אחר דם יבש, בעלי חיים צולעים או סימנים אחרים של קרבות, במיוחד לאחר החלפת כלובים. אם מבחינים בסימנים אלה, יש להסיר מיד את החיה/ים הבעייתי ולהרחיק אותם מהמשך ניסויים. השתמשו בסעיף "ביצועי עכבר בודד" בקוד שסופק כדי להעריך האם ולמשך כמה זמן השפיעה תוקפנות על התנהגות השתייה של עכברים בודדים. החריג את כל הימים המושפעים מהניתוח. כפי שנאמר קודם, המחברים אינם יכולים להבטיח את הכללת הפרוטוקול לגנוטיפים או סידורי דיור שונים.

בהקשר דומה, לעיתים היו לכותבים בעיות עם עכברים ש"תופסים" פינות אופרנט, על ידי שינה או שהייה באותה פינה במשך שעות ארוכות. התנהגות זו חוסמת עכברים אחרים לגשת לבקבוקי השתייה בפינה הזו. מצבים אלה עלולים לבלבל את תוצאות השתייה אם לא יילקחו בחשבון כראוי בניתוח. השתמשו בסעיפים "תפוסה פינה (משך ביקור)" ו"ביצועי עכבר בודדים" בקוד שסופק כדי להחליט האם "תפוס" השפיע מספיק על התנהגות העכבר כדי להוציא ימים ניסיוניים מסוימים. באופן כללי, חוסר היכולת לתעד או לכמת התנהגויות חברתיות במהלך ניסויים הוא מגבלה מרכזית של מערכת ניטור אוטומטית זו.

לבסוף, כפי שקורה יותר ויותר בשיטות נוירו-מדעיות מתקדמות, מערכות ניטור ביתיות אוטומטיות מייצרות כמויות גדולות של נתונים. באמצעות קוד קוד פתוח כמו זה שמוצג כאן29 ופותח על ידיאחרים 63,64, לניסויים יש כלים מרובים לארגון וניתוח נתוני הוצאה. עם זאת, שינויים בפרוטוקול המוצג כאן ידרשו התאמת הקוד. יתרה מזאת, ניתן לבצע ניתוחים נוספים רבים על אוצר נתוני הפלט שאינם מוצגים כאן.

לדוגמה, חוקרים עשויים להתעניין בכימות צריכת האלכוהול (g אלכוהול לקילוגרם משקל עכבר ביום). המחברים דנים בכך בקצרה ומספקים קוד ראשוני לביצוע ניתוח זה במאגר GitHub29. שם, המחברים משתמשים בפקטור המרה מליק-לנפח של 1.94 מיקרוליטר/ליק, בהתאם לחישובים שבוצעו על ידי קסיה רדוונסקה ועמיתיה30,37. למרות שמקדם המרת ליקוק זה שימש להערכת צריכת אלכוהול על ידי אחרים בשטח 30,37,38,39, הוא חושב על ידי מדידת צריכת מים. לכן, ייתכן שאינו מדד מדויק לצריכת אלכוהול של 20% בשל הבדלים במתח הפנים בין מים לאלכוהול. אחרים בתחום השתמשו בפקטור המרת ליק של 3 מיקרוליטר/ליק 31,34,36,38, מה שמדגיש את הצורך לפתור מדידה זו. אי אפשר לשלול את האפשרות שעכברים מבצעים ליקוק בגדלים שונים, מה שמסבך עוד יותר את החישוב. אם החוקרים מעוניינים לקבל מדד מדויק של צריכת אלכוהול (גרם/ק"ג/יום), המחברים ממליצים לחשב מקדם המרה מ-ליקוק לנפח התואם את עיצוב הניסוי.

לסיכום, ההתקדמות והנגישות המוגברת של מערכות ניטור אוטומטיות בכלובים ביתיים מעניקים לחוקרי AUD כלים חדשים ומשופרים להערכת שתיית אלכוהול פרה-קלינית. פרדיגמות שתיית אלכוהול לסירוגין אופרנט כאלה מאפשרות לניסויים להעריך בו-זמנית היבטים שונים של התנהגות דמוית AUD בקצב תפוקה גבוה בהרבה וברלוונטיות אתולוגית גבוהה יותר מהמתודולוגיה המסורתית. באמצעות מערכות בדיקות IntelliCage וחלופות קוד פתוח20,26, חוקרים יכולים לבדוק בצורה יעילה וגמישה יותר התנהגויות שתיית אלכוהול התואמות את AUD, ולהאיץ את זיהוי התערבויות יעילות.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה במימון מתוכנית המחקר הפנימית של NIH של המכון הלאומי לבריאות ל-V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). אנו רוצים להודות למרים בוקרסלי, אנו מסקרי וארין מארי על עזרתם בפיתוח הפרוטוקול הזה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול, 190 הוכחהמעבדות דקון2801G
מערכת בדיקות IntelliCageמערכות TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/כולל 1x כלוב סטטי 2000P (Tecniplast, 2000P001),  4 בתי עכברים (Tecniplast, ACRE011), ו-8 בקבוקי שתייה (Techniplast, ACBT0252) וקבוקים (Techniplast, ACCP3521)
תוכנת IntelliCage ("מעצב", "בקר", "אנלייזר")מערכות TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/גרסה 3.6.9.0
פדי איזו, 6" x 10"בריינטרי סיינטיפיק, בע"מ.ISO 6105רפידות סיבי כותנה דחוסה (15.24 x 25.4 ס"מ)
איזופלוראןבקסטר10019-360-40
איזופלוראן VXP™ מאדה מלא בארמד ווט91305535
תזונה של מכרסמים במעבדהLabDiet5001
תא אינדוקציה של עכבר/חולדה עם איטום בינוניוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסEZ-178
נסטלטסאנקרהNES 3600ריבועי כותנה קטנים (5.08 על 5.08 ס"מ)
OHAUS Compass & Trade; סולם CX - 2,200 גרם x 1 גרםיוליןH-8110למדידות משקל גוף של עכבר
PC + תצוגהסופרמיקרוhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/נמכר כחלק ממערכת הבדיקות של IntelliCage
משדר RFID (1.25 x 7 מ"מ)מערכות TSE290000-IC-60400
מזרק משדר RFIDAVIDAVID2028
קורא משדר RFIDמערכות TSE290000-IC-50800
RStudioהנחהhttps://posit.co/download/rstudio-desktopגרסה 2026.01.1+403; עם Tidyverse (2.0.0) ו-Quarto (1.9.37)
חד-פעמית טרי פורקונסולידייטד פלסטיקס45317למדידות משקל גוף של עכבר

מקורות

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התנהגות אופרנטיתמערכת IntelliCageהפרעת שימוש באלכוהולהערכה אוטומטיתגישה לסירוגין לאלכוהולמשדר RFIDשתייה רצוניתבדיקות בתפוקה גבוהה

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.