הליך סטנדרטי במבחנה להערכת שינויים במיקרוקשיות פני השטח בחומרים ננו-היברידיים של שרף לאחר חשיפה למשקאות חלבון מי גבינה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית במבחנה להערכת השפעות משקאות חלבון מי גבינה על קשיחות מיקרו-קומפוזיטית של שרף. הגישה מאפשרת הערכה מבוקרת של חשיפה תזונתית באמצעות טבילה מחזורית ובדיקות ויקרס, ומספקת מודל שניתן לשחזר לחקירת האינטראקציה בין משקאות תזונתיים לביוחומרים משקמים.

תקציר

מטרת מחקר זה במבחנה הייתה להעריך את השפעת משקאות חלבון מי גבינה שונים על הקשיחות המיקרו-קשיחות פני השטח של שלושה קומפוזיטים ננו-היברידיים של שרף. בסך הכול הוכנו 90 דגימות בצורת דיסק משלושה קומפוזיטים ננו-היברידיים (n = 30 לכל חומר) וחולקו לשלוש קבוצות (n = 10) בהתאם למדיום ההטבילה: ריכוז מי גבינה מרוכז, איזוט מי גבינה ומים מזוקקים. הדגימות הוטבלו במשך 10 דקות פעמיים ביום במשך 30 יום. מיקרו-קשיחות פני השטח נמדדה בבסיס ואחרי הטבילה באמצעות בודק מיקרוקשיות ויקרס, ושינוי הקשיות חושב כ-ΔVHN. הנתונים נותחו באמצעות מדידות דו-כיווניות, ANOVA ובדיקות לאחר מכן. הניתוח חשף כי סוג הרכיבה, תמיסת הטבילה והאינטראקציה ביניהם השפיעו באופן מובהקים סטטיסטית על ערכי ΔVHN (p < 0.0001). אובדן הקשיות הגבוה ביותר נצפה במרוכב להזרקה שנחשף לריכוז מי גבינה (ΔVHN: 10.4 ± 2.1), בעוד שהשינוי הנמוך ביותר נרשם בקומפוזיט המלא מאוד המאוחסן במים מזוקקים (ΔVHN: 0.9 ± 0.4). טבילה בריכוז מי גבינה גרמה לאובדן קשיות משמעותית גבוה יותר בכל החומרים המורכבים בהשוואה למים מזוקקים (p < 0.05). מבודד מי גבינה גרם גם לאובדן קשיחות גבוה משמעותית בכל החומרים המורכבים למעט החומר המרוכב המלא מאוד, שבו לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית (p = 0.076). ממצאים אלו מצביעים על כך שמשקאות חלבון מי גבינה עשויים להפחית את המיקרוקשיחות השטחית של קומפוזיטים שרפים, כאשר מידת הפירוק תלויה הן בהרכב החומר והן בנוסחת המשקה.

מבוא

ההצלחה ארוכת הטווח של שיקום קומפוזיט שרף תלויה בעמידותם לאתגרים סביבתיים מורכבים בפה, כולל עומס מכני, חשיפה תזונתית ופירוק כימי ^1,2. קומפוזיטים של שרף ננו-היברידי נמצאים בשימוש נרחב בשל תכונותיהם האסתטיות והמכניות הטובות, במיוחד קשיחות מיקרו-שטחית, המשמשת כאינדיקטור חשוב לעמידות לשחיקה והתדרדרות מבנית ^3,4.

מחקרים קודמים הראו כי חשיפה למשקאות חומציים כמו מיצי פירות, משקאות מוגזים ומשקאות אנרגיה עלולה להשפיע לרעה על שיקום חומרים מרוכבים על ידי הפחתת קשיחות המיקרו-פני השטח ושינוי שלמות פני השטח 5,6,7,8. השפעות הפירוק הללו מושפעות ממספר גורמים, כולל pH, זמן חשיפה והרכב מילוי-מטריצה. עם זאת, רוב המודלים הניסיוניים הקיימים מסתמכים על תמיסות חומציות מאוד, שאינן משקפות במדויק את האתגרים הכימיים הקיימים בהרגלי התזונה העכשוויים.

לעומת זאת, משקאות חלבון מי גבינה זכו לפופולריות רחבה בשל ערכם התזונתי והצריכה הגוברת^{בקרב אנשים} שמתמקדים בכושר ^9,10. למרות ה-pH כמעט הנייטרלי שלהם, משקאות אלו מכילים לקטוז, חלבונים ורכיבים אורגניים נוספים שעשויים לקיים אינטראקציה עם מטריצת השרף ולהשפיע על יציבות החומר. לכן, הערכת השפעותיהם דורשת פרוטוקול שמתייחס לא רק לחומציות אלא גם להרכב אורגני ודפוסי חשיפה חוזרים.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה סטנדרטית וניתנת לשחזור במבחנה להערכת השפעות משקאות חלבון מי גבינה, ובמיוחד נוסחאות מרוכזות ומבודדות, על הקשיחות המיקרו-קשיחות של קומפוזיטים ננוהיברידיים של שרף. שיטה זו מאפשרת סימולציה מבוקרת של חשיפה יומית לתזונתית באמצעות טבילה מחזורית, ובכך לשפר את הרלוונטיות הניסויית של תנאי הבדיקה במבחנה .

בהשוואה למודלים קונבנציונליים לחשיפה למשקאות חומציים, פרוטוקול זה מציע מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר חקירת התדרדרות חומר בתנאי pH כמעט ניטרליים, ומאפשר הערכה של תגובות חומר מעבר להשפעות מונעות חומצה. שנית, עיצוב הטבילה המחזורית משקף טוב יותר דפוסי צריכה אמיתיים. שלישית, השיטה מקלה על הערכה השוואתית של נוסחאות מרוכבות שונות בהתבסס על מאפיינים מבניים כגון תכולת חומרי מילוי והרכב מטריצת שרף.

פרוטוקול זה מתאים במיוחד לחוקרים השואפים להעריך את היציבות הכימית של חומרים משקמים בתנאים תזונתיים רלוונטיים, וכן למחקרים החוקרים את האינטראקציה בין רכיבי תזונה לביוחומרים דנטליים. ניתן גם להתאים אותו לבדיקת נוסחאות משקאות חלופיות, טיפולי שטח או חומרים מרוכבים שפותחו לאחרונה.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימה

1. הכינו בסך הכל 90 דגימות בצורת דיסק משלושה קומפוזיטים של שרף ננו-היברידי (n = 30 לכל חומר).
2. ייצור דגימות באמצעות תבניות סיליקון שקופות גליליות (קוטר 6 מ"מ × 2 מ"מ) כדי להבטיח מידות סטנדרטיות.
3. הכניסו את החומר המרוכב לתבניות בתוספת אחת (2 מ"מ עובי) וכסו את המשטח עם סלייד מיקרוסקופ שקוף כדי לקבל משטח שטוח.
4. פולימר את הדגימה באמצעות יחידת קיבוש אור LED כחולה (≈440–480 ננומטר ספקטרום פליטה) הממוקמת כ-1 מ"מ מהשטח עם עוצמת יציאה של 1000 mW/^cm2 למשך 20 שניות.
5. בדוק את עוצמת האור המתקשרת באמצעות רדיומטר לפני כל מחזור פולימריזציה כדי להבטיח חשיפה עקבית לאור באור.
6. יש לאחסן את הדגימות המוכנות במים מזוקקים בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות כדי לאפשר פוסט-פולימריזציה ולדמות תנאים אוראליים ראשוניים.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות במים מזוקקים בטמפרטורה של 37°C עד 24 שעות לפני המשך העיבוד.

2. הליך גימור וליטוש

1. גימור וליטוש המשטחים העליונים של כל הדגימות באמצעות דיסקי ליטוש ספוגים באלומיניום אוקסיד. כל הליכי הליטוש צריכים להתבצע על ידי מפעיל יחיד כדי להבטיח תקינה של פני השטח.
2. יש ליטוש ברצף באמצעות דיסקים בינוניים, דקים וסופר-דקים למשך 10 שניות כל אחת בקירור במים במהירות של כ-10,000 סל"ד, עם לחץ קל ותנועה סיבובית חד-כיוונית.
3. החלפת דיסקי ליטוש לאחר כל חמש דגימות כדי לשמור על יעילות שוחקת עקבית ולהבטיח תקינה של פני השטח.
4. לאחר כל שלב ליטוש, שטוף דגימות במים מזוקקים במשך 10 שניות להסרת פסולת וייבש בעדינות באוויר במשך 5 שניות לפני שממשיכים לדיסק הבא.
5. סמנו את פני השטח הלא מלוטשים של כל דגימה בקוד זיהוי ייחודי כדי להבטיח כיוון אחיד במהלך הבדיקות הבאות.
6. אחסן דגימות במים מזוקקים בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות לפני בדיקת המיקרוקשיות הבסיסית.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות במים מזוקקים בטמפרטורה של 37°C עד 24 שעות לפני בדיקות בסיסיות.

3. מדידת קשיחות מיקרו-בסיסית

1. בצע בדיקת מיקרו-קשיחות ויקרס בסיסית (VHN) בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר באמצעות בודק מיקרו-קשיחות ויקרס¹¹.
2. הפעיל עומס של 200 גרם ל-15 שניות זמן שהיה.
3. עשו שלושה שקעים לכל דגימה עם מרווח של לפחות 1 מ"מ. בצע שקעים על שטח הפנים המרכזי של כל דגימה כדי למנוע השפעות קצוות.
4. חשב ממוצע VHN בסיסי.
5. לבצע מדידות על ידי מפעיל מכויל יחיד כדי למזער שונות.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות במים מזוקקים בטמפרטורה של 37°C עד 24 שעות לפני הטבלה.

4. הכנת מדיה טבילה

1. הכינו שתי נוסחאות חלבון מי גבינה: ריכוז חלבון מי גבינה (WC) ובידוד חלבון מי גבינה (WI) באמצעות אבקות זמינות מסחרית.
2. המיס 25 גרם אבקת חלבון מי גבינה ב-200 מ"ל מים מזוקקים (0.125 גרם/מ"ל) להכנת תמיסות הטבילה.
3. ערבבו את התמיסות באמצעות שייקר מעבדה למשך 60 שניות עד להשגת התמוססות מלאה.
4. אפשר לתמיסות להתאזן בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי למזער את היווצרות הקצף ולהבטיח אחידות.
5. מדוד ורשום את ה-pH של כל תמיסה באמצעות מד pH דיגיטלי מכויל לפני ההטמעה.
6. הכינו תמיסות מי גבינה טריות לפני כל מחזור טבילה כדי להבטיח הרכב כימי אחיד ולמנוע פירוק חלבון.
7. השתמש ב-10 מ"ל תמיסת טבילה לכל דגימה כדי להבטיח טבילה מלאה בכל מחזור.

5. הליך טבילה

1. חלק כל קבוצה מורכבת לשלוש תת-קבוצות (n = 10).
2. טבלו דגימות בתמיסות שהוקצו ל-10 דקות, פעמיים ביום. בחר את משך הטבילה והתדירות בהתבסס על מודלים של חשיפה למשקאות במבחנה שתוכננו לדמות^דפוסי צריכה חוזרים 7.
3. לאחר כל מחזור הטבילה, שטפו את הדגימות במים מזוקקים והניחו אותן ברוק מלאכותי למשך 10 דקות כדי לדמות חשיפה קצרה לרוק.
4. אחסן את הדגימות במים מזוקקים בין מחזורי הטבילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למחזור החשיפה הבא.
5. יש ליישם הליך זה רק על קבוצות החשופות למי גבינה. לשמור על קבוצת הביקורת ברציפות במים מזוקקים (DW) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת הניסוי.
   הערה: פרוטוקול ההטמעה יכול להיות מושהה בין מחזורים ולהמשיך ביום הבא מבלי לפגוע בעקביות הניסוי.
6. המשך את פרוטוקול ההטמעה למשך 30 יום.

6. מדידת קשיחות מיקרו-לאחר טבילה

1. שטפו דגימות במים מזוקקים וייבשו בעדינות.
2. בצע בדיקות מיקרו-קשיות של ויקרס עם אותם פרמטרים (200 גרם, 15 שניות).
3. רשמו שלוש הזחות וחישבו את ממוצע ה-VHN לאחר הטבלה.
4. קבעו ΔVHN לכל דגימה.

7. ניתוח סטטיסטי

1. ניתחו ערכי מיקרו-קשיחות של ויקרס באמצעות מודל ANOVA עם מדידות חוזרות, כאשר נקודת הזמן (קו בסיס ואחרי הטבילה הפנימית) היא הגורם בתוך הנושא, וסוג הרכיבה ופתרון הטבילה הם גורמים בין הנושאים.
2. כאשר מתאים, חישבו ערכי ΔVHN כמדדי תוצאה תיאוריים לביטוי גודל השינוי במיקרו-קשיות עבור כל דגימה.
3. בצע השוואות זוגיות לאחר הוק באמצעות מבחן ההפרש המשמעותי בכנות (HSD) של טוקי.
4. חשב טווחי אמון של 95% עבור כל ממוצעי הקבוצה.
5. דווח על גודל אפקט באמצעות ETA בריבוע חלקי (η²p) עבור תוצאות ANOVA.
6. השווה ערכי pH בין תמיסות חלבון מי גבינה באמצעות מבחן ה-t של וולש.
7. הגדר את רמת המובהקות הסטטיסטית על p < 0.05.
8. בנוסף לערכי ΔVHN מוחלטים, יש לחשב את אחוז שינוי המיקרו-קשיחות באמצעות הנוסחה הבאה: [(VHN בסיסי − VHN לאחר הטבלה) / VHN בסיסי] × 100.

תוצאות

סטטיסטיקה תיאורית

ערכי ΔVHN (±SD) הממוצעים של שילובי התמיסה המורכבים מוצגים בטבלה 1.

קומפוזיט שרף	פתרון	ΔVHN (ממוצע ± SD)	95% CI	n
EA	מים מזוקקים	0.9 ...

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה סטנדרטית להערכת ההשפעה הכימית של משקאות חלבון מי גבינה על קשיחות מיקרו-קומפוזיט של שרף. השלבים הקריטיים כוללים ייצור דגימות אחיד, תנאי ייבוש מבוקרים באור, ופרמטרים סטנדרטיים של בדיקת ויקרס. שמירה על מידות ודגימה עקביות ועוצמת ריפוי היא חיונית, שכן שינויים עשויים להשפיע על מידת ההמרה והיציבות המכנית. בנוסף, שליטה קפדנית על משך הטבילה וטמפרטורה מבטיחה שחזוריות ומפחיתת שונות הקשורה לתהליכי ספיגת מים והרפיית פולימרים^12,13

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דיסקי ליטוש תחמוצת אלומיניום	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., איסטנבול, טורקיה	5714	בינוני, עדין, סופר עדין, המשמש לגימור וליטוש
מאזניים אנליטיים			משמש לשקילת חומרים
תמיסת רוק מלאכותית	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, איסטנבול, טורקיה		משמש לאחסון בין מחזורי טבילה
מד pH דיגיטלי	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, ארה"ב	HI2211	מדידת pH של משקאות
מים מזוקקים	לא צוין	לא חל	משמש כפתרון בקרה ולאחסון דגימות
שקופית מיקרוסקופ מזכוכית	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, סין	7102	משמש להשגת משטח דגימה שטוח במהלך הצבת קומפוזיט
צילינדר מדורג	לא צוין	לא חל	משמש למדידת נפחי נוזלים
חומר קומפוזיט נאנו-היברידית ממולא גבוה (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, טוקיו, יפן)	10942	משמש כחומר שיקום; שונה בתוכן המילוי ובהרכב מטריצת השרף
חממה	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, גרמניה	UN55	משמש לאחסון ב-37°C
חומר קומפוזיט נאנו-היברידית להזרקה (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, טוקיו, יפן)	12365	משמש כחומר שיקום; שונה בתוכן המילוי ובהרכב מטריצת השרף
כוס מעבדה	לא צוין	לא חל	משמש להכנת פתרונות חלבון מי גבינה
שייקר מעבדה	לא צוין	לא חל	משמש לערבוב והומוגניזציה של פתרונות
יחידת LED לייבוש אור ורדיום	יחידת לייבוש LED Woodpecker (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., גואנגשי, סין)	FD-300	פולימריזציה ו  אימות של עוצמת האור
ידית מיקרומוטור	FX205, NSK Ltd., Kanuma, יפן	C1056002	משמש בהליך ליטוש
חומר קומפוזיט נאנו-היברידית ממולא בינוני (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, ארה"ב)	6570A2	משמש כחומר שיקום; שונה בתוכן המילוי ובהרכב מטריצת השרף
תבנית סיליקון	לא צוין	לא חל	בצורת דיסק, קוטר 6 מ"מ × עובי 2 מ"מ, המשמש לייצור דגימה
בוחן מיקרו-קשיות ויקרס	HMV, Shimadzu Corporation, קיוטו, יפן	HMV-G31	בדיקת מספר קשיות ויקרס (VHN)
אבקת חלבון מי גבינה מרוכזת	חלבון מי גבינה בטעם תות, Proteinocean Gida AS., אנקרה, טורקיה		תכולת לקטוז: ~1–2%, תכולת חלבון: ~85–90%
אבקת חלבון מי גבינה מבודד	חלבון מי גבינה בטעם שוקולד, Proteinocean Gida AS., אנקרה, טורקיה		תכולת לקטוז: ~4–6%, תכולת חלבון: ~70–80%