מאמר מחקר

אפיון מולקולרי וגנומי ממוקד מייצג של גני אלימות בסטפילוקוקוס אוראוס מזיהומים בכף רגל סוכרתית

DOI:

10.3791/71373

⸱

29 במאי 2026

 ,  , 
1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אפיין את מנגנוני העמידות לאנטימיקרוביאלים, קובעי אלימות ותכונות גנומיות של מבודדי Staphylococcus aureus שהחלימו מזיהומים בכף רגל סוכרתית, באמצעות בדיקות רגישות אנטימיקרוביאליות, פרופיל אלימות מבוסס PCR וריצוף גנומי מלא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים בכף רגל סוכרתית (DFIs) מהווים דאגה מרכזית לבריאות הציבור, ו-Staphylococcus aureus עמיד למתיצילין (MRSA) הוא בין הפתוגנים החשובים ביותר מבחינה קלינית. מחקר זה חקר את שכיחות גני האלימות (can ו-hlg), פרופילי עמידות אנטימיקרוביאלית, ותכונות גנומיות מייצגות של מבודדי S. aureus עמידים לרב-תרופות שנמצאו ממטופלים עם DFIs. מחקר תצפיתי חתך נערך על 125 מטופלים עם זיהומים סוכרתיים בכף הרגל בין ינואר לדצמבר 2024. בדיקות רגישות אנטימיקרוביאליות בוצעו באמצעות שיטת דיפוזיית דיסק קירבי–באואר וסקר צפוקסיטין בהתאם להנחיות המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI), כאשר S. aureus ATCC 25923 שימש כזן בקרת איכות. הרגישות לונקומיצין אושרה באמצעות בדיקות ריכוז מעכב מינימלי (MIC). תגובת שרשרת פולימראז (PCR) שימשה לזיהוי גני האלימות (CAN ו-HLG) וגני blaOXA-group I. ריצוף גנום מלא (WGS) בוצע על שני מבודדים מייצגים, כולל מבודד עמיד לתרופות מרובות תרופות (MDR) ומבודד עמיד לתרופות (XDR) אחד, תוך שימוש בגישת ריצוף דה נובו ליצירת מכלולי גנום טיוטה. מבין 125 דגימות קליניות, נצפה גידול חיידקים ב-90 דגימות (72%), מתוכם 45 מבודדים (50%) זוהו כ-S. aureus. מבין המבודדים הללו, 35 מתוך 45 (77.78%) סווגו כ-MRSA, ו-36 מתוך 45 (80%) היו עמידים לרב-תרופות. גן ה-HLG זוהה בכל הבידודים, בעוד שגן ה-can זוהה ב-13 מתוך 45 (28.89%) מבודדים. לא זוהו גנים של blaOXA-group I. ניתוח גנומי זיהה גנים רבים הקשורים לעמידות, כולל blaZ, tet(38), norA ו-vanT, יחד עם אלמנטים של CRISPR-Cas ודדרי עמידות הקשורים לפלסמיד. ממצאים אלו מדגישים את השכיחות הגבוהה של S. aureus עמיד לרב-תרופות ב-DFIs ותומכים בחשיבות המשך המעקב הגנומי של זנים עמידים קליניים רלוונטיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכונות קולוניזציה ואלימות רבות הופכות את החיידק הגרם-חיובי Staphylococcus aureus (S. aureus) לפתוגן אופורטוניסטי נפוץ המסוגל לגרום למגוון רחב של זיהומים, כולל אימפטיגו, זיהומים בפצעים, פרונקלים, מורסות עור, בקטרמיה ואנדוקרדיטיס זיהומית1. חלק מהזיהומים הללו עלולים להתקדם למחלה קשה ולדרוש אשפוז, במיוחד אצל חולים עם סוכרת, דיכוי חיסונית, ממאירויות, קטטריזציה בשתן או זיהום בנגיף הכשל החיסוניהאנושי 1.

זנים עמידים למתיצילין (S. aureus) (MRSA) קשורים לתחלואה ותמותה משמעותיים בשל יכולתם לרכוש במהירות גורמי עמידות אנטימיקרוביאלית ולהישאר בסביבה רפואית1. מטופלים עם סוכרת מליטוס מפתחים לעיתים קרובות כיבי כף רגל סוכרתיים עקב נוירופתיה, חוסר ספיקת כלי דם ותגובות חיסוניות לקויות. זיהומים בכף רגל סוכרתית (DFIs) הם בעלי פתופיזיולוגיה מורכבת, והתוצאות הקליניות מושפעות הן מגורמים מיקרוביאליים והן מגורמים הקשורים למארח, כולל אלימות חיידקית3. למרות שכיבי כף הרגל הסוכרתיים עשויים להכיל קהילות פולימיקרוביאליות המורכבות מחיידקים ופטריות אירוביים ואנאירוביים, S. aureus נותר אחד הפתוגנים הדומיננטיים שבודדו מזיהומים אלו4. לאורגניזם יש מספר גורמי אלימות המסייעים להתחמקות חיסונית, פלישת רקמות, קולוניזציה כרונית וזיהום מתמשך. יתרה מזאת, רכישת עמידות למתיצילין בתיווך mecA/SCCmec וגורמים אחרים לעמידות אנטימיקרוביאלית הגבילה משמעותית את אפשרויות הטיפול לזיהומים הקשורים ל-DFI 4,5. מחקרים קודמים דיווחו על שכיחות גבוהה של מבודדי S. aureus עמידים לרב-תרופות (MDR) בזיהומים בכף רגל סוכרתית, כאשר עמידות לעיתים קרובות קשורה לגנים β-לקטמאז, כולל blaTEM, blaOXA ו-blaCTX-M 6.

מספר גנים הקשורים לאלימות תורמים לפתוגניות ולהתמדה של S. aureus בזיהומים כרוניים בפצעים. מתוכם, גן ה-HRG מקודד γ-המוליזין, גורם ציטוטוקסי הקשור להרס רקמות, דלקת, התחמקות חיסונית והתמשכות של זני MRSA שנרכשו על ידי הקהילה 7,8. גן ה-Can מקודד אדאזין קושר לקולגן שמקל על היצמדות חיידקים לרקמות עשירות בקולגן ותורם להתיישבות כרונית והתמשכות זיהום8. מחקרים קודמים זיהו שכיחות גבוהה של HLG בקרב מבודדי MRSA שהחלימו מזיהומים בכף רגל סוכרתית, והדגישו את ההופעה המשותפת של גורמי אלימות ועמידות אנטימיקרוביאלית בזיהומים אלו. חשיפה לא מתאימה לאנטיביוטיקה, אשפוז ממושך, פגיעה בחדירת חומרים אנטי-מיקרוביאליים לרקמות והתקדמות פצעים כרונית תורמים עוד יותר להופעת והפצת אורגניזמים של MDR אצל חולים עם DFIs10. לפי הגדרות בינלאומיות, חיידקים עמידים לרב-תרופות (MDR) מפגינים עמידות לפחות לסוכן אנטימיקרוביאלי אחד בשלוש קבוצות אנטימיקרוביאליות או יותר, חיידקים עמידים לתרופות (XDR) באופן נרחב עדיין רגישים רק לקטגוריה אחת או שתיים של אנטימיקרוביה, וחיידקים עמידים לפנדרוג (PDR) עמידים לכל סוגי האנטימיקרוביאליים שנבדקו10. למרות החשיבות הקלינית המוכרת של S. aureus בזיהומים בכף רגל סוכרתית, עדיין קיימת מידע מולקולרי וגנומי משולב מוגבל המקשר בין מגני אלימות לבין פרופילי עמידות אנטימיקרוביאלית בבידוד קליני מאזור זה.

לכן, מחקר זה נועד לאפיין דפוסי עמידות אנטימיקרוביאלית, לקבוע את שכיחות גני האלימות הנבחרים (HLG ו-CAN), לחקור את הופעת גנים מקבוצת OXA I של bla, ולבצע ניתוח רצף גנומי מלא מייצג של מבודדי S. aureus עמידים לרב-תרופות שנאספו מחולים עם זיהומים סוכרתיים בכף הרגל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מטופלים במחקר

מחקר זה אושר על ידי ועדת האישור האתי של אוניברסיטת אנבר, משרד ההשכלה הגבוהה והמחקר המדעי, עיראק (אישור מס' 145), עיר רמדי, מחוז אנבר, עיראק, ב-24 בדצמבר 2023. כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות האתיות המוסדיות של אוניברסיטת אנבר. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני ההרשמה.

מחקר תצפיתי חתך נערך מינואר עד דצמבר 2024 בבתי החולים ההוראה רמאדי ובמרפאות פרטיות קשורות במחוז אנבר, עיראק. בסך הכול נרשמו במהלך תקופת המחקר, 125 מטופלים זכאים ברצף עם זיהום סוכרתי בכף הרגל (DFIs). גודל המדגם נקבע לפי מספר המטופלים הזכאים הזמינים במהלך תקופת המחקר ולא באמצעות חישוב סטטיסטי. קלינית, DFI הוגדר כנוכחות כיב רגל מכל דרגה אצל חולים עם סוכרת סוג 1 (T1DM) או סוכרת סוג 2 (T2DM). נכללו מטופלים גברים ונשים עם רמות חומרה שונות של כיב.

המטופלים היו זכאים אם היו להם כיב כף רגל סוכרתי שאובחן קלינית, הגיעו למוסדות הבריאות המשתתפים, ונתנו הסכמה מדעת. קריטריוני ההדרה כללו כיבים בכף הרגל שאינם קשורים לסוכרת (למשל, כיבים טראומטיים), הפניה ממוסדות בריאות אחרים, חוסר יכולת לתת הסכמה מדעת בשל מחלה קשה, קבלת טיפול אנטיביוטי בתוך 48 שעות לפני איסוף הדגימות, וזיהומים פולימיקרוביאליים. מטופלים עם זיהומים פולימיקרוביאליים הוצאו מהחוק כדי להבטיח אפיון פנוטיפי, מולקולי וגנומי מדויק של מבודדי סטפילוקוקוס אוראוס . נתונים דמוגרפיים וקליניים, כולל גיל, מין, סיבוכי סוכרת, משך הסוכרת, היסטוריה אנטיביוטית ומצבים נלווים, נאספו באמצעות שאלון מובנה.

הדגימות הקליניות הועברו למעבדת המיקרוביולוגיה בתוך שעתיים מהאיסוף בתנאי קירור (4 מעלות צלזיוס) באמצעות מטושי הובלה סטריליים המכילים מדיום אמיס ועובדו מיד לניתוח מיקרוביולוגי. כל ההליכים הכוללים דגימות קליניות, תרביות חיידקים, בדיקות רגישות אנטימיקרוביאלית, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) והדמיית אולטרה סגול (UV) בוצעו בתנאי מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית. צוותי המעבדה השתמשו בציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל מעילי מעבדה, כפפות חד-פעמיות, מסכות ניתוח והגנה על עיניים בעת הצורך. ננקטו נהלים אספטיים מחמירים בכל ההליכים המיקרוביולוגיים והמולקולריים כדי למזער את סיכוני הזיהום והחשיפה. אזורי עבודה ייעודיים שימשו לטיפול בתרביות חיידקים ולהליכי הגברת DNA למניעת זיהום צולב. חומרים מזוהמים, כולל לוחות גידול, מטושים, קצות פיפטות וחומרים חד-פעמיים, עברו אוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 15–20 דקות לפני ההשלכה. חתיכות חדות הושלכו במיכלים מסוכנים לביולוגיה עמידה לדקירה. הפסולת הביולוגית נוהלה בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים להשלכת פסולת ביו-רפואית. אמצעי הבטיחות הביולוגית הללו הבטיחו טיפול בטוח באורגניזמים עמידים לרב-תרופות, כולל MRSA ובודדים עמידים לוואנקומיצין (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: סקירה של תהליך העבודה הקליני, המיקרוביולוגי, המולקולרי, ריצוף הגנום המלא והביואינפורמטיקה ששימש במחקר. התרשים מסכם איסוף דגימות, תרבית מיקרוביולוגית, בדיקות רגישות אנטימיקרוביאליות, גילוי מולקולרי מבוסס PCR, ריצוף גנומי מלא וניתוחי ביואינפורמטיקה במורד הזרם. תרשים זה נוצר בסיוע פלטפורמת העיצוב מבוססת הבינה המלאכותית Gamma Pro (אפליקציית גמא) ולאחר מכן נבדק, עודכן ואומת על ידי המחברים לדיוק מדעי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הנתונים נותחו באמצעות תוכנת SPSS גרסה 22.0. סטטיסטיקות תיאוריות, כולל ממוצעים ואחוזים, חושבו. אסוציאציות בין משתנים קטגוריים נותחו באמצעות מבחן חי-ריבוע. ערך p <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

2. עיבוד ואיסוף דגימות

הדגימות נאספו מהחלק העמוק יותר של כיבי כף הרגל הסוכרתיים באמצעות טכניקת מטוש עמוק. שתי מטליות כותנה סטריליות שהולחו מראש במרק סטרילי סובבו בחוזקה מעל בסיס הפצע לאחר ניקוי המגזין עם סכין סטרילי וניקו במי מלח סטריליים כדי למזער זיהום על ידי מיקרואורגניזמים מתיישבים. מטוש אחד שימש לצביעת גרם, בעוד שהשני שימש לתרבית מיקרוביולוגית. מריחות עם צביעת גרם ישירה נבדקו מיקרוסקופית.

דגימות רקמת עצם נאספו ממטופלים עם חשד קליני לאוסטאומיאליטיס בתנאים סטריליים לאחר ניתוח דברידמנט. לפני איסוף הדגימות, משטחי הכיבים נוקו עם סליין סטרילי נורמלי כדי להפחית זיהום שטחי. דגימות רקמת עצם נאספו באופן אספטי באמצעות כלים כירורגיים סטריליים והועברו מיד למיכלים סטריליים לעיבוד מיקרוביולוגי.

הדגימות עברו הומוגניות או טחונים דק בתנאים סטריליים והוחזקו על אגר דם, אגר מלח מניטול (MSA), אגר מקונקי ואגר מזון. הלוחות היו מודגרים אירובית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18–24 שעות. אגר דם ואגר תזונתי תמכו בצמיחת אורגניזמים גרם-חיוביים וגרם-שליליים, בעוד ש-MSA שימש לבידוד והתמיינות סלקטיבית של מיני סטפילוקוקים , כולל S. aureus. אגר מקונקי שימש לשיקום חיידקים גרם-שליליים. לוחות תרבית נבדקו לאחר הדגירה, ודגימות ללא גדילה נראית לעין לאחר 48 שעות דווחו כ"ללא צמיחה".

זיהוי חיידקי ראשוני התבסס על מורפולוגיית מושבה, צביעת גרמים ומאפיינים ביוכימיים, ואחר כך אישור מולקולרי של S. aureus באמצעות הגברת PCR של גן הגרעין . זיהוי ביוכימי כלל בדיקות קטלאז, בדיקות קואגולאז בשקופיות ובצינורות, תסיסת מניטול ובדיקות DNase. מבודדים מאומתים זוהו בהמשך באמצעות מערכת VITEK 2 Compact עם כרטיס הזיהוי של VITEK 2 GP. תוצאות הזיהוי התקבלו רק כאשר רמת הביטחון הייתה ≥95%. תוצאות לא עקביות או בעלות ביטחון נמוך נבדקו מחדש באמצעות ניתוח ביוכימי חוזר ובדיקות VITEK חוזרות. מבודדים טהורים נשמרו ב-20% גליצרול שהוכן במרק עירוי לב מוחי (BHI) לניתוחים מולקולריים וגנומיים לאחר מכן (איור 1).

3. בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית

בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית בוצעה באמצעות שיטת דיפוזיית דיסק קירבי–באואר בהתאם להנחיות המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI) לשנת 2022. הבדיקות בוצעו על אגר מולר–הינטון עם עומק אגר סטנדרטי של 4 מ"מ. תרביות חיידקים טריות הותאמו לסטנדרט של 0.5 מקפרלנד באמצעות מד צפיפות לפני החיסון. מטוש סטרילי שימש לחיסון אחיד של משטחי אגר.

הדיסקים האנטימיקרוביאלים הבאים שימשו: אמפיצילין (10 מיקרוגרם), גנטמצין (10 מיקרוגרם), אמיקאצין (30 מיקרוגרם), ספוקסיטין (30 מיקרוגרם), ספורוקסים (30 מיקרוגרם), פיפרצילין/טאזובקטאם (100/10 מיקרוגרם), מרופנם (10 מיקרוגרם), אמוקסיצילין–קלבולאניק חומצה (30 מיקרוגרם), אוקסצילין (1 מיקרוגרם), לבופלוקסאצין (5 מיקרוגרם), קלינדמיצין (2 מיקרוגרם), טיגציקלין (15 מיקרוגרם), ציפרופלוקצין (5 מיקרוגרם), אריתרומיצין (15 מיקרוגרם), טרימתופרים–סולפמתוקסאזול (25 מיקרוגרם), לינזוליד (30 מיקרוגרם), וונקומיצין (30 מיקרוגרם). הלוחות דגרו באופן אירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16–18 שעות. קוטרי האזורים פורשו לפי נקודות הפסקה של CLSI.

סטפילוקוקוס אוראוס עמיד למתיצילין (MRSA) זוהה באמצעות סקר של צפוקסיטין (30 מיקרוגרם) לפי המלצות CLSI. בדיקות בקרת איכות בוצעו באמצעות S. aureus ATCC 25923. כל הניסויים בוצעו בשכפול כדי להבטיח שחזוריות. מבודדים עמידים לתרופות מרובות (MDR), עמידות נרחבת לתרופות (XDR) ועמידות לפנדרוג (PDR) סווגו לפי הגדרות סטנדרטיות בינלאומיות המבוססות על פרופילי עמידות אנטימיקרוביאלית (איור 1).

4. זיהוי S. aureus עמיד למתיצילין (MRSA)

בדיקת דיפוזיה דיסקית של ספוקסיטין (30 מיקרוגרם) שימשה כשיטה פנוטיפית לזיהוי MRSA. מבודדים עם אזורי עיכוב ≥22 מ"מ סווגו כ-S. aureus רגיש למתיצילין (MSSA), בעוד שבודדים עם אזורי עיכוב ≤21 מ"מ סווגו כ-MRSA לפי קריטריוני CLSI (איור 1).

5 קביעת עמידות לונקומיצין באמצעות בדיקות ריכוז מעכב מינימלי (MIC)

ריכוזי המעכבים המינימליים של ונקומיצין (MICs) נקבעו בשיטת מיקרודילול המרק בהתאם להנחיות CLSI11. הוכנו דילול כפול סדרתי של ונקומיצין (4–512 מיקרוגרם/מ"ל) במרק מולר–הינטון. תליות חיידקיות הותאמו לסטנדרט מקפרלנד 0.5 ודוללו לכ-1 ×10 5 CFU/mL.

לאחר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, הוגדר ה-MIC כרכוז הנמוך ביותר שבו לא נצפה צמיחה חיידקית נראית לעין. רגישות לוואנקומיצין פורשה לפי קריטריוני CLSI כך: רגישה (≤2 מיקרוגרם/מ"ל), בינונית (4–8 מיקרוגרם/מ"ל), ועמידה (≥16 מיקרוגרם/מ"ל)11,12 (איור 1).

6. גילוי מולקולרי

6.1 חילוץ DNA

מבודדי סטפילוקוקוס אוראוס גודלו במרק עירוי לב מוחי (BHI) במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. DNA גנומי חיידקי הופק באמצעות ערכה מסחרית ומערכת חילוץ אוטומטית של חומצות גרעין. ה-DNA שהופק נשמר בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. ריכוז ה-DNA נמדד באמצעות פלואורומטר להערכת ההתאמה להגברת PCR. ריכוז ה-DNA הממוצע היה 85 ± 8.2 ng/μL.

פריימרים המיועדים לגנים Can, HLG וגנים מסוג D β-לקטמאז (blaOXA-group I) הושגו מסחרית ושימשו להגברת PCR כפי שמפורט בטבלאות 1, 13, 14, 15, 16.

טבלה 1: רצפי פריימר ששימשו להגברת PCR של גני המטרה שנחקרו במחקר זה. הטבלה מסכמת את הגנים היעדים, רצפי הפריימר, גודל האמפליקונים הצפויים, טמפרטורות האנילינג והמקורות המשמשים להגברת PCR של גנים מקבוצת OXA מסוג OXA ב-nuc, mecA, hlg, can ו-bla בקבוצת OXA I בבידוד סטפילוקוקוס אוראוס שנמצאו מזיהומים בכף רגל סוכרתית. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

6.2 זיהוי מולקולרי של גני אלימות וגנים מסוג D β-לקטמאז (blaOXA-group I) באמצעות PCR

רצפי הפריימרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1. הגברת PCR של גנים mecA, nuc, גנים הקשורים לאלימות, וגנים מסוג D β-לקטמאז (blaOXA-group I) בוצעה ב-25 תערובות תגובה של מיקרוליטר שכללו 12.5 מיקרוליטר GoTaq Green Master Mix (2×), 0.5 מיקרוליטר MgCl2, 3 מיקרוליטר תבנית DNA גנומית, 1 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים ואחוריים (10 pmol/μL), ו-7 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.

תנאי מחזור תרמי כללו שלב דנאטורציה ראשוני ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו 30–35 מחזורי הגברה שכללו דנאטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות–1 דקה, אנילינג בטמפרטורה של 50–62 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות–דקה אחת בהתאם לסט הפריימר, והארכה בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד דקה. הארכה סופית בוצעה בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 7–19 דקות.

מוצרי PCR מוגברים הופרדו על ג'לים של אגרוז 1.5%–2% עם צביעת Safe Red והוצגו תחת תאורה אולטרה-סגולה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל. בקרים שליליים נכללו בכל ריצת PCR כדי לאשר את תקפות ההגברה.

7. ריצוף גנום מלא (WGS)

ריצוף גנום מלא (WGS) בוצע על שני מבודדים קליניים מייצגים של סטפילוקוקוס אוראוס שנמצאו מדגימות רקמת עצם שנאספו מחולים עם זיהומי כף רגל סוכרתיות. הבודדים שנבחרו כללו מבודד עמיד לתרופות מרובות (MDR) ובודד עמיד לתרופות (XDR) אחד, שזוהו באמצעות בדיקות רגישות אנטימיקרוביאליות פנוטיפיות ופרופילי עמידות מאומתים על ידי MIC. אסטרטגיה זו אפשרה אפיון גנומי מייצג של מבודדים עמידים קלינית רלוונטיים (איור 1).

איכות ה-DNA הגנומי, הריכוז והשלמות הוערכו לפני הריצוף כדי להבטיח התאמה להכנת ספרייה וניתוח ביואינפורמטי במורד הזרם. ה-DNA נמדד באמצעות פלואורומטר, והשלמות אובחנה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1% ב-150 וולט למשך 40 דקות. קטעי DNA באורך של כ-200–400 bp נבחרו לפי גודל באמצעות טיהור חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן תיקון קצה, אדנילציה של 3′ רגל וקשירת מתאם.

מולקולות DNA מעגליות חד-גדיליות נוצרו על ידי הגברה, טיהור ועיגול של קטעים קשורים על ידי אדפטור באמצעות אוליגונוקלאוטידים מסוג ספלינט. ננו-כדורי DNA (DNBs) נוצרו לאחר מכן באמצעות הגברה במעגל גלגול. ריצוף בוצע על פלטפורמת DNBSEQ באמצעות כימיה קומבינטורית של Probe-Anchor Synthesis (cPAS).

קריאות ריצוף גולמיות עברו נהלי בקרת איכות להסרת קריאות באיכות נמוכה, זיהום מתאמים, קריאות מעורפלות ורצפים כפולים. קריאות נקיות שימשו לניתוחים במורד הזרם. הרכבת הגנום בוצעה להערכת גודל הגנום, תכולת GC ועומק כיסוי הריצוף. הרכבות הגנום הסופיות נוצרו בפורמטים של FASTA, GenBank ו-NCBI.

האנוטציה של הגנום זיהתה גנים של רצפים מקודדים (CDS), RNA מעביר (tRNA), RNA ריבוזומי (rRNA) ו-RNA קטן (sRNA). אנוטציה פונקציונלית של גנים חזויים בוצעה באמצעות מספר מסדי נתונים, כולל Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB ו-CARD, עבור גנים הקשורים לאלימות ולעמידות לאנטימיקרוביאליות.

8. ניתוח ביואינפורמטיקה

הרכבת הגנום והאנוטציה בוצעו באמצעות מרכז המשאבים לביואינפורמטיקה חיידקית וויראלית (BV-BRC). ניתוחים פילוגנטיים בוצעו באמצעות כלי PATRIC. נוצרו מפות ויזואליזציה מעגליות של גנום כדי להמחיש רצפי קידוד, תוכן GC, סטייה של GC, קובעי עמידות אנטימיקרוביאלית, גנים הקשורים לאלימות ואלמנטים גנטיים ניידים.

הקשרים הפילוגנטיים נקבעו באמצעות משפחות חלבונים גלובליות של PATRIC (PGFams) שזוהו מהגנומים הייחוס הקרובים ביותר באמצעות ניתוח Mash/MinHash. יישורי חלבונים נוצרו באמצעות MUSCLE, ויישורי הנוקלאוטידים התואמים מופו למשפחות חלבונים. עצים פילוגנטיים נבנו באמצעות RAxML עם ניתוח אתחול מהיר (איור 1).

קונטיגים של הגנום נותחו בנוסף באמצעות Pathogenwatch לאישור מין וזיהוי גנים לעמידות אנטימיקרוביאלית. גנים הקשורים לאלימות נותחו באמצעות ABRicate. שירות האנוטציות של הגנום PATRIC השתמש בגישה מבוססת k-mer לזיהוי גנים לעמידות לאנטימיקרוביאליים ולהקצאת הערות פונקציונליות, מחלקות אנטימיקרוביאליות ומנגנוני עמידות. נוצרו ויזואליזציות גנום מעגליות של מבודדים עמידים ל-MDR ו-S. aureus עמידים למתיצילין כפי שתואר קודם17. טבלה משלימה 1 מסכמת את כל כלי הביואינפורמטיקה, גרסאות התוכנה, מסדי הנתונים והפרמטרים האנליטיים המשמשים בניתוחים הגנומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיבוד דגימות וחיוביות לתרבית

בסך הכל נאספו ונותחו 125 דגימות קליניות במחקר זה. נצפה גידול חיידקים ב-90 מתוך 125 דגימות (72%). דגימות חיוביות לתרבית אלו עובדו לאחר מכן לזיהוי חיידקים ולבדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית. סטטיסטיקות תיאוריות, כולל תדירויות ואחוזים, שימשו לסיכום התפלגות של מבודדי חיידקים בין כל הדגימות הקליניות והדגימות החיוביות לתרבית. בשלב זה לא בוצעו ניתוחים סטטיסטיים הסקתיים.

התפוצה של סוגי חיידק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים סוכרתיים בכף הרגל (DFIs) הנגרמים על ידי מיקרואורגניזמים עמידים לתרופות מרובות (MDR) הולכים וגדלים ברחבי העולם, כאשר שליטה גליקמית לקויה והיגיינת כף רגל לקויה תורמים לעלייה בתחלואה ובתמותה 18,19,20,21. למרות ש-DFIs הם לעיתים קרובות פולימיקרוביאלים, סטפילוקוקוס אוראוס נשאר אחד הפתוגנים המרכזיים המבודדים מזיהומים אלו, כאשר שכיחות ה-S. aureus

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או מערכות יחסים אישיות שיכלו להשפיע על העבודה המדווחת במחקר זה.

תרומה לכתיבה:

שימא ח. אל-קובייסי תרמה לקונספטואליזציה, פיתוח מתודולוגיה, חקירה, ניתוח פורמלי והכנת טיוטת כתב היד המקורית. ראווה א. חוסיין תרם לאימות, חקירה והכנת טיוטת כתב היד המקורית. מושטאק ט.ס. אל-עוקיילי תרם לקונספטואליזציה, פיקוח, ניהול פרויקטים, חקירה, וסקירת ועריכת כתבי יד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בשימוש בפלטפורמת העיצוב מבוססת הבינה המלאכותית Gamma Pro (אפליקציית גמא) ליצירת איור 1. כל התוכן שנוצר נבדק, נערך ואומת בקפידה על ידי המחברים כדי להבטיח דיוק מדעי, עקביות ושלמות. המחברים לא קיבלו תמיכה כספית למחקר, לכתיבה ו/או לפרסום מאמר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבריקייט תוכנהGitHub (ט. סימן)קוד פתוחזיהוי גנים של אלימות
אגרוזאינויטרוגן, ארה"ב16500-500אלקטרופורזה בג'ל
Agencourt AMPure XP Kitבקמן קולטרA63881טיהור DNA ובחירת גודל
אמיקסין (30 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0107BAST
דיסקים אנטיביוטיים (אמפיצילין 20 ומיקרו; g)אוקסויד, בריטניהCT0003Bבדיקת רגישות לאנטימיקרוביאליות
בסיס בלוד אגראוקסויד, בריטניהCM0055בידוד חיידקים גרם-חיוביים וגרם-שליליים
מרק עירוי לב מוחי (BHI)אוקסויד, בריטניהCM1135גידול ואחסון של מבודדים
ספוקסיטין (30 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0119Bזיהוי MRSA
ספורוקסימה (30 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0026BAST
ציפרופלוקסצין (5 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0425BAST
קלינדמיצין (2 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0064BAST
פלטפורמת DNBSEQBGI, סיןמגווןריצוף גנום מלא
אריתרומיצין (15 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0020BAST
FastQC<סטרונג>סיימון אנדרוז במכון בברהם (ביו-אינפורמטיקה בברהם)NAמערכת תור
מערכת תיעוד ג'לביו-רד, ארה"בGel Doc™ XR+הדמיה של ג'לים לאלקטרופורזה
גנטמיצין (10 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0024BAST
גליצרול (דרגה מולקולרית)סיגמא-אלדריץ'G5516בשימוש ב-20% לשימור בידוד לטווח ארוך
GoTaq Green Master Mix (2×)פרומגה, ארה"בM7122תערובת הגברה של PCR
לבופלוקסאצין (5 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT1587BAST
לינזוליד (30 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT1716BAST
מקונקי אגראוקסויד, בריטניהCM0007מדיום סלקטיבי לחיידקים גרם-שליליים
מניטול סולט אגר (MSA)אוקסויד, בריטניהCM0085מדיום סלקטיבי/דיפרנציאלי למינים של סטפילוקוקוס.
מרופנם (10 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0774BAST
פתרון MgCl2פרומגה, ארה"במגווןרכיב תגובת PCR
מולר-הינטון אגראוקסויד, בריטניהCM0337שימש עבור Kirby– בדיקת דיפוזיה בדיסק באואר
כלי יישור שריריםקוד פתוחמגווןיישור רצפי חלבונים
מים ללא נוקלאזפרומגה, ארה"בP1193רכיב תגובת PCR
אגר מזיןאוקסויד, בריטניהCM0003מדיום צמיחה כללי
אוקסצילין (1 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0159BAST
PathogenWatchמכון וולקום סנגרכלי מקווןמזהה מין & זיהוי גן AMR
פטריק / BV-BRCמרכז המשאבים לביואינפורמטיקה חיידקיתפלטפורמה מקוונתהרכבת גנום ו- הערות
פיפרצילין/טאזובקטם (100/10 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT1628BAST
כלי ויזואליזציה לגנום של פרוקסיאוניברסיטת טורונטוכלי מקווןהדמיית מפת גנום
פלואורומטר קוונטוספרומגה, ארה"בE6150כימות DNA
פלואורומטר קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ33238כימות DNA עבור WGS
תוכנת RAxMLקוד פתוחמגווןניתוח פילוגנטי
S. aureus ATCC 25923ATCC, ארה"ב25923זן בקרת איכות עבור AST
כתם אדום בטוחiNtRON ביוטכנולוגיהמגווןכתם ג'ל DNA
ערכת חילוץ DNA חיידקי SaMagסקאסה ביוטכנולוגיות, איטליהמגווןחילוץ DNA גנומי
מערכת חילוץ אוטומטית SaMag-12סקאסה ביוטכנולוגיות, איטליהSMG-12מחלץ חומצות גרעין אוטומטי
מטליות כותנה סטריליותיצרנים שוניםמגווןמשמש לאיסוף דגימות טכניקת מטוש עמוק
סליין נורמלי סטרילייצרנים שוניםמגווןמשמש לשטיפת משטח הכיב לפני דגימה
להבי סקלפל סטרילייםיצרנים שוניםמגווןמשמש לדברידמנט כיבים לפני דגימה
טיגסייקלין (15 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT1849BAST
טרימתופרים-סולפמתוקסאזול (25 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0052BAST
טרנסליומינטור UVיצרנים שוניםמגווןהמחשה של מוצרי PCR
ונקומיצין (30 ומיקרו; ז) דיסקאוקסויד, בריטניהCT0588BAST
VITEK 2 קומפקטBioMé ריו, צרפתמגווןמערכת זיהוי אוטומטית
כרטיסי זיהוי VITEK 2 GNBioMé ריו, צרפתמגווןזיהוי חיידקים גרם-שליליים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים