מרקמה למורפומטריה: תהליך עבודה שלב אחר שלב של גולג'י–קוקס לניתוח עמוד שדרה עצבי ודנדריטי בעכברים בוגרים

סיכום

מאמר זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לצביעת גולג'י-קוקס בעכברים בוגרים, הכוללת הכנת תמיסה, השפעת רקמות, הגנה מקריאה, חתך, פיתוח והרכבה. הוא מדגיש שימור רקמות וצביעה הומוגנית עם רקע נמוך, ומאפשר הדמיה ברורה של מורפולוגיית הנוירונים. השיטה מסמנת קצוות דנדריטיים ותומכת בניתוח מורפומטרי כמותי של קוצים דנדריטיים.

תקציר

ניתוח מורפולוגיה נוירונית בבריאות ומחלות הוא יסודי להבנת תפקוד המוח ולהערכת השפעות של התערבויות ניסיוניות. צביעת גולג'י–קוקס נותרה טכניקה קלאסית, אך רלוונטית מאוד, להמחשת קוצים עצביים מלאים וקוצים דנדריטיים. עם זאת, פרוטוקולים שפורסמו לעיתים קרובות שונים בשלבים פרוצדורליים קריטיים ולעיתים חסרים פרטים מתודולוגיים חיוניים, מה שמוביל לשונות משמעותית באיכות הצביעה והופך את התקינה במעבדה לגוזלת זמן ומאתגרת. כאן מוצג פרוטוקול גולג'י–קוקס מקיף שלב אחר שלב לעכברים בוגרים, הכולל את כל תהליך העבודה מהטיפול ב-in vivo ועיבוד רקמות ועד הדמיה וחילוץ נתונים מורפומטריים. הוא מפרט שיקולים מעשיים ומלכודות נפוצים המשפיעים על יעילות ההזמה, שלמות החתכים ויחס האות לרעש, ומספק הנחיות מתודולוגיות לשיפור השחזוריות. בסך הכול, פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה אמינה וניתוח כמותי של נוירונים שלמים, מקטעים דנדריטיים וקוצים דנדריטיים. צפוי שמשאב זה יקל על יישום צביעת גולג'י-קוקס בעקביות, שקיפות וחומרה טכנית רבה יותר, תוך מתן מסגרת ברורה להתאמת השיטה לסביבות מעבדות מגוונות.

מבוא

המטרה הכוללת של שיטת הצביעה גולג'י–קוקס היא לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיית עצב מלאה, כולל קוצים דנדריטיים וקוצים דנדריטיים, ברקמת מוח קבועה 1,2,3,4. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של נוירונים בודדים בתוך מעגלים עצביים מורכבים, מה שהופך אותה לחשובה במיוחד למחקרים של פלסטיות סינפטית, התפתחות עצבית, ניוון עצבי ועיצוב מבני תלוי ניסיון ^5,6.

ההיגיון בפיתוח ובשימוש המתמשך בשיטות מבוססות גולג'י טמון ביכולתן הייחודית לייצר הזרה עצבית דלילה ומלאה ^1,2. השיטה תוארה במקור על ידי קמילו גולג'י ב-1873 ושופקה ב-1891 על ידי קוקס ^7,8, ומתבססת על שקיעת כרומט כסף בתוך תת-קבוצה מוגבלת של נוירונים, ומאפשרת שחזור מורפולוגי מלא ללא חפיפה עם סימון³. שינוי גולג'י–קוקס מחליף את ניטראט הכסף ששימש בשיטת גולג'י המקורית בכלוריד כספית, ומשפר את חדירת הרקמות ועקביות הצביעה². בהשוואה לטכניקות תיוג נוירונים חלופיות כמו ביטוי חלבון פלואורסצנטי, מעקב ויראלי או גישות מילוי צבע, צביעת גולג'י-קוקס מציעה מספר יתרונות. הוא אינו דורש מניפולציה גנטית, הזרקות סטריאוטקסיות או ציוד מיקרוסקופיה מיוחד, ומאפשר הדמיה של קוצים דנדריטיים עם ניגודיות גבוהה תחת מיקרוסקופיית שדה^{בהיר 1,2}. למרות ששיטות מודרניות מבוססות פלואורסצנציה מספקות ספציפיות לסוג התא, צביעת גולג'י–קוקס נותרת יתרון מיוחד לדגימה מורפולוגית בלתי מוטית ^9,10 ולשימוש במינים או בתנאים ניסיוניים שבהם כלים טרנסגניים אינם זמינים.

בספרות הרחבה יותר, שיטות מבוססות גולג'י שימשו רבות לכימות צפיפות ומורפולוגיית עמוד השדרה הדנדריטי במחקרים של למידה וזיכרון⁵, לחץ והפרעות פסיכיאטריות¹¹, גיל¹², ומחלות ניווניות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר 12,13,14. השימוש המתמשך בו לאורך עשורים מדגיש את אמינותו לנוירואנטומיה^{מבנית 2}. שיטה זו מתאימה במיוחד לחוקרים המנתחים את הארכיטקטורה הדנדריטית ומורפולוגיית עמוד השדרה ברקמת המוח כאשר נדרשת הדמיה של כל התא¹. הוא מתאים היטב למחקרים מורפולוגיים השוואתיים בין קבוצות ניסוי. עם זאת, חוקרים הזקוקים לספציפיות סוג תא, הדמיה חיה או קולוקליזציה מולקולרית עשויים להפיק תועלת רבה יותר מגישות סימון פלואורסצנטי או מקודד גנטי ^9,10.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים מסוג בר מסוג B6129SF2/J (n = 3). עם זאת, ניתן לבצע צביעה דומה על שני המינים בשלב הבוגר. כל ההליכים הניסיוניים קיבלו אישור קודם של ועדת ביואתיקה. (#117.A, המכון לנוירוביולוגיה (INb), האוניברסיטה האוטונומית הלאומית של מקסיקו)

1. הכנת פתרונות

אזהרה: כלוריד כספית הוא רעיל ומקורוזיבי מאוד. להחזיק בתוך מכסה אדים כימי תוך כדי כפפות, חלוק מעבדה והגנה לעיניים. השלכו פסולת במיכל פסולת מסוכנת מסומן. דיכרומט אשלגן וכרומט אשלגן הם מחמצנים רעילים ומסרטנים. החזיקו בכובע אדים כימי והימנעו ממגע עור או שאיפה.

1. הכנת פתרונות השריית מלאי
   1. שקול 15 גרם דיכרומט אשלגן. המיס אותו ב-300 מ"ל מים מזוקקים כפול כדי לקבל תמיסה של 5% (ללא וולט).
   2. משקל 15 גרם כלוריד כספית. המיס אותו ב-300 מ"ל מים מזוקקים כפול כדי לקבל תמיסה של 5% (ללא וולט).
   3. שקול 15 גרם כרומט אשלגן. המיס אותו ב-300 מ"ל מים מזוקקים כפול כדי לקבל תמיסה של 5% (ללא וולט).
   4. עטוף את כל המיכלים בנייר אלומיניום ואחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מאור.
2. הכנת פתרון עבודה של גולג'י–קוקס
   1. מערבבים 50 מ"ל תמיסת אשלגן דיכרומט, 50 מ"ל תמיסת כלוריד כספית, ו-40 מ"ל תמיסת כרומט אשלגן.
   2. הוסיפו 100 מ"ל מים מזוקקים וערבבו היטב.
   3. דגרו את התערובת במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר, מוגנת מאור.
   4. תן למשקעים לשקוע. השתמשו רק בסופרנטנט להפריה ברקמות.
      הערה: ניתן לאחסן את תמיסת גולג'י–קוקס עד חודש כאשר היא מוגנת מהאור. כדי להפחית בזבוז תגובות ולהבטיח טריות התמיסה, הכינו רק את הנפח הנדרש הן של תמיסות המלאי והן של תמיסת גולג'י–קוקס הסופית הנדרשת לניסוי. הכינו לפחות 23 מ"ל למוח כדי לקבל 20 מ"ל סופרנטנט שימושי לאחר אובדן משקעים.
3. הכינו תמיסת מגן קריופרוטנט
   1. המיס 300 גרם סוכרוז ב-0.1 מ' מלח מפוזר-פוספט (PBS), pH 7.4, המוכן עם נתרן פוספט די-בסיסי חסר מים, נתרן פוספט מונו-בסיס מונו-הידרטי, ונתרן כלוריד.
   2. כוון את הווליום הסופי ל-1 ליטר.
   3. אחסן בטמפרטורה של 4°C עד שבוע.

2. איסוף רקמות והפריה

1. בצע פרפוזיה תוך-לבבית
   1. הרדימו את בעל החיים עם נתרן פנטוברביטל (252 מ"ג/ק"ג, i.p.). לאשר עומק הרדמה מספק בהיעדר משיכת דוושה לפני הממשיך.
   2. בצע פרפוזיה תוך-לבבית עם כ-30 מ"ל של 0.1 M PBS (pH 7.4) עד שהשפכים יוצאים נקיים, כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם מרקמת המוח. לא נעשה שימוש במקבע; פתרון גולג'י–קוקס עצמו משמש כקיבוע בזרימת עבודה זו.
   3. חלץ את המוח בזהירות ושוטף אותו במים מזוקקים. ודא שהמוח מחובר כראוי ונקי משאריות דם (איור 1A).
2. רקמה מפריה
   1. חלק את המוח לחצאי כדור או לבלוקים קורונליים (~3 מ"מ עובי) באמצעות מטריצת מוח לשיפור ההפריה. בלוקים קטנים יותר מאפשרים הפריה אחידה יותר ומפחיתים את השונות, בעוד שדגימות גדולות יותר עשויות לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר ולהציג צביעה פחות הומוגנית.
   2. שים את המוח בתמיסת גולג'י-קוקס של 10 מ"ל. להגן מפני אור.
      הערה: נפח של 10 מ"ל של תמיסת גולג'י–קוקס מספיק למוח של עכבר בוגר שלם. כאשר משתמשים בחצי כדור יחיד או בלוקים קורונליים קטנים יותר (~3 מ"מ עובי), נפח התמיסה עשוי להיות מוקטן באופן יחסי, בתנאי שהרקמה נשארת טבועה לחלוטין. אם משתמשים בכל המוח, מומלץ לחתך אותו תוך שמירה על אזור העניין כדי להבטיח חדירה מיטבית של תגובת והפריה הומוגנית.
   3. דגרו במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
   4. החליפו ב-10 מ"ל של תמיסת גולג'י-קוקס טרייה. דגרו במשך 10-14 ימים בטמפרטורה של 22–25 מעלות צלזיוס בחושך.
      נקודת הפסקה: אחסן רקמה בתמיסת גולג'י–קוקס עד 15 ימים ללא אובדן משמעותי של החיוניות.
      הערה: לאחר ההפריה של גולג'י–קוקס, המוח מפתח מראה זהוב כהה והופך לשביר מאוד; לכן, יש לטפל בזה בזהירות (איור 1B). מומלץ להשתמש בפינצטה מפלסטיק למניפולציה כדי למנוע תגובות כימיות עם חומרים מפלדה.

3. קריופרוטקציה

1. העבירו את הרקמה לתמיסת מגן קריופרוטקטנט של 10 מ"ל (30% סוכרוז (w/v) ב-0.1 M PBS, pH 7.4, מוכנה בשלב 1.3).
2. דגרו במשך 24 שעות (4 מעלות צלזיוס).
3. באותה טמפרטורה (4 מעלות צלזיוס), החליפו בתמיסת מגן קריופרוטנט טרייה ודגרו לפחות 4–7 ימים.
   נקודת הפסקה: לפני החתך, יש לאחסן את הרקמה בתמיסת קריופרוטקטנט עד 3 שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

4. הטמעה וחתך

1. רקמת הטמעה
   1. הכינו 8% (ללא וייט) אגרוז במים מזוקקים חמים. תן לו להתקרר לכ-40 מעלות צלזיוס.
   2. הניחו את הרקמה בתבניות מוטמעות, והתמקמו כראוי.
   3. שפוך אגרוז על הרקמה ומאפשר לה להתקשה במשך שעה בטמפרטורת החדר או 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1C).
   4. גזום אגרוז עודף מהבלוק (איור 1D).
2. רקמת חתך
   1. אבטח את בלוק האגרוז על שלב הויברטום באמצעות דבק. (איור 1E)
   2. מלאו את תא החיתוך בתמיסת מגן קריופרוטקטנט.
   3. רקמת החתך בעובי 100–200 מיקרון. חתכים דקים יותר (למשל, 100–120 מיקרון) מומלצים לניתוח עמוד שדרה דנדריטי לשיפור רזולוציית ההדמיה, בעוד שחתכים עבים יותר (למשל, 150–200 מיקרון) עשויים לשמש לשחזור של כל הנוירונים. במחקר זה, חתכים נחתכו ב-120 מיקרון (איור 1F).
   4. אספו חלקים באמצעות מברשת רכה.
      הערה: הקלט את הגדרות הויברטום בטבלת החומרים. אין לשטוף את המחסניות בכל מצב לאחר שהחלקים הורכבו. הסוקרוז יגן על הרקמה עד שלב ההתפתחות.

5. הרכבה

1. הכנת שקופיות מצופות ג'לטין
   1. הכינו תמיסת ציפוי על ידי המסה של 0.5 גרם ג'לטין ב-100 מ"ל (0.5% w/v) של מים מזוקקים מחוממים לרתיחה.
   2. ערבבו עד שהג'לטין נמס לחלוטין ותנו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. הוסיפו 0.05 גרם כרום אשלגן סולפט (0.05% w/v) וערבבו עד שהן מומסות לחלוטין. הסר קצף שנותר במידת הצורך.
   4. סנן את תמיסת הג'לטין דרך נייר פילטר כדי להסיר חלקיקים לא מומסים וקצף שנותר, כדי להבטיח ציפוי אחיד של השקופיות.
   5. שטפו את הזכוכית עם חומר ניקוי ניטרלי ומים, שטפו היטב ואז שטפו במים מזוקקים.
   6. טבלו את החלק באתנול של 96% עד שלא נשארו טיפות נראות לעין.
   7. מחליקים ייבוש בתנור בטמפרטורה של 50–60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד שיתייבשו לחלוטין.
   8. הטבילה מחליקה לתמיסת הג'לטין ומאפשרת לתמיסה העודפת להתנקז.
   9. הניחו את הסליידים בתנור בטמפרטורה של 50–60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד שיתייבשו לחלוטין.
   10. חזור על תהליך הציפוי והייבוש לפחות חמש פעמים כדי להבטיח הידבקות תקינה.
   11. לאחר שלב הייבוש הסופי, אפשר למגלשות להתקרר לטמפרטורת החדר בסביבה נטולת אבק (למשל, בתוך מכסה אדים כימי) ואחסן אותן במיכל נקי וסגור עד לשימוש.
       הערה: הכינו רק את כמות תמיסת הג'לטין הנדרשת למספר השקופיות שיש לציפוי. ניתן להגדיל את כמויות המגיב באופן פרופורציונלי תוך שמירה על הריכוזים שנקבעו (w/v).
2. הניחו חלקים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין באמצעות מברשת רכה
   הערה: השתמשו בשקופיות מיקרוסקופ מצופות לפחות בחמש שכבות של ג'לטין 0.5%. הכינו את השקופיות טריות כדי להבטיח שלמות הרקמה במהלך ההתפתחות. מחסניות חשמליות לא נבדקו בפרוטוקול זה.
3. השרה נייר סופג בתמיסת קריופרוטקטנט והנח אותו מעל החלקים.
4. לחצו בעדינות עם כף היד כדי להסיר בועות אוויר ולהבטיח מגע אחיד בין חלק הרקמה למחסנית המצופה בג'לטין, מה שמקדם הידבקות יציבה במהלך העיבוד הבא.
   הערה: לחץ עדין משפר את ההידבקות על ידי מקסום המגע בין החתך לשכבת הג'לטין, ומפחית את הסיכון להיפרדות במהלך התפתחות המים.
5. הסירו את הנייר בזהירות ואפשרו לשקופיות להתייבש בחושך במשך 2–3 ימים בטמפרטורת החדר.
   הערה: ייבוש בסביבה עם לחות נמוכה הוא קריטי להידבקות יציבה. הגנה מפני אור ממזערת שינויים פוטוכימיים ברקמה המושפעת בגולג'י–קוקס, הרגישה לאור בשל נוכחות מלחי כרומט. בנוסף, אגרוז שנותר אינו מפריע באופן משמעותי לתהליך ההתפתחות וניתן לצפות בו סביב הרקמה בחתך המפותח (איור 2A). נוכחות האגרוז מקלה על טיפול בטוח יותר ברקמה במהלך ההרכבה, שכן רקמה מושרה בגולג'י–קוקס היא רגישה מאוד. אם רוצים, ניתן להסיר בזהירות את האגרוז העודף ידנית לאחר שהחלקים הותקנו על שקופיות.
   נקודת עצירה: שמרו על המחסניות מוגנות מאור.

6. פיתוח

אזהרה: קסילן דליק ורעיל בשאיפה. יש להכניס מכסה אדים כימי ולהימנע מלהבות פתוחות. האמוניה היא קורוזיבית ומייצרת אדים מעוררי גירוי. ידית בתוך קפוצ'ון אדים.

1. החזרת מקטעים
   1. טבלו את הסליידס במים מזוקקים למשך 5 דקות.
   2. העבר למים מזוקקים טריים למשך 5 דקות.
   3. טבלו ב-50% אתנול למשך 5 דקות.
      הערה: שלב 50% אתנול מספק מעבר הדרגתי מתנאי מים להתייבשות, מקל על חדירת המגיב ועוזר לשמור על שלמות הרקמה לפני שלב הפיתוח.
2. פיתוח צביעה
   1. דגרו שקופיות בתמיסת אמוניה מימית המוכנה על ידי ערבוב של 2 נפחים של 25% אמוניה עם נפח אחד של מים מזוקקים (2:1, v/v) למשך 8 דקות
   2. שטוף במים מזוקקים במשך 5 דקות.
   3. שטפו שוב במים מזוקקים למשך 5 דקות.
   4. לדוגר ב-5% (עם יחס ל-V) נתרן תיוסולפט במים מזוקקים למשך 10 דקות בחושך.
   5. שטוף במים מזוקקים למשך דקה.
   6. שטפו שוב במים מזוקקים למשך דקה אחת.
      הערה: השלים את תהליך הפיתוח ללא הפסקה לאחר שהתחיל.
3. ייבוש וניקוי
   1. טבל את ההחלקה ב-70% אתנול למשך 5 דקות.
   2. טבלו סלייד ב-96% אתנול למשך 5 דקות.
   3. טבלו סלייד באתנול 100% למשך 5 דקות.
   4. העברו את ההחלקות לתוך קסילן לפחות 6 דקות.

7. התקנה קבועה

1. יש להחיל מדיום התקנה של Permount® (מקדם שבירה ~1.52) על כל חלק.
   הערה: מקדם השבירה של מדיום ההרכבה צריך להיות תואם למטרות טבילה בשמן כדי להבטיח איכות תמונה מיטבית.
2. הניחו כיסוי בזהירות כדי למנוע בועות אוויר.
3. אטמי את הקצוות עם לק שקוף.
4. אפשר למגלשות להתייבש בחושך במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר.

8. דימות

הערה: שיטות הדמיה ותצורות רכישה משתנות לפי מותג מיקרוסקופ; יש לקבוע את ההגדרות האופטימליות לכל מערכת.

1. תדליק את המיקרוסקופ.
2. פתח את תוכנת המיקרוסקופ
3. הנח שקופית על שלב המיקרוסקופ.
4. ללכוד תמונה רחבה דו-ממדית של חלק המוח באמצעות אובייקטיב בהגדלה נמוכה כמו 1X/0.04 N.A. או 4x/0.10 (איור 2A, B).

9. הדמיית נוירונים שלמים

1. ללכוד ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל את הנוירון הרלוונטי, באמצעות מטרה של 10x/0.25 N.A. או 20x/0.40 N.A. (איור 2C).
   הערה: נוירונים שנבחרו לניתוח צריכים להציג הזרמת גולג'י–קוקס מלאה והומוגנית, עם קצוות דנדריטיים מוגדרים בבירור וצביעת רקע מינימלית. יש להוציא תאים עם תהליכים מקוצרים, ספיגיה לא שלמה, מבנים חופפים או אות רקע גבוה כדי להבטיח ניתוח מורפומטרי מדויק.
2. למקד את התמונה ולהתאים את הגדרות המצלמה, כולל החשיפה ואיזון הלבן.
3. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת התמונות.
4. הגדר את מרחק הצעד ל-0.5 מיקרון בתוך חלון רכישת התמונה.
5. לכוד את ערימת התמונות באמצעות פקודת התוכנה לרכישת ערימה.
6. חזור על השלבים הנ״ל כדי ללכוד כל תחום עניין.
7. שמור את קובץ הנתונים ושמור את כל קבצי התמונה. פורמט TIFF לעיבוד חיצוני.

10. הדמיית קוצים דנדריטיים

1. ללכוד ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל את הנוירון המעניין, באמצעות אובייקט טבילה בשמן בגודל 63x/1.4 N.A. במיקרוסקופ שדה בהיר מתאים (איור 2D).
   הערה: בכתב היד הנוכחי, הושגו תמונות ברזולוציה גבוהה של קוצים דנדריטיים המוצגים באיור 2D באמצעות מצב שדה בהיר של מיקרוסקופ קונפוקלי, דגם זייס LSM 780. עם זאת, מיקרוסקופים אחרים בשדה בהיר עשויים לשמש לקבלת תמונות z-stack באיכות גבוהה של 63x, שפרמטריהן אמורים להיות סטנדרטיים על ידי כל מעבדה.
2. מרחו 1–2 טיפות שמן טבילה על הסלייד והניחו את המטרה מעל המחסנית, תוך שמירה על מגע בין האובייקטיב לשמן.
3. למקד את התמונה ולהתאים את הגדרות המצלמה, כולל החשיפה ואיזון הלבן.
4. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת התמונות.
5. הגדר את מרחק הצעד ל-0.3 מיקרון בתוך חלון רכישת התמונה.
6. לכוד את ערימת התמונות באמצעות פקודת התוכנה לרכישת ערימה.
7. חזור על השלבים לעיל כדי לתפוס כל תחום עניין
8. שמור את קובץ הנתונים ושמור את כל קבצי התמונה בפורמט TIFF לעיבוד חיצוני.
   הערה: לשלבים 9 ו-10. אם המיקרוסקופ אינו מצויד בשלב ממונע לרכישת Z-stack, ניתן לאסוף תמונות ידנית על ידי התאמת המיקוד המיקרומטרי. עם זאת, ייתכן שהמרווחים בין החלקים האופטיים פחות מדויקים. במקרה זה, ניתן לשחזר ערימות Z לאחר מכן בתוכנות עיבוד תמונה (למשל, ImageJ) מתוך רצף התמונה שנרכש.

11. ניתוח מורפומטרי

הערה: ניתן להשתמש בגישות שונות ותוכנות ייעודיות למטרה זו. כלים חינמיים לניתוח עמוד שדרה דנדריטי כוללים את ImageJ או, כמו במחקר זה, PyReconstruct¹⁵. לתיאור מפורט יותר של PyReconstruct ותפקידו לשחזור נוירונים וניתוח מורפומטרי, ראו את המקור המוזכר.

1. הליך לניתוח מורפומטרי של עמוד שדרה דנדריטי
   1. לאחר פתיחת הקובץ ב-ImageJ, שנה את הפורמט ל-RGB על ידי בחירת Image > Type > RGB Color.
   2. המרו את ערימות ה-Z לרצף תמונות ב-ImageJ: לחצו על קובץ > Save As > רצף התמונה. שמור כל רצף תמונות בתיקייה נפרדת לניתוח הבא. ב-PyReconstruct, טען את רצף התמונה על ידי לחיצה על קובץ > > חדש מהתמונות.
   3. יופיע חלון דיאלוג, שיבקש הקצאת שם לקובץ (למשל, WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse Neuron 1).
   4. לאחר מכן יופיעו שלושה חלונות דיאלוג עוקבים. בחלון הראשון, הזין את ערך הכיול (מיקרומטר/פיקס). מידע זה זמין במטא-דאטה של Z-stack וניתן לגשת אליו ב-ImageJ.
   5. בחלון השני, הכנס את עובי כל חתך אופטי עוקב (מיקרון). לבסוף, סדרת התמונות תתחיל להיטען אוטומטית (איור משלים 1A).
   6. לאחר זיהוי הקטע הרלוונטי, בהתאם לקריטריוני ההכללה שהוגדרו על ידי החוקר, יש להמשיך במעקב לקבלת נתונים כמותיים.
   7. הקצה שם ודומיין נפרדים לכל סוג עקבה. מיקמו את התחומים בלוח התחתון, שם הם מיוצגים בצורות גאומטריות בצבעים שונים (איור משלים 1B).
   8. צייר קו התואם לאורך הדגימה הרצוי באמצעות כלי העיפרון. לאחר מכן, יצירת עקבה שנייה דרך ערימת ה-Z לאורך המקטע הדנדריטי באמצעות כלי Z.
   9. השתמשו במעקב ההתחלתי כדי לקבוע את אורך המקטע המתאים ולאמת אותו תחת רשימות > רשימת עקבות Z (איור משלים 1B).
   10. נווט דרך ערימת ה-Z וזהה ראשי עמוד שדרה דנדריטיים במיקוד מיטבי. באמצעות כלי העיפרון, עקבו אחרי האזור הרחוק הרחב ביותר של כל ראש עמוד שדרה. לאחר מכן, השתמשו בכלי Z כדי לעקוב אחרי צוואר עמוד השדרה לאורך ערימת ה-Z (איור משלים 1C, D). חזור על ההליך הזה עד שכל ראשי עמוד השדרה והצווארים בתוך המקטע הדנדריטי שנבחר יומצאו.
2. מדידות ראש עמוד שדרה לייצוא
   1. פתח את הרשימות עם מדידות רוחב ואורך ראש עמוד השדרה. גש אליהם תחת רשימות > רשימת עקבות (לרוחב) ורשימות > רשימת Z-trace (לאורך), בהתאמה.
   2. ייצא את הנתונים למיקום הרצוי במחשב. ייווצרו שני קבצי אקסל נפרדים, שכל אחד מהם מכיל את נתוני המדידה המתאימים.
3. סיווג מורפולוגיית עמוד השדרה וחישוב צפיפות
   1. חלץ את מדידות הרוחב והאורך של ראשי עמוד השדרה והצוואר מקבצי אקסל שנוצרו קודם.
   2. הנתונים צריכים להיות מאורגנים בעמודות המתאימות המסומנות רוחב ואורך לסיווג מורפולוגי בהתבסס על הקריטריונים^{הבאים 16}: פילופודיה (>2 מיקרון), דקה (< 2 מיקרון), קצרה (יחס רוחב אורך לראש ≤1), ופטרייה (רוחב ראש >0.6 מיקרון). (איור משלים 1E). פילופודיות נצפו לעיתים נדירות במקטעים הדנדריטיים שנותחו ולכן לא נכללו בניתוח.
   3. מספר הקוצים הכולל לכל קטע דנדריטי שנבדק נקבע בשלב זה, יחד עם צפיפות הקוצים (קוצים למיקרון ליניארי), וכן סוג ומספר כל תת-סוג של עמוד שדרה. תבנית אקסל¹⁶ ששימשה לניתוח זה זמינה ב- זמינה במקור המוזכר. באמצעות שיטה זו, צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי הבסיסי נמדדה באזור CA1 של ההיפוקמפוס אצל עכברים בני 12 חודשים.
   4. ייצוא נתונים כמותיים ויצירת גרפים עם תוכנות מדעיות מיוחדות המיועדות לניתוח נתונים, גרפים וסטטיסטיקה. כאן, הגרף באיור 3 נבנה באמצעות תוכנת Prism של GraphPad.

תוצאות

הזרעת רקמות וחתך
פרוטוקול גולג'י–קוקס המתואר כאן יצר צביעת נוירונים אמינה והומוגנית ברקמת מוח של עכבר בוגר. לאחר הספגה בתמיסת גולג'י–קוקס, המוח קיבל גוון זהוב כהה אופייני, המצביע על דיפוזיה מוצלחת של תמיסת הצביעה בכל הרקמה. חתך ויברטום שימר על שלמות המבנה של הסומטות הנוירונליות ותהליכים דנדריטיים.

ויזואליזציה נוירונית
הדמיית ברייטפילד חשפה גופי תאי עצב מוגדרים בבירור וקשתות דנדריטיות עם צביעת רקע מינימלית. נוירונים בודדי...

דיון

שיטת הצביעה גולג'י–קוקס נותרה אחת הטכניקות הנפוצות ביותר להמחשת מורפולוגיה נוירונית וקוצים דנדריטיים ברקמת מוח קבועה ^3,4. על ידי השריית תת-קבוצה קטנה ואקראית של נוירונים, שיטה זו מאפשרת הדמיה של עצים דנדריטיים שלמים עם צביעת רקע מינימלית. בפרוטוקול הנוכחי, הטכניקה אפשרה הדמיה ברורה של נוירוני הפירמידל ההיפוקמפלי והקוצים הדנדריטיים שלהם, מה שאפשר ניתוח מורפומטרי אמין באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ודימות Z-stack. דוגמאות מייצגות לא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	טכנולוגיות חיים	15510-027	CAS 9012-56-6
תמיסת אמוניה 25%	מרק	208380	CAS 1336-21-6. מסוכן.
נתרן פוספט דיביסיקלי חסר מים	סיגמא-אלדריץ'	S3264	CAS 7558-79-4
מיקרוסקופ שדה בהיר	ניקון	אקליפס צ'י
כרום סולפט אשלגן	סיגמא-אלדריץ'	243361
מיקרוסקופ קונפוקלי	צייס	LSM 780
איזון דיגיטלי	אקיוריס אינסטרומנטס	W3200-1200
תבניות הטמעה	מרק	E6032	מידות: 22x22 מ"מ
אתנול	מאייר	394
בעלי חיים ניסיוניים	מעבדת ג'קסון	2124-01	זן העכבר B6129SF2/J
אבקת ג'לטין	סיגמא-אלדריץ'	G2500
תוכנת GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.		גרסה 8.0.2
ImageJ Fiji Software	המכון הלאומי לבריאות של ארה"ב		גרסה 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
כלוריד כספית	ג'יי.טי. בייקר	2594-01	CAS 7487-94-7. מסוכן.
מצלמת מיקרוסקופ	ניקון	DS-Vi1
מטרת מיקרוסקופ (10x)	ניקון	93183	תוכנית 10x/0.25 N.A.
מטרת מיקרוסקופ (1x)	ניקון	93180	תוכנית UW 1x/0.04 N.A.
מטרת מיקרוסקופ (20x)	ניקון	93184	תוכנית 20x/0.40 N.A.
מטרת מיקרוסקופ (4x)	ניקון	93182	תוכנית 4x/0.10 N.A.
מטרת מיקרוסקופ (63x)	צייס	420782-9900-799	תוכנית APO 63x/1.4 N.A. שמן DIC
שקופיות מיקרוסקופ	סיגמא-אלדריץ'	S8902
מונו-בייס מונו-פספט נתרן מונו-בסיסי	ג'יי.טי. בייקר	3818-05	CAS 10049-21-5
לק לציפורניים	צבעים חוטאים	צבע נועז	שקוף
מדיית הרכבה בפרמונט	פישר סיינטיפיק	SP15-500
כרומט אשלגן	Productos Quí מיקוס מונטריי	2784	CAS 7789-00-6. מסוכן.
דיכרומט אשלגן	סיגמא-אלדריץ'	207802	CAS 7778-50-9. מסוכן.
תוכנת PyReconstruct	אוניברסיטת טקסס, אוסטין		גרסה 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
כלוריד נתרן	פרמונט	24912	CAS 7647-14-5
תיוסולפט נתרן	Productos Quí מיקוס מונטריי	7291	CAS 7772-98-7. מסוכן.
סוקרוזה	ג'יי.טי. בייקר (אבנטור)	4072-05	66.55° סיבוב ספציפי, מגיב ACS
ויברטום	Leica Biosystems	VT1200S	מהירות 20 מ"מ/ש, אמפל & נדש; 0.60 מ"מ
קסילן	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. מסוכן.