מאמר שיטה

ניתוח אופטוגנטי של התנהגות ביתוש Aedes aegypti

262 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש באופטוגנטיקה להבנת התנהגותו של יתוש ה-Aedes aegypti. מוצגות שיטות לגידול, הכנה, בדיקות וניתוחים להערכת התפקוד הנוירונלי במהלך המשיכה לבעלי חיים המהווים מאכסנים ובעת הזנת דם. טכניקות יסוד אלו יאפשרו מחקרים על מעגלים עצביים ועל התנהגות של וקטור חשוב זה של מחלות בבני אדם.

תקציר

היתוש Aedes aegypti הוא וקטור חשוב של פתוגנים נגיפיים ומשמש כמודל עבור מיני וקטורים אחרים. פתוגנים מועברים כאשר יתוש נושך בעל מאכסן, אך המעגלים העצביים השולטים בהתנהגות החיפוש והנשיכה נותרים לא ידועים. מאמר זה מפרט שיטות למניפולציה של פעילות עצבית ביתוש באמצעות אופטוגנטיקה, טכניקה מרכזית לקביעת הקשר הסיבתי בין מעגלים עצביים להתנהגות. שיטות אלו כוללות גידול יתושים לאופטוגנטיקה ושלושה ניסויים שנועדו למדוד שלבים שונים ברצף של עירור, משיכה, בדיקת חרטום (proboscis probing) והשבעה בדם המאכסן. התנהגויות אלו מתרחשות בקנה מידה מרחבי שונה ובתגובה לגירויים חושיים שונים. כל ניסוי התנהגותי מצויד בנוריות LED אדומות (~625 nm) להפעלה אופטוגנטית. כדי לזהות עירור בתגובה לגירויים ריחוניים, נמדדים כמותית הטיסה וההליכה. כדי לבחון משיכה או נחיתה, מוצגת ליתושים ארוחה של דם מחומם בזירה גדולה. בדיקת חרטום והשבעה נבחנות באמצעות וידאו ברזולוציה גבוהה, המאפשר מדידה של נספחים ושל גודל הבטן. הפרוטוקול מתאר מודלים של ראייה ממוחשבת המאפשרים כימות זמני ברזולוציה גבוהה של ההתנהגות ומדידות של נקודות סיום של ההאכלה. ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי לבחון את תפקידן של אוכלוסיות נוירונים נגישות גנטית בהתנהגות נשיכה של יתושים, וניתן להרחיבן להתנהגויות נוספות.

מבוא

היתוש הוא אחת החיות המסוכנות ביותר בעולם, לא בשל פראותו או כוחו אלא בשל יעילותו כווקטור למחלות. טפילים הגורמים למלריה, המופצים על ידי יתושי Anopheles, אחראים למאות אלפי מקרי מוות מדי שנה, בעוד ש-Aedes aegypti ו-Aedes albopictus אחראים להפצת מחלת הדברה הצהובה, דנגי, צ'יקונגוניה, קדחת זיקה ומחלות רבות אחרות המאיימות על החיים1. יתושים נמצאים בכל יבשת למעט אנטארקטיקה והם מהווים דאגה רבה לבריאות הציבור2. התנהגות הזנת הדם מעבירה פתוגנים באופן ישיר, אך היא גם שלב חיוני במחזור החיים של היתוש , שכן ארוחת דם של חולייתן נדרשת להטלת ביצים. לפיכך, בלימת התפשטותן של מחלות המועברות על ידי יתושים דורשת הבנה של מנגנוני חיפוש המארח שלהם.

ידוע כי נקבות של יתושים משתמשות ברמזים למרחקים ארוכים וקצרים כדי לאתר מארחים3,4. פחמן דו-חמצני (CO2) הוא גז נדיף מאוד הנמצא בנשיפה של בני אדם, ולעתים קרובות הוא הרמז הראשון שיתוש מזהה. הוא מזוהה בנוירונים חושיים ריח של Aedes aegypti על ידי חלבוני Gr1, Gr2 ו-Gr3, המרכיבים את קולטן ה-CO25. חשיפה ל-CO2 גורמת להתחלה של טיסה והתנהגות מעוף, תהליך המכונה גם אקטיבציה (activation)6,7, אשר יכולה להימשך עד 10–15 min, גם בהיעדר גירויים נוספים8. CO2 פועל בסינרגיה עם ריח העור כדי להגביר את האקטיבציה והמשיכה5,9. בעקבות זיהוי של CO2 וריח העור, היתוש נמצא במצב מוכנות לזיהוי רמזים נוספים וקרובים יותר של המארח, כגון חום, ניגודיות ויזואלית ולחות, המנחים אותו לנחות על מארח מתאים לארוחת דם5,10,11,12,13. אינטגרציה של רמזים חושיים מרובים מאפשרת ליתושים לרדוף ולאתר את המארח שלהם ביעילות.

כאשר נקבת יתוש נוחתת על מאכסן פוטנציאלי, היא דוחפת את החרטום שלה אל תוך הפני השטח עד לאיתור אזור עור מתאים, תהליך המכונה probing (מישוש)14,15. בעקבות המישוש, הסטילט חודר את העור, מאתר כלי דם, ובמקביל שואב דם תוךما הזרקת רוק, מה שמאפשר ליתוש להכפיל את משקל גופו בתוך מספר דקות16. הדם מועבר למעי האמצעי, שם מתבצע עיכול של חלבונים לצורך ייצור ביצים. מעניין לציין כי שביעה (engorgement) מהמאכסן אינה הכרחית להפצת פתוגנים, שכן פעולת המישוש לבדה יכולה להעביר מחלות16,17. לכן, הבנת כל שלב בהתנהגות הנשיכה עשויה לאפשר פיתוח של אסטרטגיות לשיבוש חיפוש המאכסן והנשיכה של נקבות היתושים, ובסופו של דבר לשליטה בהפצת מחלות המועברות על ידי יתושים.

כלים רבים פותחו באורגניזמי מודל כדי לתמרן פעילות נוירונלית. כלים מוקדמים פעלו באופן קונסטיטוטיבי או באמצעות הפעלה תרמית18,19,20,21. למרות תועלתם, לרכיבים גנטיים אלה ישנם חסרונות מסוימים. כלים קונסטיטוטיביים עלולים להשפיע על ההתפתחות, ולהוביל לפנוטיפים שאינם נובעים אך ורק מתפקוד המעגלים של הנוירונים. יתושים משתמשים בחום גוף כדי לזהות חולייתנים המהווים מאכסנים, מה שהופך תעלות המופעלות תרמית לבלתי מתאימות באופן מובהק למחקרים של התנהגותם22,23. במחקרי התנהגות, אופטוגנטיקה מתייחסת לשימוש בכלים גנטיים המגיבים לאורכי גל ספציפיים של אור כדי לשלוט בהפעלה של נוירונים בעלי עניין. טכניקה זו כבר שימשה במערכות מרובות, החל מבדיקת הערכיות (valence) של צמא בעכברים, דרך חקר התנהגות חיזור ב- Drosophila, ועד לשחזור אובדן ראייה כתוצאה מ-retinitis pigmentosa בניסויים בבני אדם24,25,26. תעלות אופטוגנטיות פועלות על ידי בליעת פוטונים ומתן אפשרות לסוגים ספציפיים של יונים לעבור דרך ממבנה הפלזמה, ובכך הן מפעילות או מעכבות את הנוירון. באמצעות הכנסת גנים טרנסגניים המקודדים לחלבונים רגישים לאור אל תוך אורגניזם, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפעיל או לעכב נוירונים ספציפיים שבעבר היה בלתי אפשרי לתמרן אותם. אופטוגנטיקה מספקת יתרונות בשליטה זמנית ומרחבית, ומגוון של בקרות המאפשרות הסקה ניסויית.

המחברים תיארו לאחרונה את השימוש הראשון בכלים אופטוגנטיים לחקר התנהגות יתושים8. כלים אלה מתבססים על תעלת הקטיונים CsChrimson המופעלת על ידי אור אדום, שהיא channelrhodopsin בעל הסטה לאדום27. אופסינים מיקרוביאליים, כולל CsChrimson, דורשים קופקטור כימי, all-trans retinal, כדי לספוג פוטונים28. CsChrimson מחובר למסמן הפלואורסצנטי tdTomato ונמצא תחת בקרתו של מערכת הביטוי הבינארית QF2/QUAS, המאפשרת לשלב אותו באופן גמיש עם קווי מנוע (driver lines) שונים29. כדי לטרגט נוירונים החושים CO2 , נעשה שימוש בקו מנוע המבטא את גורם השעתוק QF2 בנוירונים המבטאים את תת-היחידה Gr3 של קולטן ה-CO2 30. יתושים הראו תגובה התנהגותית מינימלית לאחר חשיפה לאור אדום לבדו8; בנוסף, אור אדום הוא היעיל ביותר בחדירה לרקמה ביולוגית, מה שהופך אופסין המופעל על ידי אור אדום לאידיאלי עבור אופטוגנטיקה25.

מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשלושה בדיקות המודדות היבטים שונים של התנהגות חיפוש מאכס והזנת דם בשילוב עם גרייה אופטוגנטית (איור 1A). ראשית, מוצג פרוטוקול לגידול של שושלות יתושים אופטוגנטיות. החלק השני מתאר את ה-opto-thermocycler, תרמוסייקלר PCR ששונה כך שניתן להשתמש בו למעקב אחר עוררות ודקירה כאשר יתושים נחשפים לגירויי טמפרטורה ואור. בדיקת ה-opto-thermocycler נועדה למדוד התנהגויות חיפוש אלו לאורך פרקי זמן ממושכים, תוך שימוש בשבטי דרייבר (driver strains) לשליטה בפעילות נוירונלית באמצעות אופטוגנטיקה. החלק השלישי מתאר את בדיקת שמיכת הדם (blood blanket assay), שבה ליתושים יש גישה קבועה לארוחת דם מלאכותית דקה בבסיסו של תרמוסייקלר ששונה, מה שמאפשר מעקב אחר טיסה, דקירה ומילוי דם תחת תנאי אור וטמפרטורה משתנים. בדיקת שמיכת הדם, המבוססת על ה-opto-thermocycler, מספקת אמצעי לכימות מילוי הדם מארוחה מלאכותית, ובכך מאפשרת את חקר התנהגויות ההזנה של היתושים עם גירויי חום ואופטוגנטיקה בתזמון מדויק. החלק האחרון מתאר את ה-opto-membrane feeder, שבו מוצגת ליתושים ארוחת דם חמה בתוך מיכל, דבר המאפשר מעקב הן אחר המשיכה למקור דם והן אחר מילוי דם תחת חשיפה לגירויי אור. בדיקת ה-opto-membrane feeder משמשת לחקירת הרצף ההתנהגותי המלא של חיפוש מאכס והזנת דם במערכת תעופה חופשית. בנוסף לתוצרים הצפויים לכל בדיקה, מתוארים מודלים של ראייה ממוחשבת למעקב אחר חלקי גוף של היתושים וזיהוי התנהגויות במהלך הבדיקות. בדיקות ה-opto-thermocycler, שמיכת הדם וה-opto-membrane feeder מאפשרות מדידה של שלבים נפרדים בהתנהגות הזנת הדם של היתושים תוך מניפולציה של הפעילות העצבית באמצעות אור. טכניקות חדשניות אלו מאפשרות לחקור כיצד מעגלים עצביים ביתושים שולטים בהתנהגויות המהוות איום על בריאות הציבור.

פרוטוקול

היתושים המשמשים בפרוטוקול זה מכילים טרנסגנים, ובהתאם לתקנות של משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA), יש לגדלם במתקנים ברמת בידוד פרוקי-רגליים II (Arthropod Containment Level II).32היתושים נשמרים במיכלים למניעת בריחה ומסולקים כפסולת ביולוגית מסוכנת. פרוטוקולי בטיחות ביולוגית והכלה של פרוקי רגליים נבחנו ואושרו על ידי Yale Environmental Health. & בטיחות. עבודה זו אינה משתמשת בנבדקים בבני אדם או בבעלי חיים. ניתן לאשש את הגנוטיפ של היתושים באמצעות סמנים פלואורסצנטיים (3xP3-dsRed עבור Gr3-QF2 ו- 3xP3-CFP עבור QUAS-CsChrimson) או באמצעות PCR עבור המבנה שהוכנס8כל החומרים ששימשו במחקר זה מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. גידול אופטוגנטי

  1. גדלו יתושים לפי הפרוטוקול הסטנדרטי31 עם החריגים הבאים, כדי למקסם את התגובה של קווי האופטוגנטיקה במהלך הניסויים.
  2. בצעו הכלאות באמצעות זני Liverpool הומוזיגוטים של Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson וזן פרא (wild-type), כדי להפיק את קווי הניסוי ההטרוזיגוטים Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ ו-Gr3>CsChrimson.
  3. גדלו את היתושים בתוך אינקובטור אטום לאור המכוון ל-28 °C ו-80% לחות, במחזור של 14 שעות אור כחול (450 nm) ו-10 שעות חשיכה (איור 1B).
    הערה: שימוש באור כחול ממזער את ההפעלה של תעלים המופעלים על ידי אור אדום, כגון CsChrimson. את כל שלבי הגידול המבוצעים מחוץ לאינקובטור יש לבצע בתנאי תאורה נמוכה.
  4. התחילו את הניסויים ביתושים בוגרים שבוע לאחר הבקיעה (eclosion) לכל המוקדם.
    הערה: בעוד שהגיל האידיאלי לניסויי התנהגות הוא 2–3 שבועות, ניתן להשתמש ביתושים עד 4 שבועות לאחר הבקיעה. הגנוטיפים של קבוצת הביקורת ושל קבוצת הניסוי צריכים להיות באותו גיל, שיירשם כימים לאחר הבקיעה. כדי להנחית את גיל בעלי החיים, יש להבקיע את כל הביצים באותו היום.
  5. יומיים לפני הניסוי, שאבו בעדינות יתוש נקבות שהזדווגו ולא ניזונות דם מתוך הכלובים והרדימו אותן ב-4 °C. באמצעות נוצה או שאב, העבירו אותן בזהירות למכלי הניסוי בהתאם לסוג הבדיקה המבוצעת.
  6. הכינו אליקוט של 0.2 M של all-trans retinal (ATR) בתוך dimethyl sulfoxide (DMSO), המאוחסן ב-20 °C-. ספקו 10% סוכרוז ו-400 µM ATR באמצעות פתילים מבד כותנה ספוגים על רשת המכל. בעלי החיים עשויים להזדהן מהמזון הזה במשך 1–3 ימים בחשיכה.
    הערה: הזנה בחשיכה, בניגוד להזנה תחת אור כחול, מונעת הבהרה (bleaching) של ה-ATR (איור 1B). בנוסף, לאורך כל שלבי הפרוטוקול, היתושים הורדמו על ידי חשיפה ל-4 °C למשך 5–10 דקות, עד שהפסיקו לזוז. בסיום כל ניסוי, היתושים הוהרגו (euthanized) על ידי חשיפה ל-20 °C- למשך 24 שעות.
    זהירות: All-trans-retinal עלול לגרום לגירוי חמור במגע עם העור והעיניים. יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים כגון חלוק מעבדה, כפפות והגנה לעיניים בזמן הטיפול בו. Dimethyl sulfoxide הוא נוזל דליק שעלול להיספג דרך העור במגע ואותו יש לטפל בסביבה יבשה עם ציוד מגן אישי והגנה לעיניים. יש לאחסן DMSO גם במיכלי אחסון כימיים חסיני אש.
  7. יום אחד (20–24 שעות) לפני הניסוי, החליפו את מאכלי הסוכרוז במאכלים חדשים המכילים מים מזוקקים ו-400 µM ATR. בעלי החיים נשארים בחשיכה עד לביצוע הניסוי (איור 1B). המשיכו לסעיף 2, 3 או 4.
    הערה: יש להריץ את הניסויים במהלך תקופת האור היומית של היתושים כדי למקסם את שיעור התגובה.

2. אופטו-תרמוסייקלר

  1. הרכבת רכיבי הבדיקה
    1. הכינו את לוחות האקרילי להכלת היתושים (איור 2). עיינו ב-איור 2A  עבור תרשים, איור 2B  עבור רכיבים אלקטרוניים, ו-איור 2C  עבור תמונה של לוח האקרילי. ראו קבצים ב-(https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) עבור תבניות.
      1. ליצירת הדפנות, חתכו באמצעות לייזר יריעת אקרילי בעובי 3 mm לארבעה מלבנים של 10 cm על 1 cm ושישה מלבנים של 7 cm על 1 cm. הדביקו את המלבנים בעזרת דבק אקרילי למטריצה של חמישה על שלושה, כאשר כל יחידה היא תא של 17 mm על 17 mm על 10 mm. התבנית לחלקים אלו נמצאת בקובץ “14_animal_thick_v3.ai”.
        ​זהירות: דבק אקרילי הוא חומר דליק ועלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה וכן לגירוי בעיניים. יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בדבק אקרילי, כגון כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן, ויש להשתמש בממס זה באזור מאוורר היטב, הרחק מאש גלויה.
      2. עבור תחתית התא, חתכו יריעת אקרילי בעובי 1.5 mm לגודל של 6.985 cm על 10.16 cm, כאשר הבאר הימנית התחתונה מוסרת. חתכו יריעת אקרילי בעובי 1.5 mm למלבן של 6.985 cm על 10.16 cm עבור המכסה. התבנית לחלקים אלו היא “14_animal_thin_v3.ai”.
    2. חתכו יריעת רשת שחורה עמידה ל-UV לגודל זהה לחלק האקרילי התחתון (איור 2C). הניחו את הרשת בין דפנות הלוח לבין החלק התחתון, ואז הדביקו אותם במקומם בעזרת דבק אקרילי. הסירו את הרשת מהבאר הימנית התחתונה כך שהחור יישאר פתוח.
  2. בנו מסגרת שתחזיק את המצלמה ונורות ה-LED (איור 2A).
    1. בנו מסגרת עם ארבעה עמודים בכל פינה של ה-thermocycler באמצעות מסילות בנייה אופטיות ריבועיות של 25 mm באורך 60.96 cm. השתמשו בשתי מסילות בנייה של 25 mm באורך 22.86 cm כדי לחבר את העמוד הימני-קדמי לעמוד הימני-אחורי ואת העמוד השמאלי-קדמי לעמוד השמאלי-אחורי, במרחק 30 cm מהספסל.
    2. חברו את העמודים הימני והשמאלי בחלק הקדמי באמצעות מסילת בנייה של 25 mm באורך 30.48 cm, מוגבהת ב-24 cm מהספסל, ובחלק האחורי באמצעות מסילת בנייה של 25 mm באורך 30.48 cm מוגבהת ב-42 cm מהספסל.
    3. חברו מוטות אופטיים באורך רגל אחת למסילת הבנייה בצדדים השמאלי והימני של המסגרת. קשרו שיש NPP של 627 nm (אדום) המחוברים בטור 24 cm מעל בלוק ה-PCR של ה-thermocycler לכל מוט.
      הערה: למרות שאורך הגל שגורם לפעילות שיא של CsChrimson הוא כ-590 nm, אורכי גל סביב 625 nm מאזנים את הצורך להפעיל את CsChrimson והימנעות מתגובות התנהגותיות לאור בביקורות גנטיות27. הדביקו גוף קירור ועדשה על כל נורת LED כדי למקד את האור לעבר הבלוק של ה-thermocycler.
    4. חברו מוט אופטי באורך 30.48 cm לחלק העליון של שני עמודי מסילת הבנייה הקדמיים. השתמשו במהדק זווית ישרה במרכז המוט האופטי כדי לחבר מוט אופטי באורך 15.24 cm הפונה פנימה מעל בלוק ה-thermocycler. חברו מצלמה עם מסנן infrared long-pass לקצה, כשהיא פונה כלפי מטה, 40 cm מעל הבלוק.
    5. בעזרת מוטות אופטיים, צרו מסגרת הנמתחת ממסילת הבנייה במלבן סביב בלוק ה-PCR, מוגבהת מעט מעל פני השטח. חברו רצועת נורות LED בתכופת אינפרא-אדום, הפונות לבלוק ה-PCR, כדי להאיר את היתושים בזווית ישרה למצלמה.
      הערה: התאורת אינפרא-אדום המשמשת להדמיה בווידאו אינה מחממת את הזירה באופן מדיד, שכן פני השטח של ה-thermocycler נשמרים ב-24 °C לאורך כל הניסוי.
    6. כסו את המבנה בווילון חסיכה כדי למנוע הפרעות מאור סביבתי.
    7. כסו את פני השטח והצדדים של בלוק ה-PCR בשכבה אחת של סרט חסיכה ליצירת משטח שטוח ואחיד עם רקע כהה.
    8. מקמו את חיישן ה-thermocouple על בלוק ה-PCR בפינה הימנית התחתונה ואבטחו אותו עם סרט חסיכה. ודאו חלוקת אור אחידה על פני בלוק ה-PCR באמצעות מד הספק. התאימו את מתח או זרם ספק הכוח כדי לספק אור ב-12 µW/mm2.
    9. על קצה בלוק ה-PCR, מקמו נורת LED אינפרא-אדומה לסנכרון הווידאו עם פלט הגשת הגירוי (איור 2C). כסו את פני השטח בסרט שחור כדי לאפשר זיהוי של האור ללא יצירת סנוור במצלמה.
    10. חברו את ה-thermocouple, נורת הסנכרון ונורות האור האדום לפי התרשים ב-איור 2B. הורידו את התוכנות הנדרשות (SpinView (גרסה 1.27.0.48), CoolTerm (גרסה 2.0.1), Arduino IDE (גרסה 1.8.12)). הורידו את קוד ה-Arduino ותוכנית ה-thermocycler ממאגר ה-GitHub.
      ​הערה: קוד ה-Arduino מתוכנת לספק אור אדום, חום בטמפרטורת הגוף, ושילוב של שני הגירויים. שבע תוכניות גירוי, כאשר סדר הגירויים אקראי ביניהן, מסופקות כמשאבים. ניתן לשנות אותן כדי לספק גירויים שונים. ישנם תשעה גירויים לניסוי: שלושה של חום בלבד, שלושה של אור בלבד, ושלושה של חום ואור בו-זמנית. הגשת הגירוי פועלת כך שה-Arduino מזהה שינויים בטמפרטורת פני השטח של בלוק ה-PCR דרך ה-thermocouple, ואז מספק גירויי אור בזמנים המוגדרים. פרטים נוספים ניתן למצוא בהערות בתוך תוכניות הגירוי.
  3. הכנה לניסוי
    1. גדלו יתושים לפי פרוטוקול הגידול האופטוגנטי; ראו סעיף 1 ו-איור 1B.
    2. יומיים לפני הניסוי, העבירו 14 נקבות של יתושים בעזרת aspirator למכל נפרד. ספקו ליתושים ATR לפי שלב 1.6. אם משווים מספר גנוטיפים, הפכו אותם לסמויים מהנסיין.
      ​הערה: ברגע שיתושים מקבלים ATR, יש לטפל בהם בתאורה עמומה.
    3. יום אחד לפני הניסוי (20–24 שעות), שאבו 14 נקבות של יתושים לכל לוח אקרילי והרדימו אותם ב-4 °C. מקמו בזהירות יתוש אחד בכל פעם בכל אחת מהבארים בעזרת נוצה או aspirator.
    4. הדביקו את צד לוח האקרילי בסרט הדבקה כדי להחזיק את המכסה במקומו. אין לקפל את הסרט מעל החלק העליון או התחתון של לוח האקרילי, שכן הדבר יחסום את שדה הראייה של המצלמה.
    5. מקמו את לוח האקרילי מעל שלושה פתילים של כותנה הספוגים ב-400 µM ATR במים מזוקקים (ראו שלב 1.6), המוצבים במקביל. יישרו כל אחת משלוש השורות לפתיל כך שלכל היתושים תהיה גישה לתמיסת מים-ATR. מקמו את לוח האקרילי באינקובטור חשוך למשך הלילה.
  4. ביצוע הניסוי
    1. חברו את המצלמה, נורות ה-LED וה-Arduino למחשב. הפעילו את ספק הכוח. נגבו את פני השטח של ה-opto-thermocycler עם 70% אתנול והמתינו לייבוש.
      ​זהירות: אתנול הוא חומר דליק ועלול לגרום לגירוי חמור בעיניים. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול באתנול. בנוסף, הימנעו מכל אש גלויה.
    2. בעזרת מכל חשוך, העבירו את לוח האקרילי עם היתושים למרכז בלוק ה-PCR. כסו את ה-opto-thermocycler בווילון חסיכה.
    3. פתחו את SpinView במחשב. לחצו על שם המצלמה כדי לפתוח את תצוגת המצלמה. חברו את תאורת האינפרא-אדום וודאו שבלוק ה-PCR ולוח האקרילי נראים בתצוגת המצלמה.
    4. במידת הצורך, התאימו את לוח האקרילי כך שיהיה מיושר, ממורכז ושה-thermocouple נראה בפינה הימנית התחתונה של לוח האקרילי. ודאו שנורת הסנכרון נמצאת בתוך הפריים (איור 2C).
    5. התאימו את ההגדרות במצלמה וב-SpinView כדי להבטיח וידאו חד וחתוך המראה את לוח האקרילי. בלשונית Image Format, התאימו את האפשרויות Width, Height, Offset X, ו-Offset Y כדי להבטיח שלוח האקרילי ונורת הסנכרון נראים. בלשונית Settings, הגדירו את Acquisition Frame Rate Enable ל-true ואת Acquisition Frame Rate ל-30 fps.
    6. כבו את Exposure Auto ו-Gain Auto. התאימו את ערכי ה-Exposure Time וה-Gain כדי ליצור ניגודיות נקייה בין הרקע השחור ליתושים. לחצו על כפתור ההקלטה האדום בפינה הימנית העליונה כדי לפתוח חלון נפרד לשמירת קובץ הווידאו.
    7. בחלון הקופץ, הגדירו את נתיב הקובץ למעלה: לחצו על Browse, נווטו לתיקיית הניסוי, לחצו על New folder, ותייגו אותה בשם הניסוי. הגדירו את מספר הפריימים להקלטה למספר המתאים לניסוי (למשל, 43,500) או ל-0 כדי לעצור את ההקלטה ידנית.
    8. בלשונית Videos, הגדירו את השדות הבאים: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, JPEG Compression Quality: 65. פתחו את תוכנית ‘optothermo_lightheat_random1’ ב-thermocycler והפעילו אותה. ה-thermocycler אמור להתחיל בשלב השהיה (hold) ב-25 °C.
    9. פתחו את התוכנית התואמת, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino’, ב-Arduino IDE, והעלו אותה ללוח. פתחו את ה-serial monitor וודאו שהטמפרטורה היא בערך 25 °C.
    10. סגרו את ה-serial monitor ב-Arduino IDE. פתחו את CoolTerm כדי להתחיל לאסוף את פלט ה-serial monitor של ה-Arduino. ודאו שפורט הסריאל והערוץ תואמים לאלה שב-Arduino IDE. הפלט יתחיל להופיע בחלון ה-CoolTerm.
    11. התחילו את ההקלטה של פלט ה-Arduino לקובץ Text/Binary. התחילו את הקלטת הווידאו ב-Spinview. לחצו על Resume כדי לסיים את השהיית ה-thermocycler. עקבו אחר פלט ה-Arduino ב-CoolTerm כדי לבדוק אם הטמפרטורה יורדת ל-18 °C ומונה הגירויים עולה ל-1, מה שמסמן את תחילת הניסוי. אפשרו לבדיקה לרוץ עד לסיום הניסוי.
  5. ניקיון
    1. עצרו את הקלטת הווידאו ואת איסוף הפלט ב-CoolTerm. סגרו את שתי התוכניות. סיימו את תוכנית ה-thermocycler. הסירו את לוח האקרילי עם היתושים מה-thermocycler והניחו אותו במקפיא של -20 °C למשך הלילה כדי להמית את היתושים.
      ​זהירות: בעת המיתה של יתושים טרנסגניים, ודאו שהם נשארים בסביבה של -20 °C למשך 24 שעות לפחות לפני השלכתם לפח פסולת ביו-בטי כדי להבטיח את מותם.
    2. אם מתחילים ניסוי נוסף, חזרו על סעיף 2.3. נתקו את כבלי המצלמה וה-Arduino. כבו את ספק הכוח. נתקו את נורות ה-LED האינפרא-אדומות. נקו את לוחות האקרילי על ידי הסרת סרט ההדבקה והשלכת היתושים המתים.
    3. רססו את המכסה ולוח האקרילי ב-70% אתנול ונגבו את כל דפנות הבארים והרשת בעזרת אצבע עם כפפה בזהירות. שטפו היטב במים דה-יוניים, ולאחר מכן ערמו את לוחות האקרילי לאחסון, תוך הפרדת המכסים בעזרת נייר סופג למניעת שריטות.

3. בדיקת שמיכת דם (Blood blanket assay)

  1. הרכבת רכיבי הבדיקה (איור 3)
    1. בנו את מערך ה-opto-thermocycler כפי שמתואר בסעיף 2.1. עיינו באיורים של מערך הבדיקה (איור 3A), הגירוי התרמי (איור 3B) ולוח האלומיניום (איור 3C).
    2. בנו לוח האכלת ארוחת דם מאלומיניום כפי שמוצג ב-איור 3C.
      1. באמצעות חיתוך בלייזר או חיתוך בסילון מים, בנו את החלק העליון והתחתון של הלוח. בנו את החלק התחתון של הלוח על ידי חיתוך יריעת אלומיניום בעובי 0.8 mm למידות של 90 mm על 134 mm. בנו את החלק העליון על ידי חיתוך יריעת אלומיניום בעובי 1.6 mm למידות של 90 mm על 134 mm. חתכו 15 חורים מלבניים (17.2 mm על 18.6 mm) בלוח העליון. ניתן למצוא את קבצי התבנית במאגר ה-GitHub של ה-blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) תחת "Aluminum plate templates".
      2. מקמו בין חלקי האלומיניום אטם סיליקון דק (בעובי 0.5 mm) כדי למנוע דליפה. חתכו באמצעות חיתוך בלייזר כך שיתאים לצורת חלק האלומיניום העליון.
      3. חברו את השכבות יחד באמצעות שמונה ברגי standard bolts 4–40 בעלי ראש כיפה והברגה משושה באורך 0.47625 cm. השתמשו במקדד הברגות (forming tap) כדי ליצור הברגות עבור הברגים בחלקי המתכת. חברו אותם באמצעות דלייות עגולות ודלייות בצורת "W" בחלקו התחתון של הלוח להגברת היציבות בעת ההנחה על גבי בלוק ה-thermocycler.
    3. הורידו את קוד ה-Arduino ותוכנית ה-thermocycler עבור בדיקת ה-blood blanket ממאגר ה-GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. הכינו מנות של 20 mM ATP ב-25 mM NaHCO3 ואחסנו ב- -20 ˚C עד לשימוש.
      ​הערה: הכינו תמיסת ATP טרייה מדי שישה חודשים. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. הכינו 1 M NaHCO3 ו-5 M NaCl (אחסנו כל אחד בטמפרטורת החדר). NaHCO3 יציב בתמיסה למשך 7 ימים בלבד.
  2. הכנה לניסוי
    1. גדלו פיתוחיים והעבירו אותם ללוחות אקריליים כפי שמתואר בסעיפים 1 ו-2.2. אם מתוכננות השוואות בין גנוטיפים שונים, בצעו סמיות (blinding) כלפי הנסיין.
    2. ביום הניסוי, הכינו 10 mL של ארוחת דם מלאכותית מינימלית (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 ו-1.5 mM ATP) על ידי הוספת 750 µL של תמיסת stock של 20 mM ATP,‏ 220 µL של 5 M NaCl ו-200 µL של 1 M NaHCO3 ל-8.83 mL של מים דאיוניים. ערבבו היטב על ידי הפיכה.
      הערה: הכינו את ארוחת הדם המלאכותית טרייה לפני כל ניסוי.
    3. הגדירו את הקלטת ה-SpinView בהתאם לשלבים 2.3.4 עד 2.3.8.
    4. פתחו את קובץ ה-Arduino ששמו “Red-light-Only__BB_.ino” (או את קובץ הגירוי הרצוי) עבור הניסוי.
  3. ביצוע ניסיונות
    1. טפטפו 650 µL של ארוחת דם מלאכותית מינימלית לתוך כל באער של הלוח, תוך וידוא שהארוחה ממלאת לחלוטין כל באער ללא גלישה.
    2. מתחו ריבוע פאראפילם (parafilm) בגודל 10.2 cm על 10.2 cm מעל טבעת בקוטר 20.3 cm. הניחו את הפאראפילם מעל הלוח, והדקו את הקצוות עד להיצמדות. בעזרת סכין מנתח, גזרו שוליים ברוחב 1.3 cm מסביב ללוח והכניסו את עודפי הפאראפילם מתחת כדי לאטום את הארוחה.
    3. הניחו את הלוח ישירות על גבי בלוק ה-PCR כדי לאפשר העברת חום מקסימלית (איור 3A).
      הערה: סרט בידוד לאור (Blackout tape) משמש על פני השטח של בלוק ה-PCR עבור ה-opto-thermocycler, אך לא עבור ה-blood blanket.
    4. הניחו את התרמוקפל (thermocouple) על פני שטח הפאראפילם בפינה הימנית התחתונה של לוח האלומיניום. חברו את המצלמה, נורות ה-LED ואת ה-Arduino למחשב. הפעילו את ספק הכוח. הפעילו את תוכנית “BB_thermocycler_program.x50prog” ב-thermocycler.
      הערה: קצב שינויי הטמפרטורה הוא מהירות העלייה (ramp speed) המקסימלית של ה-thermocycler, שנבחרה כדי לדמות בצורה הטובה ביותר את נחיתת פיתוחי על מאכיל לצורך הזנה.
    5. תוך שימוש במכל כהה ותאורה עמומה בחדר כדי למזער את החשיפה לאור, העבירו את לוח האקרילי עם הפיתוחיים אל לוח האלומיניום, תוך וידוא שכל באער מיושר עם הפיתוחיים. ודאו שהתרמוקפל נמצא בפינה הימנית התחתונה של הלוח ובמגע עם הפאראפילם כדי למדוד את הטמפרטורה של ארוחת הדם המלאכותית.
    6. הפעילו את התוכנית על ידי העלאה מחדש של תוכנית “Red-light-Only__BB_.ino” ב-Arduino IDE. סגרו את מסך הניטור הסדרתי (serial monitor). ב-CoolTerm, לחצו על Connect כדי לראות את הטמפרטורה הנוכחית. בעזרת טמפרטורת התחלה זו, התאימו את טמפרטורת ההדק (trigger temperature) בסקריפט ה-Arduino לכ-0.6 °C מתחתיה.
    7. בחלון ה-CoolTerm, בחרו Capture to Text/Binary File והתחילו באיסוף נתונים. התחילו הקלטת וידאו בחלון ההקלטה ב-SpinView. לחצו על Resume כדי לסיים את השהיית (hold) ה-thermocycler. עקבו אחר פלט ה-Arduino ב-CoolTerm כדי לוודא שצניחת החום זוהתה והניסוי התחיל.
    8. בתום משך הניסוי, לחצו על Stop Recording. ב-CoolTerm, בלשונית Capture to Text/Binary File, בחרו Stop כדי להפסיק את כתיבת הפלט הסדרתי.
    9. הסִירו את לוח הפיתוחיים מלוח ה-blood blanket והעבירו אותם לחדר קר כדי להרדימם. ספרו את מספר הפיתוחיים עם בטנים מורחבות המכילות את ארוחת הדם המלאכותית כרוויים (engorged), כולל אלו שהזוננו חלקית.
    10. בין ניסיונות, נקו את פני השטח של בלוק ה-PCR על ידי ניגוב עם Kimwipe טבול ב-70% אתנול. הסירו את הפאראפילם ושטפו את לוח האלומיניום במים דאיוניים. חזרו על סעיף 3.3 עבור ניסיונות נוספים. גוון את סדר הניסיונות בין הימים כדי למזער את השפעת מחזורי הפעילות הצירקדיים.
  4. ניקיון
    1. הפסיקו את כל התוכניות המקליטות וצאו מהן. נתקו את כבלי ה-USB של המצלמה, ה-Arduino ונורות האינפרא-אדום. כבו את המחשב. הפסיקו את תוכנית “thermocycler_program.x50prog” הרצה ב-thermocycler.
    2. הניחו את לוחות הפיתוחיים במקפיא של -20 °C למשך לילה כדי להרוג את הפיתוחיים. שטפו את לוח האלומיניום במים דאיוניים. רססו את לוח האקרילי ב-70% אתנול, ולאחר מכן שטפו במים דאיוניים והשאירו לייבש למשך לילה לפני העמסת פיתוחיים נוספים.
      הערה: יש לייבש את הלוחות למשך לילה לאחר השטיפה כדי להבטיח שלא נותרה לחות. אם תישאר לחות, הדבר יגרום לעיבוי על המכסה ויפריע לסרטון הווידאו.

4. בדיקת הזנה באמצעות ממברנה אופטיקה

  1. הרכבת רכיבי המערך (איור 4)
    1. הרכב מסגרת באמצעות רכיבים אופטו-מכניים ופלטפורמת אקריליק שחורה בעובי 0.635 cm ובמידות 30.48 cm על 30.48 cm. צור חור במרכז האקריליק בקוטר של 11.43 cm באמצעות חיתוך בלייזר. חתוך חורים במרחק של 2.54 cm מכל פינה כדי לאפשר לאקריליק להישען על תומכי המסגרת, בגובה של כ-23.495 cm מעל הבסיס.
    2. במרכז, הצמד טבעת אקריליק שחורה בעלת קוטר פנימי של 19.05 cm וקוטר חיצוני של 20.32 cm (איור 4A). תבניות לכל רכיבי האקריליק נמצאות במאגר ה-GitHub של ה-opto-membrane feeder (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) יחד עם תוכניות ה-Arduino. ראו את האיור למבנה הכללי (איור 4A), הגירוי (איור 4B), דיאגרמת המעגל (איור 4C), ותמונת סטיל מהווידאו (איור 4D).
      ​הערה: החומרים הספציפיים המשמשים להרכבת פלטפורמה זו אינם קריטיים, לכן עשויות להיות זמינות אפשרויות חסכוניות יותר.
    3. הצמד מצלמה עם מסנן infrared long-pass מתחת לחור המרכזי, כשהיא פונה כלפי מעלה לעבר מיכל היתושים. כוון את הצמצם למצב פתוח לחלוטין, כדי לאפשר מיקוד סלקטיבי בחלק העליון של רשת המיכל (איור 4A).
    4. כדי להכין את המיכלים, חתוך צינור פוליקרבונט שקוף בקוטר של 11.43 cm למקטעים גליליים באורך 12.7 cm.
      1. בנה תחתיתים למיכלים על ידי חיתוך לייזר של עיגולים בקוטר 11.43 cm מאקריליק בעובי 0.3175 cm. קצוות העיגולים חרוטים בלייזר כך שייכנסו פנימה לתוך הצינור. הצמד אותם לצינורות באמצעות אפוקסי פלסטי.
      2. צור מכסה פנימי באמצעות אקריליק שחור בעובי 0.635 cm ו-0.3175 cm ורשת שחורה עמידה ל-UV. לטבעת הפנימית קוטר של 10.795 cm, בעוד שלטבעת החיצונית קוטר של 12.065 cm, כאשר הרשת השחורה מתוחה מעל הטבעת הקטנה יותר. יש לתפור את הרשת דרך חורי לייזר באמצעות חוט שעווה.
        ​הערה: יש להניח את המיכלים תמיד על נייר סופג כדי למנוע שריטות בתחתית האקריליק שדרכה מוקלט הווידאו.
    5. בנה מכלים מאקריליק לאספקת ארוחת דם (איור 4A).
      1. חתוך טבעת בעלת קוטר פנימי של 5.08 cm וקוטר חיצוני של 6.6 cm מאקריליק שקוף בעובי 0.15875 cm. הצמד אותה לטבעת שקופה נוספת בעלת קוטר פנימי של 5.842 cm וקוטר חיצוני של 6.604 cm באמצעות דבק אקרילי.
      2. מקם גליל רשת מתכתית בגובה 13.97 cm ובקוטר 19.05 cm בתוך טבעת האקריליק השחורה במרכז הפלטפורמה.
      3. בתוך רשת המתכת, הצמד סליל של נורות RGB LED במרווח של 3.81 cm מהחלק החיצוני של המיכל, שיישלט על ידי לוח Arduino Uno, המונח על פלטפורמת האקריליק השחורה (איור 4C).
      4. באמצעות מד עוצמה, מדוד את עוצמת האור בכל חלקי פנים הגליל וכוון את מיקום הנורות כך שהזירה תומאר בין 3.5–6 µW/mm2. מחוץ לרשת המתכת, הצמד טבעת של נורות infrared LEDs ב-850 nm למסגרת באמצעות אזיקי פלסטיק, כאשר הן פונות פנימה.
    6. חבר כבל USB ללוח ה-Arduino Uno וחבר למחשב. חבר כבל USB מהמצלמה למחשב. כבה את חיבור האינטרנט.
    7. מקם את מבנה ה-opto-membrane באינקובטור חשוך או בחדר סביבתי בטמפרטורה של 26 °C ובלחות יחסית של 80% למשך כל תקופת הניסויים.
  2. הכנת מיכלי היתושים
    1. לפני הניסוי, שטוף את מיכלי היתושים על ידי ריסוס אתנול 70% וניגוב עדין עם ספוג רך. שטוף את המיכלים במים דה-יוניים והשאר לייבוש באוויר למשך הלילה.
    2. יומיים לפני הניסוי, מיין יתושים זכרים ונקבות תחת הרדמה קרה והכנס 20 נקבות לכל מיכל. אפשר גישה ל-ATR בהתאם לשלב 1.6.
    3. בשלב זה, הגנוטיפים צריכים להיות מסתוריים (blinded) עבור המנסה. יש לסובב את סדר הניסויים בין הימים כדי למזער הבדלים בתוצאות ההתנהגות עקב תזמון ניסויי.
  3. ביצוע ניסויים
    1. להכנת ארוחת הדם, הנח בקבוקי מים של 119 mL באמבט חימום של 45 °C, בקבוק אחד לכל ניסוי. נפח וטמפרטורה אלו שומרים על ארוחת הדם קרובה לטמפרטורת הגוף לאורך כל הניסוי.
    2. הכן אליקוטיות של 5 mL של דם כבשים ללא פיברין (defibrinated). אחסן ב-4 °C והפוך את המבחנה לפני השימוש למניעת הפרדה. הכן את ארוחת הדם טרייה לפני כל ניסוי.
      זהירות: טפל בדם כבשים ללא פיברין תוך לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים כדי למזער חשיפה לנשאי מחלות. חומרים רב-פעמיים הבאים במגע עם דם יש להשרות ב-10% אקונומיקה ולשטוף במים דה-יוניים. כיוון שאקונומיקה עלולה לגרום לגירוי חמור של העור והעיניים, יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לאורך כל הטיפול.
    3. מקם את האליקוטיות הראשונה של הדם באמבט חימום של 45 °C למשך 20 min לפחות לפני הניסוי. הפשר את ה-ATP על קרח. מתח ריבוע פאראפילם של 5.08 cm על 5.08 cm מעל מכסה האקריליק בצד שבו נמצא העיגול השטוח והגדול יותר, כדי ליצור שקע לארוחת הדם (איור 4A).
    4. נגב את המחשב באתנול 70% כדי להסיר ריחות אנושיים. חבר את המחשב לכונן קשיח חיצוני. חבר את המצלמה ואת ה-Arduino. חבר את נורות ה-RGB והאינפרא-אדום למקור מתח.
    5. פתח את תוכנת ה-SpinView ואת קובץ ה-Arduino עבור הגירוי המתאים. צור תיקייה בכונן הקשיח החיצוני להכיל את נתוני הניסוי. העלה את קובץ ה-Arduino בשם “blue_only.io” כדי לספק אור כחול עמום של 471 nm מנורות ה-RGB לזירה (בהתאם ל-איור 4B).
    6. בלי לחשוף את היתושים לכמות עודפת של CO2 מהנשימה, בחן את המיכל עבור הניסוי ורשום מקרי מוות כלשהם לפני הניסוי. מקם את המיכל במרכז ואפשר אקלימציה תחת אור כחול עמום למשך 10 עד 20 min לפני החשיפה לגירוי.
      ​הערה: שלב האקלימציה והניסוי מבוצעים תחת אור כחול עמום מכיוון שחושך מוחלט מעכב את תעופת היתושים.
    7. הפעל לכידת וידאו
      1. בתוכנת ה-SpinView, בחר את המצלמה. בלשונית Settings, כוון את החשיפה (exposure) וההגבר (gain) לפי הצורך כדי לשמור על ניגודיות גבוהה בין החרקים בהירים לרקע הכהה (איור 4D).
      2. לחץ על כפתור ההקלטה האדום בסרגל העליון כדי לכוון את הגדרות לכידת הווידאו. קבע את נתיב הקובץ על ידי לחיצה על Browse, ולאחר מכן נווט לכונן הקשיח החיצוני. צור תיקייה חדשה עם שם תיאורי לכל ניסוי. אל תכלול רווחים בשם התיקייה.
      3. בלשונית Save Options, בחר Capture 0 frames, מה שיאפשר לווידאו להקליט עד לעצירה ידנית. תחת Recording Mode, בחר Buffered. בלשונית Videos, הגדר את השדות הבאים: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, ו-JPEG Compression Quality: 65.
    8. מייד לפני החשיפה לגירוי, טפטף עם פיפטה 500 µL של 20 mM ATP, לריכוז סופי של 2 mM ATP, לתוך אליקוטיות הדם של 5 mL שהוכנה. הפוך את המבחנה מספר פעמים כדי לערבב.
    9. שפוך את תמיסת ה-ATP-blood לתוך מכל ארוחת הדם. מעל ארוחת הדם, הנח בקבוק הפוך של 119 mL מלא במים ב-45 °C כדי לשמור על טמפרטורת הדם קרובה לטמפרטורת גוף האדם לאורך כל הניסוי.
    10. בתוכנת ה-SpinView, בחר Start Recording. ללא גירוי של היתושים באמצעות נשימה, הנח את ארוחת הדם מעל מכסה הרשת של המיכל כך שהיתושים יוכלו לנקב את ממברנת הפאראפילם דרך הרשת.
    11. העלה את תוכנית ה-Arduino עבור “1sON_10sOFF.io” (איור 4B), או את הגירוי הרצוי. זה יספק 1 s של אור אדום ב-624 nm כל 10 s, עד להעלאה ידנית של קובץ “blue_only.io”. אורך הגל של 624 nm מספיק להפעלה אופטוגנטית של CsChrimson.
    12. מקם את אליקוטיות הדם באמבט החימום עבור הניסוי הבא. לאחר שהניסוי רץ במשך 15 min, בחר Stop Recording. העלה את קובץ “blue_only.io” כדי להפסיק את גירוי האור האדום.
    13. הסר את מחזיק ארוחת הדם ובקבוק המים. הסר את המיכל והרדם את היתושים ב-4 °C. לביצוע ניסויים נוספים, חזור לסעיף 4.3. בחן ויזואלית את היתושים המורדמים כדי לקבוע ולרשום את מספר היתושים ששבעו דם על ידי חיפוש בטן מלאה בדם.
  4. ניקיון
    1. סגור את כל התוכניות. הוצא את הכונן הקשיח החיצוני ונתק אותו מהמחשב. כבה את המחשב.
    2. נקה את מיכלי היתושים כפי שתואר קודם בשלב 4.2.1. נקה את מחזיקי ארוחת הדם מאקריליק. מלא מגש פוליקרבונט חצי-גודל ב-2/3 מים, ולאחר מכן הוסף 100 mL של אקונומיקה.
    3. הוסף את מחזיקי ארוחת הדם מאקריליק והבקבוקים הפלסטיים למגש. כסה במכסה והשאר להשריה למשך 10 min. שטוף את האקונומיקה והסר את הפאראפילם. שפשף בעדינות ושטוף כדי להסיר שאריות דם כלשהן.

5. ניתוח התנהגות

  1. הכינו את הסרטונים לניתוח על ידי דחיסתם לקובצי .mp4 באמצעות ffmpeg (גרסה 8.0.1). אם קובצי הווידאו מפוצלים, מיזגו אותם לסרטון אחד באמצעות כל תוכנה לעריכת וידאו. פתחו את סרטוני האימון ב-SLEAP (גרסה 1.4.1) בגווני אפור.
    ​הערה: אם הגדרות הקלטת הווידאו מתאימות, הכל צריך להיות בתוך הפריים, ויתושים נעים לא צריכים להיות מטושטשים. ניתן להשתמש בתוכנות אחרות למעקב אחר חלקי גוף. גרסת ה-SLEAP ששימשה במאמר זה היא 1.4.1. עיינו בתיעוד של SLEAP לקבלת פרוטוקולים עדכניים.
  2. צרו שלד (skeleton) המסמן את חלקי הגוף הרלוונטיים של בעלי החיים בהתאם להתנהגויות הנבדקות (איור 2D, איור 3D, ו-איור 4E).
  3. באמצעות אפשרות ה-“Random frame” תחת לשונית Suggested frame, בחרו באופן אקראי 10 פריימים וסמנו כל יתוש כמופע (instance). אם חלקים מסוימים של היתוש חסומים (כלומר, קצה החרטום מוכנס לרשת במהלך הדיגום), סמנו את המיקום המשוער של חלק הגוף. אמנו מודל על הפריימים המסומנים עם הגדרות אלו:
    1. עבור מודל רב-בעלי-חיים מסוג Top-Down (בשימוש עבור ה-opto-thermocycler ומודל שמיכת הדם): בלשונית Training Pipeline, הגדירו את Max Instances ל- 14. בלשונית Centroid Model Configuration, הגדירו את Crop Size ל- Auto, והגדירו את Plateau Min. Delta ל- 1e-04, הגדירו את Plateau Patience ל- 10, הגדירו את Stride ל- 8, ואת ה-Anchor Part כ- thorax.
    2. עבור מודל רב-בעלי-חיים מסוג Bottom-Up (בשימוש עבור ה-Opto-membrane feeder): בלשונית Training Pipeline, הגדירו את Max Instances ל- no max. בלשונית Bottom-Up Model Configuration, הגדירו את Crop Size ל- Auto, והגדירו את Plateau Min. Delta ל- 1e-04, הגדירו את Plateau Patience ל- 10, והגדירו את Stride ל- 16.
  4. בצעו חיזוי (Predict) על מספר קבוע של פריימים עם הגדרות אלו: בלשונית Inference Pipeline, עבור ה-opto-thermocycler ושמיכת הדם, הגדירו Max Instances ל-14, Tracker ל-Simple, Max number of tracks ל-14, ו-Connect Single Track Breaks ל-True.
  5. עבור ה-opto-membrane feeder, הגדירו No Max עבור Max Instances ו-Max number of tracks, Tracker ל-Simple, ו-Connect Single Track Breaks ל-True. תקנו את הפריימים שנחזו ואמנו מחדש. חזרו על מחזורים של חיזוי, סימון ואימון על סט נתוני האימון.
    הערה: תיקוף בוצע על ידי בדיקה אקראית של פריימים מסומנים וזיהוי שגיאות עקביות (למשל, זיהוי שגוי של יתושים, חיזויים כפולים, אוריינטציה שגויה או השמה שגויה של חלקי גוף), תוך התמקדות בפריימים המכילים מקרי קצה אלו. ייתכן שיהיה צורך בעד 150 פריימים מסומנים, תלוי בתדירות השגיאות. SLEAP מספקת גם מדדי הערכה מבוססי ממשק גרפי (GUI) לתיקוף נוסף של המודל. ברגע שבדיקה חזותית מאשרת דיוק ורגישות מספיקים, החילו את המודל על סרטוני ניסוי וייצאו את התוצאות כ- .csv או .h5 לצורך ניתוח התנהגותי. ניתן להכשיר מסווגי התנהגות באמצעות פלטי הערכת תנוחה (pose estimation) כפי שמתואר בעבר8. ההתנהגויות מוגדרות כך: הליכה (walking), תנועת גוף טרנסלציונית עם תנועת רגליים; טיסה (flying), תנועה טרנסלציונית מהירה עם כנפיים פרושות; טיפוח (grooming), תנועות רגליים חזרתיות מעל חלקי גוף (מחושים, חרטום, כנפיים או רגליים); ודיגום (probing), הכנסת החרטום דרך הרשת בתחתית המכל. מסווגי התנהגות צריכים להגיע לדיוק של >90% בהשוואה לסימונים אנושיים.
  6. בצעו ניתוח סטטיסטי על ידי בחירה במבחנים לא-פרמטריים, כיוון שהנתונים בדרך כלל אינם מתפלגים נורמלית. בצעו את מבחני ה-post-hoc המתאימים עם תיקון להשוואות מרובות. עבור נתוני מלאות (engorgement), החזרות ניסיוניות הן קבוצות של יתושים, בעוד שעבור נתוני התנהגות, החזרות הן יתושים בודדים.

תוצאות

שלושה מבחני התנהגות שימשו לתצפית על התנהגויות חיפוש מאפנה והזנת דם ביתושים, כפי שמוצג ב-איור 1A. יתושים גודלו תחת מחזור של אור כחול-חושך (14:10 LD; איור 1B) כדי לסנכרן את המקצבים הצירקדיים, ובכך לאפשר את ביצוע הניסויים במהלך תקופות ערות. יומיים לפני הניסויים, היתושים הועברו לחושך מוחלט וסופקו להם ATR, שהוא קופקטור של אופסין. אם היתושים אינם מסונכרנים או שלא ניזונו ב-ATR, הם יראו פעילות נמוכה במבחני ההתנהגות. הגנוטיפים ששימשו לכל מבחן היו Gr3>CsChrimson ושתי בקרות גנטיות: קו הדרייבר Gr3-QF2 וקו האפקטור QUAS-CsChrimson.

בדיקת ה-opto-thermocycler (סעיף 2) מאפשרת להעריך את התעוררות היתושים והתנהגות הדיגום (probing) לאורך תקופות ארוכות בתגובה לגירויי חום ואור. אספקת החום מדמה את התקרבות היתוש למארח בעל דם חם, בעוד שאספקת אור למשך 5 שניות מדמה נשיפה ממושכת של נשימה3. השימוש ב-thermocycler מאפשר חימום וקירור מהירים של הפני השטח, המסונכרנים עם הפעלה אופטוגנטית באמצעות תרמוקפל ומקומץ (Figure 2A, B). שלושת הגנוטייפים של היתושים הוצבו בלוחות אקריליים עם בארות מבודדות בעלות תחתית רשת שבהם הם מראים התנהגות של הליכה, תעופה ודיגום (Figure 2C). מיקום חלקי גוף היתוש זוהה באמצעות אלגוריתמים למעקב אחר תנוחה (pose-tracking), כגון SLEAP34 ו-DeepLabCUT35 (Figure 2D, E). ניתן להשתמש באלגוריתמים לסיווג התנהגות החל מקלט של מעקב תנוחה (למשל, SimBA36, A-SOiD37) או וידאו (למשל, FERAL38). Figure 2E מציג את תוויות ה-SLEAP במהלך תעופה, הליכה ודיגום, שהן התנהגויות חיוניות לחיפוש מארח ולהזנה. התנהגויות אלו ניתן לסווג לפי מהירות החזה והמרחק בין בסיס החרטומה לקצהו. כאן מוצג הפלט של מעקב התנהגות באמצעות APT ו-JAABA39. היתושים נחשפו לעלייה בחום, לגירוי אור, או לשני גירויי החום והאור בו-זמנית, ולאחר מכן הוענקה הפסקה של 20 min לפני הגירוי הבא8 (Figure 2F). כאשר הם נחשפו לחום, כל שלושת הגנוטייפים הראו תקופה קצרה של דיגום (Figure 2G). חשוב לציין, כאשר הם נחשפו לגירוי אור של 5 שניות, יתושי ה-Gr3>CsChrimson הפכו למעוררים או "פעילים", והראו עלייה בהתנהגות הליכה ותעופה שנמשכה עד 10–15 min. היתושים הראו גם דיגום, המוגדר כהחדרה חוזרת של החרטומ לתחתית הרשת של הלוחות. הנתונים שורטטו כהתנהגות של יתושים בודדים (Figure 2G) וכשיעור כלל היתושים שהפגינו כל התנהגות לאורך זמן (Figure 2H). ה-opto-thermocycler מאפשר גירוי אופטוגנטי וחום חוזר ומדויק על פני מספר פרטים, מה שהופך אותו לכלי שימושי לחקר התעוררות והתנהגות דיגום.

בדיקת שמיכת הדם (סעיף 3) מבוססת על בדיקת האופטו-תרמוסייקליר, אך מספקת ארוחת דם מלאכותית מינימלית וטעימה, כך שניתן לכמת את מידת השביעה של היתושים (איור 3A). פולס של 5 שניות של אור אדום (~627 nm) ניתן כדי להפעיל באופן אופטוגנטי נוירוני חישה של CO2, והשכבה הדקה של ארוחת הדם המלאכותית חוממה מ-25 °C ל-~35 °C (כפי שנמדד על פני השטח באמצעות תרמוקופל; איור 3B). שלושת הגנוטיפים הוצגו כל אחד עם ארוחת דם מלאכותית בצלחת האכלה מאלומיניום (איור 3C). יתושים מסוג Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson, ו-Gr3>CsChrimson (n = 10 ניסויים לכל קבוצה גנטית, 14 יתושים בכל ניסוי) הוצגו כל אחד עם ארוחת דם מלאכותית בצלחת האכלה מאלומיניום (איור 3C). כדי למדוד את שביעת היתושים לאורך זמן במהלך הניסוי, נעשה שימוש ב-SLEAP למעקב אחר נקודות על גוף היתוש. הדבר בוצע על ידי יצירת שלד שכלל 5 צמתים על בטן היתוש (איור 3D). בסוף כל ניסוי, מספר היתושים השבעים נספר ידנית. קווי הבקרת היתושים, Gr3-QF2 ו-QUAS-CsChrimson, הראו ממוצע שביעה דומה (איור 3E, p = 0.401). לעומת זאת, קו ה-Gr3>CsChrimson הראה שיעורי הזנה גבוהים משמעותית, עם שיעור שביעה ממוצע של 53% (איור 3E, p = 0.078 לעומת Gr3-QF2 ו-p = 0.0097 לעומת QUAS-CsChrimson). הנתונים הוצגו כתרשימי כינור ותרשימי קופסה (חציון, טווח בין-רבעוני וטווח) ונותחו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis ומבחן Dunn עם תיקון Holm בסף מובהקות של p < 0.05. שביעה של חיה בודדת לאורך זמן זוהתה כשינוי בשטח הבטן התחום על ידי 5 צמתים (איור 3F). תוצאות אלו מראות כי ניתן להשתמש בבדיקת שמיכת הדם כדי להעריך את ההשפעות של הפעלה אופטוגנטית של אוכלוסיות נוירונליות המגיבות ל-CO2 על התנהגות השביעה של יתושים על ארוחת דם מלאכותית.

בדיקת המזין בעל הממברנה האופטית (סעיף 4), שבה מוצגת ליתושים גישה לארוחת דם חמה בתוך זירה גלילית, מאפשרת לחקור את משיכת היתושים למקור דם ואת מידת ההשבעה שלהם. כדי לקבוע אם הפעלה אופטוגנטית של CO2 נוירונים חושיים מספיקים כדי לגרום למשיכה למקור דם ולהאכלה ממנו, Gr3>CsChrimson וכן יתושערים של ביקורת (n = 10 עבור כל גנוטיפ, כאשר n מתייחס למספר הניסויים שבוצעו, עם 20 יתושים למיכל בכל ניסוי) קיבלו גישה לארוחת דם חמה במזין בעל ממבנה אופטו-ממברנה, תחת חשיפה לפולס חוזר של אור אדום בהיר למשך שנייה אחת בכל 10 שניות, למשך 15 דקות (איור 4B). כדי למדוד את המשיכה למזין הקרומי, נעשה שימוש במודל SLEAP עם שלוש נקודות למעקב אחר הראש, החזה והבטן של פיתוחי היתושים, תוך ספירת אלו שנמצאו בתוך אזור העניין (איור 4D, איור 4E). Gr3>CsChrimson הפגינו היתושים משיכה מוגברת לאזור ארוחת הדם עם חלוף הזמן בהשוואה ל- Gr3-QF2 בקרה (איור 4F, p = 0.027). ה Gr3>CsChrimson היתושים לא הראו משיכה גבוהה יותר באופן מובהק סטטיסטית מאשר ה- QUAS-CsChrimson (איור 4F, p = 0.310). קבוצות מובהקות נקבעו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ולאחריו מבחן Dunn עם תיקון Holm. סף המובהקות נקבע ל- p < 0.05. הנתונים הוצגו כאחוז ממוצע של יתושים שנמשכו לארוחת הדם, כאשר האזור המוצל מייצג את השגיאה התקנית. הגנוטיפים של הביקורת Gr3-QF2 ו QUAS-CsChrimson הראו גודש דומה של 26% ו-29%, בהתאמה, שדורג ידנית כפי שתואר (איור 4G, p = 0.351). לעומת זאת, Gr3>CsChrimson היתעשויות של היתושים היו גבוהות באופן מובהק מאשר בשתי קבוצות הביקורת, עם שיעור ממוצע של 61% (איור 4G, p < 0.01 לעומת Gr3-QF2 ו- p = 0.02 לעומת QUAS-CsChrimson). הנתונים הוצגו באמצעות תרשימי כינור (violin plots) ותרשימי קופסה (חציון, טווח בין-רבעוני וטווח) ונותחו באמצעות מבחן Kruskal-Wallis ומבחן Dunn עם תיקון Holm, תחת סף מובהקות של p < 0.05. תוצאות אלו מעידות כי בדיקת המזין בעלת ממבנה אופטו-ממברנלי (opto-membrane feeder assay) היא אמצעי בר-קיימא להערכת ההשפעות של הפעלה אופטוגנטית של CO2 נוירונים המעורבים במשיכת יתושים ובמילוי קיבתו של היתוש בארוחה של דם.

תרשים בדיקת התנהגות יתושים; שיטות: opto-thermocycler, שמיכת דם; גירויים: חום, CO2.
איור 1בדיקות וגידול לאופטוגנטיקה ביתושים. (A(תרשים של התנהגויות חיפוש מאכסן של יתושים, עם מאפייני בדיקות ההתנהגות המוצגות. שלבי חיפוש המאכסן שנמדדו בכל בדיקת התנהגות מסומנים בפסים אפורים. (Bלוח זמנים של גידול יתושונים עבור ניסויי אופטוגנטיקה. איור 1 נוצר על ידי המחברים עבור פרסום זה באמצעות Adobe Illustrator, ואינו דורש רישיון לשימוש בו. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של איור זה.

התנהגות יתושים, תרמוסייקלר אינפרה-אדום, מערך תאורת LED-אדום, ניתוח גרפים, תגובה לגירוי.
איור 2ה-opto-thermocycler מכמת התנהגויות של עוררות וחיפוש במהלך הפעלה אופטוגנטית. (A) תרשים של בדיעת אופטו-תרמוסייקלר (opto-thermocycler), המורכבת מלוחית עם יתושים על גבי הבלוק של מכשיר PCR thermocycler עם נורות LED ומצלמה מעליהם. (Bסכימה של המעגל עבור המיקרו-בקר הגילוי של טמפרטורת התרמוסייקלר והבקר של נורות ה-LED. סכימת המעגל נוצרה באמצעות Fritzing תחת רישיונ CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). רישיונ זה מאפשר גם שימוש חוזר מלא בתמונה, בתנאי שיינתן קרדיט מתאים.Cתמונה סטטית מהבדיקה המציגה את לוח האקרילי המחזיק עד 14 יתושים. התרמוקפל נמצא בבאר השמאלית התחתונה.ד'שלד היתוש ששימש במודל SLEAP להערכת תנוחות. הנקודות המסומנות על הגוף כוללות: קצה ובסיס החרטום, המשמשים לזיהוי התנהגות דיגוס (מסומן באדום); הרגליים הקדמיות, בנקודת חיבורן לטורקס (חזה), בנקודת החיבור של הפמור (ירך) לטיביה (שוק), ובנקודת החיבור של הטיביה לטרסוס (כף רגל) (מסומן בכחול); וקצה הבטן (מסומן בצהוב). נעשה שימוש במודל רב-בעלי חיים במבט מלמעלה. מעריכי תנוחה ומסווגי התנהגות שימשו לכימות רמת העירור והתנהגות הדיגוס של היתושים.הדוגמאות של יתושים בהליכה, תעופה ודיגום (probing), עם תחזיות SLEAP המוטלות מעליהן. הליכה ותעופה משמשות כמדדים התנהגותיים לעוררות.ז׳פלט של הגשת הגירויים. קווים גליים צהובים מציינים גירויי חום של טמפרטורת הגוף, ונורות LED אדומות מציינות גירויי אור אדום.G) אתוגרמות של התנהגות הליכה, תעופה וחיפוש באמצעות מגע (probing) על ידי Gr3-QF2, QUAS-CsChrimsonו- Gr3>CsChrimson יתושים (n = 2–23 יתושים בודדים לכל גנוטיפ) לאחר מתן הגירוי. (ה׳התנהגות ממושכת לאחר הפעלה אופטוגנטית ב- Gr3>CsChrimson יתושים (n = 68–70 יתושים בודדים). לוחות איור A–E נוצרו על ידי המחברים עבור פרסום זה באמצעות Adobe Illustrator, ואינם דורשים רישיון זכויות יוצרים לשימוש. הנתונים ב-(F–H) הועתקו מ-Sorrells et al, 202, תחת רישיון CC BY 4.08. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

הגדרת ניסוי הזנת יתושים, תרשימי ניתוח נתונים, דיאגרמה של ארוחת דם מלאכותית, גרף טמפרטורה.
איור 3בדיקת שמיכת הדם (blood blanket assay) מכמתת את מידת ההצפה בעקבות הפעלה אופטוגנטית. (A) תרשים של בדיקת שמיכת הדם. היתוש מוכל בכלוב אקרילי שבו מוצג דם מלאכותי נגיש מתחת לרשת. (B) קריאת הטמפרטורה וגירוי האור האדום מהבדיקה. (C) סכימה של מכלול לוח ההזנה של כיסיית דם מאלומיניום. (Dשלד ה-SLEAP ששימש להערכת תנוחה כלל את הנקודות המתוארות באיור 2D, בנוסף לארבע נקודות לאורך דפנות הבטן במפגשן עם בית החזה וקצוות החלק העבה ביותר של הבטן. גודל הנפיחות נמדד כשטח בתוך חמש הנקודות לאורך היקף הבטן, תוך שימוש בחיזויים ממודל רב-בעלי חיים במבט מלמעלה.ה(תרשים כינור (Violin plot) המציג את אחוז ההשבעה הממוצע מארוחת דם מלאכותית עבור כל גנוטיפ (n = 10 חזרות של 14 יתושים לחזרה עבור כל גנוטיפ). המובהקות נקבעה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ולאחריו מבחן Dunn עם תיקון Holm. אותיות שונות מעידות על מובהקות של p < 0.05 בין הקבוצות, כאשר קבוצות עם אותה אות אינן שונות באופן מובהק אחת מהשנייה. (פלוטום (F)גודש לאורך זמן ב- Gr3>CsChrimson בעל חיים, כפי שנמדד על פי שטח הבטן. קו המגמה האדום מציג חלון גלישה של 30 שניות לאורך שמונה דקות של הניסוי, כאשר x = 0 מסמן את הזמן שבו מתחילה ההצפה (engorgement). כל הסכמות באיור 3 נוצרו על ידי המחברים עבור פרסום זה באמצעות Adobe Illustrator, ולא נדרש רישיון זכויות יוצרים עבור השימוש בהן. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הקמה של אופטוגנטיקה ביתושים; בקרת תאורה RGB; ארדואינו (Arduino); ארוחת דם; גרף אחוזי משיכה; תוצאות.
איור 4בדיקת הזנת ממברנה אופטית (opto-membrane feeder assay) מודדת משיכה והזנת דם. (Aסכימה של מזין האופטו-ממברנה עם הרכיבים הבודדים.B) ציר זמן של ניסיונות הניסוי. הקו הכחול מייצג אור כחול עמום לאורך תקופת ההסתגלות והניסוי. מוצג מקטע של הגירוי הניסויי, המייצג פולסים של אור אדום למשך שנייה אחת במרווחים של 10 שניות. (C) תרשים המתאר את החיווט עבור מאכיל האופטו-ממברנה. תרשים מעגלים שנוצר באמצעות Fritzing תחת רישיון CC-BY על ידי המחברים. (ד׳פריים לדוגמה מסרטון המזין האופטו-ממברנתי (opto-membrane feeder). הפיתיון של יתושים הנמצאים בתוך העיגול האדום נספר כדי לקבוע את אחוז המשיכה.המשךדוגמאות ליתוש שטרם ניזון וליתוש שבע, כאשר הראש, החזה והבטן סומנו על ידי מודל המעקב SLEAP עבור מאכיל ממברנת האופטו (opto-membrane feeder). מודל SLEAP רב-בעלי חיים בגישת bottom-up שימש למדידת המשיכה לאזור העניין שבו ממוקמת ארוחת הדם.Fגרף קווי המתאר את אחוז התפוס הממוצע באזור ארוחת הדם (המש כמד התנהגותי לנחיתה) לאורך זמן, לפי גנוטיפ (n = 10 ניסויים של 20 יתושים לכל גנוטיפ). הממוצע משרטט בכל 30 שניות. אזורים מוצלים מתארים שגיאה סטנדרטית. המובהקות נקבעה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ולאחריו מבחן Dunn עם תיקון Holm. אותיות שונות מייצגות קבוצות מובהקות; הסף הוגדר כ- p < 0.05. (ג') תרשים כינור (Violin plot) המציג את אחוז השבעה הממוצע מארוחת דם לפי גנוטיפ. ב- (F, G), המובהקות נקבעה באמצעות מבחן Kruskal-Wallis, ולאחריו מבחן Dunn עם תיקון Holm. גנוטיפים המסומנים באותה אות אינם שונים באופן מובהק זה מזה. סף המובהקות מוגדר כ- p < 0.05. איור 4 נוצר באמצעות Adobe Illustrator, הנתונים עבורו נאספו על ידי המחברים עבור פרסום זה, ולא נדרש רישוי זכויות יוצרים עבור השימוש בו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לבחינת המספיקות של סוגי תאי עצב להנעת שלבים בתהליכי המשיכה למארח והנשיכה. התנהגות הנשיכה מורכבת מסדרה של שלבים התנהגותיים, החל מזיהוי לטווח רחוק, דרך משיכה לטווח קצר, חדירה לעור ועד להשבעה. באופן עקרוני, סוגי תאי עצב עשויים לשלוט בפעולות או בשלבים ספציפיים, להטות את ההתנהגות לעבר רצפים מסוימים, להגדיל את משך ההתנהגות הכוללת, או למלא תפקידים רבים אחרים. לפיכך, הבדיקות המרובות המוצגות כאן נחוצות כדי לנתח את התפקוד העצבי בתהליך זה.

מספר טעויות נפוצות עלולות להוביל לתגובות דלות של יתושים במבחנים אלו. ניתן למנוע פעילות נמוכה והזנה לקויה על ידי ביצוע הניסויים בזמני שיא הפעילות של היתושים, סמוך לזמני המעבר בין מחזורי האור והחושך בתאי הדגירה שלהם. קצבי הזנה נמוכים בכיסוי הדם (blood blanket) ובמזין האופטו-ממברנה עלולים להיגרם מארוחת דם מלאכותית באיכות נמוכה או מטמפרטורה שגויה. ודאו שכל الريאגנטים (NaHCO3, ATP, דם כבשים ללא פיברינוגן) אינם פגי תוקף ומאוחסנים כראוי. מומלץ להכין את כל התמיסות ביום הניסוי כדי להבטיח רעננות מרבית. ודאו שפלטת כיסוי הדם באה במגע ישיר עם פני השטח של בלוק ה-PCR thermocycler. על פלטות ה-opto-thermocycler וכיסוי הדם עלולה להיווצר קונדנסציה אם קיימת לחות שיורית. לפני הניסויים, הניחו את הפלטות על נייר סופג כדי לספוג לחות כלשהי. במקרה של תגובה אופטוגנטית דלה, ודאו שהיתושים בני לפחות שבוע אחד ומקבלים זמן מספיק להזנה ב-ATR, שכן זהו קו-פקטור כימי הכרחי עבור תעלות ה-CsChrimson.

פותחו כלים אופטוגנטיים הרגישים לאורכי גל שנעים בין כחול (~450 ננומטר) לאדום (~650 ננומטר), ובכך הם מקיפים את הספקטרום הנראה. אור אדום שימושי במיוחד בחרקים, שכן בדרך כלל יש להם רגישות נמוכה ו/או תגובות התנהגותיות מועטות לאורכי גל אלה.40מעניין לציין כי במהלך התעופה, יתושים מגלים משיכה לאזורים של גירויים ויזואליים בעלי אורכי גל ארוכים המצויים בגווני העור האנושי.41לפיכך, שימוש באור אדום עלול להוות מגבלה המערפלת את פרשנות ההפעלה האופטוגנטית בניסויי משיכה של יתושים למארח. עם זאת, גישה גנטית ביקורת היתושים הראו תגובות מינימליות לאור אדום שהופעל באופן רחב, אפילו בעצמות גבוהות (איורים 2–4). מומלץ להשתמש בביקורות גנטיות החסרות את קונסטרוקט המפעיל (driver) או את קונסטרוקט האפקטור (effector), ובביקורות ללא חשיפה לאור, כדי להבטיח כי ההשפעות ההתנהגותיות יפורשו באופן מדויק. בניסויי אופטוגנטיקה במינים אחרים נעשה שימוש נפוץ בביקורת החסרה את ה-ATR, הקופקטור של הרודופסין; עם זאת, מזון הדגים המשמש להזנת זחלי יתושים מכיל ויטמין A, שהוא הקדמון של ATR, ולכן ביקורת זו פחות יעילה במערכת זו.

הגירויים האופטוגנטיים המוצגים כאן מוגבלים לגירויים רציפים בעוצמת אור ניתנת לכיוונון. גירויים אופטוגנטיים המשחזרים באופן מדויק דפוסי פעילות עצבית טבעיים הם בעלי הסבירות הגבוהה ביותר לעורר את ההתנהגות הנחקרת. לכן, אם זמינותן של הקלטות עצביות קיימת, ניתן לתכנן את הגירוי כך שיתאים לעוצמה ולדינמיקה הזמנית שנצפו. כאשר נתונים אלה אינם ידועים, ניתן לבחון את תפקוד הנוירונים באמצעות גירויים והקשרי התנהגותיים שונים, תחת הסייג שייתכן והתוצאות לא ישקפו את תפקוד הנוירונים בהתנהגות טבעית. עם זאת, עירור פעילות של נוירונים מחוץ לטווח הטבעי יכול לשמש לבחינת מעגלים או תכונות התנהגותיות בדרכים ייחודיות, בדיוק כפי שאלקטרופיזיולוגיה יכולה לשמש לבחינת תכונות תאיות. נכון לעת זו, כלים אופטוגנטיים שימשו רק בנוירונים תחושתיים ביתוש, יישום המספק מספר יתרונות על פני מתן גירויים טבעיים. אסטרטגיות מסורתיות למדידת חיפוש מאכיל על ידי יתושים מסתמכות על מתן גז CO2 ממשי. שימוש ב-CO2 ממשי דורש זרימת אוויר שעברה סינון והלחלה, דבר הדורש מערכי ניסוי מורכבים כדי שניתן יהיה לספק ולהסיר אותו במדויק בפרקי זמן קצרים9,10,42,43. זרימת אוויר ולחות הן שתיהן רמזים למשיכה וניווט של יתושים, מה שהופך את הגירוי האופטוגנטי לשיטה אטרקטיבית לחקר השפעות של גירויים ריחוניים בנפרד מגירויים אחרים אלו. כלים אופטוגנטיים שימשו בעבר גם לחקר השפעת המין והמצב הפיזיולוגי על התנהגות8, ובכך סיפקו תובנות לגבי שאלות חשובות אלו בביולוגיה של היתוש.

מלבד אופטוגנטיקה, פרוטוקולים אלו עושים שימוש במבחנים סטנדרטיים ששימשו להערכת התנהגות יתושים והם כרוכים במגבלות מסוימות. לצורך קלות הניקוי, "שמיכת הדם" (blood blanket) משתמשת בארוחה מלאכותית המכילה רק את חומרי הטעם הדרושים ליתושים כדי להגדיל את בטנם בדם (engorge). ניתן להתגבר על מגבלה זו באמצעות שימוש בדם (כפי שנעשה במזין האופטו-ממברנה) או בחומרים ביו-מימטיים המשחזרים היבטים של רקמת המארח. חום באופטו-תרמוסייקלר ובשמיכת הדם מועבר ליתושים שהם בהליכה או בעמידה ולא ליתושים במעוף, והוא מוגבל על ידי מהירות העלייה (ramp speed) של תרמוסייקלר ה-PCR. לפיכך, מבחנים אלו מסוגלים לזהות התנהגות של דיגום (probing) והזנה, אך לא התנהגות של משיכה. מגבלה נוספת של מבחנים מבוססי מעבדה היא שכדי להבין את ההשפעה ההתנהגותית של רמזים ספציפיים, רמזים אחרים שבהם משתמשים היתושים מושמטים. ניתן ליצור מבחני מעבדה ומבחני שמי-שדה מורכבים יותר כדי לחקור היבטים נוספים של הסביבות הטבעיות שבהן יתושים ניזונים ממארחיהם.

מגבלה נוספת של אופטוגנטיקה ביתוש היא שנוצרו מעט קווי דרייבר (driver lines) מעבר לאלו של נוירונים תחושתיים. לפיכך, הפוטנציאל המלא שלה ימומש כאשר היא תשולב עם דרייברים המבוטאים בנוירונים מקשרים (interneurons) שאינם ניתנים לגירוי ישיר בגישות אחרות. משאבים חדשים המופיעים כעת, כגון ה-Mosquito Cell Atlas של Aedes aegypti, פותחים את הדלת ל התקדמויות בנוירוגנטיקה של יתושים44. עבודה עתידית תהיה נחוצה כדי לפתח דרייברים כאלו לצורך בדיקת מעגלים עצביים של יתושים. באופן דומה, נדרשים כלים אופטוגנטיים נוספים לעיכוב (inhibition) כדי לקבוע אם סוג נוירון מסוים הכרחי להתנהגות ספציפית. למרות שהבדיקות המוצגות במאמר זה נועדו למדוד משיכה למארח והזנת דם, ניתן להרחיב גישות אלו כדי לחקור שלבים נוספים של חיפוש מארח והתנהגויות כגון הזדווגות, הטלת ביצים והזנת צוף. מחקרים אופטוגנטיים יספקו תובנות חדשות לגבי האופן שבו התנהגות היתוש נשלטת ברמת המעגל העצבי ועשויים להוביל לגישות חדשות למניעת התפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים ל-Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini ו-Yaoyu Jiao על הערותיהם למסמך. מחקר זה מומן על ידי מענק NIH מספר DP2AI177891. אנו מודים ל-Neurotechnology Core, הממומן על ידי מכון Yale Kavli למדעי העצבים, על הייעוץ הטכני. T.S. הוא מלומד במסגרת תוכנית HHMI Freeman Hrabowski.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1⁄אקריליק שחור 8 אינץ'McMaster-Carr8650K32מבנה הזנה של ממברנה אופטית
1⁄אקריליק שקוף בגודל 8 אינץ'McMaster-Carr8536K134מכל הזנה עם ממברנה אופטית
¼ אקריליק שחור אינץ׳McMaster-Carr8560K259מבנה מאכיל אופטו-ממברנתי
ספק כוח (AC Adapter)Jameco ReliaPro2197581מבנה הזנה של ממברנה אופטית
דבק אקריליUnited States Plastic Corp 97562מכל הזנה עם ממברנה אופטית, כלוב שמיכת דם
אדנוזין 5′מלח נתרן דו-טריפוספט הידרטSigma AldrichA6419-1Gארוחת דם מלאכותית
טרנס-רטינלי מלאSpectrum ChemicalR3041-1GMגידול אופטוגנטי
לוח בסיס אלומיניום (Aluminum Breadboard)ThorlabsMB12מבנה הזנה של ממברנה אופטית
לוח אלומיניום 0.03125 inMcMaster-Carr89015K11צלחת הזנה עם שכבת דם
לוח אלומיניום 0.0625 אינץ'McMaster-Carr89015K37צלחת הזנה עם שכבת דם (Blood blanket feeding plate)
מעקב אחר חלקי בעלי חיים (APT)מעבדת Branson ב-HHMI Janelia Farmלא רלוונטיגרסה 3.0, נתוני שחזור של Opto-thermocycler (איור 2), הורד ב-9 ביולי 2020
Arduino IDEArduinoלא רלוונטיגרסה 1.8.12, המשמשת לבקרת גירויים עבור termocycler אופטוגנטי, שמיכת חימום לדם, &מזין ממברנה אופטו-מגנטי (opto-membrane feeder)
לוח בקר זעיר Arduino Uno Rev3ArduinoA000066 תכנות של מאכיל ממברנה אופטו-מכנית
רשת חלון מפיברגלס שחורהמוצרי פרימיום פורצי דרך IHLRS3684BLכלוב שמיכת דם
סרט הדבקה שחורThorlabsT137-2.0אופטו-תרמוסייקלר
אזיקי פלסטיק שחורים אזירי כבלים ואביזרים נוספיםct242מבנה מזין אופטו-ממברנלי
וילון הסתרה (Blackout Drape)חנות הציוד6520SFאופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
נורות LED כחולות21LEDUSARB5730BLWPגידול יתושים
בקבוקבקבוק SKS &אריזה0604-07מחמם דם למזין ממברנה אופטי
כופתיות לדגים ניזוני קרקעיתממשק תכנות יישומים (API)5352983האכלת זחלים
מצלמהזבוב שחורU3-13S2M-CS, FLIהקלטת וידאו עבור בדיקות (assays)
מונה לחיצותULineH-7350דילול זחלים
מחשבAsus X1407Qביצוע בדיקות (Assays)
אקונומיקה מרוכזת (8.25% נתרן היפוכ לוריט)VWR89501-620ניקוי מאכיל אופטו-ממברנה
CoolTermהתוכנות החינמיות של Roger Meierלא רלוונטיגרסה 2.0.1, המשמשת להקלטה של יציאת טורית עבור אופטו-תרמוסייקלר, שמיכת דם, &מזין קרום-אופטי (opto-membrane feeder) ו-amp
דם כבשים ללא פיברינוגן מעבדות Hemostat DSB100ארוחת דם עבור מאכיל ממברנה אופטי (opto-membrane feeder)
בורג אלן (hex) 4-40 עם ראש כיפהMcMaster-Carr92949A105צלחת הזנה עם כיסוי דם
אפוקסיLoctite1363118לוח אקרילי למחזור תרמי אופטי, מבנה מזין לממברנה אופטית
אתנולDecon Labs2716חיטוי
כונן קשיח חיצוניLaCieLAC9000298אחסון וידאו
ffmpegFFmpegלא רלוונטיגרסה 8.0.1, עיבוד מקדים של וידאו
פתיל כותנה באורך ארבעה אינץ'Richmond Dental201226האכלת יתושים בוגרים
GitHubGitHub, Incלא רלוונטיRepositories for code, part files, and SLEAP models for opto-thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), blood blanket (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0), and opto-membrane feeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
דרגה 3>CsChrimsonלא רלוונטילא רלוונטינוצר עבור מחקר זה, כפי שמתואר בשלב 1.2
יתושי Gr3-QF2לא רלוונטילא רלוונטיריאגנט גנטי, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
אינקובטור עם דלת אטומהקרון7340-25גידול יתושים
נורית LED לאור אינפרא-אדוםAdafruit387אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
פס אינפרא-אדום של נוריות LEDתאורת גלי-צורה7031.85אופטו-תרמוסייקלר, שמיכת דם ומבנה אופטו-ממברנה
מסנן מעביר אינפרא-אדוםEdmund Optics65-796הקלטת וידאו עבור בדיקות (assays) 
כלוב חרקיםBugdormDP1000כלוב ליתושים בוגרים
מערכת ג'אנליה לסימון אוטומטי של התנהגות בעלי חיים (JAABA)מעבדת Branson ב-HHMI Janelia Farmלא רלוונטינתונים ששוחזרו באמצעות אופטו-תרמוסייקלר (איור 2); גרסה 0.5.0
כוס מרק גדולהWebstaurantStore50016SOUPPLAגידול יתושים
גוף קירור ל-LEDLuxeon StarN25-15Bאופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
עדשת LEDLuxeon Star10209אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
תושבת עדשה ל-LEDLuxeon Star10235אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
סרט עדשה ל-LEDLuxeon StarLT-01אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
תאורת LEDLuxeon StarSP-01-D9גירוי באור אדום עבור Opto-thermocycler ושמיכת דם
סרט תרמי ל-LEDLuxeon StarLXT-S-12אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
מסילות בנייה אופטיותThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12מבנה הטרמו-ציקלר האופטי ושמיכת דם
עמוד אופטי ThorlabsTR12מבנה מזין של ממברנה אופטית
נייר סופגPacific Blue27385ניקוי מיכל איסוף
ParafilmAmcorPM-996קרומי שמיכת דם, מיכל מזון עם קרומי-אופטיקה
תרמוסייקלר ל-PCREppendorf2231001196אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
כוס מנה מפלסטיקבחירה999P2Cהאכלת יתושים בוגרים
מכסה לכוס מנת פלסטיקבחירה999PL2האכלת פשיטות (יתושים) בוגרים
תבנית פוליקרבונטCambro21410CWCHCLגידול זחלים 
תבנית פוליקרבונט בחצי גודלCambro24CW135 ניקוי רשתות אופטו-ממברנה (Opto-membrane)
מכסה לתבנית פוליקרבונט בחצי גודלCambro20CWCH135 ניקוי קרומי אופטו-ממברנה
מכסה למגש פוליקרבונטCambro10CWCH135גידול זחלים
מבחנה מפוליקרבונטMcMaster-Carr8585K56מיכל הזנה עם ממברנה אופטית 
מד מדספק (Power Meter)קוהרנטי1299161כל הבדיקות
יתושי QUAS-CsChrimsonלא רלוונטילא רלוונטיריאגנט גנטי, DOI: 10.7554/eLife.76663
נורות RGBDigikey 289-1189-NDהגשת גירוי באמצעות מאכיל עם ממברנה אופטית
מהבץ זווית ישרהThorlabsRA90מבנה הזנה של ממברנה אופטית
סרט דביק Scotch Magic Tape3M104אופטו-תרמוסייקלר ומכסה אקרילי לשמיכת דם
אטם סיליקון, 0.5 מ"מMcMaster-Carr1460N22פלטת הזנה של שמיכת דם
SLEAPמעבדת טלמולא רלוונטיגרסה 1.4.1a2, מעקב תנוחות (pose tracking) של יתושים בכל אחת מהבדיקות
נתרן ביקרבונט, תמיסת בופר 1M, pH 8.0Thermo ScientificJ62495.APארוחת דם מלאכותית
תמיסת נתרן כלורידSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552ארוחת דם מלאכותית
SpinViewTeledyne Vision Solutionsלא רלוונטיגרסה 1.27.0.48, תוכנה להקלטת וידאו עבור כל שלושת המבחנים
בקבוק ספרייUlineS-11686חיטוי
סוכרוזSigma AldrichS0389-500Gהאכלת יתושים בוגרים
צמד תרמי (סוג T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-Nאופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
מגבר תרמוזוג (Thermocouple amplifier)AdafruitMAX31856אופטו-תרמוסייקלר ושמיכת חימום לדם
טיימרEnduraLightRAC-MTבקרת מחזור התאורה לגידול יתושים
פיפטת העברה Thermo ScientificSAM-225דילול זחלים
שקית אשפהUlineS-23040הובלת חרקים
רשת עמידה לקרינת UVMcMaster-Carr 87655K13מיכל הזנה בעל ממברנה אופטית
מיםSigma AldrichW4502-1Lארוחת דם מלאכותית עבור שמיכת דם
חוט מושעווהMcMaster-Carr6356K91מכסה למכל עם ממברנה אופטית
רשת תילMcMaster-Carr9322T65מבנה הזנה של ממברנה אופטית

מקורות

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

התנהגות יתושיםמעגלים עצבייםהפעלה אופטוגנטיתבדיקות התנהגותיותחיפוש מאכילהזנת דםראייה ממוחשבתגירויים חושיים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.