אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

Summary

פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.

Abstract

מחקרי קונטום הרחיבו מאוד את ההבנה של קישוריות סינפטית במערכות העצבים של מינים שונים. בעוד שאפיון שותפים סינפטיים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) מספק מידע אנטומי מפורט, היבטים תפקודיים של רשתות נוירונים דורשים גישות משלימות. מחקרים עדכניים בדרוזופילה חשפו לא רק את הקונקטום המלא של הזחל, וכן את מערכת העצבים המרכזית הבוגרת של זכר ונקבה, אלא גם את המרכיבים התאיים של רשתות עצביות המווסתות התנהגויות מסוימות, כגון רשת הנוציספטיבית של הזחל. בשלב הזחל השלישי, נוירונים סנסוריים מולטידנדריטיים מסוג 4 (cIVda) יוצרים את רוב המגעים הסינפטיים עם נוירוני ה-Basin-4. כדי להעריך את הרלוונטיות הפונקציונלית של קשרים אנטומיים אלו, שימש אינדיקטור סידן מקודד גנטית CaMPARI (אינטגרטור Calcium Modulated Photoactivateable Ratiometric Integrator) בזחלים חיים בשלב שלישי שלא נתקעו כמדווח תלויי פעילות להערכת קישוריות סינפטית בין נוירוני cIVda לבין נוירוני בין-נוירוני Basin-4. CaMPARI הוא אינדיקטור פלואורסצנטי ביחס שספקטרום הפליטה שלו משתנה בתגובה לרמות סידן תוך-תאי גבוהות. בתנאים בסיסיים, CaMPARI מפואר ירוק; בנוכחות ריכוזי סידן גבוהים ובחשיפה לאור פוטקונברסציה (~400 ננומטר), הוא עובר באופן בלתי הפיך לפלואורסצנציה אדומה. מכיוון שזרם סידן לנוירונים פוסט-סינפטיים הוא סימן היכר של הפעלה סינפטית, פוטקונברנסמציה של CaMPARI מספקת קריאה של איתות סינפטי פונקציונלי. מוצגת שיטה שלב אחר שלב לקיבוע זחלים בשלב שלישי על סלייד מיקרוסקופ להפעלה אופטוגנטית של נוציצפטורים cIVda באמצעות CsChrimson עם ערוץ אדום-מוסח, בשילוב עם פוטוקונברציה סימולטנית של CaMPARI בנוירוני Basin-4. פוטקונברנסציה תלויה בסידן בנוירוני Basin-4, למרות תנועות פנימיות ושינויים במישור המוקד, מספקת ראיות פונקציונליות לקישוריות סינפטית בין תאים אלה. זה משמש כהוכחה לשימוש ב-CaMPARI בשילוב עם גירוי אופטוגנטי פרה-סינפטי בזחלי דרוזופילה שלמים ולא מפורקים.

Introduction

זיהוי שותפים סינפטיים מדויקים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מאפשר מעקב אחר היווצרות ושיפור הקשרים הסינפטיים במהלך התפתחות מערכת העצבים. בהתאם לכך, המאמצים התרכזו בשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים וולומטרי (EM) לשחזור לא רק קונטומים שלמים באורגניזמים גנטיים רבי עוצמה כמו Caenorhabditis elegans ^1,2 ו-Drosophila melanogaster ^3,4,5, אלא גם נפחי EM בקנה מידה מילימטרי של מוחות יונקים מורכבים, כולל קליפת הראייה הראשונית^של העכבר 6 והקורטקס הטמפורלי^{האנושי 7}. מחקרים אלו מספקים תובנות ייחודיות לעקרונות הארגוניים העומדים בבסיס הקישוריות הסינפטית ברמה האנטומית. עם זאת, אפיון פונקציונלי של שותפים סינפטיים מספק תובנה משלימה לקישוריות נוירונית ונדרש לאימות ממצאים אנטומיים.

דרוזופילה מציעה יתרונות רבים לחקר הקישוריות הנוירונלית, כולל זמינות קונטומים שלמים למערכת העצבים המרכזית של הזחל³ וכן למערכת העצבים המרכזית של הנקבה⁴ והזכר⁵, בנוסף למעגלים עצביים מאופיינים היטב המווסתים התנהגויות צפויות ^8,9,10. רשת הנוציספטיבית של הזחלים מייצגת אחד מהמעגלים המתאימים לחקר קישוריות סינפטית מדויקת¹¹. שחזור EM של רשת זו חשף שותפויות סינפטיות מפורטות הנדרשות לעיבוד גירויים נוציספטיביים, מה שהוביל להתנהגות בריחה אופיינית הידועה כגלגול נוציפנסיבי^12,13.

בתוך רשת זו, נוירוני ארבוריזציה דנדריטית מסוג IV (cIVda)¹⁴ פועלים כנוציצפטורים חושיים ראשוניים האחראים לזיהוי כאב 11,12,13,15,16. גופי התאים והדנדריטים שלהם ממוקמים בשולי דופן הגוף, בעוד שהאקסונים שלהם בולטים אל תוך חוט העצבים הגחוני של הזחל (VNC)¹⁵. בתוך מערכת העצבים המרכזית, נוירוני cIVda מעצבים את הטרמינלים האקסונליים שלהם בדפוס סטריאוטיפי ומרכיבים את רוב המגעים הסינפטיים שלהם עם נוירוני בין-נוירוני Basin-4 11,12,13,17. הקשר הסינפטי המוגדר הזה קובע את נוירוני cIVda ונוירוני בין-נוירוני Basin-4 כזוג אידיאלי להערכה פונקציונלית של קישוריות סינפטית ב-vivo. פיתוח שיטות לניתוח קשרים פונקציונליים בין שותפים סינפטיים שזוהו באופן אישי יקל על חקירת המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות ושיפור הסינפטי, במיוחד במערכות גנטית ניתנות לטיפול עם מעגלים עצביים סטריאוטיפיים.

CaMPARI (אינטגרטור סידן מודוליט פוטואקטיבביל ליחס מטרי)¹⁸ הוא אינדיקטור פלואורסצנטי מקודד גנטית, שספקטרום הפליטה שלו משתנה בתגובה לרמות סידן תוך-תאי גבוהות. בתנאים בסיסיים, CaMPARI מפואר ירוק; בנוכחות ריכוזי סידן גבוהים ובחשיפה לאור פוטוקונברציה (~400 ננומטר (ננומטר)), הוא ממיר באופן בלתי הפיך לפלואורסצנציה אדומה¹⁸. מכיוון שזרם סידן לנוירונים פוסט-סינפטיים הוא סימן היכר של הפעלה סינפטית, CaMPARI Photoconversion מספקת קריאה של איתות סינפטי פונקציונלי^19,20.

בנוסף ל-CaMPARI, ניתן להמחיש פעילות נוירונית באמצעות חיישנים הפיכים כגון מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) כולל GCaMP או RCAMP²¹, וכן מדדי מתח מקודדים גנטית (GEVIs⁾²² כגון Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ או VARNAM²⁵. בעוד שהחיישנים המהירים וההפיכים הללו מתאימים היטב למעקב אחר פעילות חולפת בזמן אמת, הם רגישים לתופעות תנועה במהלך הדמיה בתוך החיים . לעומת זאת, תכונות הפוטקונברציה האינטגרטיביות והבלתי הפיכות של CaMPARI מאפשרות ללכוד פעילות לאורך חלון זמן מוגדר, ומאפשרות זיהוי הפעלה נוירונית גם כאשר מישורי המוקד משתנים במהלך הדמיה²⁰. בנוסף, ניתן לכוונן את פוטוקונברסיית CaMPARI על ידי התאמת עוצמת האור הסגול, מה שמאפשר זיהוי של ירידה בעוצמת הסינפטית או קלטים תת-סף²⁶. תכונות אלו אפשרו מיפוי פעילות בבעלי חיים נעים בחופשיות ללא קיבוע ראש או קשירה, כולל מחקרים על קליפת עכבר²⁷, מוח דג זברה²⁸, C. elegans²⁹, ודרוזופילה^{בוגר 20}.

מתואר פרוטוקול להמחשת שותפים סינפטיים פונקציונליים באמצעות פוטקונברסציה של CaMPARI בשילוב עם גירוי אופטוגנטי פרה-סינפטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בזחלי דרוזופילה שלמים ולא מנותחים. בגישה זו, CaMPARI משמש לזיהוי זרם סידן פוסט-סינפטי באינטרנוירונים של Basin-4 לאחר הפעלה אופטוגנטית של נוירוני cIVda בזחלים חיים בשלב שלישי. נוירוני cIVda מבטאים את ערוץ ה-CsChrimson^30,31 המופעל באור אדום, בעוד שנוירוני ה-Basin-4 מבטאים את CaMPARI. חשיפה לאור אדום מפעילה באופן סלקטיבי קולטני נוציספטורים, ומחקה גירוי נוציספטיבי באופן מבוקר זמן^16,30. אסטרטגיה זו מאפשרת להעריך האם הפעלה פרה-סינפטית גורמת להמרת פוטוקנספורמציה של CaMPARI תלויה בסידן בנוירונים פוסט-סינפטיים, ובכך מספקת ראיות פונקציונליות לקישוריות סינפטית.

מספר יתרונות טכניים תומכים בשימוש ב-CaMPARI בשילוב עם CsChrimson לניתוח קישוריות cIVda–Basin-4. ראשית, דנדריטים מסוג cIVda יוצרים ריצוף מלא, לא חופף, של דופן הגוף של הזחל³², ומאפשר הפעלה אופטוגנטית של נוירונים חושיים שלמים ללא השפעות מבלבלות מנזק שנגרם על ידי ניתוח¹⁶. שנית, למרות שהזחלים מוחזקים פיזית על סלייד מיקרוסקופ, תנועות פנימיות משנות לעיתים קרובות את מיקום מערכת העצבים המרכזית ומישור המוקד במהלך ההדמיה; פוטוקונברציה של CaMPARI פחות רגישה לתופעות תנועה כאלה ומספקת קריאה יציבה ומשולבת בזמן של פעילות נוירונים. שלישית, התכונות האינטגרטיביות והניתנות לכיוון של CaMPARI מאפשרות זיהוי פעילות סינפטית גם כאשר עוצמת הסינפטית או מספר המגע שלה מופחת, כמו בשלבים מוקדמים של התפתחות, ובכך תומכות במחקרים עתידיים של היווצרות ושיפור הסינפסות.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים שעסקו בדרוזופילה מלנוגסטר בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. הגנוטיפ w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (שהושג משילוב מחדש של RRID:BDSC_54899¹² ו-RRID:BDSC_32079¹⁶) שימש לקידום ביטוי אופטוגנטי ו-CaMPARI (באמצעות הקו w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo התקבל משילוב מחדש של RRID:BDSC_81085 עם סמנים כרומוזומיים שני) בשותפים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, בהתאמה. כלי המחקר המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת הזחלים

1. הקמת הכלאות גנטיות בין נקבות בתוליות UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) וזכרים מקו זבוב הכולל שתי מערכות בינאריות, לדוגמה, כאשר הנוירון הפרה-סינפטי הנדון מניע את ביטוי GAL4 והנוירון הפוסט-סינפטי המעניין מניע את LexA^33,34.
2. קבעו הכלאות גנטיות בבקבוקי פלסטיק המכילים מדיום אגר סטנדרטי של קמח תירס 35,36,37,38 עם תוספת של 0.5 מ"מ רטינל טרנס (ATR) להפעלת CsChrimson ^30,33. הכינו בקבוקים מקבילים ללא ATR כבקרות ללא ATR.
   הערה: המיס את מדיום אגר קמח התירס בלי להרתיח אותו. תן לו להתקרר בלי להתקשות. הכינו תמיסת ATR בנפח 40 מ"מ (אבקת ATR מדוללת ב-95% אתנול לפי הוראות היצרן), ואז מדללים ל-0.5 מ"מ במדיום וערבבו היטב.
3. כסה את הבקבוקים לחלוטין בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
   הערה: לשמור על תנאי קיום בחושך מתמיד בשל האופי הרגיש לאור של ATR ולמנוע הפעלה לא מכוונת של נוירונים. למרות ש-CsChrimson רגיש ביותר לאור אדום (590–680 ננומטר), הוא יכול להיות מופעל גם על ידי אורכי גל נראים אחרים ^31,39.
4. דגרו בקבוקונים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס והעלו את הזחלים לשלב שלב שלישי.

2. קיבוע זחלים

1. אסוף זחל בשלב שלישי באמצעות מכחול. שטפו את הזחלים בצלחת מיקרו-נקודות בת שלוש בארות המכילה 0.1 מיליון PBS כדי להסיר את המזון.
   הערה: אל תסיר עודפי PBS; זה עוזר לשמור על הידרציה.
2. הנח כמות קטנה של חימר מודלינג בכל פינה של כיסוי נקי (18 × 18 מ"מ). מניחים את הזחל בטיפה של PBS על הכיסוי ותנו לו להתמקם בצד הגחוני כלפי מטה.
   הערה: להדמיה של חוט העצב הגחוני (VNC), התקן את הזחל בצדו הגבי כך שהמשטח הגחוני ייגע בכיסוי הכיסוי. כיוון זה מאפשר לנוירונים הפנימיים של Basin-4 ב-VNC לפנות אל המטרה דרך ה-coverslip.
3. הנח סלייד מיקרוסקופ נקי מעל הכיסוי המכיל את הזחל.
4. אבטח את הכיסוי על ידי מריחת חימר מודלינג נוסף על הפינות. הפעיל לחץ מספק כדי ליתק את הזחל תוך הימנעות מקרע של הזחל או החלקת כיסוי.

3. גירוי, המרת פוטו וזרימת עבודה של דימות

1. רכוש ערימת Z בסיסית של נוירונים פוסט-סינפטיים המבטאים CaMPARI באמצעות ערוצים ירוקים (488 ננומטר, 0.8% עוצמת לייזר) ואדומים (~561 ננומטר, 0.8% עוצמת לייזר) בו-זמנית. השתמש ב-Z-step של 1 מיקרון, רזולוציה של 256 × 256 פיקסלים, ממוצע קו של 2, סריקה דו-כיוונית ומהירות סריקה של 9 במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרת 40×/1.2. בצע את כל ההדמיות בסביבה חשוכה. לשמור על פרמטרים זהים של ערימת z לאורך כל הניסוי.
   הערה: צפו לגופים של תאים ירוקים בוהקים במיקומים סטריאוטיפיים ב-VNC של הזחל וללא פלואורסצנציה אדומה שניתן לזהות בתחילת הדרך.
2. גירוי הזחל ברציפות במשך 30 שניות באמצעות אור פוטוקונברסציה סימולטני (405 ננומטר, 0.5% כוח לייזר) ואור גירוי אופטוגנטי (594 ננומטר, 0.8% עוצמת לייזר).
3. רכוש ערימת z לאחר גירוי באמצעות אותם פרמטרים כמו בשלב 3.1 תחת ערוצי אדום (~561 ננומטר) וירוק (488 ננומטר). צפו לגופי תאים של VNC במיקומים דומים לאלו שבקו הבסיס. זיהוי פלואורסצנציה אדומה של CaMPARI בנוירונים שהופעלו במהלך גירוי בזחלים המוזנים על ידי ATR, עם פוטוקונברסציה מינימלית בבקרות ללא ATR.
   הערה: זרימת העבודה והפרמטרים מסוכמים באיור 1.

איור 1: זרימת עבודה לגירוי, המרת פוטו (PC) והדמיה. שלושה שלבי הדמיה עוקבים שימשו להערכת פעילות הסידן בנוירוני אגן-4. במהלך שלב הבסיס, נרכשו מחסניות z באמצעות לייזרים 488 ננומטר ו-561 ננומטר כדי ללכוד פלואורסצנציה ירוקה ואדומה של CaMPARI לפני הגירוי. במהלך שלב הגירוי, נוירוני cIVda הופעלו אופטוגנטית באמצעות CsChrimson (594 ננומטר) בעוד שהארה של 405 ננומטר סימולטנית הפיכה את CaMPARI הפעיל מהפלואורסצנציה הירוקה לאדומה; לא בוצעה הדמיה במהלך תקופה של 30 שניות זו. במהלך שלב הפוסט-גירוי, מחסניות z נרכשו מחדש באמצעות אותן הגדרות לייזר כמו בבסיס כדי לזהות אות אדום פוטוקונמר בגופי תאים של אגן-4. כל ערימות ה-z נרכשו ב-256 × 256 פיקסלים עם צעדי Z של 1 מיקרומטר, ממוצע קו של 2, וסריקה דו-כיוונית בתנאי חשוך באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרה 40×/1.2 NA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. ניתוח הדמיה

1. תמונות z-stack פתוחות בפיג'י (RRID:SCR_002285) עם Bio-Formats מופעלים. הגדר את תצוגת המחסנית ל-Hyperstack, מצב צבע לקומפוזיט, והפעל Autoscale. גלול בין מישורי Z ובחר את המישור במיקוד מיטבי. לשכפל את המישור הנבחר (תמונה → כפילות; ערוצים: 1–2; מישור Z נבחר).
2. ערוצים מפוצלים באדום וירוק (תמונה → צבע → ערוצים מפוצלים).
   הערה: כוון בהירות וניגודיות באמצעות Image → Adjust → בהירות/ניגודיות → אוטומטי לשני הערוצים.
3. הסר רקע משני הערוצים (תהליך → חיסור רקע) באמצעות רדיוס כדור מתגלגל של 50 פיקסלים.
4. הגדר מדידות (ניתוח → מדידות סט) שיכללו שטח, ערך אפור ממוצע, צפיפות משולבת (IntDen), סטיית תקן וערכי אפור מינימום ומקסימום.
5. צייר אזורי עניין (ROIs) סביב כל תא בערוץ הירוק באמצעות כלי Freehand. הוסף ROI למנהל ה-ROI ומדד. החלו את אותם תשואה על התעלה האדומה ומדדו.
6. רשמו את כל המדידות בגיליון אלקטרוני, כולל מזהי זחלים ותאים.
   הערה: בצע מדידות הן לתמונות לפני והן לפוסט-גירוי.
7. חשב יחסי פלואורסצנציה אדום-ירוק באמצעות ערכי צפיפות משולבת לקבלת (R/G)_post ו-(R/G)_pre לכל תא. ערכי רמת התא הממוצעים לכל זחל.
   הערה: צפיפות משולבת (שטח × ממוצע) מאפשרת השוואה בין תאים בגדלים שונים.
8. מחשב את Δ(R/G) _כ- (R/G)לאחר − (R/G)_pre באמצעות ממוצעי זחל. פירוש ערכי Δ(R/G) חיוביים כפעילות סידן פוסט-סינפטית מוגברת במהלך פוטקונברמציה.
   הערה: ערכי Δ(R/G) שליליים עשויים להיווצר מרעש או אסימטריה ברקע. הגדר ערכים שליליים ל-0. במאגר נתונים זה, זחל אחד הראה ערך שלילי (−0.008), שהיה מוגדר ל-0.

Results

בהתאם לפרוטוקול זה, קישוריות פונקציונלית בין נוירוני cIVda לבין נוירוני Basin-4 הוערכה בזחלים חיים ולא מפורקים של D. melanogaster בשלב שלישי באמצעות CaMPARI (איור 2). לפני כל גירוי באמצעות אור פוטוקונברנסציה (PC) או הפעלה אופטוגנטית, הנוירונים הפנימיים של Basin-4 הציגו פלואורסצנציה ירוקה עקב ביטוי CaMPARI ציטוזולי (איור 2A). לא זוהתה פלואורסצנציה אדומה בתנאי בסיס (איור 2B), מה שמאשר את היעדר הפוטקונברציה לפני הגירוי.

חשיפה סימולטנית לאור PC ולגירוי אופטוגנטי הובילה להמרת פוטוקונברציה של CaMPARI מפלואורסצנציה ירוקה לאדומה (איור 2C, D). כדי לאמת שהפוטקונברציה הונעה במיוחד על ידי פעילות נוירונית בתיווך CsChrimson, בוצעה בדיקה שלילית באמצעות זחלים מאותו רקע גנטי (מאותו הכלאה הורית) שגודלו ללא רשתית טרנס-מלאה (ATR). מכיוון ש-ATR הוא קו-פקטור חיוני לפונקציית CsChrimson, היעדרו הופך את האופסין ללא פונקציונלי למרות חשיפה לאור גירוי של 594 ננומטר. בקרה זו גם מתייחסת להפעלה פוטנציאלית של נוציצפטורים על ידי אור PC באורך 405 ננומטר⁴⁰, שכן זחלים ללא ATR עברו את אותו פרוטוקול גירוי, כולל חשיפה לאור^{PC 40}.

למרות שנצפתה רמת פלואורסצנציה אדומה נמוכה של CaMPARI בזחלים ללא ATR, בהתאם לפוטקונברסציה חלקית שנגרמה על ידי אור PC בלבד, כימות Δ(R/G) גילה ערכים גבוהים משמעותית בבעלי חיים ניסיוניים לעומת קבוצת הביקורת (איור 2E). עלייה זו מצביעה על כך שהמרת האור המוגברת בזחלים ניסיוניים תלויה בפעילות נוירונית מונעת על ידי CsChrimson.

ניתוח תמונות בוצע בפיג'י (RRID:SCR_002285) כפי שמתואר בפרוטוקול. השוואה סטטיסטית של ערכי Δ(R/G) בין קבוצות ביקורת ניסיוניות וללא ATR בוצעה ב-GraphPad (RRID:SCR_002798) באמצעות מבחן t לא מזווג לאחר אישור התפלגות תקינה וסטיות תקן שוות בערך בין הקבוצות.

איור 2. פוטוקונברסציה של CaMPARI בנוירונים ב-Basin-4 חושפת פעילות סינפטית פונקציונלית לאחר גירוי אופטוגנטי של נוירונים סנסוריים cIVda ב-vivo. (א) חצים לבנים מצביעים על גופי תאים של תאי עצב בין-נוירונים באגן-4 בתוך חוט העצבים הגחוני של הזחל (VNC) המבטאים פלואורסצנציה ירוקה של CaMPARI. (B) היעדר פלואורסצנציה אדומה של CaMPARI בתאי Basin-4 המסומנים בקווים מקווקו לפני גירוי אופטוגנטי ולפני חשיפה לאור פוטוקונברמציה. אזורי עניין (ROIs) הוגדרו ידנית סביב גופי תאים ירוקים-פלואורסצנטיים בערוץ הירוק באמצעות כלי הבחירה החופשית בפיג'י ולאחר מכן יושמו על הערוץ האדום. (C) פלואורסצנציה אדומה ו-(D) ירוקה של CaMPARI בנוירוני Basin-4 לאחר גירוי אופטוגנטי סימולטני וחשיפה לאור פוטקונברמציה. (ה) כל נקודת נתונים מייצגת את ממוצע ה-Δ(R/G) לכל זחל, מחושב מ-1–4 תאים לכל פרט (גודל הדגימה הכוללת: ביקורת, 8 זחלים, כולל 23 תאים; קבוצת הניסוי, 9 זחלים, כולל 19 תאים). הניתוח הסטטיסטי מראה עלייה משמעותית ב-Δ(R/G) לאחר גירוי אופטוגנטי ופוטקונברציה (קבוצת הניסוי) בהשוואה למצב הבסיסי במצב ללא ATR (ביקורת). פס קנה מידה: 10.2 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר הערכה איכותית וכמותית של קישוריות סינפטית בין שותפים סינפטיים מוגדרים בזחלי D. melanogaster שלמים. גישה זו מנצלת את השילוב של גירוי אופטוגנטי של נוירונים סנסוריים cIVda לבין ויזואליזציה מבוססת CaMPARI של נוירוני בין-תאי בין-סינפטיים פוסט-סינפטיים מופעלים ב-Basin-4, כדי לנטר פעילות סינפטית במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלים לא מפורקים. יישומים קודמים של CaMPARI ב-D. melanogaster התמקדו בעיקר בשלבים²⁰ של מבוגרים או בגירוי פיזי פרה-סינפטי (למשל, גירוי תרמי נוציספטיבי)¹⁷. השיטה הנוכחית מרחיבה את השימוש ב-CaMPARI לשלבים מוקדמים יותר ומציגה אסטרטגיה להערכה פונקציונלית של פעילות סינפטית באמצעות שילוב של גירוי פרה-סינפטי אופטוגנטי עם גילוי פוסט-סינפטי מבוסס CaMPARI. הפעלה אופטוגנטית מספקת שליטה זמנית מדויקת בקלט הפרה-סינפטי, ומאפשרת גירוי מבוקר ומעקב נוסף אחר תגובת CaMPARI פוסט-סינפטית.

למרות יתרונות אלה, יישום גישה זו דורש התייחסות קפדנית לתכנון ניסוי, בקרות מתאימות ומגבלות טכניות. בדיקות ביקורת שליליות, כולל זחלים שגודלו ללא רטינל טרנס (ATR), שמונע הפעלה של CsChrimson^30,33, או זחלים ללא ביטוי של CsChrimson, נדרשים כדי לאשר את היעדר הפוטקונברציה של CaMPARI בהיעדר גירוי אופטוגנטי פרה-סינפטי. יש לקחת בחשבון גם גורמים נוספים. פעילות פוסט-סינפטית ספונטנית או אנדוגנית עשויה להתרחש במקביל לחשיפה לאור פוטוקונברסציה (PC), מה שמוביל להמרת CaMPARI ירוק לאדום בלתי תלויה בפרה-סינפטיה. למרות ש-CsChrimson מותאם להפעלה על ידי אור אדום (590–680 ננומטר), הוא שומר על רגישות לאורכי גל קצרים³⁹, ולייזרי הדמיה המשמשים לפני הגירוי עלולים בטעות לגרום להפעלה טרום-סינפטית לא מכוונת. יתרה מזאת, נוירונים פוסט-סינפטיים מקבלים קלטים ממספר שותפים פרה-סינפטיים, כך שהפעלה מקלטים לא מטרה עשויה להתרחש במקביל לחשיפה לאור PC ולהוביל להמרת CaMPARI ללא תלות בגירוי אופטוגנטי מבוקר.

לדוגמה, אינטרנוירונים של Basin-4 מקבלים קלט סינפטי לא רק מנוירוני cIVda אלא גם מנוירונים סנסוריים מולטידנדריטיים מסוג III (cIIIda) ונוירונים כורדוטוניים (Ch) כחלק מהמעגל נוציספטיבי 11,12,13,17. כתוצאה מכך, ייתכן שנוירונים אלו יופעלו על ידי קלטים מעוררים חלופיים, כולל גירוי מכנוסנסורי המושרה על ידי לחץ מהכיסוי. גורם זה ספציפי לתצורה הניסויית המתוארת כאן, אך מדגיש את חשיבות התחשבות בפוטוקונברסציה עקיפה מונעת רשת או לא אופטוגנטית, במיוחד בתנאי בקרה שבהם אין ATR.

כדי לשלוט עוד יותר בזרימת סידן לא ספציפית ופוטקונברסציה נלווית, ניתן לחלק את הזחלים לשתי קבוצות: קבוצה אחת החשופה לאור PC בלבד, וקבוצה שנייה שעוברת גירוי משולב של אור PC ואופטוגנטי, כאשר ערימות z אדומות וירוקות נרכשות לאחר כל מצב כדי לאפשר השוואה ישירה בין הקבוצות. עוצמות פלואורסצנציה שמתקבלות בתנאי PC-only יכולות להפחית מהעוצמות הנמדדות לאחר גירוי משולב. רמות הפוטקונברציה שנצפו בתנאי בקרה (ללא ATR וגירוי PC-בלבד) מספקות הערכה של הפעלה פוסט-סינפטית הנובעת מפעילות אנדוגנית סטוכסטית וקלטים מונעי רשת.

בתנאים הניסיוניים שתוארו, גירוי אופטוגנטי של נוירוני cIVda בשילוב עם פוטוקונברציה של CaMPARI באינטרנוירונים ב-Basin-4 הוביל ל-Δ(R/G) חיובי, המצביע על פעילות סינפטית בין שותפים לפני ופוסט-סינפטיים. פרוטוקול זה מספק מסגרת לחקירת יחסים סינפטיים פונקציונליים ב-vivo וניתן להתאים אותו למעגלים נוירונליים אחרים בדרוזופילה. על ידי אפשרות הפעלה ממוקדת של פרה-סינפטיקה וגילוי תלוי פעילות בנוירונים פוסט-סינפטיים, גישה זו תומכת באימות חיבורים סינפטיים החזויים על ידי מערכי נתוני קונטומים ומקלה על חקר הקישוריות התפקודית במהלך ההתפתחות. לכן, הוא מהווה שיטה גמישה לניתוח תפקוד המעגלים העצביים במערכת העצבים של דרוזופילה הניתנת לטיפול גנטי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 מ' מלח עם מאגר פוספט (PBS)	סיגמא אולדריץ'	P5368-10PAK	כימיקלים המשמשים בתמיסה למתן לחות והרכבה של זחלים
טרנס-רטינל (ATR)	סיגמא אולדריץ'	R2500-500mg	כימיקלים שנוספו למזון כדי להפעיל כלים אופטוגנטיים
מיקרוסקופ קונפוקלי	ZEISS	LSM900 קונפוקל	מיקרוסקופ קונפוקלי, עדשה אובייקטיבית (40&x;/1.2 NA), מקור אור/לייזר (405, 488, 561 ננומטר)
כיסויי כיסוי (18x18 מ"מ)	VWR	48366-205	משמש להרכבה של בעלי חיים להדמיה
אתנול (95%)	סיגמא אולדריץ'	E7023	משמש כממס לאבקה ATR
פיג'י (ImageJ)	קוד פתוח	RRID:SCR_002285	משמש לניתוח דימות
גרסת פריזם 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	משמש לניתוח סטטיסטי
שקופיות מיקרוסקופ	VWR	48300-041	משמש להרכבה של בעלי חיים להדמיה
חימר מודל	פלין סיינטי	FB0600	משמש להחזיק זכוכית כיסוי על סלייד מיקרוסקופ עם זחלים ביניהם
Paintbrush	ג'נסי מדעי	59-204	משמש להעברת זחלים בין מיקומים
אגר קמח תירס סטנדרטי בינוני	ג'נסי מדעי	66-123	ניתן גם להכין אוכל באמצעות מתכונים ומרכיבים סטנדרטיים דומים
בקבוקי פלסטיק סטנדרטיים של דרוזופילה (בקבוקונים צרים בגודל 25 מ"מ x 95 מ"מ)	ג'נסי מדעי	32-109	ניתן להשתמש גם בבקבוקים או בקבוקים גדולים
לוח נקודתי מיקרו עם שלוש בארות	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	71561-01	פלטה המשמשת להפרדה וניקוי של זחלים בודדים
מאגר דרוזופילה (גנוטיפ: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	הושג משילוב מחדש של RRID:BDSC_54899 ו-RRID:BDSC_32079
מאגר דרוזופילה (גנוטיפ: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון	RRID:BDSC_81085	הושג משילוב מחדש של RRID:BDSC_81085 עם סמני כרומוזום שניים