תגובת שרשרת היברידיזציה בסיוע התרחבות - smFISH ואימונוהיסטוכימיה במוח דרוזופילה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך HCR-smFISH ואימונוהיסטוכימיה בסיוע הרחבה לניתוח כמותי ספציפי לסוג תא של RNA וביטוי חלבונים במוח הדרוזופילה , כולל דימות במיקרוסקופיה של יריעת אור או קונפוקלית וכימות אוטומטי של תמלילים גרעיניים וציטופלזמיים.

תקציר

ניתוח כמותי ומרחב של ביטוי גנים חיוני להערכת פרופילים מולקולריים ספציפיים לסוג התא. במערכת הראייה של דרוזופילה , כלים גנטיים נרחבים פותחים מסגרת להערכה ישירה של רמות RNA וחלבון באוכלוסיות נוירונים מוגדרות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב המשלב HCR-smFISH (היברידיזציה, תגובת שרשרת היברידיזציה, פלואורסצנציה במקום ) בעזרת התרחבות עם אימונוהיסטוכימיה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של פרופילים מולקולריים ספציפיים לסוג תא בסוגי נוירונים מוגדרים גנטית במערכת ראייה. תהליך העבודה מותאם לתאים המסומנים בסמנים ממוקדי גרעין או קשורים לממברנה, ומאפשר מדידת רמות תמלול וחלבון באותם נוירונים. לאחר התפשטות הרקמות, הדגימות מדוממות באמצעות מיקרוסקופ אור לרכישה נפחית מהירה, כאשר תהליך התקנה והדמיה חלופי מודגם עבור מיקרוסקופים קונפוקליים עם סריקה לייזר הפוך ודיסקית מסתובבת סטנדרטית. בנוסף, אנו מספקים אלגוריתם סגמנטציה אוטומטי שמבדיל בין תמלילים גרעיניים וציטופלזמטיים, ומאפשר ניתוח של מצב שעתוק ומיקום RNA תת-תאי. ניתנת הנחיה מעשית לגבי פרמטרים ניסיוניים ומכשולים נפוצים המשפיעים על איכות האות, שלמות הרקמה והביצועים הכמותיים. יישומים מייצגים כוללים אימות של הפרעות RNA ספציפיות לסוג תא על ידי כימות שינויים תואמים ברמות RNA וחלבונים. על ידי אפשרות מדידות משולבות ברמת RNA וחלבון עם ספציפיות סוג תא, גישה זו מספקת אסטרטגיה ניתנת להרחבה לניתוח מולקולרי מונחה השערות, ובהקשרים ממוקדים, חלופה מעשית לבדיקות טרנסקריפטומיות חד-תאיות. פרוטוקול זה מספק גישה מעשית לאימות הפרעות מולקולריות ספציפיות לסוג תא תוך שמירה על ההקשר האנטומי של מוח הדרוזופילה השלם.

מבוא

מערכת הראייה של דרוזופילה מלנגסטר שימשה מודל עוצמתי לטיפול במגוון רחב של שאלות במדעי המוח ההתפתחותיים, כולל התמיינות נוירונית ^1,2, מפרט סוג תא ^3,4, ולוגיקה מולקולרית של חיווט מוחי ^5,6,7. התקדמות זו מונעת על ידי ערכת כלים ניסיונית עשירה במיוחד, הכוללת אוספים גדולים של קווי מניע גנטיים ספציפיים לסוג תא ^8,9,10, שחזורים קונטומיים מקיפים^{עדכניים} 10,11,12, וטרנסקריפטומיקה^{חד-תאית 13,14} ומולטיאומי¹⁵ מפורטת יותר מערכי נתונים. יחד, משאבים אלו מגדירים סוגי נוירונים באופן רב-מודלי ומאפשרים מניפולציות גנטיות מדויקות. כתוצאה מכך, התחום יכול כעת לייצר השערות חיזוי יותר ויותר לגבי האופן שבו גנים מסוימים מווסתים זהות, קישוריות ותפקוד נוירונים¹⁶.. בעוד שריצוף RNA חד-תאי מספק תובנות חזקות לגבי מצבי שעתוק, שפע ה-RNA אינו תמיד מנבא ביטוי חלבון¹⁷, ורבים מניסויי הפרעה דורשים בסופו של דבר מדידה ישירה וכמותית של RNA וחלבון באותם נוירונים.

היברידיזציה של פלואורסצנציה חד-מולקולית במקום (smFISH)^18,19 מאפשרת מדידה כמותית של שפע התמלול ברזולוציה תאית ותת-תאית תוך שמירה על הקשר אנטומי. השילוב של smFISH עם מיקרוסקופ התרחבות 20,21,22 הרחיב עוד יותר את השימושיות שלו למוחות שלמים על ידי הגדלת רקמה פיזית בתוך הידרוג'ל מתנפח, ובכך מפחית צפיפות מולקולרית, משפר את הגישה האופטית והגביר את הרזולוציה המרחבית האפקטיבית. כאשר משולבים עם הגברת אות מבוססת תגובת שרשרת היברידיזציה (HCR)²³, smFISH בסיוע התרחבות מאפשר זיהוי חזק של תמלולים נפרדים ברקמת עצב עבה ותומך בהדמיה מוחית שלמה באמצעות מיקרוסקופיה של לוח אור או מיקרוסקופיה קונפוקלית.

מגוון גישות הדמיית RNA בשטח יושמו במוח הדרוזופילה , המשקפות עדיפויות ניסוייות שונות. HCR-FISH איטרטיבי בסיוע התרחבות אפשר זיהוי RNA במוח שלם, עם פתרון מרחבי^. במקביל, גישות FISH מלאות ללא התרחבות שימשו למדידות RNA בנוירונים מסומנים גנטית, כולל אסטרטגיות מיפוי פעילות מבוססות HCR המתמקדות בגנים מוקדמים^{מיידיים 25} וזרימות עבודה של ספירת תמלול מבוססות סגמנטציה באמצעות סמנים מקודדים גנטית קשורים לממברנה²⁶. שיטות מסחריות מבוססות פרוב כמו RNAscope אפשרו עוד יותר גילוי RNA מרובה במוחות שלמים, לעיתים בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה לזיהוי אוכלוסיות תאים ממוקדות²⁷. יחד, גישות אלו מקביעות כי ניתוח RNA מפוזר במרחב במוח הזבוב הוא אפשרי מבחינה טכנית. עם זאת, ניסויי הפרעה מונחי השערות מטילים סט דרישות ספציפי יותר שאינם מטופלים במלואם על ידי זרימת עבודה קיימת אחת. שיטות רבות נותנות עדיפות למיפוי תמלול בסגנון גילוי מולטיפלקס, פרופיל מצב פעילות או כימות RNA בלבד, כאשר צביעת חיסון משמשת בדרך כלל כמזהה תא ולא כקריאה תואמת של החלבון המופרע, או מיושמת בהיעדר הקצאה גנטית^{לסוג תא 28}. בנוסף, יישומים שגרתיים ייהנו מתאימות לפלטפורמות דימות מרובות ומצינורות ניתוח אוטומטיים וניתנים להרחבה.

כאן, אנו מציגים תהליך משולב שלב אחר שלב עבור מערכת הראייה של דרוזופילה , המשלב HCR-smFISH בסיוע התרחבות עם אימונוהיסטוכימיה המתבצעת לפני ההתרחבות, ומאפשר מדידה משולבת של רמות RNA וחלבון באותם נוירונים באותו דגימה ביולוגית. בהתבסס על מסגרת FlySeg²⁹ שפיתחנו בעבר, אנו מספקים צינור כימות אוטומטי לסגמנטציה גרעינית וספירת תמלול שמבדיל בין נקודה גרעינית לציטופלזמה, ותומך הן במדידות ביטוי כולל והן בניתוחים רגישים למצב שעתוק. הפרוטוקול מודגם הן במיקרוסקופ אור והן בשתי מערכות קונפוקליות עם זרימות עבודה חלופיות להרכבה ודימות. לבסוף, אנו מדגישים את התועלת של קריאת RNA-חלבון משולבת באמצעות ניסוי אימות-הפרעה מייצג (כלומר, הפלת מטרה מוגדרת בתיווך RNAi), המספק הנחיות מעשיות לגבי פרמטרים ומלכודות המשפיעים על איכות האות, שלמות הרקמה והביצועים הכמותיים.

פרוטוקול זה מתבסס בדרך כלל על מסגרת²⁴ EASI-FISH שתוארה קודם לכן לזיהוי RNA מוחי שלם בדרוזופילה, ושומר על עקרונות הליבה שלו של עיגון RNA, הרחבת הידרוג'ל והגברת אותות מבוססת HCR. הפרוטוקול הנוכחי מרחיב ומשפר גישה זו על ידי שילוב אימונוהיסטוכימיה לפני ההתרחבות כדי לאפשר מדידות RNA וחלבונים תואמים באותם נוירונים, על ידי עדכון שלבי עיבוד וטיפול רבים לאורך תהליך העבודה לשיפור החוסן והשחזוריות, על ידי מתן אסטרטגיות התקנה והדמיה מעשיות הן למיקרוסקופים של יריעת אור והן למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, וכן על ידי שילוב סגמנטציה אוטומטית של סומה וכימות תמלול עם הפרדה מפורשת של מאגרי RNA גרעיניים וציטופלזמיים.

תהליך עבודה זה מתאים במיוחד לניסויים ממוקדים שבהם מטרתם לכמת קריאות RNA וחלבונים מוגדרים בנוירונים מזוהים גנטית תוך שמירה על הקשר אנטומי. הוא שימושי במיוחד לאימות הפרעות מולקולריות כאשר המטרה היא למדוד ויסות של גן מוגדר או קבוצה קטנה של גנים מועמדים, השוואת ביטוי בין גנוטיפים או שלבי התפתחות, או הערכת מצב השעתוק באמצעות מיקום גרעיני לעומת ציטופלזמי. היא פחות מתאימה לגילוי תמלול בלתי מוטה או למיפוי ביטוי מוח שלם ב-plex גבוה, כאשר גישות ריצוף תאים בודדים, טרנסקריפטומיקה מרחבית או גישות FISH מרובות איטרטיביות עשויות להתאים יותר.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה

פרוטוקול זה עושה שימוש ב-Drosophila melanogaster. לא נעשה שימוש בבעלי חוליות או בנבדקים אנושיים. לכן לא נדרשה אישור של ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדית.

הערה: השתמש בטכניקת RNase-clean לאורך כל הדרך. לבש כפפות, נגב משטחים וכלים עם תמיסת ניקוי RNase, והכין את כל התמיסות עם מים ללא RNase.

איור 1. תהליך עבודה שלב אחר שלב של פרוטוקול הכנת הדגימה (A) ציר זמן סכמטי של הפרוטוקול, המציין את ההתקדמות היומית המשוערת ואת שלבי הדגירה הלילית. (B–J) סקירה סכמטית של שלבי הכנת הדגימה העיקריים, החל מניתוח מוחי וקיבוע דרך אימונוהיסטוכימיה, קישור RNA/חלבון, הטמעת הידרוג'ל, עיכול, היברידיזציה של פרוב, והגברת אות HCR. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. דיסקציה מוחית, קיבוע ואימונוהיסטוכימיה (ימים 1–3)

הערה: בצע את כל השלבים בלוח רב-בארות בסגנון טרסאקי אלא אם צוין אחרת. השתמש ב-10 מיקרוליטר לכל באר לדגירות ושטיפות. שמרו על לחות על ידי הנחת מגבון מעבדה רטוב בפינה אחת של הצלחת.

אזהרה: פאראפורמלדהיד ומקבעי גליאוקסל הם רעילים/מגרים. הידית עם קפוצ'ון אדים ולבוש ציוד מגן אישי מתאים.

1. נתח מוחות במדיום חרקים S2 קר כקרח. העברת מוחות לבארות, עד 10 מוחות בכל באר (איור 1B–C).
   הערה: בניסויים המייצגים המוצגים כאן, השתמשו במוחות גולם בני 72 שעות.
2. החלף את מדיום S2 ב-10 מיקרוליטר מקבע לכל באר, החלף פעם אחת.
3. מקבע ב-Addax גליאוקסל ללא חומצה עם סוכרוז של 5% (עם v) בלילה בטמפרטורה של 4°C (איור 1C).
4. שטיפת מוח 3× ב-10 מיקרוליטר PBST (0.5% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
   אזהרה: טריטון X-100 הוא מגרה; הימנע מקשר עין ועור ועיניים.
5. דגרו מוחות בתמיסת נוגדנים ראשונית של 10 מיקרוליטר (ב-PBST, בדילול המפורט בטבלת החומרים) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. (איור 1D).
6. שטוף מוח 3× למשך 10 דקות ב-10 מיקרוליטר PBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בכל שטיפה, החלף את התמיסה באמצע הדגירה (שתי החלפות בכל שטיפה).
7. דגרו מוחות בתמיסת נוגדנים משנית של 10 מיקרוליטר (ב-PBST, בדילול המפורט בטבלת החומרים) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 1D).
   הערה: להגן על דגימות מאור.
8. שטוף מוח 3× למשך 10 דקות ב-10 מיקרוליטר PBST בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בכל שטיפה, החלף את התמיסה באמצע הדגירה (שתי החלפות בכל שטיפה).
   הערה: השתמש בריכוזי נוגדנים ראשוניים ומשניים גבוהים פי 2–3 מהריכוזים הסטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה שלמה
   נקודת עצירה: מאחסנים מוח ב-10 מיקרוליטר 1× PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 96 שעות.

2. עיגון קוולנטי של RNA וחלבונים (יום 4) (איור 1E)

זהירות: אלקילטורים מעגנים RNA ו-AcX מסוכנים (רעילים/מגרים; חלקם חשודים כמסרטנים). הכינו וטפלו בתמיסות במכסה אדים כימי עם ציוד מגן מתאים. אסוף את כל הפסולת כפסולת כימית מסוכנת.

1. דגרו מוח ב-10 מיקרוליטר של בופר MOPS של 20 מ"מ (pH 7.7) למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. הכינו תמיסת עיגון על ידי ערבוב 49.5% (v/v) 20 mM MOPS, 49.5% (v/v) מלאי Melphalan (2.5 mg·^mL-1 ב-DMSO), ו-1% (v/v) מאגר AcX (10 mg·^mL-1 ב-DMSO). זה מניב ריכוזים סופיים של 1.24 מ"ג·מ"^ל-1 מלפלן ו-0.10 מ"ג·מ"^ל-1 AcX.
3. החלף את MOPS בתמיסת עיגון של 7–8 מיקרוליטר לכל באר, החלף את התמיסה פעם אחת, ודוגר ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
   הערה: השתמש ב-7–8 מיקרוליטר כדי למזער הצפה וערבוב בין בארות חוצה תוך שמירה על כיסוי דגימה מלא.

3. ג'לציה (הטמעת מוח בהידרוג'ל) ועיכול פרוטאנאז K (יום 5)

אזהרה: מונומרים אקריליים, APS ו-TEMED הם מגרים/רעילים. טיפול עם ציוד מגן אישי; הכינו רכיבים נדיפים/אקסותרמיים במכסה אדים.

1. חבר אטם סיליקון דבק בעובי 0.5 מ"מ למחסנית זכוכית מיקרוסקופית לא טעונה (איור 1F, למטה משמאל), לחץ היטב כדי להבטיח מגע מלא ואטימה.
2. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת פולי-אל-ליזין לתא ומרחו באופן שווה כדי לצפות את המשטח, דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, והסירו את התמיסה עם פיפטה.
3. אפשר לפולי-אל-ליזין להתאדות לחלוטין עד שהמשטח יבש לעין.
   הערה: אידוי פולי-אל-ליזין הוא איטי. לתוצאות אמינות, הכינו את התאים מראש ואפשרו להם להתייבש לילה בסביבה ללא אבק. חלופה נוספת היא לייבש תאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך ≥ שעה ביום השימוש.
4. שטוף מוח 2× ב-10 מיקרוליטר 1× PBS למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
5. הכינו תמיסת מונומר ג'ל והוסיפו תגובות פולימריזציה מיד לפני השימוש על ידי ערבוב תמיסת מונומר עם 4HT, TEMED ו-APS (מכינים טרי) ביחס של 47:1:1:1. תמיסת הג'לציה הסופית מכילה 1 M נתרן אקרילט, 14% אקרילאמיד, 0.1% ביס-אקרילאמיד, 1× PBS, 0.01% 4HT, 0.2% TEMED ו-0.2% APS.
6. וורטקס לזמן קצר והשאיר את תמיסת הג'לציה הסופית בקפיא. השתמש בפתרון מיד.
7. דגרו מוח בתמיסת ג'לציה קרה של 10 מיקרוליטר למשך 15 דקות על קרח.
8. במהלך שיווי משקל מוקדם, באמצעות להב גילוח חדש, חתכו תעלה צרה אחת בכל צד של אטם הסיליקון כדי לאפשר לאוויר לצאת בזמן המילוי (איור 1F, למעלה משמאל)
9. באמצעות קצה פיפטה, העבר את המוח לתא הג'לציה המוכן, תוך שמירה על כך שכל מוח יישאר טבול בתמיסת ג'לציה בכל עת.
   אזהרה: לאחר עיגון ואיזון, המוח הופך לדביק מאוד ונדבק בקלות למשטחים פלסטיים. כדי למנוע אובדן דגימה, השתמשו בקצוות פיפטה רחבי קוטר או גזמו את קצה הקצה הסטנדרטי להרחבת הפתח.
10. הסר את הליינר המגן מהדבק הסיליקוני של המשטח והניח בעדינות כיסוי זכוכית נקי 1.5H מעל החדר, תוך הימנעות מבועות אוויר שנלכדו.
11. בהדרגה פיפטה של 200 מיקרול של תמיסת ג'לציה טרייה לתא דרך אחד התעלות הצדדיות, עד שהתא מתמלא לחלוטין.
12. מניחים את התא האטום במיכל כהה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    הערה: הניחו מגבוני מעבדה רטובים במים) בתוך המיכל. ודאו שהמחסנית לא באה במגע ישיר עם מים נוזליים.
13. הכינו בופר עיכול המורכב מ-50 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 500 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, ו-0.5% (v/v) טריטון X-100 במים ללא RNase.
14. מיד לפני השימוש, מוסיפים פרוטינאז K בקצב של 1:100 ממאגר של 20 מ"ג·מ"^ל-1 לריכוז סופי של 0.2 מ"ג·מ"^ל-1.
    אזהרה: פרוטינאז K הוא מגרה ויש לטפל בו עם כפפות; הימנעו משאיפות ומגע עור.
15. תן למחסנית להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני הסרת הכיסוי. גזמו את הג'ל עם אזמל לצורה מלבנית באמצעות חיתוכים ישרים בודדים. מזער את נפח הג'ל העודף שמקיף כל מוח (איור 1F, למעלה מימין).
16. הניחו כל ג'ל חתוך בתוך באר נפרדת של צלחת 24 בארות המכילה 1000 מיקרוליטר לתמיסת עיכול. ודא שהג'לים טבולים לחלוטין.
17. אטום את הלוח עם Parafilm ודוגר במשך הלילה בטמפרטורת החדר על סולד אורביטלי ב-0.11 גרם (איור 1G).

4. עיכול DNase והיברידיזציה של HCR-smFISH (יום 6)

1. שאפו בזהירות את תמיסת העיכול באמצעות פיפטה הממוקמת בקצה הבאר כדי למנוע מגע או עיוות של הג'ל.
2. ג'לי שטיפה 3× עם 500 מיקרוליטר 1× PBS למשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי במשקל 0.11 גרם.
   נקודת עצירה: אחסון ג'לים טבולים ב-500 מיקרוליטר 1× PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים לפני הממשיכה.
3. הכינו תמיסת עבודה של 500 מיקרולטר DNase לכל ג'ל על ידי דילול מלאי DNase I מערכת DNase Free של QIAGEN RNase 1:10 בבופר RDD. פתרון העבודה הסופי מכיל כ-0.27 יחידות קוניץ·^μL-1.
4. דגרו ג'לים בתמיסת DNase של 500 מיקרוליטר למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין (איור 1H).
5. ג'לי שטיפה 4× עם 500 מיקרוליטר 1× PBS ללא RNase למשך 15 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
6. ג'לים מאוזנים בבופר היברידיזציה של 500 מיקרוליטר עם פרוב מחומם מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס
7. מאגר מדולל של HCR smFISH (1 מיקרומון; מכשירים מולקולריים) 1:300 בבופר היברידיזציה של פרוב לריכוז סופי של ~3.3 ננומטר. ערבב באמצעות מערבולת
8. החלף את בופר האיזון בתערובת גשושית של 500 מיקרוליטר לכל ג'ל ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי ב-0.11גרם (איור I).
   אזהרה: בופרי היברידיזציה של פרוב מכילים פורממיד, שהוא רעיל. השתמש בכפפות והימנע משאיפות.

5. תגובת שרשרת היברידיזציה (יום 7) (איור 1J)

1. ג'לי שטיפה 3× עם בופר שטיפה מחומם מראש של 500 מיקרו ליטר למשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי ב-0.11 גרם.
   אזהרה: מאגרי שטיפת הגשוש מכילים פורממיד, שהוא רעיל. השתמש בכפפות והימנע משאיפות.
2. ג'לי שטיפה 3× עם 500 מיקרוליטר 1× PBS למשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי ב-0.11 גרם.
3. השאירו ג'לים ב-1 מ"ל 1× PBS ללילה בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי ב-0.11 גרם.
   הערה: שטיפה ממושכת בלילה משפרת את יחס האות לרעש על ידי הפחתת קישור הגלאי מחוץ למטרה ופנקטות רקע. לעיבוד באותו יום, יש להמשיך ישירות להגברת HCR.
   נקודת עצירה: לאחר שטיפות לאחר ההיברידיזציה, מאחסנים ג'לים ב-1 מ"ל 1× PBS בטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס למשך עד 96 שעות לפני הגברת ה-HCR.
4. החלף את PBS בבופר הגברה של 500 מיקרוליטר (שהיה מאוזן קודם לטמפרטורת החדר) לכל באר ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מנער אורביטלי ב-0.11 גרם.
5. לכל סט חיישים, מדלל סיכות שיער h1 ו-h2 (מאגר 3 מיקרומטר; מכשירים מולקולריים) בבופר הגברה 1:100 (ריכוז סופי של 30 ננומטר). הכינו 350 מיקרוליטר של תערובת סיכת שיער מדוללת לכל באר.
6. תמיסות סיכת שיער מדוללות בחום בצינורות PCR בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות במחזור תרמי או בלוק חום. השתמש בנפח כולל של 100 מיקרוליטר לכל צינור כדי להבטיח חימום אחיד ואיזון טמפרטורה.
   הערה: הנחיות HCR ממליצות לעיתים קרובות על חימום חד-חד H1 ו-H2 בנפרד ולשלב אותם רק לאחר הקירור; לחלופין, לשלב H1 ו-H2 לפני חימום ה-snap כאשר נדרש טיפול פשוט.
7. אפשר לסיכות השיער להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך ללא הפרעה.
8. הסר את בופר ההגברה והוסיף תערובת של 350 מיקרו-ליטר לכל באר.
9. דגירה של ג'לים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר אורביטלי במשקל 0.11 גרם.
10. ג'לי שטיפה 3× עם 500 מיקרוליטר 5× SSCT למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על מתנער אורביטלי ב-0.11 גרם.
11. החזרו תמיסות סיכות שיער לאחר ההגברה, הגנו עליהן מאור, ואחסנו אותן בטמפרטורה של מינוס 20°C לשימוש חוזר.
12. העבר ג'לים ל-500 מיקרוליטר 1× PBS ושוטף 3× למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
13. אחסנו ג'לים ב-500 מיקרוליטר 1× PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מאור.
    נקודת הפסקה: ניתן לאחסן ג'לים מוגברים עד שבועיים לפני ההדמיה עם אובדן אות מינימלי.

6. הכנה, התקנה והדמיה של דגימות מורחבות (יום 8) (איור 2)

1. דגרו ג'לים ב-1× PBS המכילים DAPI (1:1000) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C על רועיד מסלול ב-0.11 g.
2. השתמש באור UV קצר כדי לדמיין את המוח בתוך הג'ל. כוון את הדגימה וגזם את הג'ל העודף לפי הצורך.
   זהירות: תאורת UV משמשת במהלך מיקום הדגימה והרכבתה. שים מגן עיניים מתאים.
3. הרכבה דגימות ב-1× PBS בתוספת DAPI (1:1000) באמצעות התצורה המתאימה לפלטפורמת ההדמיה הנבחרת (ראו טבלה 1).
4. אפשר לדגימות להתאזן לפחות שעה לפני הרכישה.
5. השתמש במטרות טבילה במים עם מרחק עבודה מספיק כדי לצלם דרך הג'ל המורחב.
6. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור, מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת לייזר, או מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. פרמטרי התקנה ורכישה ייצוגיים הספציפיים לפלטפורמה ששימשו במחקר זה מסוכמים בטבלה 1.
   הערה: לאחר הדמיה, ניתן להסיר את הגשושים וסיכות השיער של HCR באמצעות עיכול DNase כפי שתואר לעיל. הג'לים יכולים לעבור סבבים נוספים של היברידיזציה של פרוב והגברת HCR.

פלטפורמה	ויזואליזציה לדוגמה, התקנה ואיתור	מטרה / גלאי	הגדרות רכישה ייצוגיות
דף אור צייס 7	השתמש באור UV קצר כדי לדמיין את מיקום המוח בג'ל. קצץ את הג'ל העודף וכיוון כל מוח לכיוון מטרת האיתור. הנח 5–6 ג'לים על כיסוי מצופה פולי-L-ליזין בגודל 1 × 1 ס"מ עם ג'לים הפונים החוצה (איור 2A). חבר את הכיסוי למחזיק הדגימה LS7 באמצעות טיפה קטנה של דבק שניתן לרפא ב-UV; כבה את מנורת ה-UV לפני שמורחים דבק. התקן בתא LS7 ואתר אזורים במוח באמצעות תצוגה חיה ב-ZEN Black.	20×/1.0 NA לגילוי טבילה במים; זום אופטי 2.5× (50× הגדלה כוללת).	Z-step, 0.4 מיקרון בזום 2.5× והרחבה של 2×. סריקת ציר מופעלת. חשיפה, 50 מילישניות לכל הערוצים. לייזרים: 405 ננומטר ב-5%, 488 ננומטר ב-2%, 561 ננומטר ב-8%. פליטה: 420–470 ננומטר, 505–545 ננומטר, 570–620 ננומטר.
			(איור 2C, משמאל)
ניקון Ti2-E AXR NSPARC קונפוקל לסריקת לייזר	השתמש באור UV קצר כדי לדמיין את המוח בתוך הג'ל. כוון ג'ל יחיד כך שהמוח פונה כלפי מטה לעבר המטרה ההפוכה. העבר לצלחת הדמיה עם תחתית זכוכית מלאה ב-1× PBS + DAPI (איור 2B). לאתר את המוח עם מטרה של 4×, לזהות ROIs עם מטרה של 20×, ולרשום מיקומי X-Y ב-NIS-Elements. הוסיפו מדיום הטמעה, חזרו על תשואה רשומה, והביאו אותם למוקדים.	40× מטרה לטבילה במים למרחקים ארוכים (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1.15 NA Lambda S, 0.61 מ"מ מרחק עבודה); גלאי NSPARC במצב רזולוציית על.	סריקת גלוונומטר, 2048 × 2048 פיקסלים, 1.6 מיקרו-שנייה/פיקסל, זום 8.0×. לייזרים: 488 ננומטר ב-2%, 640 ננומטר ב-20%. פליטה: 502–546 ננומטר ו-666–732 ננומטר.
			(איור 2C, באמצע)
Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1 דיסק סיבוב קונפוקל	התקן דגימות בדימות קונפוקלי הפוך: כיוון את הג'ל כשהמוח פונה לאובייקטיב והניח בצלחת הדמיה עם תחתית זכוכית עם 1× PBS + DAPI (איור 2B). זהה אזורים מעניינים כפי שמתואר עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת לייזר באמצעות תוכנת cellSens.	60× מטרת טבילה במים למרחקים ארוכים (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1.10 NA, 1.5 מ"מ מרחק עבודה); מצלמת Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 פיקסלים; 6.5 × 6.5 מיקרומטר).	עירור 488 ננומטר בהספק של 75%, חשיפה של 200 מילישניות; גירוי 640 ננומטר בעוצמה של 100%, חשיפה של 800 מילישניות. פליטה: 500–550 ננומטר ו-665–705 ננומטר.
			(איור 2C, ימין)

טבלה 1: התקנה מייצגת, מיקום דגימה ופרמטרי הדמיה בפלטפורמות מיקרוסקופיה. סיכום של אסטרטגיות הרכבה לדגימות, גישות לוקליזציה, מטרות ופרמטרי רכישה המשמשים בפלטפורמות מיקרוסקופיה של גיליון אור ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

7. ניתוח כמותי של RNA וביטוי חלבונים

הערה: בחר את תהליך הניתוח בהתאם למטרה הניסויית. השוואה בין הגישות הללו מוצגת בטבלה משלימה 1.

1. כימות תמלול בקנה מידה אוכלוסייה באמצעות FlySeg.
   הערה: הניתוח מבוסס על הגרסה המעודכנת של צינור FlySeg²⁹ . סקירה סכמטית של תהליך הניתוח מוצגת באיור 3A–B
   1. התקן את FlySeg, חבילה מבוססת פייתון, על ידי יצירת סביבת קונדה באמצעות:
      conda env create -f environment.yml
   2. הפעל את הסביבה לפני הניתוח באמצעות:
      קונדה הפעיל את פלייזג
   3. התחל את הניתוח באמצעות:
      Python main.py --file <input_file>
      השתמש בפורמטי קלט נתמכים, כולל קבצי CZI או NPY.
   4. התאם את הניתוח באמצעות טיעונים אופציונליים לפי הצורך, כולל:
      מספר הערוצים (--channels)
      ערוץ גרעינים (--nuclei_ch או --nuclei_wavelength)
      ערוץ ציטופלזמה (--cytoplasm_ch או --cytoplasm_wavelength)
      פרמטרי זיהוי גרעינים (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      גורם התרחבות גרעינית (--nuclei_dilation)
      ספי זיהוי FISH (--fish_threshold_range)
      תיקיית פלט (--output_dir)
      Visualization via Napari (--visualize)
   5. הצג את כל האפשרויות הזמינות באמצעות:
      פייתון main.py – עזרה
   6. בדוק מטא-דאטה של תמונות באמצעות:
      פייתון main.py --metadata_only.
      אשר את גודל הווקסלים, מספר הערוצים וזהות הערוץ.
   7. הרץ את הניתוח באמצעות פרמטרים מותאמים בהתאם למערך הנתונים. בדרך כלל, יש לציין את מספר התעלות הכולל, ערוץ הגרעינים, ערוץ הציטופלזמה (אם קיים), ופקטור ההתרחבות הגרעינית.
      הערה: הגדר את ערך --nuclei_dilation המתאים לגבול הגרעיני/ציטופלזמי הרצוי. ראו איור 3C–D לדוגמה.
   8. עוקב אחרי יומן העיבוד. כל הפלטים נשמרים בתיקייה שנקראת על שם קובץ הקלט.
   9. זהה את התוצרים הראשיים לניתוח במורד הזרם, כולל:
      1. <קובץ>-Nuclei-df.csv
         שמכיל מדידות תכונה לכל גרעין וספירות פנקטות נלוות לכל ערוץ FISH ומספק נתונים כמותיים לניתוח סטטיסטי.
      2. <קובץ>-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         זהו תרשים פיזור המשמש לזיהוי חריגים של סגמנטציה בהתבסס על גודל ועוצמת גרעין; החריגו גרעינים שסומנו כחריגים מניתוח נוסף.
   10. השתמש בפלטים ביניים נוספים (למשל, מסכות סגמנטציה, טבלאות זיהוי נקודות וקבצי סיכום FISH מאוחדים) לעיבוד מתקדם במידת הצורך.
2. ספירת תמלילים בתאים מזוהים בנפרד באמצעות Imaris
   1. באמצעות כלי Surfaces, חלקו את הנוירון המעניין בהתבסס על ערוץ סימון ציטופלזמי או ממברנה.
   2. כוון את פרמטרי החלקת המשטח וסף העוצמה כדי להבטיח שהמשטח המתקבל מכסה את הסומה במדויק תוך החרגת מבנים סמוכים.
   3. באמצעות כלי זיהוי הכתמים, מזהה פנקטות תמלול בתעלת FISH. קבעו את קוטר הנקודה המשוער וסף העוצמה בהתבסס על גודל הפנקטה ועוצמת האות (למשל, 0.25 מיקרומטר עבור התפשטות פי 2 של הרקמה).
   4. הגבל את גילוי הנקודות למשטח שנוצר קודם כדי להבטיח שרק פונקטות בתוך הנוירון נספרים.
   5. חלץ את מספר הנקודות שזוהו על פני הנוירונים באמצעות לוח הסטטיסטיקה.
   6. ספירת נקודות ייצוא ומדידות נלוות לניתוח במורד הזרם.
3. כימות פלואורסצנציה מבוסס ROI באמצעות FIJI/ImageJ
   1. פתחו ערימות תמונה ב-FIJI ויצרו הקרנות בעוצמה מרבית באמצעות מחסניות תמונה > > פרויקט Z > הקרנת עוצמה מרבית . השתמש בהגדרות הקרנה זהות לכל הדגימות בתוך הניסוי.
   2. זהה את המבנה הנוירוני המעניין באמצעות ערוץ סמן אנטומי (למשל, GFP ממברנה או ציטופלזמית). באמצעות כלי Freehand או Polygon Select, מתאר ידנית את תשואה התואם למבנה (למשל, דנדריט סיב ענק).
   3. עברו לערוץ החלבונים ומדדו את עוצמת הפלואורסצנציה בתוך התשואה המוגדרת באמצעות ניתוח > מדידה. רשמו את הפרמטרים הבאים: עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת; צפיפות משולבת; אזור החזר על ההשקעה.
   4. למדוד עוצמת פלואורסצנציה בתשואה על הרקע הקרובה בגודל דומה, שחסר אות ספציפי ונמצא מחוץ למבנה הנוירוני המסומן. השתמש באותה אסטרטגיית ROI ברקע עבור כל הדגימות בתוך הניסוי וחסר את ערך הרקע ממדידת התשואה (ROI).
   5. השתמשו בערכי צפיפות או עוצמה ממוצעת משולבים מתוקנים ברקע להשוואה כמותית בין גנוטיפים או תנאי ניסוי. ודאו שכל הדגימות משווות בהגדרות הדמיה זהות.

תוצאות

כדי לאמת את תהליך העבודה של HCR-smFISH והאימונוהיסטוכימיה בסיוע התרחבות בסביבה ביולוגית רלוונטית, התמקדנו במעגל הבריחה המתקרב של מערכת הראייה של דרוזופילה. מעגל זה מורכב מנוירוני הקרנה חזותית LC4 מוגדרים גנטית^30,31 שמזהים גירויים מתקרבים, ונוירונים יורדים מאופיינים היטב מסוג סיבים ענקיים (GF) שמניעים המראה מהירה^32,33, ומספקים מערכת אנטומית סטריאוטיפית למדידות מולקולריות ספציפיות לסוג תא במוחות שלמים.

חלבון מפרק הרווח של דרוזופילה , Shaking-B (ShakB)³⁴ , נמצא מעורב בהעברת חשמל בתוך מספר רכיבים במעגל GF, כולל סינפסות יציאה אקסונליות³⁵ וקלטים שמיעתיים³⁵. למרות שהראיות הישירות לקישור חשמלי בדנדריטים של GF במהלך גילוי מתקרב מוגבלות, מחקרים עדכניים מצביעים על כך שנוירוני LC4 מבטאים רמות גבוהות של shakB³⁶. תצפיות אלו הניעו את השימוש באסטרטגיות knockdown ו-taging של shakB כמקרה ניסוי להערכת השאלה האם הפרוטוקול יכול להעריך כמותית הפרעות מולקולריות ממוקדות הן ברמות ה-RNA והן ברמות החלבון בסוגי נוירונים מוגדרים גנטית.

ראשית הערכנו את יעילות knockdown של shakB ב-GF וב-LC4 באמצעות HCR-smFISH בשילוב עם צביעת נוגדנים ShakB. ה-GF, נוירון יחיד לכל חצי מוח, סומן בסמן ממברנה (איור 4A). LC4, אוכלוסייה של כ-60 נוירונים בכל חצי מוח, סומנו בסמן גרעיני כדי לאפשר כימות ברמת האוכלוסייה (איור 4B). במוחות הבקרה, תמלילי shakB זוהו בבירור הן בנוירוני GF והן ב-LC4. ביטוי של shakB RNAi הוביל לירידה משמעותית בפנקטה של shakB mRNA בנוירונים ממוקדים משני סוגי התאים (איור 4C–D). בהתאם לאתר הציטופלזמי של הפרעת ה-RNA, דלדול התמלול היה בולט במיוחד במחלקה הציטופלזמית. הפרדה של פונקטה גרעינית וציטופלזמית באמצעות כימות מבוסס FlySeg חשפה הפחתה סלקטיבית של תמלילי shakB ציטופלזמיים באוכלוסיית LC4, בעוד שפנקטות גרעיניות הושפעו פחות משמעותית (איור 4D, ירידה של 69% לעומת 22%, בהתאמה).

מצאנו צביעת נוגדנים של ShakB ממוקמת באזורים שבהם דנדריטים של GF חופפים לאקסונים של נוירונים פנימיים ענקיים (GCI), שמחברים בין שני הסיבים הענקיים ומאפשרים תגובות ויזואליות מנוגדות³⁷ (איור 4E). תצפיות אלו תואמות את המחקרים הקודמים³⁵ שהראו קישור חשמלי תלוי ב-ShakB בין ה-GF ל-GCI. צביעת נוגדנים ב-ShakB נצפתה גם באזורים שבהם אקסוני LC4 נוגעים בדנדריטים של GF, אם כי המיקום באזור זה היה פחות ברור. ללא קשר למיקום התת-תאי המדויק, אות נוגדני ShakB הקשור לאזור הדנדריטי של GF פחת משמעותית לאחר ביטוי RNAi (איור 4F).

עם זאת, זיהוי מבוסס נוגדנים אינו מאפשר הקצאה חד-משמעית של חלבון ShakB לטרמינלים פרה-סינפטיים של LC4 לעומת דנדריטים פוסט-סינפטיים של GF באתרי מגע. בנוסף, הביטוי הנרחב של shakB במערכת הראייה^34,36 מגביל את הכימות הספציפי לסוג התא בנוירוני LC4 באמצעות צביעת חיסון אנטי-ShakB. כדי להתגבר על מגבלות אלו ולהעריך ישירות את מיקום ShakB הספציפי לסוג התא, השתמשנו באלל shakB מתויג אנדוגני שיצרנו^{בעבר 36,38}. דבר זה אפשר ויזואליזציה סלקטיבית של חלבון ShakB, במיוחד בתוך נוירוני LC4. ShakB מתויג SmGdP-10×V5 הועשר הן בדנדריטים (התואמים לאזורי קלט מנוירונים ויזואליים במעלה הזרם) והן בטרמינלים אקסונים שנוגעים בדנדריטים GF (איור 4G). ביטוי של shakB RNAi גרם להיעלמות כמעט מוחלטת של אות V5 הן בתא הדנדריטי והן בתא האקסונלי (איור 4H). תוצאות אלו מראות כי הפרוטוקול מאפשר פתרון ייחודי לסוג תא ותת-תא של מיקום חלבונים אנדוגניים בתוך נוירופיל מעורבב בצפיפות.

כביקורת איכותנית נוספת, בדקנו FISH לא מורחב בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה באוכלוסיות נוירונליות שזוהו (איור משלים 1). אות FISH מ-grd חפף עם LC22 סומטה, בהתאם לביטוי החזוי מנתוני scRNA-seq באונה האופטית (איור משלים 1A–C)¹³. בנוירונים Tm3 המבטאים tdTomato, mRNA של tdTomato חפף עם חלבון tdTomato (tdTomato protein), בעוד ש-mRNA של VGlut1 לא חפף עם Tm3 סומטה, בהתאם לזהות הכולינרגית של נוירוני Tm3 (איור משלים 1)¹³. דוגמאות אלו ממחישות כי FISH + IHC לא מורחב מספיק להערכת נוכחות/היעדרות איכותנית, בעוד שנדרש הרחבה לכימות אמין של נקודה בודדת.

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מתבטא בתיוג ברור הספציפי לסוג התא, smFISH puncta בדידות עם רקע נמוך, סגמנטציה אמינה של גרעינים בודדים או נפחי תא מוגדרים ידנית, והפחתה עקבית של אות RNA או חלבון מטרה לאחר הפרעה. תוצאות שליליות או בעלות אות נמוך צריכות להיות גם ניתנות לפרשנות: לדוגמה, RNAi של shakB יצר אות mRNA מופחת של shakB ואות חלבון ShakB, בעוד ש-FISH לא מורחב הראה חוסר אות VGlut1 בסומטות Tm3 למרות זיהוי mRNA ברור של tdTomato (tdTomato mRNA). תוצאות לא אופטימליות כוללות אות נוגדן חלש או smFISH, פונקטה רקע גבוהה, סגמנטציה לא שלמה, שיוך שגוי של הפונקטות, או סטיית דגימה במהלך ההדמיה, שכולם יכולים להשפיע על כימות במורד הזרם.

איור 2. הרכבה והדמיה מורחבת של דגימות באמצעות פלטפורמות מיקרוסקופיה של יריעות אור ומיקרוסקופיה קונפוקלית. (א) ויזואליזציה וגזירת הידרוגלים מורחבים (1–2), המשותפים לכל פלטפורמות ההדמיה, ואחריה התקנה למיקרוסקופיה של גיליון אור (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) צילום של דגימה מורחבת המותקנת על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הפוך (Nikon Ti2-E AXR). (C) חתכים אופטיים בודדים מייצגים (מישורי Z בודדים) של דגימת מערכת ראייה מורחבת של דרוזופילה (נוירונים LC4 מסומנים בסמן גרעיני פלואורסצנטי) שנבדקו עבור mRNA של shakB (ראו איור 4), שנאספו בשלוש פלטפורמות הדמיה. מוטות קשקשים, 10 מיקרומטר (רקמה לאחר התפשטות). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3. ניתוח כמותי של smFISH puncta באמצעות FlySeg. (א) סקירה סכמטית של תהליך ניתוח FlySeg לסגמנטציה אוטומטית וכימות נקודות בתוך תאים מזוהים. (B) טסלציה תלת-ממדית של וורונוי הממחישה את לוגיקת הסגמנטציה המרכזית של FlySeg. נפח ההדמיה מחולק לתחומים מרחביים (כל אחד מוצג בצבע מובחן), כאשר כל חלוקה מוגבלת להכיל לכל היותר גרעין אחד, מה שמבטיח הקצאה לתא יחיד. בתוך כל תחום וורונוי, הגרעין מחולק באמצעות תהליך אופטימיזציה פונקציונלית שקובע את פני השטח הגרעיניים האופטימלי בהתבסס על ערכי עוצמת הגרעין והציטופלזמה הסובבת. (ג) הדגמה של אפשרות --nuclei_dilation להבחין בין תמלילים גרעיניים וציטופלזמיים קטע אופטי יחיד המציג גרעין מסומן GFP מוקף בפנקטה smFISH, עם אות DAPI מפוזר המתאר את תא הציטופלזמה לאחר טיפול ב-DNase. הקווים מציינים גורמי התרחבות של 0 ו-0.5, המתאימים לנפחים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה. (D) הקרנת עוצמה מקסימלית של (C), המדגימה שהנקודה ממוקמת הן את המחלקים הגרעיניים והן את התאים הציטופלזמטיים. מוטות קשקשים, 10 מיקרומטר (רקמה לאחר התפשטות). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4. אימות זרימת העבודה הכמותית באמצעות הפרעה מולקולרית מתווכת RNAi (A) הקרנות של גיליון אור (עובי 10 מיקרון, שאינן מכסות את נפח התא המלא) של סומה Giant Fiber (GF) המסומנת בסמן ממברנה ונבדקה ל-shakB mRNA בתנאי שליטה (למעלה) ו-shakB RNAi (תחתון). קווי מתאר ירוקים מקווקו מצביעים על גבולות סומה כדי להדגיש דלדול מאגר ה-mRNA הציטופלזמי אך לא של מאגר ה-mRNA הגרעיני. N, מוח (צד אחד לכל חיה). (B) זהה ל -(A) עבור נוירוני LC4 המסומנים בסמן גרעיני. (ג) כימות של פנקטות shakB FISH בנוירוני GF (בריכות גרעיניות וציטופלזמיות משולבות) בתנאי RNAi מבוקרים ו-shakB . נקודות מייצגות נוירונים בודדים (נוירון אחד לכל מוח, צד אחד לכל בעל חיים). (D) זהה ל -(C) עבור נוירוני LC4. נקודות מייצגות מוחות בודדים (צד אחד לכל בעל חיים; ספירת נקודות לכל תא בממוצע למוח). (ה) הקרנות קונפוקליות של דנדריטים של GF, מסומנות בסמן ממברנה וצובעים עבור ShakB בתנאי שליטה (למעלה) ו-shakB RNAi (למטה). (ו) כימות רמות חלבוני ShakB בדנדריטים של GF שנמדדו כממוצע עוצמת פלואורסצנציה תחת שליטה ותנאי RNAi של GF>shakB . N, מוח (צד אחד לכל חיה). (G) הקרנות קונפוקליות של נוירוני LC4 המסומנים בסמן ממברנה ומבטאים ShakB עם סימון smGdP-10xV5 בתנאי RNAi בשליטה (למעלה) ו-shakB RNAi (למטה). קווי מתאר ירוקים מקווקו מציינים אזורים של דנדריטים LC4 וטרמינלים אקסונים שבהם הוערכה צפיפות ShakB-V5 (H) כימות רמות חלבוני ShakB-smGdP-V5 בדנדריטים ובטרמינלים האקסונים של LC4 שנמדדו כעוצמת פלואורסצנציה ממוצעת תחת שליטה ותנאי LC4 > RNAi של shakB . N, מוח (צד אחד לכל חיה). שורות השגיאה מציינות ממוצע ± SEM. כל ההשוואות הסטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחני t דו-צדדיים של וולש. פסי קשקש, 10 מיקרומטר בכל התמונות (רקמת פוסט-התרחבות). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

פרוטוקול זה משלב HCR-smFISH בסיוע התרחבות, אימונוהיסטוכימיה לפני התפשטות, וכימות תמלול מבוסס סגמנטציה כדי לאפשר מדידות RNA וחלבון תואמים באותם נוירונים מוגדרים גנטית. על ידי שילוב רכיבים אלה בזרימת עבודה אחת, שיטה זו אמורה להקל על ניתוח מולקולרי כמותי ספציפי לסוג תא במוח דרוזופילה השלם.

מספר שינויים מעשיים שהוצגו כאן מהווים צעדים קריטיים לשילוב אימונוהיסטוכימיה עם HCR-smFISH בסיוע התרחבות^במוח דרוזופילה. ראשית, יש לבצע אימונוהיסטוכימיה לפני התרחבות הרקמה ו-smFISH. מכיוון שהפרוטוקול כולל שלב עיכול של פרוטינאז K, ביצוע אימונוהיסטוכימיה לאחר התרחבות עלול להפחית את שלמות האפיטופים. חשוב לציין כי דגירה של נוגדנים לפני התרחבות (24 שעות ראשונית + 24 שעות משנית) אינה מפחיתה באופן ניכר את עוצמת אות ה-RNA כאשר משתמשים בטכניקת ניקוי RNase ובעיגון RNA קוולנטי. שנית, יש להעלות את ריכוזי הנוגדנים הראשוניים והמשניים, בדרך כלל ב-2–3× ביחס ל-IHC שלם, כדי לפצות על אובדן אות הקשור לעיכול ולהתרחבות הרקמות של פרוטינאאז K. שלישית, תנאי קיבוע חשובים לשימור גם חלבון וגם אות RNA. קיבוע גליאוקסלי ללא חומצה משפר את שימור מיקום חלבוני סינפטי מנוקדים, שומר על שלמות מבנית של תהליכים נוירונים, ואינו פוגע בזיהוי כמותי של mRNA puncta. כמו כן, שמנו לב כי עיגון סימולטני של RNA וחלבון תואם הן ל-HCR-smFISH במורד הזרם והן לזיהוי אימונופלואורסצנציה. ביחד, התאמות אלו משפרות את התאימות בין אימונוהיסטוכימיה לזיהוי תמלול בסיוע התרחבות.

הרחבה מוסיפה שלב לילה אחד ואינה מורכבת טכנית, אך השימוש בה תלוי במטרה הניסויית. כפי שמודגם באיור המשלים 1, FISH לא מורחב בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה מספיק כדי להעריך האם גן מתבטא בסוג תא מסוים, בעוד שנדרש התרחבות כאשר יש לפתור באופן אמין של פנקטות smFISH בודדות, להקצות לסומטה בודדת ולנתח כמותי, בשל העלייה המשמעותית ברזולוציה מרחבית אפקטיבית. באופן דומה, לוחות רב-בארות בסגנון טרסאקי אינם נדרשים בהכרח, אך הם מפחיתים את השימוש בתגובה, מאפשרים עיבוד של מספר תנאים במקביל, ועוזרות לשמור על זהות הדגימה באצווה קטנה; צינורות מיקרוצנטריפוגות סטנדרטיים יכולים לשמש גם כאשר נפח המגיב פחות מגביל. למרות שמיקרוסקופיית יריעת אור מאפשרת הדמיה נפחית מהירה של רקמות מורחבות, אנו מראים שמערכות קונפוקליות של דיסק עם סריקה הפוכה והדיסק המסתובב מספיקות להדמיה מלאה של אוכלוסיות נוירונים נבחרות במוח הדרוזופילה המורחב. מגבלה נפוצה של מיקרוסקופיה קונפוקלית היא מרחק עבודה קצר. עם זאת, מכיוון שמוח הזבוב קטן והדגימות מורחבות בכ-2× ב-PBS, מטרות טבילה במים למרחקים ארוכים מספקות עומק חדירה מספק. להשוואות כמותיות, יש לשמור על הגדרות רכישה זהות בין הדגימות, להימנע מפיקסלים רוויים, וגודל הווקסל צריך להספיק כדי לפתור נקודות smFISH בודדות. דבר זה מרחיב את הנגישות של הפרוטוקול למעבדות ללא מכשור ייעודי ליריעות אור.

המימוש המעודכן של FlySeg מבוסס על מסגרת FlySeg שפורסמה קודם ומציג שתי תוספות עיקריות לפרוטוקול זה. ראשית, פרמטר התרחבות גרעינית שניתן להתאמה מאפשר לסווג את smFISH puncta כגרעיני או ציטופלזמי בהתבסס על הקשר המרחבי שלהם לגרעינים מקוטעים. צביעת DAPI ציטופלזמית לאחר טיפול ב-DNase חשובה לשלב זה, שכן היא מספקת אות מפוזר המתאר את גוף התא ותומכת בסגמנטציה גרעינית אמינה, התומכת בהפרדה בין בריכות תעתיק גרעיני וציטופלזמי. שנית, זיהוי חריג אוטומטי מזהה גרעינים מחולקים בצורה לקויה, שניתן להוציא אותם מכימות במורד הזרם. מעבר להערכת ההשפעות המולקולריות של הפלת גנים ספציפית לסוג תא, הפרדת תמלילים גרעיניים וציטופלזמיים יכולה להיות אינפורמטיבית כאשר מיקום התמלול משקף פעילות שעתוק מתמשכת. במוח היונקים, תמלולי גנים מוקדמים מיידיים הנגרמים על ידי פעילות מופיעים תחילה בגרעין ולאחר מכן מצטברים בציטופלזמה כאשר mRNA מעובדים ומיוצאים³⁹, עיקרון המשמש בניתוח catFISH⁴⁰ של זמני הפעלה נוירונים. האם דינמיקת שעתוק דומה מתרחשת במוח הדרוזופילה אינה ידועה כיום, אך ניתן לעקרון זאת באמצעות תהליך העבודה הנוכחי. בכל ניסוי פולס-רדיפה אחר, הבחנה בין פונקטה גרעינית לציטופלזמה עשויה לספק מידע זמני מעבר לספירת התמלול הכוללת. במקביל, זרימת העבודה אינה מוגבלת לסגמנטציה גרעינית וניתן להתאים אותה לסגמנטציה של תאים שלמים (כלומר, מוגדרים על ידי ממברנה). זרימת העבודה הכמותית הנוכחית מותאמת לסומטה נוירונלית; למרות שניתן להדגים אזורים של נוירופילים, הקצאה כמותית של פונקטות mRNA לאקסונים או דנדריטים בודדים תדרוש אסטרטגיות סגמנטציה נוספות ספציפיות לאזור. FlySeg שימושי בעיקר לכימות אוטומטי עם תפוקה גבוהה באוכלוסיות נוירונים צפופות שבהן נדרשת סטטיסטיקות ברמת אוכלוסייה. לנוירונים הניתנים לזיהוי אישי או לתאים מוגדרים ידנית, כלים אחרים כמו Imaris או FIJI/ImageJ עשויים להתאים יותר. סיכום של אסטרטגיות הכימות הללו, כולל היישומים העיקריים, היתרונות והמגבלות שלהן, מסופק בטבלה משלימה 1.

נקודות נפוצות לפתרון בעיות כוללות אות נוגדנים חלש, רקע smFISH גבוה, נזק לג'ל או אובדן דגימה, סטיית דגימה במהלך ההדמיה וחלוקה לקויה. אות נוגדן חלש יכול להשתפר לעיתים קרובות על ידי הגברת ריכוז הנוגדנים או הארכת דגירות נוגדנים ראשוניות ו/או משניות מ-24 שעות ל-48 שעות. רקע גבוה ב-smFISH ניתן לעיתים להפחית על ידי הארכת שטיפות לאחר ההיברידיזציה והימנעות מסביבות רכישה רוויה. נזקי ג'ל ואובדן דגימה מצטמצמים על ידי שימוש בקצות רחבי קנה, חיתוך ג'לים עם חיתוכים ישרים, וחיתוך תעלות אוורור למניעת בועות במהלך מילוי התא. סטיית הדגימה במהלך ההדמיה מופחתת על ידי איזון ג'לים מותקנים לפחות שעה לפני הרכישה; אם הסטייה נמשכת, ניתן להאריך את האיזון ל-2 שעות או יותר. סגמנטציה לקויה יכולה להיגרם מצביעת DAPI ציטופלזמית חלשה או מאיזון דגימה לא שלם, מה שעלול להפחית את אות גבול התא או לגרום לשינויים ב-X-Y-Z במהלך הרכישה; יש לבדוק אותם לפני שינוי פרמטרי FlySeg. בפרוטוקול זה, הג'לים נשמרים ב-1× PBS, מה שמוביל להתרחבות איזוטרופית של כ-2×. אם נדרשת רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, ניתן להשיג התרחבות גדולה יותר ב-PBS מדוללים או במים דה-יוניים. לעומת זאת, כאשר המטרה היא רק להעריך נוכחות או היעדר ביטוי בסוג תא מוגדר, FISH לא מורחב בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה עשויים להספיק, כפי שמודגם באיור המשלים 1. הפרוטוקול נשאר תואם לתהליכי עבודה איטרטיביים של FISH. ניתן להסיר פרובים וסיכות שיער HCR באמצעות טיפול ב-DNase, מה שמאפשר סבבים נוספים של היברידיזציה והגברה באותו דגימה. הרחבות טכניות עתידיות עשויות לכלול HCR-smFISH איטרטיבי ב-plex גבוה יותר, רישום אוטומטי לאורך סבבי הדמיה, שיפור בחלוקת תא שלם או נויריטים, וצינורות ניתוח סטנדרטיים יותר להשוואת אותות RNA וחלבון בין ניסויים. פיתוח נוסף של אסטרטגיות סגמנטציה ספציפיות לתחום יכול להרחיב ניתוח כמותי מעבר לסומטות נוירונליות לאקסונים ודנדריטים. ביחד, הקריאה המשולבת של RNA–חלבון, כימות תמלול רזולוציה בתחום, ותאימות לפלטפורמות הדמיה סטנדרטיות הופכים את תהליך העבודה הזה למתאים לניסויי אימות מולקולרי ממוקדים בנוירונים מוגדרים גנטית במוח הדרוזופילה השלם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת נתרן הידרוקסיד 10N	פישר סיינטיפיק	Cat# SS255-1
תמיסת הידרוקסיד נתרן 1N	פישר סיינטיפיק	Cat# SS266-1
20X בופר ציטראט מלח-נתרן	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Hydroxy-TEMPO	סיגמא-אלדריץ'	חתול# 176141
תמיסת כלוריד נתרן 5M	סיגמא-אלדריץ'	Cat# S5150
אקרילאמיד	סיגמא-אלדריץ'	Cat# A9099
חומצה אקרילית	סיגמא-אלדריץ'	Cat# 147230
Acryloyl-X, SE	Invitrogen	Cat# A20770
אדובי אילוסטרייטור	Adobe	לא זמין
אלקסה פלואר 488 אנטי-תרנגולת עזים (1:200)	מעבדות מחקר חיסוני ג'קסון	קטגוריה# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 נגד עכבר עזים IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 נגד ארנב עזים IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
אמוניום פרסולפאט	סיגמא-אלדריץ'	קטגוריה# A3678
DMSO חסר מים	סיגמא-אלדריץ'	Cat# 900645-4X2ML
דבק קונדיק לקיבוש UV	בונדיק	ערכת התחלה של בונדיק
תוכנת הדמיה cellSens v4.4.1	Evident Scientific	לא זמין
אנטי-GFP פוליקלונלי עוף (1:400)	אבקאם	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
קונדה (מנהל סביבה)	אנקונדה, בע"מ	לא זמין
קורנינג וטרייד; שקופיות מיקרוסקופ קרוז	קורנינג	קט# 2948-75X25
מחזיק דגימות LS7 בעיצוב מותאם אישית	ג'נליה טק;	מזהה 2021-021
DAPI	סיגמא-אלדריץ'	Cat# D9542
סקלפל סטריל חד-פעמי מנירוסטה	מדפרייד	MPR-47101
אתילנדיאמין טטראצטית	סיגמא-אלדריץ'	Cat# EDS-100G
תוכנת ניתוח תמונות Fiji (ImageJ) v2.14.0	קונסורציום ImageJ	לא זמין
FlySeg (צינור מותאם אישית)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	לא זמין
GAF fixative solution	Addax Biosciences	Cat#VI25
GenClone® 24 לוחות תרבית תאי באר, לא מטופלים	ג'נסי סיינטיפיק	קטגור# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	מרכז המלאי בלומינגטון	#41315
עדר תורם סרום עזים	סיגמא-אלדריץ'	Cat# G6767
HCR™ RNA-FISH (v3.0) בופר מגבר	מכשירים מולקולריים	לא זמין
HCR™ RNA-FISH (v3.0) מגברים: AF546, JF669	מכשירים מולקולריים	לא זמין
HCR™ RNA-FISH (v3.0) בופר היברידיזציה	מכשירים מולקולריים	לא זמין
HCR™ RNA-FISH (v3.0) בופר שטיפה	מכשירים מולקולריים	לא זמין
HCR™ RNA-FISH (v3.0) ShakB Probe	מכשירים מולקולריים	לא זמין
אימאריס 10.1	אוקספורד אינסטרומנטס	לא זמין
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב IXPlore IX85 SpinSR	Evident Scientific	לא זמין
מיקרוסקופ יריעת אור LS7	קרל צייס	לא זמין
מלפאלן	קיימן כימיקל	קטגורוג# 16665
MOPS Buffer	פישר סיינטיפיק	Cat# BP308-100
עכבר מונוקלונלי אנטי-V5 (SV5-PK1) (1:100)	אבקאם	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N',N',N'-טטראמאתילתילנדיאמין	סיגמא-אלדריץ'	Cat# T7024
N,N'-מתילן-ביסקרילאמיד	סיגמא-אלדריץ'	Cat# M7279
נפארי	קהילת קוד פתוח	לא זמין
תוכנת הדמיה מתקדמת של NIS-Elements	תאגיד ניקון	לא זמין
מים ללא נוקלאז	קיאגן	Cat# 129114
Nunc&Trade; מיני-טרייס עם Nunclon & trade; Delta surface	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7.4	גיבקו	Cat# 70011044
דטרגנט Photo-Flo	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	קט# 74257
תמיסת פולי-אל-ליזין	טד פלה	Cat#18026
משקפי כיסוי מדויקים, #1.5H עובי	Thorlabs	חתול# CG15CH2
Press-to-Seal&Trade; מבודד סיליקון עם דבק, באר אחת, קוטר 20 מ"מ, עומק 0.5 מ"מ	Invitrogen	Cat# P24740
פרוטינאז K	ניו אינגלנד  מעבדות ביולוגיות	Cat# P8107S
ארנב אנטי-שייקבי (1:400)	מתנה מג'יורד אמר	לא זמין
RNase AWAY וטרייד; חומר ניקוי פני שטח	Invitrogen	Cat# 7002
ערכת DNase ללא RNase	Qiagen	קט# 79256
שניידר s Drosophila Medium	גיבקו	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto ואח', 2025	PMID: 41278920
נתרן אזיד	סיגמא-אלדריץ'	Cat# S8032
מיקרוסקופ סטמי סטמי 508	קרל צייס	לא זמין
SYTO™ 41 צבע חומצה גרעינית פלואורסצנטית כחולה	Invitrogen	Cat# S11352
מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר Ti2E AXR NSPARC	תאגיד ניקון	לא זמין
טריס בייס	פישר סיינטיפיק	Cat# BP152-500
טריטון וטרייד; X-100	סיגמא-אלדריץ'	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	סנפיליפו ואח' 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	דומברובסקי ואח', 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	מרכז המלאי בלומינגטון	#35785
UAS-myr::GFP;	מרכז המלאי בלומינגטון	#32198
UAS-shakB RNAI	אמר ואח', 2022	PMID: 35385694
UltraPure&Trade; 1M Tris-HCI, pH 8.0	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (סיב ענק)	דומברובסקי ואח', 2025	PMID: 40468081
זן בלאק 3.1	קרל צייס	לא זמין