פרוטוקול למעקב וכימות התנהגותי אוטומטי בדרוזופילה מלנגסטר

Summary

פרוטוקול זה משתמש בהערכת תנוחה באמצעות פייתון כדי לעקוב אחר נקודות גוף מרכזיות בדרוזופילה זוגית, ומקל על כימות אוטומטי של התנהגויות חברתיות עדינות, במיוחד באינטראקציה חברתית, וכן במפות חום ומסלולי תנועה.

Abstract

כדי לפתח כלי אנליטי בקוד פתוח המתגבר על המגבלות של שיטות מעקב מסורתיות מבוססות סנטרואידים, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מדויק של אינטראקציות חברתיות בזוגות דרוזופילה הפועלים בחופשיות. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מושפע ממסגרת הרשת ברזולוציה גבוהה (HRNet) שמטרתה לעקוב בו-זמנית אחרי חמישה נקודות מפתח אנטומיות — ראש, חזה, בטן וקצות אגף שמאל וימין — במטרה לייצר נתוני קואורדינטות ברזולוציה גבוהה לניתוח כמותי נוסף של התנהגויות חברתיות. פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מלא המבוסס על פייתון וממשק משתמש גרפי (GUI) שעיצבנו, כולל בניית מערכי נתונים, אימון מודלים וחילוץ קואורדינטות אוטומטי, לצד מודולים משולבים ליצירת מפות חום לתפוסה מרחבית, מסלולי תנועה ויחסי אינטראקציה חברתית בזבובים. כדי לאמת מסגרת זו, היא נבדקה באמצעות שני זנים נפוצים, w1118 ו-Canton-S (CS). התוצאות שלנו הדגימו את יציבות זיהוי נקודות מפתח וחשפו הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בשימוש מרחבי ובמבנה הקטר. מתודולוגיה זו מספקת בסיס ניתן להרחבה לאתולוגיה כמותית ולניתוח אוטומטי של אינטראקציות חברתיות בדרוזופילה, תוך הפחתת מאמץ ההערות הידניות ושיפור השחזוריות.

Introduction

דרוזופילה מלנגסטר הוא אורגניזם מודל נפוץ עם כלים גנטיים רבי עוצמה ומעגלים עצביים ממופים היטב המאפשרים ניתוח מכני של התנהגות¹. יש לו מגוון רחב של התנהגויות חברתיות, כולל חיזור ותוקפנות, ויכולת למידה חזקה 2,3,4,5,6,7,8. כל אחד מהם מורכב מאלמנטים מוטוריים מובחנים הנשלטים על ידי מערכת עצבים קומפקטית אך מאורגנת היטב. חשוב לציין שמדידה מדויקת של יציבת הגוף חיונית להבנת היסודות הנוירולוגיים של בחירת פעולה, שכן רבות מההתנהגויות הללו מכילות מוטיבים מדויקים של יציבה שמקודדים מידע הקשרי ומצב פנימי ^9,10.

למרות הצורך ברזולוציית זבוב יחיד כדי ללכוד הבדלים בודדים, רבות מהבדיקות ההתנהגותיות בעלות תפוקה גבוהה בדרוזופילה עדיין מסתמכות על מדדים ברמת קבוצה¹¹. בדיקות התנהגות בעלות תפוקה גבוהה כוללות בדיקות T-maze להעדפה חברתית ^12,13, בדיקות רווח חברתי שמכימות מרחק בין זבובים, או פרדיגמות הצטברות/הימנעות תחת גירוי חושי¹⁴ שיכולות ללכוד ביעילות מגמות אוכלוסייה. עם זאת, הן כרוכות במהותן ממוצע בין יחידים, ובכך מטשטשות הטרוגניות ברצפי פעולה ובמבנה הזמן של חילופי הדברים החברתיים. במהלך השנים, ניסיונות להתקדם לזיהוי לפי זבוב הסתמכו על שיטות מוגבלות פונקציונלית, כגון זיהוי אירועים מבוסס כללים באמצעות ספי קינמטיים, חיסור רקע באמצעות מעקב מרכזי, והערות וידאו ידניות 15,16,17,18. כתוצאה מכך, התנהגויות נפרדות כמו זינוק, טפיחה או איומי כנפיים לעיתים קרובות מתעלמים מהן או מסומנות לא נכון, מה שמצריך תיקון ידני משמעותי. מגבלות כאלה הגבילו מחקרים מכניים שדורשים יישור זמני מדויק בין פעילות עצבית לפעולות אישיות.

פתרון מהפכני זמין כעת בזכות התפתחויות אחרונות בראיית מחשב והערכת תנוחה מבוססת למידת מכונה. מסגרות קוד פתוח כמו DeepLabCut¹⁹ ו-SLEAP²⁰ מאפשרות זיהוי חלקי גוף ללא סימנים, סיווג ניתן להרחבה של פעולות נפרדות, ושימור זהות אישית גם במהלך אינטראקציות קרובות. תכונות אלו מתגברות על החסרונות של גישות מבוססות קבוצה וכללים קודמות ומאפשרות כימות חוזר של התנהגויות חברתיות מורכבות.

אינטראקציות אישיות בדרוזופילה מאופיינות בתכונות מוטוריות ייחודיות המצביעות על התקדמות האינטראקציות החברתיות. תוקפנות, למשל, כוללת התנהגויות טיפוסיות כמו קפיצה, איומי כנפיים ואחיזה, שכולן מייצגות שלבי קונפליקט הולכים וגדלים^21,22. חיזור מוגדר באופן דומה על ידי אוריינטציה, הארכת כנפיים חד-צדדית עם הפקת שירה, נקישות וניסיונות להזדווגות, שמתחברים ליצירת רצף זמני של אינטראקציות הזיווג²³. לכידת המוטיבים הללו תלויה בזיהוי מדויק של יציבת הגוף ותנועות מפרקים^24,25. בפועל, דגימה דורשת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה לאורך תקופות הקלטה ממושכות כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות וליישר דפוסים מוטוריים עדינים במדויק עם פעילות עצבית^25,26.

כאן, אנו מציגים מסגרת קוד פתוח, מבוססת ראייה, לזיהוי אוטומטי של חמש נקודות מפתח אנטומיות—ראש, חזה, בטן, קצה אגף שמאל וימין²⁷. המערכת כוללת תהליך עבודה מלא לבניית מערכי נתונים, אימון מודלים וחילוץ קואורדינטות, ומפיקה נתוני סדרות זמן ברזולוציה גבוהה המתאימים לסיווג התנהגותי מותאם אישית. על ידי אוטומציה של תהליכי הערות ידניות וסטנדרטיזציה של תהליכי עבודה אנליטיים, השיטה שלנו מאפשרת ניתוח כמותי בקנה מידה עדין של התנהגויות אינטראקציה חברתית, מה שמגביר את היעילות והשחזוריות תוך הפחתה משמעותית של הזמן והעבודה הנדרשים לניתוח.

כדי לאמת את אמינות המערכת, יישמנו אותה על שני זנים נפוצים במעבדה, w1118 ו-Canton-S (CS), וזיהינו זיהוי יציב של נקודות מפתח בין מסגרות, וכן הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בתפוסה מרחבית, מאפייני מסלול ומדדי אינטראקציה חברתית בהתבסס על מרחק ראש וזווית כיוון. חוקרים יכולים להעריך את ההתאמה של פרוטוקול זה בהתבסס על רזולוציית מרחב-זמן נדרשת (≥30 fps, ≤0.5 מ"מ/פיקסל) ותנאי הקלטת וידאו (תאורה וניגודיות). גודל הפיקסל ניתן לקבוע ישירות מהגדרות המצלמה. זבוב פירות עם אורך גוף מדוד יכול להיות ממוקם בשדה הראייה לצורך כיול. פרוטוקול זה מתאים במיוחד לתרחישים הבאים: הצורך לעקוב בו-זמנית אחרי שתי דרוזופילה הפועלות בחופשיות ולהבחין בזהות האישית שלהן; התמקדות ביציבות עדינות (למשל, זווית ראש ומרחק) במקום רק במיקומי המרכז; משך הקלטה העולה על 10 דקות כאשר לא ניתן לבצע הערות ידניות; נדרש יישור זמני ברמת אלפיות שנייה בין אירועים התנהגותיים לפעילות עצבית (למשל, הדמיית סידן או אלקטרופיזיולוגיה) בניתוחים הבאים.

Protocol

1. הכנת זבובים

1. איסוף ומין של הזבובים בגיל 3–4 ימים תחת הרדמה קצרה של CO₂ לפני הניסויים.
   הערה: משך ההרדמה וקצב זרימת CO₂ עשויים להשתנות בהתאם למפרט וללחץ של גליל הפחמן הדו-חמצני המשמש בכל מעבדה. יש לעקוב אחרי זבובים באופן רציף במהלך ההרדמה, ולשמור על חשיפה ל-CO₂ רק עד שהזבובים יורדמו במלואם ויפגינו הפסקה מוחלטת של תנועה.
2. הניחו כל זבוב בנפרד בתוך צינור Falcon בנפח 50 מ"ל המכיל מדיום סטנדרטי של קמח תירס–אגר–גלוקוז–שמרים.
3. שמרו על זבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור אור/חושך של 12 שעות עד השימוש.

2. בניית הזירה

1. הכינו שני לוחות אקריליק שקופים בקוטר 3 מ"מ ולוח פוליאתילן אחד בקוטר 3 מ"מ.
2. חתוך ארבעה תאים עגולים (קוטר 35 מ"מ כל אחד) במרכז פלטת הפוליאתילן.
3. השתמשו בקליפים כדי להדביק פלטת אקריליק אחת לפלטת הפוליאתילן ליצירת בסיס החדר; שמור על הפלטת האקרילית השנייה ככיסוי נשלף.

איור 1: סכמטי של תחום ההתנהגות והגדרת הדמיה. (א) בניית חדר תצפית מותאם אישית מוצגת בדיאגרמה. התא מורכב משלוש שכבות עיקריות: לוח בסיס אקרילי שקוף בקוטר 3 מ"מ; לוח פוליאתילן בקוטר 3 מ"מ עם ארבעה חיתוכים עגולים בקוטר 35 מ"מ המשמשים כבארות תא נפרדות; ולוחית אקרילית שנייה המשמשת ככיסוי נשלף. (ב) מהדק מתאם 90° משמש להתקנת המצלמה אנכית על עמוד אופטי בקוטר 40 ס"מ. לצילום מלמעלה למטה, המצלמה ממוקמת ישירות מעל זירת התצפית הרב-שכבתית, כאשר הציר האופטי שלה ניצב על פני שטח התא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הגדרת הדמיה

1. הרכיבו שני עמודי אופטיקה בקוטר 20 ס"מ ועמוד אחד בקוטר 40 ס"מ עם מהדקי מתאם בזווית 90°.
2. התקן את המצלמה (1280 × 1024 פיקסלים) אנכית על עמוד ה-40 ס"מ, מיושר בניצב למשטח הזירה, וקבע את קצב הפריימים ל-150 fps.
3. הניחו את הזירה על פאנל LED לבן באור יום בגודל 25 ס"מ × 25 ס"מ, המכוסה בדף דיפוזיה.
4. כוון את התאורה לכ-1500 לוקס על פני האולם.
   הערה: ודא שקצוות הכנפיים נשארים גלויים בתצוגה הבינארית. הימנעו מ->2000 לוקס כדי למנוע ארטיפקטים שנגרמו מחום, שכן זבובים עלולים לשנות את תנועתם הטבעית או את התפלגותם עקב מאמץ תרמי ממקור האור.

4. הליך הקלטה

1. הניחו רפידות קצף בקוטר 3 ס"מ מתחת לכל פינה של הזירה כדי לייצב אותה.
2. מעבירים זוגות זבובים תחת הרדמה CO₂ לחדרים; אטום עם הפלטת האקרילית העליונה.
3. תן לזבובים להסתגל ל-40 דקות לפני ההקלטה.
4. התחל ברכישת וידאו באמצעות MIAS.exe²⁷: לחץ על q כדי להתחיל ו-C כדי לעצור.
   הערה: זה מוביל להקלטות וידאו רציפות של זוגות זבובים הפועלים בחופשיות בתנאים סטנדרטיים.

5. הגדר את פאנל הפעילות החברתית

1. הרץ את סקריפט הקדם-עיבוד: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   הערה: כל סקריפטי הקידוד מסופקים בקובץ משלים 1.
2. יש להוסיף הערות לאזור התא ולהקצה מטא-דאטה בצורת Genotype_age (ימים) × 1 (מספר חדרים). (למשל, CS_3 × 1)
3. כוון את סרגל הזיהוי עד שהכנפיים כמעט בלתי נראות בתמונה הבינארית כדי להבטיח חיסור אופטימלי ברקע ונראות כנפיים.

6. הכנת מערכי נתונים

1. צור תיקיית סט נתונים חדשה על ידי הרצה:
   PYTHON tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (מרווח דגימת פריימים)
   הערה: פרמטר מרווח דגימת המסגרת ("10") הותאם מפרוטוקול²⁷ שפורסם בעבר. ערכים נמוכים מעלים צפיפות דגימה ועומס חישוב, בעוד שערכים גבוהים מפחיתים את הביקוש החישובי וניתן להתאים אותם בהתאם לביצועי חומרה זמינים ולדרישות ניסוי.
2. הגדר נתיב וידאו ונתיב סט נתונים ב'כלים/SoAL_DatasetUtils.py'
3. הפעלת ממשק תיוג ידני:
   >python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. ניווט במסגרת: לחץ על מקש הרווח או מקש Z כדי לנווט לפריים הבא או הקודם, בהתאמה. חלופה נוספת היא להשתמש במחוון ציר הזמן לניווט.
   2. סימון נקודות מפתח: לחץ על המיקום הנכון של זבוב בכל תמונה (ברצף מסוים: ראש, חזה, בטן, כנף שמאל וכנף ימין) כדי לסמן את 5 נקודות המפתח.
   3. בחירת נקודת מפתח: לחץ על מקשי מספר כדי לבחור נקודת מפתח (מסומנת בעיגול לבן). הלחיצה הבאה תקצה מחדש מספר חדש לנקודת המפתח שנבחרה.
   4. שמירה: סגור את החלון או לחץ על מקש D כדי לשמור את תוצאות ההערות.
      הערה: ארכיון סט אימון מלא מורכב משני רכיבים: תיקיית תמונות וקובץ annotation.json.

7. אימון מודלים

1. חלק את מערך הנתונים למערכי אימון ואימות:
   Python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME divide
   שתי תיקיות חדשות ייוצרו ב-'dataset/.'
2. הגדר פרמטרי אימון ב-hrnet/fly_w32.yaml:
   מקדם סיבוב: 15°
   מקדם קנה מידה: 0.35
   מקדם בהירות: 0.25
   גודל אצווה: 24
   תקופות: 200
3. הפעילו את תוכנית ההדרכה:
   Python HRNET/tools/train.py --CFG HRNET/fly_w32.yaml
   סיום מערכי אימון כאשר רמת דיוק ממוצע (AP) מגיעה; לשמור על המודל הטוב ביותר (AP > 90%).
4. אימות מודל באמצעות:
   Python HRNET/tools/test.py --CFG HRNET/fly_w32.yaml
   תוצאה: מודל מבוסס HRNet חזק לזיהוי נקודות מפתח מרובות זבוב.

8. הרץ את תוכנית הגילוי

1. העתק קבצי וידאו חדשים לתיקיית הווידאו.
2. הערות על מטא-דאטה כפי שמוצג בשלב 5.
3. הרצת תוכנית גילוי: פייתון SoAL_KptDetect.py הכל
4. בדוק תוצאות גילוי:
   Python Tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   תוצאה: קואורדינטות דו-ממדיות של חמישה נקודות ציון אנטומיות לכל טיסה בין מסגרות.

9. כימות התנהגותי

1. הפעיל אפליקציית מעבד גרפי עצמאית לניתוח (קובץ משלים 2) וייבא קבצי קואורדינטות לממשק.
2. יצר מפות חום לתפוסה מרחבית (צפיפות הסתברות של מיקומי הזירה).
3. שחזור מסלולי תנועה מתוך סדרות זמן קואורדינטות.
4. צור נתוני אינטראקציה חברתית, כולל מרחק ראש, נטייה ומצב חברתי נגזר.
   תוצאה: ויזואליזציה סטנדרטית של שימוש מרחבי ספציפי לגנוטיפ ודינמיקת תנועה.

Results

איור 1 ממחיש את גאומטריית הזירה, תצורת התאורה ומיקום המצלמה המשמשות לתיעוד אינטראקציות חברתיות טבעיות בדרוזופילה. ההתקנה מבטיחה תאורה אחידה ותנאי הדמיה יציבים המתאימים להערכת תנוחה ולחילוץ קואורדינטות.

הערכת תנוחה אוטומטית יושמה על כל הסרטונים המוקלטים כדי להפיק קואורדינטות דו-ממדיות לנקודות מפתח אנטומיות מוגדרות מראש של כל זבוב. המודל זיהה בעקביות את מפרקי הראש, החזה, הבטן והכנף בין מסגרות, אפילו במהלך אינטראקציות בטווח קרוב. איור 2 מציג מסגרת מייצגת עם נקודות מפתח מונחות מעל, המדגימה מעקב מדויק של מספר זבובים וזיהוי יציב של נקודות מפתח לאורך כל ההקלטה. אמינות שלב זה מבטיחה שסדרת הקואורדינטות שהופקו תוכל לשמש בסיס איתן לניתוחים כמותיים במורד הזרם. איור 3 ממחיש את זרימת העבודה האנליטית.

באמצעות הקואורדינטות שהופקו ויחס הפריימים לכל קואורדינטה, יצרנו מפות חום לתפוסה מרחבית כדי להמחיש את ההתפלגות המצטברת של מיקומי הזבובים בזירה. מפות חום אלו מסכמות את צפיפות ההסתברות של מיקומי הזבובים לאורך זמן ומדגישות אזורים של תפוסה מועדפת. איור 4 ואיור 5 מציגים מפות חום מייצגות עבור זבובי w1118 ו-Canton-S (CS). הבדלים בדפוסי שימוש מרחבי בין האזורים המרכזיים והפריפריאליים בשני הגנוטיפים ניכרים בקלות, ומשקפים נטיות מובחנות בחקר הזירה והעדפת אזורים.

בנוסף לדפוסי תפוסה, שיחזרנו מסלולי תנועה מסדרת זמן קואורדינטות כדי ללכוד דינמיקת תנועה בקנה מידה עדין. המסלולים נוצרו על ידי חיבור הקואורדינטות הדו-ממדיות של זבובים מכל מסגרת עוקבת ללא החלקה כלשהי. המסלולים המוצגים באיור 4 ובאיור 5 ממחישים מסלולי תנועה בודדים עבור זבובי w1118 ו-CS, וחושפים הבדלים ספציפיים לגנוטיפ בטווח התנועה, מורכבות המסלול והמעברים בין אזורים בעלי תפוסה גבוהה. ביחד, תוצאות זיהוי נקודות מפתח, מפות חום ושחזורי מסלול מראים כי צינור הערכת תנוחה משולב וניתוח מבוסס קואורדינטות לוכד ומבדיל ביעילות את מבנה ההתנהגות של דרוזופילה הפועלת בחופשיות בין הגנוטיפים.

הגדרנו גם אינטראקציה חברתית בכל מסגרת בהתבסס על קואורדינטות דו-ממדיות של חמש נקודות מפתח אנטומיות. זוג נחשב מעורב חברתית כאשר שני הקריטריונים התקיימו בו-זמנית: מרחק ראש בראש של יותר מ-0.5 מ"מ אך פחות מ-20 מ"מ, והפרש כיוון של יותר מ-30°28,29,30,31. בהתאם לכך, מדדנו את שיעור הזמן שהוקדש לאינטראקציה חברתית עבור כל זוג (שישה זוגות לכל גנוטיפ). השיטה שלנו יכולה למדוד באופן אמין התנהגות חברתית בזבובים, כפי שמוצג באיור 6. היחסים החברתיים הממוצעים עבור זבובי W1118 ו-CS היו 0.270 ± 0.001 ו-0.252 ± 0.005, בהתאמה, במהלך שישה ניסויי שכפול עצמאיים, מה שמרמז על שחזוריות חזקה בקבוצות ניסוי שונות. זה גם תואם את התוצאה שאין הבדל משמעותי ביחס החברתי בין שני זני הזבובים הפראיים.

איור 2: תוצאות זיהוי נקודות מפתח מייצגות. הערכת תנוחה אוטומטית זיהתה את כל נקודות המפתח האנטומיות המוגדרות מראש עבור כל טיסה בין פריים. סימנים מונחים ממחישים מעקב מדויק של מספר זבובים במהלך אינטראקציות חברתיות טבעיות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: תהליך הניתוח. זרימת העבודה העיקרית כוללת קדם-עיבוד, הכנת נתונים, אימון מודלים ואימות, ולבסוף מניבה קואורדינטות דו-ממדיות של דרוזופילה, ואחריהן ניתוח מבוסס ממשק גרפי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: מפת חום פעילות מייצגת ומסלולי תנועה של זבובי w1118. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מפת החום מציגה את תפוסת המרחב המצטברת בזירה במשך מעל 10 דקות, וחושפת אזורי פעילות מועדפים לכל זבוב w1118. מסלולים מונחים על זה ממחישים מסלולי תנועה בודדים שנבנו מחדש מסדרות זמן קואורדינטות.

איור 5: מפת חום מייצגת של פעילות ומסלולי תנועה של זבובי קנטון-S (CS). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מפת החום מציגה את התפלגות התפוסה המרחבית של כל זבוב CS במהלך אינטראקציה חופשית למשך 10 דקות. מסלולים משוחזרים מדגישים את טווח התנועה ומבנה הנתיב, ומאפשרים השוואה לדפוסי התנהגות w1118.

איור 6: יחס חברתי בזבובי פרא. כימות התנהגות חברתית לאחר 10 דקות בתא. לשישה זוגות של כל גנוטיפ בזירה קטנה, כדי לקבוע את אחוז המגע החברתי. ערכי היחס החברתי עבור זבובי W1118 ו-CS היו 0.270 ±0.001 ו-0.252 ± 0.005, בהתאמה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1. כל קבצי הקידוד נדרשים לביצוע הפרוטוקול.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2. אפליקציית GUI עצמאיתאנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3. דרישות פייתוןאנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

המחקר שלנו מראה שהערכת תנוחה מבוססת למידת מכונה מספקת שיטה אמינה וניתנת להרחבה למדידת אינטראקציות חברתיות מדויקות בדרוזופילה. היא מתגברת על המגבלות של גישות מבוססות סנטרואידים 15,16,17,18 על ידי מעקב אחרי חמש נקודות מפתח אנטומיות בזוגות הפועלים בחופשיות, ומאפשרת רכישת מידע זוויתי המסופק על ידי ציר הגוף ומרחק ראש לראש המוסקת מנקודות ראש. הטכניקה שלנו יכולה לשחזר דפוסי תפוסה מרחביים ומסלולי תנועה על ידי מעקב אחר קואורדינטות המרכז של הזבובים בכל פריים וידאו כדי לקבל מסלולי תנועה ושימוש בנקודות ציון של חמש נקודות להערכת כיוון הראש. זיהוי נקודות מפתח יציב שנצפה הן בזני w1118 והן ב-Canton-S מצביע על כך שהצינור עמיד בפני שונות טבעית בדינמיקת התנועה, ומספק בסיס שחזורי לסיווג התנהגותי במורד הזרם. יכולות אלו חיוניות לניתוח האלמנטים המוטוריים המדויקים שמקודדים מצבים פנימיים ומידע הקשרי בהתנהגויות חברתיות ^8,9.

נמצאו מספר גורמים מתודולוגיים חיוניים להבטחת תוצאות עקביות. החום ועוצמת התאורה של מערכת התאורה השפיעו באופן משמעותי על הביטוי ההתנהגותי, בהתאם לממצאים קודמים שגורמים סביבתיים משפיעים על הפעילות החברתית והניידת של הזבובים^32,33. פרמטרי הדמיה, כולל מרחק מוקד, ניגודיות וגמא, שמותאמים אמפירית בניסויים שלנו, השפיעו גם הם על דיוק הערכת תנוחה, בהתאם לממצאים קודמים שלפיהם הקלטות התנהגותיות מהירות דורשות כיול אופטי מדויק ללכידת תנועות מהירות^34,35. שונות התנהגותית הושפעה גם היא מהליכי טיפול: הרדמה CO₂ גרמה לשינויים מדידים באינטראקציה חברתית ובתנועה, בהתאם לפרסומים קודמים שהראו שינויים התנהגותיים שנגרמו מהרדמה 36,37,38. שלב זה קריטי במיוחד כי כאשר ההרדמה אינה מספקת, הזבובים עשויים להתעורר ולברוח לאחר שהונחתם בתא; לעומת זאת, עם הרדמה מספקת, יש לתת לזבובים מספיק זמן להחלמה, שכן הסתגלות לקויה מפחיתה את המוטיבציה שלהם לזוז מאוחר יותר, מה שישפיע קשות על הניתוח הבא.

למרות חוזק הצינור, נותרו מספר מגבלות. דיוק הערכת תנוחה רגיש לאיכות ההערות, כך שגם שגיאות תיוג קטנות עלולות להתפשט לעיוותים במסלולים משוחזרים. בעיה זו נצפתה בעבר במסגרות אחרות של הערכת תנוחה^20,34. שינויים בתחום הנגרם משינויים בתאורה, מרקם רקע או עומס זבוב עשויים להפחית את ביצועי המודל, ולדרוש אימון תקופתי או הרחבת מאגר נתונים. בנוסף, ניסויים שבהם לא זוהו יותר מ-5% מסגרות של נקודות מפתח צריכים להיכלל או לשלב בשיפור איטרטיבי של מודל. בקרת גרסאות קפדנית (כפי שמפורט בקובץ המשלים 3) נדרשת גם היא לשחזוריות חישובית, שכן פלטים לא עקביים עלולים להיגרם מהבדלים בתלות בתוכניות.

שיפורים עתידיים עשויים לכלול נהלי כיול אוטומטיים, אסטרטגיות התאמת תחומים לשיפור הכללת המודל בתנאי ניסוי, ושילוב למידה בפיקוח עצמי להפחתת הצורך בהערות ידניות. השחזוריות בין מעבדות תשתפר עוד יותר על ידי סטנדרטיזציה של דיווח פרמטרי דימות, גורמים סביבתיים וסביבות אימון מודלים. כאשר לוקחים אותם ככולל, גורמים אלו מדגישים את היתרונות והחסרונות של כימות התנהגותי מבוסס למידת מכונה ומציעים מפת דרכים לשיפור נוסף של גישות הערכת יציבה בלימודי התנהגות חברתית של דרוזופילה .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אגר	BioFroxx	8211GR500
מצלמה(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
פחמן דו-חמצני	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
לוחית LED	/	/	בהתאמה אישית
Methylparaben	Sigma	99-76-3
צלחת פוליאתילן	/	/	בהתאמה אישית
Python	/	גרסה 3.6
סוכרוז	DaMao	57-50-1
לוחיות אקריליות שקופות	/	/	בהתאמה אישית
שמרים	Angel	100004237033