ייצור רחב היקף של וזיקולות חוץ-תאיות מתרביות תאים תלת-ממדיות בצפיפות גבוהה בביוריאקטורים של סיבים חלולים

סיכום

ניתנות הוראות להקמה ושימוש בביוריאקטור סיבי חלול תלת-ממדי לייצור ווסיקולות חוץ-תאיות מ-MSC וסוגי תאים אחרים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור שלחיצות חוץ-תאיות בריכוזים גבוהים באופן רציף תוך שליטה בצפיפות התאים בביוריאקטורים חלולים.

תקציר

ההתקדמות בתחום מחקר האקסוזומים מעוכבת בשל מספר התאים הקטן והפרודוקטיביות הנמוכה של אקזוזומים מופרשים בתרבות תאים דו-ממדית מסורתית. תרביות תאים בצפיפות גבוהה בביוריאקטורים חלולים (HFBRs) מאפשרות ייצור רציף של מולקולות ביולוגיות ומולקולות חוץ-תאיות (EVs) המופרשות, ממספר רב של תאים, לאורך תקופות ממושכות, בריכוזים גבוהים בתרבות תלת-ממדית. פרוטוקול זה מתאר איסוף אקזוזומים מופרשים מרוכזים תוך שמירה על מסת תא אופטימלית ותנאי תרבית פרפוזיה תלת-ממדיים, התומכים בצמיחה תאית בצפיפות גבוהה במשך מספר שבועות או חודשים של ייצור רציף ב-HFBR זמין מסחרית. המערכת קומפקטית, סגורה, חד-פעמית, יכולה להיות תואמת ל-cGMP, פשוטה לשימוש, ומתאימה לאינקובטור CO 2 סטנדרטי. תאים מסוימים, כגון תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ותאי גזע של נוזל מי שפיר אנושיים (HAFSCs), עשויים להראות התרבות מופחתת בתנאים אלו, מה שעשוי להשפיע על התמיינות ופנוטיפ לאורך זמן. תוצאות מייצגות מראות תפוקות EV טיפוסיות וחיוניות תאים לאורך שבועות או יותר של ייצור רציף. שיטה זו מספקת קציר חשמלי איכותי וניתנים לשכפול, המתאימים הן למחקר והן ליישומים קליניים.

מבוא

וזיקולות חוץ-תאיות מוכרות יותר ויותר בזכות תפקידן בתקשורת בין-תאית וביישומים טיפוליים, כולל רפואה רגנרטיבית. שיטות תרבית תאים דו-ממדיות מסורתיות הן עתירות עבודה ובעלות תפוקה מוגבלת, ולעיתים דורשות מאות בקבוקי תרבית כדי להשיג מספיק EVs לניסויים^{או מחקרים} בבעלי ^חיים. הרחבת תרגום קלינית בדרך כלל עושה שימוש בביוריאקטורים מסורתיים מעורבבים המשתמשים במיקרו-נשאים או תומכים אחרים. מערכות אלו אינן פיזיולוגיות מטבען, לא יעילות, ויכולות להניב תוצאות משתנות. ביוריאקטורים חלולים מספקים סביבה תלת-ממדית, מבוססת פרפוזיה, התומכת בתרביות תאים בצפיפות גבוהה במסגרת שטח קומפקטי ובקנה מידה שעשוי להתאים ליישומים קליניים ^3,4.

HFBRs מציעים מערכת תרבית תאים קומפקטית בצפיפות גבוהה, המאפשרת ייצור רציף של רכבים חשמליים מרוכזים עם עבודה, זמן ומקום מופחתים בהשוואה לתרבות דו-ממדית מסורתית⁵. הם מאפשרים תרביות תאים בצפיפות גבוהה בחלל קומפקטי, ותומכים בייצור רכבים חשמליים בקנה מידה גדול בכל מעבדה. HFBRs מגדלים מספר רב של תאים (1X10⁹ עד 1×^{10 10}) בנפח קטן (20–60 מ"ל), באינקובטור CO₂ סטנדרטי, ואינם דורשים ציוד מיוחד. מערכות אלו מאפשרות איסוף רציף ומרוכז של רכבים חשמליים במשך שבועות או חודשים, תוך הקלה על שימוש בסרום מופחת או במדיה מוגדרת כימית. ב-HFBR, התאים נשמרים בנפח קטן של מרחב הנימים החיצוני (ECS) המופרד מהתווך המחזורי באמצעות ממברנה חלולה חצי-חדירה עם חיתוך משקל מולקולרי מוגדר (MWCO) (איור 1). מולקולות קטנות כמו גלוקוז ולקטט יכולות לחצות בקלות את הסיבים, בעוד שיסודות גדולים יותר כמו נוגדנים או שלפוחיות חוץ-תאיות נשמרים ומרוכזים ב-ECS, שם ניתן לאסוף אותם.

שלושה מאפיינים יסודיים מבדילים בין תרבית תאים חלולים מכל שיטה אחרת: 1) יחס שטח הפנים לנפח הגבוה (200^{ס"מ 2}/מ"ל) מאפשר צפיפויות תאים דמויות-חיות, 1–2 ×-10-8 תאים למילילטר. 2) התאים קשורים לתמיכה נקבובית, לא לכלי פלסטיק לא נקבובי. פיצול תאים אינו נדרש³. ניתן לשלוט בחיתוך המשקל המולקולרי (MWCO) של הסיב. מוצרים מופרשים נשמרים ומרוכזים פי 10–100 לעומת תרבית הבקבוק הדו-ממדי בתוך מערכת ה-ECS של המחסנית. כמו כן, מטריצות חלבון ספציפיות, כמו פיברונקטין או קולגן, ניתנות ליישום בקלות על פני הסיבים מבלי להשפיע על השטף בין הסיבים.

HFBR מספקת סביבה מבוססת תרבית תלת-ממדית מבוססת פרפוזיה, שהיא יותר דו-חית מאשר תרבית דו-ממדית⁶, ומפחית באופן ייחודי את תלות התאים בתמיכה בסרום ומפשטת את דרישות המדיה שלהם. סביבת תרביות בצפיפות גבוהה זו עשויה לתמוך בהבדלים בעיבוד חלבונים לעומת תרבית דו-ממדית, יחד עם דיווחים על פעילות ביואקטיביות EV^{מוגברת 7,8,9}. ביוריאקטורים חלולים הם "היסטוצנטריים"; הם מנסים לחקות את התכונות הרקמתיות של פיזיולוגיית תאים ב-vivo ¹⁰. שני המאפיינים המרכזיים של ביוריאקטור היסטוצנטרי הם: 1) צפיפות תאים גבוהה, המאפשרת לתאים ליצור מיקרוסביבה ייחודית משלהם, ו-2) אין צורך בפיצול או מעבר תאים, מה שמאפשר אינטראקציות תא לתא ומבנים תלת-ממדיים כמו ספרואידים להתפתח באופן אורגני לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת צפיפויות תאים שקשה להשיג במערכות תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות ויכולה להקל על שימוש במדיה פשוטה, ללא חלבון ומוגדרת כימית.

כל סוג תא שניתן לגדל בבקבוקים ניתן לתרבית בביוריאקטור חלול סיבים. קווי תאים שעברו שינוי יהיו מתרבים¹¹. הפרמטר המרכזי למעקב הוא קצב קליטת הגלוקוז. ניטור הגלוקוז מספק מדד ישיר לפעילות מטבולית, ומאפשר אופטימיזציה של תזמון הקציר ושליטה בצפיפות התא¹². חשוב לשלוט במסת התא בתוך המקלטת כך שקצב קליטת הגלוקוז לא יעלה על קיבולת המערכת לספק חמצן ולהוציא^CO2. זה נעשה פשוט על ידי הסרת מסת התאים במהלך הקציר. MSCs ו-HAFSCs אינם מתרבים בביוריאקטור הסיבי החלול אך נשארים שקטים. תאים אלו דורשים התרחבות לפני הזרעה בביוריאקטור. עם זאת, לאחר שהתרבות מתבססת, ניתן לקצור רכבים חשמליים ברציפות במשך שבועות או חודשים. פנוטיפ ה-MSC אינו משתנה במהלך 30 יום של תרבית, למעט אולי ביטוי CD105, שיורד במהלך תקופה זו. כאשר MSCs מהביוריאקטור צויפו לאחר מכן בבקבוק עם מדיום המכיל סרום, ביטוי CD105 חזר לרמות^{ההתחלתיות 13}. ביטוי CD105 עשוי לשמש כסימן לתרבות vs. 3D דו-ממדית. טכניקות טרנספקציה חולפות יכולות לשמש גם ליצירת טרנספקטנט קוואזי-יציב¹⁴.

דוגמאות לתנאים ויתרונות תרבית תאים תלת-ממדיים יותר, שנוצרים בתרבית תאים חלולים בתלת-ממד, כוללות שינויים שלמים ואחידים לאחר תרגום לאורך זמן^15,16, יצירת סיסים על ידי אפיתל קיבה לתרבית קריפטוספורידיום¹⁷, כבד תלת-ממדי¹⁸, מחסום דם-מוח תלת-ממדי^{מודל 19}, יצירת פלסמודיום ספורוזואיט²⁰, וטיפוח משותף של מח עצם/תאי גזע²¹.

ב-HFBR, ה-EVs מרוכזים מאוד, עם הפחתת זיהום מחלבונים תוך-תאיים ומקטעי ממברנה, שכן ניתוק התאים מוגבל. ביוריאקטורים עם סיבים חלולים תואמים לכל מדיום, בתנאי שאין רכיבים בעלי משקל מולקולרי גבוה שאינם חוצים את הסיבים. במידת הצורך, ניתן להוסיף מולקולות גדולות אלו ישירות למערכת ההפעלה האלקטרונית של הביוריאקטור. מדיום עם רמות סוכר גבוהות, כמו DMEM, מועדפים. מדיה פחות מורכבת וללא חלבון יכולה לפשט את הטיהור על ידי הפחתת עומס החלבון. תאי גזע מזנכימליים ותאי גזע של נוזל שפיר אנושי גודלו במדיה בסיסית סטנדרטית וב-FBS, וכן במספר נוסחאות מסחריות של MSC. HFBR יכול לייצר כמויות גרמים של אקסוזומים באמצעות מחסניות מוכנות מהמדף. ביוריאקטור סיבי חלול הוא שיטה שימושית לייצור רחב היקף של אקזוזומים בתנאי cGMP פוטנציאליים ומייצג שינוי פרדיגמה בקידום מחקר האקסוזומים והתרגום הקליני.

השימוש המוצלח בביוריאקטור סיבי חלול לייצור וזיקולות חוץ-תאיות הוא מאוד ספציפי לפרוטוקול. מניפולציה של הביוריאקטור, צפיפות הזריעה של התאים, תדירות הקציר והמדיום שבו משתמשים – כל אלה יכולים לתרום להצלחת ריצת ביוריאקטור. פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לשימוש בביוריאקטור חלול לייצור ואיסוף וזיקולות חוץ-תאיות מתרביות תאים בצפיפות גבוהה. המטרה היא לספק גישה שניתנת לשחזור לאיסוף רכבים חשמליים, הכוללת הנחיות לגבי הקמת המערכת, חיסון תאים, תחזוקת תרביות ונהלי קטיף. השיטה נועדה לתמוך בייצור עקבי של רכבים חשמליים ליישומי מחקר ולספק מסגרת שניתן להתאים לסוגי תאים שונים ולמטרות ניסוי.

פרוטוקול

כל ההליכים עומדים בסטנדרטים של פרקטיקות מעבדה טובות (GLP) ו-Good Cell and Tissue Practices.

הערה: המחסנית מורכבת מראש ועוטרת בגמא. הוא בשקית כפולה, ומכסי לואר נמצאים בכל חיבור, כך שהוא אטום לחלוטין ויישאר סטרילי מחוץ לשקיות. ראו איור 2 לזיהוי פורט של המחסנית. כל השלבים בוצעו בטמפרטורת החדר בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי.

1. הכנה ועיטוי מכסה המאגר.

1. הסר את שני חלקי הצינור הקצרים מהמחסנית עם שקית כפולה.
2. חבר את הצינור לקוצים של הצינור בצינור הנירוסטה של מכסה המיכל.
3. עטוף את הצינור הקצר ואת קצות הנירוסטה החשופים בנייר אלומיניום כדי לשמור על סטריליות לאחר האוטוקלב. הכניסו את הרכיבים המורכבים לתיק אוטוקלאב.
4. אוטוקלאב באמצעות מחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15–30 דקות. תן למכסה להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

2. חבר את מחסנית הסיבים החלולה לבקבוק המאגר

1. העבר 50 מ"ל PBS מבקבוק של 1 ליטר לצינור קוני של 50 מ"ל לשימוש מאוחר יותר.
2. הסר את מכסה המאגר מהשקית האוטוקלאב והסר נייר כסף מגן מצינורות הפלדה הארוכים.
3. הסר את הפקק מבקבוק ה-PBS והברג את מכסה המיכל במקומו. הוציאו את המקלט מהשקית הפנימית הסטרילית.
4. הסר את נייר האלומיניום מאחד מחלקי הצינור שבחלק העליון של מכסה המאגר.
5. הסר את מכסה הלואר מאחד החלקים הארוכים של צינור המחסנית וחבר אותו לצינור המאגר שעל מכסה המאגר. השתמש בסיבוב אחורה קטן כדי למנוע קימום.
6. חזור על זה גם לחיבור הצינור השני.
7. לחץ בעדינות על צינור המשאבה החום כדי להפעיל PBS דרך המערכת עד שכל בועות האוויר מוסרות.

3. מילוי המרחב הקפילרי הנוסף (ECS)

1. למשוך 20 מ"ל PBS למזרק סטרילי באמצעות מחט גדולה באורך של לפחות 1.5 אינץ'; מחט קהה מועדפת לבטיחות.
2. חטא את שני חיבורי הצד של הנמל עם אלכוהול ואפשר להם להתייבש.
3. חבר את המזרק המלא ב-PBS לפורט צד אחד ומזרק סטרילי ריק ליציאה הנגדית. סגור את שני פתחי הקצה ופתח את שני הצדדים.
4. הזרקו לאט PBS ל-ECS תוך כדי החזקת המחסנית בזווית קלה כדי למזער בועות אוויר. המזרק הריק בפתח הצד הנגדי יתמלא באוויר.
5. אם יש אוויר ב-ECS, פתח את פתח הקצה הימני ושואב נוזל לתוך המזרק הריק עד שה-ECS מתמלא בנוזל (זה מושך PBS מבקבוק המיכל, דרך הסיבים ואל ה-ECS).
6. סגור את מהדקי הסלייד של שני היציאות, פתח את שני מהדקי הסלידה של שני פתחי הקצה, ובדוק את הזרימה על ידי לחיצה עדינה על צינור המשאבה עם האצבעות.
7. השאירו את המזרקים הריקים מחוברים ליציאות הצדדיות שישמשו כקבלים. החליפו את המזרקים בחדשים בכל פעם שהם יצאו ממכסה הזרימה הלמינרי.

4. ציפוי סיבים וחיסון תאים

הערה: ההליכים לציפוי סיבים בחלבון מטריצה ספציפי ולחיסון תאים הם למעשה זהים. נוזל עודף יזרום דרך הסיבים אל המאגר, בעוד התאים או חומר הציפוי יישארו מחוץ לסיבים ב-ECS. מומלץ להשתמש ב-1 ×-10⁸ תאים לזריעה. מומלץ להשתמש ב-100–500 מיקרוגרם חלבון מטריצה ב-20 מ"ל PBS עבור HFBR בגודל 4,000 ס"מ² . חלבוני מטריצה הקשורים למשטחי סיבים אינם משפיעים על MWCO

1. הכינו תמיסת ציפוי או מתלה תא בצינור קונוסי סטרילי בקוטר 50 מ"ל. 1 X 108 תאים בתווך מותאם מהתרחבות בקבוק או חלבון מטריצה של 100–500 מיקרוגרם ב-PBS. כרך 20 מ"ל.
2. למשוך 20 מ"ל של תאים או תמיסת ציפוי למזרק סטרילי באמצעות מחט ברוחב גדול.
3. חבר את המזרק המכיל את התמיסה לפורט צד אחד ואת מזרק סטרילי ריק לפתח הצד השני.
4. סגור את שני פתחי הקצה ופתח את שני הצדדים.
5. ערבבו בעדינות את התמיסה על ידי העברת נוזלים בין שני המזרקים. השאירו חצי מהתמיסה בכל מזרק. סגור את שני הפתחים הצדדיים.
6. פתח את פתח הקצה הימני ושחרר את מכסה המאגר רבע סיבוב.
7. הזרקו את התמיסה ממזרק אחד ל-ECS. סגור את פתח הצד המחובר.
8. הזריק את התמיסה מהמזרקה השנייה. סגור את פתח הצד המחובר. פתח את שני פתחי הקצה.
9. אם מסננים תאים, השאירו את המחסנית במצב אופקי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז סובבו 180° לאורך הציר הארוך ותנו לה לשבת עוד 30 דקות.
   1. אם מצפים את הסיבים בחלבון מטריקס, השאר ללילה בטמפרטורת החדר.
10. הכניסו את המחסנית למערכת משאבת Duet והתחילו זרימה ב-25.

5. הכנה לקציר (ראו איור 2)

1. חבר מזרק סטרילי ריק עם מתקן תלת-כיווני ומסנן סטרילי לפתח הימני.
2. כוון את העצירה התלת-כיוונית כך שיאפשר אוורור דרך המסנן הסטרילי. חבר מזרק סטרילי שני ריק לפתח הצד השמאלי.

6. איסוף חומר מותנה (קציר)

1. פתח את הפורט הימני ושמור על אוורור סטרילי דרך המסנן.
2. הטה את הקצה הימני של המקלט כלפי מעלה ושלף את החומר המותנה (המוצר) לתוך המזרק השמאלי. רוקן לחלוטין את תוכן ה-ECS למזרק השמאלי.
3. סגור את הפורט הימני. סגור את פתח הצד השמאלי, הסר את המזרק ואסף את הקציר לצינור קוני של 50 מ"ל.
4. החלף את המזרק ביציאה השמאלית. פתח את פתח הצד השמאלי. פתח את פתח הקצה הימני.
   הברג את מכסה המיכל רבע סיבוב.
5. הטה את הקצה השמאלי של המקלט כלפי מעלה וממלא את ה-ECS על ידי משיכת המזרק שמחובר ליציאה בצד שמאל. מלא את ה-ECS במלואו עד שהמניסקוס הנוזלי נמצא באמצע צינור הפורט הצדדי.
6. סגור את פתח הקצה הימני. פתח את יציאת הצד הימני והגדר את הנבל התלת-כיווני שיפלט דרך המסנן.
7. פתח את פתח הצד השמאלי. הטה את המחסנית ימינה ורוקן את ה-ECS לגמרי לתוך המזרק השמאלי.
8. סגור את הפורט בצד שמאל. הסר את המזרק ואסף את ה-ECS שנקטף לתוך צינור קונוס של 50 מ"ל.
9. החזר את המזרק ליציאה השמאלית. סגור את הפורט הימני. פתח את פתח היציאה הימנית
10. הטה את הצד השמאלי של המקלט כלפי מעלה וממלא את ה-ECS על ידי משיכת המזרק השמאלי. מלא את ה-ECS במלואו עד שהמניסקוס הנוזלי נמצא באמצע צינור הפורט הצדדי.
11. סגור את הפורט בצד שמאל. פתח את פתח הקצה השמאלי. הדק את מכסה המאגר.
12. אשר את זרימת המערכת על ידי דחיסת צינור המשאבה ידנית לפני החזרת המחסנית למשאבת Duet.

7. הכנס את הביוריאקטור למערכת המשאבה.

1. הגדר את קצב זרימת המשאבה להגדרה של 25 בקופסת הבקרה. הקארטרידג' קל יותר להתקנה בזמן שהמשאבה פועלת.
2. אחוז בקצה הימני של מעמד מסלול הזרימה. החליק את צינור המשאבה לתוך צינור המשאבה.
3. החלק את בסיס מסלול הזרימה אל החריץ בבסיס המשאבה. ודא שהרגיסטר המלבני נחבר לתוך החיתוך על מעמד מסלול הזרימה.
4. הנח את בקבוק המאגר בשקע בצד בסיס המשאבה.
5. הכבל הדק לחשמל ייכנס בין האטם של האינקובטור. לתיבת הבקרה יש מגנט לחיבור לצד האינקובטור.

8. מעקב אחרי רמות הגלוקוז

1. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מוציא דגימה של 1 מ"ל מדיום מבקבוק המאגר.
2. מדדו ריכוז גלוקוז באמצעות מד גלוקוז תואם על ידי הנחת טיפה קטנה של מדיום מדגם על רצועת הבדיקה של המד.

9. חישוב קצב קליטת הגלוקוז

הערה: קצב קליטת הגלוקוז מחושב על ידי הפחתת מדידת הגלוקוז 24 שעות לאחר מכן ממדידת הגלוקוז הראשונית. מכיוון שהקצב תלוי בנפח המאגר, הכפל את הירידה בריכוז הגלוקוז בנפח המאגר בליטרים. לדוגמה, אם יש 250 מ"ל בבקבוק המאגר, הכפל ב-0.25 (25%). (גלוקוז1-גלוקוז2) X (בקבוק מאגר בליטרים). 250 מ"ל זה 0.25 ליטר. אם עבר יותר מיום אחד, חלק זאת במספר הימים. לדוגמה: רמת גלוקוז התחלתית 4.5 גרם לליטר; למדוד גלוקוז 24 שעות לאחר מכן: 2.7 גרם לליטר; בקבוק מאגר: 250 מ"ל. 4.5-2.7=1.8 גרם. 1.8X.25 (בקבוק המאגר הוא 0.25 ליטר), 0.45 גרם גלוקוז נצרך. קצב קליטת הגלוקוז הוא 450 מ"ג ליום.

10. בדיקת כדאיות

1. אסוף דגימה קטנה של תאים באמצעות פרוטוקול הקציר.
2. תאי פלטה לתוך בקבוק תרבית T 25 עם מדיום טרי המכיל סרום 10%. העריכו ויזואלית את ההתקשרות והכדאיות.

11. תחזוקה יומית של המחסנית והשבוע הראשון של הגידול.

הערה: בשבוע הראשון של התרבית, תאים מתרבים יתרחבו לקצב היעד שלהם של 1–2 גרם גלוקוז שנצרך ביום.

1. יום 0: חיסון תאים, קביעת ריכוז התחלתי של גלוקוז מהפורמולציה של המדיה. נפח המאגר ההתחלתי: 125 מ"ל.
2. ימים 1-2: מדוד גלוקוז כל יום. כאשר הגלוקוז ההתחלתי מתרוקן ב-50%, החלף את מאגר ה-125 מ"ל במדיום טרי של 250 מ"ל, והקטין את הסרום ל-7.5%.
3. ימים 3-4: למדוד גלוקוז. כאשר הגלוקוז ההתחלתי מתרוקן ב-50%, החליפו את מיכל ה-250 מ"ל במדיה טרייה של 500 מ"ל, והורידו את הסרום ל-5%.
4. ימים 4-5: למדוד גלוקוז. כאשר הגלוקוז ההתחלתי מתרוקן ב-50%, החליפו 500 מ"ל בליטר מדיום טרי. הפחיתו את הסרום ל-2.5% ועברו למדיה מוגדרת כימית במידת הצורך.
5. יום 6+: מדידת גלוקוז, קציר ECS. לשלוט בצפיפות התאים על ידי קציר כדי לשמור על קליטת גלוקוז בין 1 ל-2 גרם ביום.
6. לתאים שאינם מתרבים, התחל עם 125 מ"ל בבקבוק המאגר, והחלף את המדיום כל 3 ימים.
7. אם יש צריכת גלוקוז משמעותית, הגדילו את המאגר ל-250 מ"ל. הסר את הסרום מה-ECS בימים 3-4 והחלף אותו בבסיס בינוני.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול זה, מחסנית בגודל 4,000 ס"^{מ 2} עם קווי תאים מתרבים צורכת בדרך כלל 1–2 גרם גלוקוז ביום. זה מתורגם לליטר אחד של מדיום כל 2–3 ימים כאשר משתמשים במדיום עם רמות סוכר גבוהות כמו DMEM. התאים מגיעים לצפיפות מקסימלית בתוך שבוע לאחר הזרעה. הקציר צריך להתחיל לאחר 5–7 ימים או כאשר קצב קליטת הגלוקוז מגיע ל-1 גרם ליום, ויש לבצע אותו מדי יום, אם אפשר. בשבוע הראשון של התרבית, ניתן להחליף את המדיום המכיל סרום ב-ECS במצע בסיסי ללא סרום, תוך שמירה על הסרום במדיום המחזור, אם נדרש סרום. כאשר קצב קליטת הגלוקוז מגיע ל-1 גרם ביום, אפשר בקלות לעבור למדיום עם סרום מופחת או למדיום מוגדר כימית אחר. MSCs ו-HAFSCs צורכים גלוקוז בקצב נמוך בהרבה מקווי תאים שעברו טרנספורמציה, כמו CHO, 293 או היברידומות. היווצרות ספרואידים אופיינית ל-MSC ו-HAFSC, יחד עם סוגי תאים אחרים (איור 3). ניטור סוכר יומי מספק מדד אמין לבריאות התרבית ולפעילות מטבולית. מדיה סטנדרטית וזמינה מסחרית ללא זנו שימשה בהצלחה עם MSC ו-HAFSC. נפחי הקציר הם כ-20 מ"ל. מרווחי 24 שעות בין הקציר הם אופטימליים כאשר ריכוזי ה-EV מגיעים לשיא לאחר 24 שעות (איור 4). ריכוזי אקזוזומים טיפוסיים במדיום שנקצר נעים בין 1–5 × 10¹² חלקיקים למ"ל, בהתאם לסוג התא, מספר הזריעה של התאים וגורמים נוספים, ויכולים להוביל לכדורים גלויים לאחר צנטריפוגה (איור 5). מספר רב של תאים ניתן לזרוע וצריך להיות מבוסס על מספר התאים, לא על שטח התרבית (איור 6).

התוצאות מראות שייצור EV קשור לפעילות מטבולית כפי שנמדד על ידי צריכת גלוקוז, ומספק פרמטר מעשי למעקב ואופטימיזציה של ביצועי התרבית. קציר יומי במרווחים של 24 שעות ממקסם את ריכוז ה-EV תוך שמירה על יציבות התרבית. ממצאים אלו תומכים בשימוש בניטור גלוקוז ותדירות קציר מבוקרת כפרמטרים מרכזיים לייצור חשמלי שכפול בביוריאקטורים חלולים.

איור 1: חתך רוחב של הביוריאקטור החלול בסיבים. המדיום זורם דרך פנים הסיבים, והתאים מתחברים לחיצוניותם. רכיבים בעלי משקל מולקולרי קטן כמו גלוקוז ולקטט יכולים לעבור בקלות בין הסיבים. מוצרים מופרשים, כמו EVs, אינם יכולים לחצות את הסיבים ולהפוך למרוכזים מאוד באזור שמחוץ לסיביים, הנקרא ECS (מרחב חוץ-נימי). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תמונה של מקלט עם פתחים וקליפסים מזוהים. שסתומי בדיקה חד-כיווניים במסלול הזרימה יוצרים זרימת סירקולציה של המדיום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: תאי גזע מזנכימליים, תאי גזע נוזל מי שפיר אנושיים, אבות לב וסוגי תאים נוספים ייצרו ספרואידים כאשר יוזרעו בכמות מספקת של המחסנית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: מדידת ריכוזי EV לאחר קציר במרווחי זמן שונים. לאחר 24 שעות, ריכוז ה-EV מגיע לריכוז מקסימלי. הקציר האופטימלי הוא אחרי 24 שעות. (הנתונים באדיבות פאולו נביאני, ליבת EV, בית החולים לילדים בלוס אנג'לס). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: קציר של שבוע של EVs מתאי DIFI שגודלו בביוריאקטור הסיבים החלול C2011. EVs מבודדים באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית. (נתונים באדיבות ג'ף פרנקלין, אוניברסיטת ואנדרבילט)^{18, 19}. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: מספר מפתיע של תאים ניתן לזרוע לתוך הביוריאקטור החלול של הסיבים. MSCs תופסים שטח רב בתרבות דו-ממדית; כאשר גדלים כספרואידים בתרבות התלת-ממדית, הם תופסים פחות מקום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

ביוריאקטורים חלולים אינם מסוגלים לייצר חלבונים או נוגדנים בכמויות מסחריות אמיתיות. עם זאת, יש להם יכולת ייחודית לגדל מספר גדול יחסית של תאים בצפיפות גבוהה ולהפריש מוצר EV מרוכז בקנה מידה קליני רלוונטי. רק בשנים האחרונות הוכרו היתרונות האמיתיים של ביוריאקטור היסטוצנטרי. תנאי תרבית הפרפוזיה בצפיפות גבוהה גורמים לריכוזי EV, המשתמשים במדיום התואם ל-cGMP, בכמויות שעשויות להתאים למחקר וליישומים קליניים פוטנציאליים. קציר יחיד מ-4,000^{ס"מ רבוע} עשוי להכיל 5 × 10¹² עד 1 × 10¹⁴ EVs בנפח של 10–20 מ"ל. תפוקות אלו נמצאות בטווח שדווח במחקרים שהעריכו מינון EV²².

ניטור יומי של קצב קליטת הגלוקוז הוא פרמטר חשוב להערכת ביצועי התרביות ומהווה אינדיקטור ישיר למטבוליזם של התאים, מספר התאים ובריאותו. באופן כללי, מדיום עם רמות גלוקוז גבוהות מועדפים, כמו DMEM, שריכוז הגלוקוז ההתחלתי שלו הוא 4.5 גרם לליטר. יש להחליף את המדיום למדיום טרי כאשר הגלוקוז נצרך ב-50%. תאים מסוימים, כמו MSCs, נראים כצורכים גלוקוז ומייצרים לקטט בריכוזי גלוקוז מעל 3 גרם לליטר, ואז עוברים לצריכת גלוטמין ולייצר אמוניה בריכוזים מתחת ל-3 גרם לליטר. עדיין לא בוצע פרופיל מטבולי מלא של MSCs בתרבות תלת-ממדית.

הפרמטר הקריטי ביותר להצלחה בתרבות ביוריאקטור הוא מספר החיסון של התאים. מספר תא החיסון המינימלי עבור ביוריאקטור C2011 בגודל 4,000 ס"מ²הוא 1 ×-^{10 8} תאים. לתאים שאינם מתרבים כמו MSC או HAFSC, מועדף מספר גדול יותר, עד 1 ×-10⁹ תאים בסך הכל. נפח המאגר צריך להיות פרופורציונלי למספר התאים בקלטת. 1 × 10⁸ תאים צריכים להשתמש במאגר שאינו גדול מ-125 מ"ל. 1 × 10⁹ תאים צריכים להכיל מאגר לא גדול מ-1 ליטר. מאגר גדול מדי יכול לשלוח תאים לשלב הלאג. זה מאופיין בכך שהתאים אינם צורכים גלוקוז, אף על פי שהם ברי קיימא כפי שנקבע על ידי צביעת Trypan Blue. במקרה זה, הפחת את נפח המאגר או זרע יותר תאים. ייתכן שיידרשו חיסון תאים מרובים כדי לקבל מספיק מספרי תאים לתרבית ביוריאקטורית יעילה. פשוט זרע עוד תאים מעל התאים שכבר נמצאים במקלט. בעת הערכת ביצועי הביוריאקטור, יש לשים לב לגודל האינוקולום של התא. עלייה פי 10 בזריעה של תאים יכולה להוביל לייצור EV פי 10 יותר.

שינויים בפרוטוקול עשויים לכלול שינויים בנוסחאות המדיה, ציפויי פני השטח, מספרי תאים, נפח הקציר, תדירות הקציר או גודל המזרק, בהתאם לסוג התא ולתפוקה הרצויה. תרבות רציפה מאפשרת אופטימיזציה קלה בזמן אמת למצב, כאשר ניתן לבצע שינויים במהלך התרבות והתוצאות מתקבלות^{בזמן אמת}. פתרון הבעיות צריך להתמקד בשמירה על סטריליות ובמעקב אחר פעילות מטבולית. ודא שאין חסימות או עיקולים בצינורות, במיוחד סביב מהדקי הסלייד. זיהום חיידקי יגרום לצריכה מהירה של גלוקוז ולעכירות בבקבוק המאגר. זיהום פטרייתי מסומן על ידי הצטברות לבנה רכה בקצה השמאלי של המחסנית, החוסמת את הזרימה. השימוש במערכת ביוריאקטור סיבי חלול דורש טיפול מיומן ועמידה קפדנית בפרוטוקולים. צעדים קריטיים כוללים זריעה נכונה של תאים, שמירה על עקרות במהלך הקציר, ומעקב מדוקדק אחר צריכת הגלוקוז למניעת צמיחה מופרזת או דלדול חומרים מזינים. רוב התאים יתחברו לסיבים, לעיתים תלוי במטריצת החלבונים המצופה בפיברונקטין, שמקלה על חיבור מהיר של התאים. חלק מהתאים, כגון MSCs, HAFSCs ו-progenitors של הלב, נשארים מחוברים לסיבים ויוצרים ספרואידים תלת-ממדיים.

מערכת HFBR תומכת בתרביות צפיפות גבוהה, מוגדרות כימית וללא זנו של רוב סוגי התאים, ומקלה על ייצור חשמלי בקנה מידה גדול²³. ניטור יומי של סוכר מספק מדד אמין לביצועי הביוריאקטור. המערכת הסגורה המבוססת על פרפוזיה תואמת לתקני cGMP, וניתן להגדיל אותה באמצעות מחסניות גדולות יותר או אפילו מספר מחסניות. ייצור רכבים חשמליים בקנה מידה גראם עשוי להיות אפשרי בתנאים אופטימליים. הביוריאקטור עם הסיבים החלול מספק פלטפורמה ניתנת לשחזור לייצור ואיסוף ממושכים של רכבים חשמליים בתנאים מבוקרים. הפרוטוקול המתואר כאן מדגיש שיקולים מעשיים, כולל הקמת מערכת, טיפול אספטי וניטור מטבולי, כדי לתמוך בתפעול עקבי ובתוצאות אמינות. ייתכן שיידרשו מחקרים נוספים להערכת מאפייני הרכבים החשמליים ותכונותיהם הפונקציונליות בתנאי תרביות שונים ולהשוואת ביצועים עם מערכות ייצור חלופיות.

שיטה זו רלוונטית באופן רחב למחקר ולייצור קליני של רכבים חשמליים, כולל רפואה רגנרטיבית ויישומים טיפוליים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט 16 גאוג 1.5"	Stellar Scientific	SOLM-111615
ברז עצירה 3 כיווני, סטרילי	Cole-Parmer	UX-48523-28
מזרק 20mL עם נעילת לואר	Becton Dickenson	302830
פיפטה סרולוגית 25mL, סטרילית	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
מסנן מזרק 25 מ"מ, סטרילי	Thomas Scientific	1162B74
כובע מאגר 38 מ"מ	FiberCell Systems	A1006
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 מ"ל תמיסת מלח זרחן דו-חומצי של דולבקו	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
רפידות הכנה אלכוהול סטריליות של CVS, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
ביו-כור סיב חלול	FiberCell Systems	C2011
פיברונקטין אנושי, 1 מ"ג	Corning	354008