מאמר מחקר

אקופוטומי (Acupotomy) מווסת את ציר ה-RIC8A/P38 MAPK על בסיס פיגום circRNA כדי לקדם תיקון סחוס באוסטאוארטריטיס של הברך

80 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71422

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tuina, Shuguang Anhui Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of First Clinical Medical College, Anhui University of Chinese Medicine, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בחן האם אקופוטומי (acupotomy) מקדם תיקון סחוס במודל של דלקת מפרקים בברך בבניינים. חמישים ארנבות חולקו לחמש קבוצות. האקופוטומי בוצע מדי שבוע במשך 4 שבועות. נבחנו נפיחות של המפרק, היסטופתולוגיה, ציטוקינים דלקתיים ומסמנים הקשורים לציר circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK כדי לבחון את המנגנון הבסיסי.

תקציר

אוסטאוארתריטיס של הברך (KOA) מאופיינת בניוון סחוס הדרגתי ובדלקת. מחקר זה בחן את ההשפעות הטיפוליות של אקופוטומי (acupotomy) במודל של KOA בארנבים ואת הקשר שלה לציר הסיגנלינג של ה-circular RNA phosphodiesterase 4B (circPDE4B)/resistance to inhibitors of cholinesterase 8A (RIC8A)/p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). חמישים ארנבים לבנים מזן New Zealand White חולקו באופן אקראי לחמש קבוצות (n = 10 לכל קבוצה): ביקורת, מודל KOA, celecoxib, אקופוטומי ואקופוטומי דמה (sham acupotomy). KOA הושרה באמצעות שיטת Videman המעודכנת. החל מ-6 שבועות לאחר יצירת המודל, בוצע אקופוטומי פעם בשבוע למשך 4 שבועות, בעוד ש-celecoxib ניתן מדי יום באמצעות gavage במינון של 24 mg/kg למשך 4 שבועות. נבחנו נפיחות של הברך והיסטופתולוגיה של הסחוס. רמות של interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) ו-interleukin-6 (IL-6) בהומוגנאטים של רקמת סחוס נמדדו באמצעות enzyme-linked immunosorbent assay. ביטוי גנים וחלבונים הקשורים למטבוליזם של הסחוס ולציר circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK הוערכו באמצעות quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ו-Western blotting. בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA, אקופוטומי הפחית את נפיחות הברך, שיפר את הציונים ההיסטופתולוגיים, הפחית את רמות הציטוקינים הדלקתיים, הוריד את הביטוי של matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), RIC8A ו-p38 MAPK מזופספר, והעלה את הביטוי של SRY-box transcription factor 9 (SOX9), aggrecan ו-circPDE4B יחסי. השפעותיו היו דומות לאלו של celecoxib, בעוד שאקופוטומי דמה לא הראה שיפור משמעותי. ממצאים אלו מעידים כי אקופוטומי מקל על דלקת וניוון סחוס ב-KOA של ארנבים וקשור לוויסות של ציר ה-circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.

מבוא

דלקת מפרקים שוחקת בברך (Knee osteoarthritis - KOA) היא מחלה ניוונית שכיחה של המפרקים, המאופיינת בניוון הדרגתי של הסחוס, דלקת סינוביאלית, סקלרוזיס של העצם הסובכונדרלית והיווצרות אוסטאופיטים1,2,3. עם הזדקנות האוכלוסייה העולמית, שיעור המקרים של KOA ממשיך לעלות, מה שהופך אותה לגורם מרכזי לתפקוד לקוי של המפרקים ולכאב כרוני בקרב מבוגרים ובני גיל העמידה ברחבי העולם4,5,6. הטיפולים הקליניים הנוכחיים מתמקדים בעיקר בהקלה סימפטומטית באמצעות סוכנים פרמקולוגיים, כגון תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs) והזרקות תוך-מפרקיות של קורטיקוסטרואידים. עם זאת, טיפולים המשנים את מהלך המחלה (disease-modifying therapies), המסוגלים לעצור את התקדמותה או לקדם תיקון של הסחוס, נותרו מוגבלים7,8.

ראיות חדשות הדגישו את תפקידיהם הרגולטוריים החשובים של RNA לא מקודד (ncRNAs) בפתוגנזה ובהתקדמות של KOA9,10,11. בין ה-ncRNAs הללו, RNA מעגלי (circRNAs) משכו תשומת לב גוברת בשל מבנה הלולאה הסגורה והקוולנטית הייחודית שלהם, המקנה יציבות רבה יותר מאשר ל-RNA ליניארי, ובשל תפקודיהם הביולוגיים המגוונים12,13. Shen et al. דיווחו כי circPDE4B מתפקד כפיגום מולקולרי המסדיר עמידות למעכבים של נתיב הסיגנלינג של resistance to cholinesterase 8A (RIC8A)/p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), ובכך משפיע על מטבוליזם המטריקס החוץ-תאי של כונדרוציטים ועל תגובות דלקתיות14. נתיב ה-RIC8A/p38 MAPK ממלא תפקיד חשוב בוויסות דלקת, קטבוליזם, אפופטוזיס והזדקנות בתאי כונדרוציטים, שכולם תורמים לפתוגנזה של אוסטאוארתריטיס15.

אקופוטומי (Acupotomy) היא גישה טיפולית זעיר-פולשנית המשלבת תיאוריות של הרפואה הסינית המסורתית עם עקרונות אנטומיים מודרניים, והיא הראתה יעילות מבטיחה בניהול קליני של KOA16,17. טכניקה זו משתמשת במכשיר מחט-סכין ייעודי כדי לשחרר הידבקויות של רקמה רכה, לשפר את הסירקולציה המקומית ולהחזיר את האיזון הביומכני סביב המפרקים הפגועים, ובכך להקל על הכאב ולשפר את התפקוד במטופלים עם KOA18. למרות יתרונות קליניים אלו שדווחו, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות הטיפוליות של אקופוטומי, ובמיוחד הוויסות הפוטנציאלי שלה על מסלולי איתות המתווכים על ידי circRNA המעורבים בתיקון סחוס, נותרו במידה רבה בלתי נחקרים.

מבחינה מכניסטית, אקופוטומיה (acupotomy) יוצרת גירויים מכניים מקומיים באמצעות שחרור רקמות רכות סביב המפרק. כונדרוציטים הם תאים רגישים למכניקה (mechanosensitive) המגיבים לאותים ביו-מכניים, והוכח כי circRNAs משתתפים בתגובות ההעברה המכנית (mechanotransduction) של כונדרוציטים19,20. למרות שחסרה ראיה ישירה הקושרת אקופוטומיה לוויסות של circRNAs ספציפיים לסחוס מפרקי, סביר מבחינה ביולוגית כי אותים מכניים הנוצרים על ידי אקופוטומיה עשויים לווסת circRNAs רגישים למכניקה, כגון circPDE4B. אפשרות זו היוותה את הבסיס למחקר הנוכחי.

בהתבסס על ממצאים קודמים בנוגע לתפקיד הרגולטורי של circPDE4B בציר הסיגנלינג של RIC8A/p38 MAPK, מחקר זה השתמש במודל ארנב של KOA שהושרה באמצעות שיטת Videman המעודכנת כדי לבחון את ההיפותזה ש-acupotomy מקדם תיקון סחוס על ידי ויסות של נתיב הסיגנלינג circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. acupotomy נבחר למחקר זה על פני התערבויות KOA אחרות ממספר סיבות. ראשית, בהשוואה לסוכנים פרמקולוגיים כגון תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs) וcelecoxib, המספקים בעיקר הקלה סימפטומטית ונקשרו להשפעות מוגבלות על שינוי מהלך המחלה ולאירועים חריגים פוטנציאליים לטווח ארוך7,8, acupotomy מציע גישה לא-פרמקולוגית הטיפולית הן בגורמים מכניים מקומיים והן בנתיבי סיגנלינג ביולוגיים. שנית, בניגוד להזרקות תוך-מפרקיות של קורטיקוסטרואידים או חומצה היאלורונית, הדורשות מתן תוך-מפרקי חוזר וכרוכות בסיכונים לזיהום ונזק למפרק, acupotomy פונה לרקמות רכות פרי-מפרקיות ועשוי להפעיל השפעות ביו-מכניות וביו-כימיות מתמשכות21. שלישית, ראיות קליניות הוכיחו כי acupotomy מניב תוצאות דומות או עדיפות לטיפולים קונבנציונליים בהפחתת כאב ובשיפור תפקוד המפרק בחולי KOA, ומחקרים ניסיוניים הצביעו על כך ש-acupotomy מווסת תגובות דלקתיות ומטבוליזם של כונדרוציטים21,22. עם זאת, הנתיבים המולקולריים הספציפיים שדרכם acupotomy מפעיל את השפעותיו המגנות על הסחוס נותרו עם מאפיינים דלים, במיוחד ביחס לסיגנלינג המתווך על ידי circRNA. לכן, חקירת הקשר בין acupotomy לציר circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK עשויה לספק תובנות מכניסטיות חדשניות ולתמוך בשימוש ב-acupotomy כהתערבות המשנה את מהלך המחלה ב-KOA16,18. נקודות הקצה העיקריות היו נפיחות של מפרק הברך, דגנרציה היסטופתולוגית של הסחוס (ציוני Mankin ו-Moran), רמות ציטוקינים דלקתיים (interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, ו-interleukin-6), ביטוי של סמנים הקשורים למטבוליזם של סחוס (matrix metalloproteinase-3, matrix metalloproteinase-13, SRY-box transcription factor 9, ו-aggrecan), וביטוי של circPDE4B ו-RIC8A, כמו גם פוספורילציה של p38 MAPK. acupotomy ניתן פעם בשבוע למשך 4 שבועות בנקודות פרי-מפרקיות נבחרות באמצעות טכניקת ארבעת השלבים (שחרור אורכי, הפרדה רוחבית, וחיתוך של קשריות). הערכה היסטופתולוגית, מדידת ציטוקינים דלקתיים ואנליזות של ביטוי גנים וחלבונים שימשו לאפיון ההשפעות של acupotomy ולבחינת הבסיס המולקולרי הפוטנציאלי שלו ב-KOA.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים למעבדה ושימוש בהם, ואושרו על ידי ועדת אתיקה לבעלי חיים של Anhui University of Chinese Medicine (מספר אישור AHUCM-rabbits-2023195). הרכיבים, הכימיקלים, התוכנות והכלים ששימשו בפרוטוקול זה מפורטים ב- טבלת חומרים.

1. בעלי ניסוי וחלוקה לקבוצות
חמישים ארנבים זכרים בריאים בוגרים מסוג New Zealand White (בגיל 6 חודשים, במשקל 2.0–2.5 kg) הושגו מחוות הגידול Laifu במחוז Nanjing Pukou (רישיון ייצור בעלי חיים מס': SCXK (Su) 2024-0007). כל בעלי החיים עברו תקופת הסתגלות והזנה של שבוע אחד לפני הניסוי. הברך הימנית הוקצתה להערכת הנפיחות והברך השמאלית לאיסוף רקמת סחוס כהסכמה פרוצדורלית עקבית, ולא על בסיס היפותזה ניסויית ספציפית. לאחר ההסתגלות, הארנבים חולקו אקראית לחמש קבוצות (n = 10 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת, שלא עברה הליך יצירת מודל או טיפול; קבוצת מודל KOA, שבה הושרה KOA באמצעות שיטת Videman המעודכנת; קבוצת celecoxib, שבה הוחל טיפול תרופתי 6 שבועות לאחר יצירת המודל; קבוצת acupotomy, שבה הוחל טיפול ב-acupotomy 6 שבועות לאחר יצירת המודל; וקבוצת sham acupotomy, שבה הוחל דקר סיכה ללא חיתוך או שחרור 6 שבועות לאחר יצירת המודל.

2. הקמת מודל ה-KOA
כל השפנפנים, למעט אלו בקבוצת הביקורת, עברו את פרוצדורת Videman המעודכנת להשראת KOA. בעלי החיים היו בצום במשך 12 h לפני הניתוח. הרדמה הושרה על ידי מתן תוך-ורידי של 3% pentobarbital sodium במינון של 30 mg/kg דרך וריד האוזן השולי. לאחר הכנה שגרתית של אזור הניתוח, חיטוי וכיסוי סטרילי, בוצע חתך אורך לאורך ההיבט המדיאלי של מפרק הברך. הרצועה הקולטרלית המדיאלית והרצועה הצולבת הקדמית נכרתו בזה אחר זה, והמניסקוס המדיאלי הוסר לחלוטין. לאחר מכן, החתך נסגר בשכבות.

כדי להפחית את הסיכון לזיהום לאחר הניתוח, ניתן פניצילין בהזרקה תוך-שרירית במינון של 40,000 U/kg/day במשך 3 ימים רצופים. לאחר הניתוח, הוחזרו השפנפנים לכלוביהם ואפשרו להם תנועה ללא הגבלה ללא קיבוע של המפרק.

3. טיפול ב-sham acupotomy
ששה שבועות לאחר יצירת מודל ה-KOA, ארנבים בקבוצת ה-sham acupotomy עברו את אותם הליכי מישוש וסימון נקודות שבוצעו בטיפול ה-acupotomy הפעיל. מחט acupotomy סטרילית חד-פעמית במידות 0.35 mm × 25 mm הוכנסה בניצב דרך העור בכל נקודה מסומנת עד להגעה לרקמה התת-עורית. לא בוצעו פעולות חיתוך, שחרור, מניפולציה רוחבית או כל תמרון שחרור מכני אחר. המחט נשלפה מיד לאחר ההחדרה ללא מניפולציה של הרקמה. הטיפול ה-sham ניתן פעם בשבוע במשך 4 שבועות רצופים.

4. טיפול באקופוטומיה (Acupotomy)
ששה שבועות לאחר הmodellization של KOA, ארנבונים מקבוצת האקופוטומיה קובעו על שולחן טיפולים. הרקמות הפרי-מפרקיות סביב הברך הפגועה נבחנו במישוש, במיוחד סביב הפיקה ובמרחבי המפרק המדיאליים והלטרליים, כדי לזהות מבנים דמויי חוט או קשריות קשות. ארבע עד שש נקודות טיפול נבחרו על סמך ממצאי המישוש וסומנו על העור.

אזור הטיפול נגסו וחומש באמצעות הליכי סטריליזציה שגרתיים. מחט אקופוטומי (acupotomy) סטרילית חד-פעמית במידה של 0.35 mm × 25 mm הוכנסה לאט ובאופן מאונך בכל אחת מהנקודות המסומנות עד להגעה לפני השטח של העצם. הפרוצדורה בוצעה בהתאם לטכניקת האקופוטומי בת ארבעה שלבים. תחילה בוצע שחרור אורכי, ולאחריו הפרדה רוחבית. כאשר נתקל פיתול (nodule) קשה, הוא נחתך עד לתחושת שחרור מובחנת שהורגשה דרך מחט-הסכין. לאחר הפרוצדורה, המחט הוצאה, וכל נקודת הכנסה נלחצה קצרות עם גזה סטרילית וכוסתה בחבישה דביקה. הטיפול ניתן פעם בשבוע במשך 4 שבועות רצופים.

5. טיפול תרופתי
6 שבועות לאחר יצירת מודל ה-KOA, ארנבות בקבוצת ה-celecoxib קיבלו תרחיף celecoxib באמצעות הזנה דרך הפה (oral gavage) במינון של 24 mg/kg פעם ביום למשך 4 שבועות רצופים. התרחיף הומס מדי יום במי מלח פיזיולוגיים. פרטי הספק והקטלוג מופיעים בטבלת החומרים.

6. הערכת נפיחות מפרק הברך
בסוף תקופת ההתערבות, כ-10 שבועות לאחר יצירת מודל ה-KOA, נערכה הערכה של נפיחות מפרק הברך. חוט משי רך נכרך סביב האזור הנפוח ביותר של מפרק הברך הימני, בדרך כלל בגובה מישור השוק (tibial plateau). החוט הוסר ונמדד בעזרת סרגל לדיוק של מילימטר אחד, והאורך שנרשם הוגדר כהיקף הברך.

את יחס הנפיחות היחסי חישבו באמצעות המשוואה הבאה:

נוסחה ליחס נפיחות יחסי, משוואת השוואת היקף ברך במחקר ניסויי בארנבים.

7. איסוף דגימות
בסיום תקופת ההתערבות, הארנבים הורדמו באמצעות מתן פניטוברביטול נתרן 3% במינון של 30 mg/kg לווריד השולי של האוזן. מפרק הברך השמאלי נפתח באמצעות להב סקלפל מס' 23 כדי לחשוף את המשטחים המפרקיים של רמת השוקה (tibial plateau) והקונדילים הפמוראליים. רקמת סחוס מפרקי נאספה מאזורים אלו.

כל דגימת סחוס חולקה לשני חלקים. חלק אחד קובע ב-4% paraformaldehyde לצורך בדיקה היסטופתולוגית. החלק השני הוכנס למבחנות קריו-גניות, הוקפא במהירות בחנקן נוזלי ונשמר ב-−80 °C עד לביצוע האנליזות המולקולריות. מיד לאחר השלמת כל הליכי איסוף הרקמות, השפנפנים הומתו באמצעות אמבוליה של אוויר על ידי הזרקה תוורידית מהירה של אוויר דרך וריד האוזן השולי.

צביעה היסטולוגית ודירוג לפי שיטות Mankin ו-Moran בוצעו באמצעות דגימות סחוס מכל 10 השפנפנים בכל קבוצה (n = 10). תמונות מייצגות של צביעות hematoxylin and eosin ו-Safranin O–Fast Green נבחרו משלושה שפנפנים שנבחרו באופן אקראי לכל קבוצה. אימונוהיסטוכימיה ו-Western blotting בוצעו באמצעות דגימות משלושה שפנפנים שנבחרו באופן אקראי לכל קבוצה (n = 3). תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) ובדיקת ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) בוצעו באמצעות דגימות משישה שפנפנים שנבחרו באופן אקראי לכל קבוצה (n = 6). כל בחירות תתי-הקבוצות בוצעו באופן אקראי ללא ידע מוקדם על השיוך לקבוצות.

8. צביעת המטוקסילין ואוזין
רקמת סחוס שקובעה ב-4% paraformaldehyde עברה דקלציפיקציה בתמיסת 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ב-pH 7.4 למשך 4–6 שבועות. תמיסת הדקלציפיקציה הוחלפה מדי 3 ימים. לאחר שאישור הדקלציפיקציה התקבל באמצעות חדירת מחט, הרקמה עברה דהידרטציה בסדרת אתנול מדורגת של 70%, 80%, 90%, 95%, ו-100%, הבהרה ב-xylene וטמיעה בפרפין. הרקמה הטמיעה נחתכה בעובי של 5 µm באמצעות מיקרוטום, והחתכים הועלו על עלויות זכוכית.

לצביעה ב-hematoxylin and eosin, חוממו החתכים ב-60 °C למשך 60 min, עברו דה-פראפיניזציה ב-xylene בשלוש החלפות של 5 min כל אחת, ועברו רהידרציה רצופה ב-ethanol בריכוזים של 100%, 95%, 80%, ו-70%, ולאחר מכן במים מזוקקים. החתכים נצבעו ב-hematoxylin למשך 5 min, נשטפו תחת מי ברז זורמים למשך 10 min, עברו דיפרנציאציה ב-1% hydrochloric acid שהומס ב-70% ethanol למשך 2–3 s, ונשטפו במים מזוקקים. לאחר מכן נצבעו החתכים ב-eosin למשך 2 min, נשטפו במים מזוקקים, עברו דהידרציה דרך ethanol בריכוזים של 70%, 80%, 90%, 95%, ו-100%, עברו הבהרה (clearing) ב-xylene, ונקבעו (mounted) עם שרף ניטרלי. מורפולוגיית הסחוס נבחנה, ותמונות מייצגות הושגו באמצעות מיקרוסקופ אור.

9. צביעה ב-Safranin O–Fast Green
חתכים של סחוס הטמעים בפרפין עברו דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש כפי שמתואר בסעיף 8. החתכים נצבעו ב-Weigert iron hematoxylin למשך 5 min ונשטפו במים מזוקקים. לאחר מכן, החתכים נצבעו בתמיסת Fast Green בריכוז 0.05% למשך 3 min, נשטפו קצרות בחומצה אצטית 1% למשך 10–15 s, ונצבעו בתמיסת Safranin O בריכוז 0.1% למשך 5 min.

לאחר הצביעה, החתכים הובאו לייבוש מהיר באתנול 95% ו-100%, עברו לשקיפות ב-xylene, ונקבעו עם שרף ניטרלי. החתכים הצבועים נבחנו באמצעות מיקרוסקופ אור. עוצמת הצביעה ב-Safranin O, המשקפת את תכולת הפרוטאוגליקנים, נותחה באופן חצי-כמותי באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.

10. דירוג היסטולוגי
שני פתולוגים, שהיו עיוורים להקצאות של הקבוצות הניסוייות, העריכו באופן עצמאי את החתכים הצבועים באמצעות מערכות הדירוג של Mankin ו-Moran כדי להעריך את מידת הניוון של הסחוס. לפני ההערכה, לכל החתכים הוקצו קודי זיהוי אקראיים. הקצאות הטיפולים לא נחשפו לפתולוגים עד להשלמת כל הדירוגים23.

11. ספיחה חיסונית תלוית אנזים (ELISA)
רקמת סחוס קפואה נשקלה, עורבבה עם phosphate-buffered saline ב-pH 7.4, ועברה הומוגניזציה יסודית על קרח. ההומוגנאט סובב בצנטריפוגה ב-3,000 × g למשך 20 דקות ב-4 °C, והתוף נאסף לצורך אנליזה. ריכוזי interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), ו-interleukin-6 (IL-6) בתוף הרקמה נמדדו באמצעות ערכות ELISA ספציפיות לארנב בהתאם להוראות היצרן.

12. תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי
RNA כולל הופק מרקמת סחוס באמצעות שיטה המבוססת על פנול-כלורופורם. בקצרה, הרקמה עברה ליזיס באמצעות ריאגנט להפקת RNA, והוסף כלורופורם כדי להפריד בין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. הפאזה המימית נאספה, וה-RNA הושקע באמצעות isopropanol, נשטף ב-75% ethanol, יובש באוויר והומס במים שעובדו ב-diethyl pyrocarbonate. ריכוז ה-RNA והטוהר שלו נמדדו באמצעות ספקטרופוטומטר.

לפני השעתוק ההפוך, הוסר DNA גנומי שארי באמצעות ריאגנט לסילוק DNA גנומי. לאחר מכן סונטז DNA משלים באמצעות ערכה לשעתוק הפוך לפי הוראות היצרן. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (Quantitative polymerase chain reaction) בוצעה באמצעות שיטת זיהוי מבוססת SYBR Green במערכת PCR בזמן אמת. תנאי המחזור היו כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-95 °C למשך 1 min, ולאחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 20 s וקישור והארכה ב-60 °C למשך 1 min. ניתוח עקומת דיסוציאציה בוצע כדי להעריך את ספציפיות ההגברה.

נמדדו רמות הביטוי של matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), SRY-box transcription factor 9 (SOX9), aggrecan, RIC8A ו-circPDE4B. β-actin שימש כגן הייחוס הפנימי. הביטוי היחסי חושב באמצעות השיטה. רצפי הפריימרים מופיעים ב-טבלה 1.

13. אנליזת Western blot
רקמת סחוס לוויסה בבופר radioimmunoprecipitation assay בתוספת phenylmethylsulfonyl fluoride. הליזט סובב בצנטריפוגה ב-12,000 × g למשך 15 min ב-4 °C, והתוף נאסף כפרק החלבון הכולל. ריכוז החלבון נקבע באמצעות בדיקת bicinchoninic acid.

כמויות שוות של חלבון (30 µg לכל נתיב) הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז 10% והועברו לממברנות polyvinylidene fluoride שהופעלו מראש במתנול. ההעברה בוצעה בזרם של 300 mA בטמפרטורה של 4 °C. זמני ההעברה היו כדלקמן: aggrecan (250 kDa) למשך 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa), ו-MMP-13 (52 kDa) למשך 50 min; ו-p38 MAPK (41 kDa) ו-GAPDH (36 kDa) למשך 40 min. הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה ללא שומן ב-Tris-buffered saline המכיל Tween 20 למשך 2 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הממברנות דגרו למשך הלילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד MMP-3 (1:2,000), MMP-13 (1:1,000), SOX9 (1:1,000), aggrecan (1:1,000), RIC8A (1:1,500), p38 MAPK מפספר (1:1,000), ו-p38 MAPK כולל (1:2,000). GAPDH (1:2,000) שימש כביקורת טעינה. לאחר שלושה שטיפות ב-Tris-buffered saline המכיל Tween 20 (10 min כל אחת), הממברנות דגרו עם נוגדנים שניוניים המשורשרים ל-horseradish peroxidase (1:20,000) למשך 1.2 h בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות נוספות, פסי החלבון הודגמו באמצעות מצע chemiluminescence מוגבר ותועדו באמצעות מערכת לתיעוד ג'לים. עוצמת הפסים נמדדה כמותית באמצעות תוכנת ImageJ ונורמלה ל-GAPDH.

14. אימונוהיסטוכימיה
חתכים של סחוס המוטמעים בפרפין עברו דפרפיניזציה ודהידרציה באמצעות סדרה מדורגת של אתנול (שלושה סבבי החלפה של xylene, 5 min כל אחד; ולאחריהם אתנול בריכוזי 100%, 95% ו-80%, 3 min כל אחד). שחזור אנטיגן בוצע על ידי חימום החתכים בבופר EDTA (pH 9.0) בסיר לחץ. הבופר חומם עד לרתיחה, ולאחר הגעה ללחץ, נמשך השחזור למשך 2 min, ולאחר מכן בוצע קירור לטמפרטורת החדר. פעילות פראוקסידאז אנדוגנית נחסמה באמצעות מי חמצן 3% למשך 10 min בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה, קשירה לא ספציפית נחסמה באמצעות סרום עיזים למשך 20 min בטמפרטורת החדר ובחושך.

את החתכים הדגרו עם נוגדנים ראשוניים נגד p38 MAPK מפוספורל (1:800) ונגד nuclear factor kappa B (NF-κB) מפוספורל (1:300) למשך 60 min ב-37 °C. לאחר שלושה שטיפות עם phosphate-buffered saline המכיל Tween 20, הדגרו את החתכים עם נוגדנים משניים מתאימים המצומדים ל-horseradish peroxidase למשך 30 min ב-37 °C. לאחר שלושה שטיפות נוספות, נעשה שימוש ב-diaminobenzidine לפיתוח הצבע (בבקרה תחת מיקרוסקופ), ולאחר מכן בוצעה צביעה נגדית ב-hematoxylin (למשך 2 min), בידול ב-1% hydrochloric acid ב-70% ethanol, והכחלה בתוך תמיסת lithium carbonate (למשך 30 s). לאחר מכן, החתכים עברו דהידרציה, שקיפות, הרכבה ובחינה באמצעות מיקרוסקופ אור. הצביעה הוערכה באמצעות תוכנת ImageJ, וצפיפות אופטית משולבת חושבה לצורך ניתוח חצי-כמותי.

15. ניתוח סטטיסטי
הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו מבחן Tukey post hoc. ערך של P < 0.05 נחשב למשמעותי מבחינה סטטיסטית.

תוצאות

אקופוטומי (Acupotomy) מקלה על שינויים היסטולוגיים בסחוס המפרקי
כפי שמוצג באיור 1A,B, היקף הברך ויחס הנפיחות היחסי עלו באופן משמעותי בקבוצת מודל ה-KOA בהשוואה לקבוצת הביקורת. שני המדדים פחתו באופן משמעותי לאחר טיפול באקופוטומי או ב-celecoxib, בעוד שאקופוטומי דמה (sham acupotomy) לא הניב שיפור משמעותי בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA.

כפי שמוצג באיור 1C,D, מדד מנקין (Mankin score) היה גבוה באופן משמעותי בקבוצת מודל ה-KOA מאשר בקבוצת הביקורת, ורד באופן משמעותי לאחר טיפול באקופוטומי או בסלקוקסיב. לא נצפתה ירידה משמעותית בקבוצת האקופוטומי המדומה (sham). מדד מוראן (Moran score) הראה דפוס הפוך.

צביעה ב-Hematoxylin and eosin וב-Safranin O–Fast Green הראתה התערות וחוסר רציפות של פני הסחוס המפרקי, עם שחיקה מוקלית, בקבוצת מודל ה-KOA בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 1E,F). אקופוטומיה (Acupotomy) ו-celecoxib שיפרו שינויים פתולוגיים אלו, כפי שניתן לראות במתווהי סחוס ברורים יותר ובנזק מבני מופחת. לעומת זאת, קבוצת ה-sham acupotomy הראתה מאפיינים פתולוגיים דומים לאלו של קבוצת מודל ה-KOA. ממצאים אלו מעידים כי לאקופוטומיה היו השפעות דומות לאלו של celecoxib בהפחתת נפיחות המפרקים ודגנרציה של הסחוס, ובשיפור הציונים ההיסטולוגיים במודל ה-KOA.

אקופוטומי (Acupotomy) מפחית את רמות הציטוקינים הדלקתיים
כפי שמוצג באיור 2A–C, ריכוזי interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) ו-interleukin-6 (IL-6) בהומוגנאטים של רקמת סחוס היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצת מודל ה-KOA מאשר בקבוצת הביקורת. טיפול באקופוטומי או ב-celecoxib הפחית באופן משמעותי את הרמות של כל שלושת הציטוקינים הדלקתיים. לעומת זאת, קבוצת ה-sham acupotomy לא הראתה הפחתה משמעותית בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA.

אקופוטומיה מווסתת את מסלול השליחות RIC8A/p38 MAPK ברמת החלבון
ניתוח אימונוהיסטוכימי הראה כי הביטוי של p38 mitogen-activated protein kinase ומסומן בפוספורילציה (p-p38 MAPK) ושל nuclear factor kappa B מסומן בפוספורילציה (NF-κB) היה נמוך באופן מובהק בקבוצות האקופוטומיה והcelecoxib בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA (איור 3A). לא נצפתה הבדל מובהק בין קבוצת ה-sham acupotomy לקבוצת מודל ה-KOA.

ניתוח Western blot הראה כי רמות החלבון של matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), resistance to inhibitors of cholinesterase 8A (RIC8A), ו-p-p38 MAPK היו גבוהות באופן משמעותי בקבוצת מודל ה-KOA מאשר בקבוצת הביקורת, בעוד שרמות החלבונים הקשורים לסינתזה של סחוס, SRY-box transcription factor 9 (SOX9) ואגריקאן (aggrecan), היו נמוכות באופן משמעותי. בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA, קבוצות ה-acupotomy וה-celecoxib הראו ביטוי מופחת של MMP-3, MMP-13, RIC8A ו-p-p38 MAPK וביטוי מוגבר של SOX9 ואגריקאן. קבוצת ה-sham acupotomy הראתה דפוסי ביטוי חלבון דומים לאלו של קבוצת מודל ה-KOA, ללא שינויים משמעותיים בחלבונים שנמדדו (איור 3B–I). ממצאים אלו מעידים כי ההשפעות של acupotomy ו-celecoxib על KOA היו קשורות לוויסות של מסלול האיתות RIC8A/p38 MAPK.

אקופוטומיה מווסתת את נתיב השליח RIC8A/p38 MAPK ברמת התמלול
כפי שמוצג באיור 4A–G, רמות הביטוי של MMP-3, MMP-13 ו-RIC8A היו גבוהות משמעותית בקבוצת מודל ה-KOA מאשר בקבוצת הביקורת, בעוד שביטוי SOX9 ו-aggrecan היה נמוך משמעותית. בהשוואה לקבוצת מודל ה-KOA, אקופוטומיה ו-celecoxib הפחיתו את הביטוי של MMP-3, MMP-13 ו-RIC8A והגבירו את הביטוי של SOX9 ו-aggrecan. קבוצת השם (sham) של האקופוטומיה לא הראתה הבדלים משמעותיים מקבוצת מודל ה-KOA ברמות התמלול שנמדדו.

אקופוטומי (Acupotomy) הגבירה גם את הביטוי היחסי של circPDE4B, דבר המעיד כי ההשפעות הטיפוליות שלהם היו קשורות לוויסות של ציר השליחה circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK ולהפחתה של סיגנלינג דלקתי וקטבולי.

זמינות נתונים:
הנתונים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה, כולל נתוני ELISA, צביעת H&E, אימונוהיסטוכימיה, RT‑qPCR, צביעת Safranin O–Fast Green ו-western blot, זמינים באופן פתוח במאגר Figshare בכתובת https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.

השוואת טיפולים בדלקת מפרקים של הברך; גרפים של עמודים, תמונות היסטולוגיות; ניתוח השפעות הטיפול.
איור 1. אקופוטומי (Acupotomy) מפחית נפיחות בברך וניוון של סחוס מפרקי בארנבים עם אוסטאוארתריטיס של הברך. (A(היקף הברך)B) יחס נפיחות ברך יחסי. (Cמדד Mankin ההיסטולוגי.ד'מדד מוראן ההיסטולוגי.ה') חתכים מייצגים של סומסס מפרקי שנצבעו בהמטוקסילין ואאוזין מקבוצות הביקורת, מודל ה-KOA, celecoxib, אקופוטומי (acupotomy) ואקופוטומי דמה (sham acupotomy). (F) חתכים נבחרים שנצבעו ב-Safranin O–Fast Green מחמש קבוצות הניסוי. דירוג היסטולוגי (Mankin ו-Moran) בוצע באמצעות דגימות מכל 10 השפנפנים בכל קבוצה (n = 10), בעוד שתמונות נבחרות עבור H&צביעות E ו-Safranin O–Fast Green התקבלו מ-3 ארנבות שנבחרו באופן אקראי לכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA), ולאחריו מבחן post hoc של Tukey. פסים אופקיים מציינים את הקבוצות שהושוו. P < 0.05, P < 0.01, ו- P < 0.001. סמני קנה מידה, 100 µmקיצורים: KOA = אוסטאוארתריטיס של הברך; SEM = טעות תקנית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואה בגרף עמודות של רמות IL-1β, IL-6, TNF-α בקבוצות טיפול ב-KOA ובביקורות.
איור 2. אקופוטומיה מפחיתה את רמות הציטוקינים הדלקתיים בארנבים עם אוסטאוארתריטיס בברך. (A) ריכוז Interleukin-1β. (B) ריכוז Interleukin-6. (C) ריכוז Tumor necrosis factor-α. ריכוזי הציטוקינים נמדדו באמצעותבדיקת enzyme-linked immunosorbent assay בדגימות משש ארנבים לכל קבוצה (n = 6). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות one-way analysis of variance ולאחריו Tukey’s post hoc test. פסים אופקיים מצביעים על הקבוצות שהושוו. P < 0.05, P < 0.01, ו-P < 0.001. קיצורים: IL-1β = interleukin-1β; IL-6 = interleukin-6; KOA = knee osteoarthritis; SEM = standard error of the mean; TNF-α = tumor necrosis factor-α. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תמונות היסטולוגיות, ניתוח ביטוי חלבונים, גרפי עמודות; תוצאות טיפול בדלקת מפרקים של הברך (osteoarthritis).
איור 3. אקופוטומיה מווסתת חלבונים הקשורים לדלקת ולמטבוליזם של סחוס בבניינים עם אוסטאוארתריטיס בברך. (Aתמונות אימונוהיסטוכימיות מייצגות המראות ביטוי של phosphorylated nuclear factor kappa B ושל phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase בסחוס מפרקי מקבוצת הביקורת, קבוצת מודל ה-KOA, קבוצת ה-celecoxib, קבוצת האקופוטומי (acupotomy) וקבוצת ה-sham acupotomy. פסקומי Scale bars, 100 µm. (B) תמונות מייצגות של Western blots המראות את ביטויי SOX9, RIC8A, MMP-13, p38 MAPK מזופספר, p38 MAPK כולל, MMP-3, aggrecan ו-GAPDH. (C(כימות דנסיתומטרי של aggrecan מנורמל ל-GAPDH. (D(כימות של MMP-13 בנורמליזציה ל-GAPDH. (המונח "E" עשוי להתייחס למספר מושגים בהקשרים מדעיים שונים, כגון אנרגיה (Energy), מספר אוקסונסורי (dalam הכימיה), או קבוע אוילר (Euler's number) במתמטיקה. אנא ספק את הטקסט המלא לצורך תרגום מדויק.) כימות של MMP-3 בנורמליזציה ל-GAPDH. (F) כימות של p38 MAPK כולל בנורמליזציה ל-GAPDH. (גכימות של p38 MAPK זרחני (phosphorylated), מנורמל ל-GAPDH.ה) כימות של SOX9 שנורמל ל-GAPDH. (I) כימות של RIC8A מנורמל ל-GAPDH. ניתוחי Western blot בוצעו באמצעות דגימות משלושה ארנבים לכל קבוצה (n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA) ולאחריו מבחן post hoc של Tukey. פסים אופקיים מציינים את הקבוצות שהושוו. P < 0.05, P < 0.01, ו- P < 0.001. Abbreviations: GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; KOA = knee osteoarthritis; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; NF-κB = nuclear factor kappa B; p-NF-κB = phosphorylated nuclear factor kappa B; p-p38 MAPK = phosphorylated p38 MAPK; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = standard error of the mean; SOX9 = SRY-box transcription factor 9. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשימי עמודות של ביטויי חלבונים (Aggrecan, MMPs, p38 MAPK, SOX9) לעומת β-actin, השפעות טיפול תרופתי.
איור 4. אקופוטומי (Acupotomy) מווסת תמלילי RNA הקשורים למטבוליזם של סחוס ואת ביטוי ה-circPDE4B בארנבים עם אוסטאוארתריטיס של הברך. (A) ביטוי יחסי של aggrecan. (B) ביטוי יחסי של MMP-3. (C(ביטוי יחסי של MMP-13. (D) ביטוי יחסי של p38 MAPK. (ה(ביטוי יחסי של SOX9. (F) ביטוי יחסי של circPDE4B. (ג') ביטוי RIC8A יחסי. הביטוי נמדד באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותית (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) ונורמל לגן הייחוס. האנליזות בוצעו באמצעות דגימות מששה ארנבונים לכל קבוצה (n = 6). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey. קווים אופקיים מצביעים על הקבוצות שהושוו. P < 0.05, P < 0.01, ו- P < 0.001. קיצורים: circPDE4B = RNA מעגלי פוספודיאסטרז 4B; KOA = דלקת מפרקים בברך; MAPK = פרוטאין קינאז מופעל על ידי מיטוגן; MMP-3 = מטריקס מטאלופרוטיינאז-3; MMP-13 = מטריקס מטאלופרוטיינאז-13; RIC8A = עמידות למעכבי כולנסטראז 8A; SEM = טעות תקן של הממוצע; SOX9 = גורם שעתוק SRY-box 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

GeneAmplicon SizeForward primerReverse primer
（bp）（5'→3'）（5'→3'）
β-actin113CAGCCCTCCTTCATCGGTATGACATGACGTTGTTGGCGTA
MMP-3108TGTGAGTTGAAGTGGCTCATCCTGTTTGAACACCCGTAAC
MMP-13119GGCTCCTAGGCAAGTACAATGTGTACGCCCATCAGGATAA
SOX985GGAGGAAGTCGGTGAAGAATGCCTTGAAGATGGCGTTG
Aggrecan70TTGATGAGTGCCTTTCAAGCCATGTGAAAGAGTCGATGGC
RIC8A100ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGCTCGATGACAGAGTACTGGTTG
p38 MAPK103TGTTCAAGGTCTCCCACAAGTGCAGCTCCCTTATGATCTG
CircPDE4B174GTCATTTTGCCGAACTCCCCATTATCATCTGCCGTCACTG

טבלה 1: רצפי פריימרים ששימשו לתגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי. הטבלה מפרטת את הגנים המטרה, גדלי האמפליקונים הצפויים, ורצפי הפריימרים הקדמיים וההפוכים בכיוון 5′ ל-3′. קיצורים: bp = base pairs; circPDE4B = circular RNA phosphodiesterase 4B; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SOX9 = SRY-box transcription factor 9.

דיון

מחקר זה העריך את ההשפעות הטיפוליות של אקופוטומיה (acupotomy) במודל של דלקת מפרקים בברך (KOA) בארנבים, וזיהה קשר בין ביטוי של circPDE4B לבין ציר הסיגנלינג של RIC8A/p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). האקופוטומיה שיפרה את הנפיחות במפרקים ואת השינויים ההיסטופתולוגיים, ושינתה סמנים הקשורים לדלקת ולמטבוליזם של סחוס הן ברמת התעתוק והן ברמת החלבון.

הירידה ברמות של interleukin-1β, tumor necrosis factor-α ו-interleukin-6 לאחר טיפול באקופוטומי הייתה עקבית עם השפעות אימונו-מודולטוריות של אקופוטומי שדווחו בעבר21. ציטוקינים אלו תורמים לניוון הסחוס על ידי קידום אנזימים המפרקים את המטריקס ודיכוי סינתזה של המטריקס החוץ-תאי22,24,25. הירידות המקבילות ב-matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) וב-matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) ברמת התמלילים והחלבונים מרמזות עוד על כך שאקופוטומי מדכאת פעילות קטבוליטית הקשורה ל-KOA.

ממצא בולט היה הקשר בין שינויים בביטוי של circPDE4B המושרים על ידי אקופוטומי (acupotomy) לבין ויסות של מסלול ה-RIC8A/p38 MAPK. הפעלה לא תקינה של מסלול זה קשורה לדלקת, לעקה חמצונית ולפירוק של המטריקס החוץ-תאי. הירידה בביטוי של RIC8A ובפוספורילציה של p38 MAPK לאחר אקופוטומי מרמזת כי הטיפול עשוי לסייע בהשבת מאזן האיתות בתוך מסלול זה. השינויים המתואמים במדדים היחסיים של circPDE4B ושל RIC8A/p38 MAPK עקביים עם ההשערה כי circPDE4B עשוי לתפקד כפיגום מולקולרי (molecular scaffold), כפי שהוצע בעבר26,27. עם זאת, הממצאים הנוכחיים הם מתאמיים ואינם מבססים את העובדה ש-circPDE4B מתווך את ההשפעות הטיפוליות של האקופוטומי. נדרשים מחקרי אובדן-תפקוד (loss-of-function) והגברת-תפקוד (gain-of-function) כדי לקבוע סיבתיות.

הקשר הפוטנציאלי בין אקופוטומי (acupotomy) לבין ויסות של circRNA הוא היבט חשוב במחקר זה. הוכח כי גירוי מכני משפיע על ביטוי של circRNA במספר רקמות28,29,30,31. עם זאת, ראיות ישירות הקושרות גירוי מכני המושרה על ידי אקופוטומי לוויסות של circRNAs ספציפיים לסחוס מפרקי נותרו מוגבלות. השינוי שנצפה בביטוי היחסי של circPDE4B לאחר הטיפול עשוי לשקף תגובה ישירה לגירוי מכני או תגובה עקיפה להפחתה בדלקת. מחקרים עתידיים שישלבו גירוי מכני מבוקר עם מניפולציה של circPDE4B הספציפית לכונדרוציטים יעזרו להבחין בין אפשרויות אלו.

אקופוטומי (Acupotomy) וסלקוקסיב (celecoxib) הראו מגמות דומות ברבות מהתוצאים שנמדדו, למרות מנגנוני הפעולה השונים שלהם. מספר הסברים עשויים להסביר התכנסות זו. ראשית, ייתכן ששני הטיפולים פועלים על מסלולים משותפים במורד הזרם, כולל ציר ה-RIC8A/p38 MAPK ואותות של nuclear factor kappa B. שנית, הדמיויות שנצפו עשויות לשקף מאפיינים משותפים של הגנה על הסחוס ולא השפעות ספציפיות למסלול מסוים. שלישית, הסמנים שנבחרו עשויים לייצג נקודות קצה משותפות של דלקת ומטבוליזם של סחוס, ולכן עשויים להיות בלתי מספיקים כדי להבחין בין מנגנוני מעלה שונים. יעילות דומה אינה מעידה על מנגנונים זהים, אלא מרמזת ששתי ההתערבויות עשויות להשפיע על רכיבים משותפים ברשת הפתולוגית של אוסטאוארתריטיס26,32,33. גישות בלתי מוטות, כגון פרופיל טרנסקריפטומי או פרוטאומי, עשויות לסייע בהגדרת חתימות מולקולריות ספציפיות לטיפול.

להשפעות הדומות של אקופוטומיה (acupotomy) וסלכוקסיב (celecoxib) עשויה להיות רלוונטיות קלינית. אקופוטומיה עשויה להוות אפשרות לטיפול לא-תרופתי המטפל בגורמים מכניים פרי-ארקולריים, תוך הימנעות מחלק מהתופעות הלוואי הקשורות לשימוש ממושך בתרופות. עם זאת, יש לגשת לפרשנות זו בזהירות, שכן מודל השפנפנים אינו משקף באופן מלא את מורכבות ה-KOA בבני אדם. נדרשים מחקרים תרגומיים וקליניים נוספים בטרם ממצאים פרה-קליניים אלו יוכלו לתמוך ביישום קליני רחב יותר.

יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, הקשר בין circPDE4B לבין ציר ה-RIC8A/p38 MAPK לא נבדק באמצעות ניסויי loss-of-function או gain-of-function. שנית, מודל הארנב ותקופת הטיפול שנמשכה 4 שבועות מגבילים את המסקנות בנוגע למחלה בבני אדם ותוצאות ארוכות טווח. שלישית, בבדיקות המולקולריות נעשה שימוש בתתי-קבוצות קטנות יחסית של בעלי חיים, דבר שעשוי להגביל את הגילוי של הבדלים דקים בין הקבוצות. רביעית, פאנל הסממנים שנבחר עשוי שלא להבדיל בין מנגנונים מעלה (upstream) ספציפיים לטיפול. לבסוף, התגובות הדומות לאקופוטומיה (acupotomy) ולcelecoxib מחייבות חקירה נוספת כדי לקבוע האם שתי ההתערבויות פועלות דרך מסלולים מתכנסים או עצמאיים.

סיכום
אקופוטומי (Acupotomy) הפחיתה נפיחות במפרקים, רמות של ציטוקינים דלקתיים, דגנרציה של סחוס וביטוי של סממנים קטבוליים במודל של KOA בארנבים. השפעות אלו היו קשורות לשינויים בביטוי היחסי של circPDE4B ולבקרת ציר הסיגנלינג של RIC8A/p38 MAPK. מכיוון שהממצאים הנוכחיים הם מתאמים, נדרשים מחקרים מכניסטיים נוספים כדי לקבוע אם circPDE4B מתווך באופן ישיר את ההשפעות הטיפוליות של האקופוטומי.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים או מערכות יחסים אישיות שעלולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81774436), פרויקט יישום מחקר רפואי קליני של מחוז אנחוי (מענק מס' 202427b10020136), פרויקט המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז אנחוי (מענק מס' 2023AH050824), תוכנית מחקר הבריאות של אנחוי (מענק מס' AHWJ2023A30123), ופרויקט מחקר להמשכיות וחדשנות של איגוד הרפואה הסינית המסורתית של אנחוי (מענק מס' 2024ZYYXH153).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מימן פראוקסיד 3%Fuzhou Maixin BiotechSP kit-A3חוסם פעילות פראוקסידאז אנדוגנית במהלך אימונוהיסטוכימיה.
פראפורמאלדהיד 4%BiosharpBL539Aמקבע רקמת סחוס לפני דקאלציפיקציה ועיבוד היסטולוגי.
חומצה אצטיתMerckA6283משמשת להכנת חומצה כלורית 1% ב-70%
תחבושות דביקותZhejiang RenkangRK-8802משמשות לאחר אקופוטומי.
נוגדן AggrecanProteintech13880-1-APנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי aggrecan בתמציות חלבון של סחוס.
אתנול אנहाइडריSinopharm Chemical Reagent10009228משמש לדהידרטציה של רקמות ולרהידרטציה של חתכים במהלך עיבוד היסטולוגי.
ערכה למדידת חלבון BCAThermo Fisher ScientificA55860משמשת לקביעת ריכוז חלבון.
CelecoxibBiochempartnerBCP02156טיפול פרמקולוגי ייחוס המ diberikan באמצעות הזנה דרך הפה (oral gavage).
צנטריפוגהAnhui Jiawen InstrumentsJW-3021HRמשמשת להבהרת ליזטים והומוגנאטים של רקמה באמצעות הפרדה צנטריפוגלית.
כלורופורםNanjing Reagent67-66-3משמש להפרדת פאזות במהלך מיצוי RNA כולל.
בופר ציטראט, pH 6.0ZSGB-BIOZLI-9065משמש לשחזור אנטיגנים בהשראת חום לפני אימונוהיסטוכימיה.
קריו-מבחנות (Cryotubes)NEST Biotechnology607001משמשות לאחסון דגימות קפואות
מצע DABFuzhou Maixin BiotechKit-5230מצע כרומוגני המשמש להדמיה של אותות אימונוהיסטוכימיים המסומנים ב-HRP.
מים מטופלים ב-DEPCGeneray BiotechD1007מים נקיים מ-RNase המשמשים להמסת RNA ולפרוצדורות ביולוגיה מולקולרית.
מחט אקופוטומי חד-פעמית, 0.35 mm × 25 mmMa'anshan Bond Medical EquipmentGB3525Rסכין-מחט סטרילית המשמשת לפרוצדורות אקופוטומי ואקופוטומי דמה (sham).
EDTAbiosharpBL617Aמשמש להכנת תמיסת הדקאלציפיקציה לרקמות המכילות סחוס.
מצע כימילומניסנציה מוגברThermo 340958340958משמש להדמיה של פסי Western blot.
תמיסת אאוזין (Eosin)Zhuhai BesoBA4022צבע נגדי המשמש בצביעת המטוקסילין ואאוזין.
תמיסת Fast GreenSolarbioG1371צבע נגדי המשמש בצביעת Safranin O–Fast Green.
נוגדן GAPDHZsbioTA-08משמש כבקרת טעינה ב-Western blot אך אינו רשום כעת.
מערכת הדמיה של ג'ליםShanghai Peiqing TechnologyJS-1070Pלוכדת תמונות כימילומניסנטיות של Western blot.
שקופיות זכוכית למיקרוסקופCITOTEST‌188105משמשות להרכבת חתכים
Goat anti-mouse IgG, HRP-conjugatedZSGB-BIOZB-2305נוגדן משני מצומד ל-HRP עבור נוגדנים ראשוניים מעכבר.
Goat anti-rabbit IgG, HRP-conjugatedZSGB-BIOZB-2301נוגדן משני מצומד ל-HRP עבור נוגדנים ראשוניים מארנב.
סרום עיזיםZSGB-BIOZLI-9056חוסם קישור לא ספציפי של נוגדנים במהלך אימונוהיסטוכימיה.
GraphPad Prism, גרסה 10GraphPad SoftwareNot applicableמשמש לניתוח סטטיסטי ולהכנת גרפים.
תמיסת המטוקסיליןZhuhai BesoBA4041צבע גרעיני המשמש לצביעת המטוקסילין ואאוזין ולצביעה נגדית אימונוהיסטוכימית.
הומוגניזטורWitegSGCR-5-553-722הומוגניזציה של רקמת סחוס עבור ELISA ובדיקות מולקולריות.
חומצה כלוריתMerck7607משמשת להכנת חומצה כלורית 1% ב-70%
תוכנת Image LabBio-RadNot applicableמשמשת לניתוח דנסייטומטרי של פסי Western blot.
Image-Pro Plus, גרסה 6.0Media CyberneticsNot applicableמשמש לניתוח חצי-כמותי של עוצמת צביעת Safranin O.
איזופרופנולSinopharm Chemical ReagentSCR40007960משמש להשקעת RNA במהלך מיצוי RNA כולל.
מיקרוסקופ אורOlympusCX41משמש לבחינה והדמיה של חתכי סחוס צבועים.
מרקר רפואיedding497985משמש לסימון נקודות טיפול
מתנולShanghai Suyi20180427משמש להפעלת ממברנת PVDF
מיקרוטוםLeicaRM2016חותך רקמה טבועה בפראפין לחתכים של 5 µm.
נוגדן MMP-13Biossbs-0575Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי מטריקס מטאלופרוטאינז-13.
נוגדן MMP-3Biossbs-43017Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי מטריקס מטאלופרוטאינז-3.
שרף ניטרליWuxi JiangyuanZLI-9516תווך הרכבה המשמש להכנה קבועה של חתכי רקמה צבועים.
ארנבים לבנים מניו זילנד (זכרים, בני 6 חודשים, במשקל 2.0–2.5 kg)Nanjing Pukou District Laifu Breeding FarmSCXK (Su) 2024-0007בעלי חיים ניסויים המשמשים למודל אוסטאוארתריטיס של הברך ולהערכת טיפול.
להב סכינת ניתוח מס' 23CaissonSCX08-100PCמשמש במהלך איסוף דגימות.
חלב רזה מיובשGene9999Sמשמש כחומר חוסם.
נוגדן p38 MAPKBiossbs-0637Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי p38 MAPK כולל.
שעוות פראפיןThermo8330משמש לטביעת רקמות (embedding)
PBSZSGB-BIOZLI-9062משמש להומוגניזציה של רקמות, שטיפה והכנת ריאגנטים.
פניציליןJilin Huamu Animal Health ProductsNot applicableמשמש לאחר ניתוח במינון של 40,000 U/kg/day
פנטוברביטול נתרןBeijing Chemical Reagents61222משמש להרדמה בריכוז 3%, 30 mg/kg.
סליין בבופר פוספט (PBS)beyotimeST448משמש להומוגניזציה של רקמות ושטיפה במהלך אימונוהיסטוכימיה.
סליין פיזיולוגיservicevioG4702משמש להכנת תמיסת celecoxib
PMSFBeyotimeST506מעכב פרוטאיז שנוסף לבופר ליזה במהלך מיצוי חלבון.
נוגדן p-NF-κBSantasc-136548נוגדן ראשוני המשמש לזיהוי p- NF-κB בניתוח אימונוהיסטוכימי.
נוגדן p-p38 MAPKBiossbs-5476Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי p38 MAPK מזופספרל.
ערכת PrimeScript RT Reagent Kit עם gDNA EraserTaKaRaRR047Aמשמשת להסרת DNA גנומי ולשעתוק הפוך של RNA ל-cDNA.
ממברנת PVDFMilliporeIPVH00010ממברנה המשמשת להעברת חלבון במהלך Western blotting.
ערכת ELISA ל-Rabbit IL-1βJiyinmeiJYM0011Rbמכמתת rabbit interleukin-1β בדגימה המנותחת.
ערכת ELISA ל-Rabbit IL-6JiyinmeiJYM0006Rbמכמתת rabbit interleukin-6 בדגימה המנותחת.
ערכת ELISA ל-Rabbit TNF-αJiyinmeiJYM0003Rbמכמתת rabbit tumor necrosis factor-α בדגימה המנותחת.
מערכת Real-time PCRThermo Fisher ScientificPIKOREAL 96מבצעת הגברת PCR כמותית מבוססת פלואורסצנציה.
נוגדן RIC8ABiossbs-11355Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי RIC8A.
בופר ליזה RIPABeyotimeP0013Bממצה חלבון כולל מרקמת סחוס.
תמיסת Safranin OSolarbioG1371צובעת פרוטאוגליקנים של סחוס בהיסטולוגיה של Safranin O–Fast Green.
ריאגנטים ל-SDS-PAGE או ג'לים מוכנים (precast)SolarbioS8010כולל אחוז ג'ל או מוצר.
נוגדן SOX9Biossbs-4177Rנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי SOX9.
ספקטרופוטומטרNanjing Wuyi TechnologyOD1000+מודד ריכוז וטוהר של RNA.
גזה סטריליתZhendeV505463משמשת ללחיצה לאחר שליפת המחט.
SYBR Green Master MixNovoproteinE096-01Bריאגנט פלואורסצנטי המשמש ל-PCR כמותי.
סליין בבופר TrisSolarbioT8060משמש להכנת בופר שטיפה וחסימה עבור Western blotting.
ריאגנט TRIzolLife Technologies15596018ריאגנט פנול–גואנידיניום המשמש למיצוי RNA כולל.
Tween 20SolarbioT8220דטרגנט לא-יוני המתווסף לתמיסות שטיפה של סליין בבופר Tris וסליין בבופר פוספט.
תמיסת Weigert iron hematoxylinMerck1.15973משמשת בצביעת Safranin O–Fast Green.
קסילן (Xylene)Sinopharm Chemical Reagent10023428משמש להסרת פראפין (deparaffinization) והבהרת רקמות.

מקורות

  1. Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
  2. Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
  3. Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
  4. Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
  5. Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
  6. Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
  7. Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
  8. Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
  9. Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
  10. Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
  11. Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
  12. Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
  13. Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
  14. Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
  15. Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
  16. Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
  17. Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
  18. Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
  19. Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
  20. Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
  21. Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
  22. Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
  23. Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
  24. Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
  25. Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
  26. Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
  27. Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
  28. Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
  29. Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
  30. Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
  31. Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
  32. Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
  33. 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Immunology and InfectionAcupotomyKnee OsteoarthritisCircular RNAcircPDE4BRIC8A p38 MAPK signaling pathway
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.