מחקר זה נועד לחקור את השפעות דיקור הקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית על פלסטיות סינפטית בקורטקס המוטורי במודל עכברוש של ספסטיות גפיים לאחר שבץ ולבחון את הקשר בין פעילות מסלולי PI3K/Akt לבין ההשפעות הטיפוליות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
מחקר זה נועד לחקור את השפעות דיקור הקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית על פלסטיות סינפטית בקורטקס המוטורי במודל עכברוש של ספסטיות גפיים לאחר שבץ ולבחון את הקשר בין פעילות מסלולי PI3K/Akt לבין ההשפעות הטיפוליות.
טיפולים יעילים לספסטיות לאחר שבץ (PSS) עדיין מוגבלים, והמנגנון שבו דיקור סיני בקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית (SAE) מקל על PSS אינו מובן במלואו. מחקר זה חקר את השפעות SAE בעכברים עם PSS וחקר האם SAE מווסת את הפלסטיות הסינפטית דרך מסלול PI3K/Akt. הוקם מודל עכברוש של חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO), והחולדות חולקו באקראי לחמש קבוצות: Blank, Sham, MCAO, SAE ו-Baclofen. כל ההתערבויות בוצעו במשך 7 ימים רצופים. לאחר מכן הוערכו תפקוד נוירולוגי, נפח האוטם המוחי, היסטופתולוגיה, מבנה סינפטי אולטרה-סטרוקטיבי וביטוי חלבונים קשור. בהשוואה לקבוצת MCAO, SAE שיפר את הליקויים הנוירולוגיים, הפחיתה את ההיפרטוניה של השרירים, הפחית את נפח האוטפקט, הקלה על פגיעות עצביות, עלתה במספר הסינפסות ושיפרה את המורפולוגיה הסינפטית. SAE גם שיפר את הוויסות של גורם נוירוטרופי מקו תאי גליה (GDNF), PI3K המזורחן (p-PI3K), Akt המזורחן (p-AKT), וחלבונים סינפטיים, כולל סינפטופיזין (SYN), חלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD-95), וחלבון 43 הקשור לצמיחה (GAP-43). צביעת אימונופלואורסצנציה רמזה עוד יותר על ביטוי מוגבר של SYN ו-p-Akt בקורטקס המוטורי לאחר טיפול ב-SAE. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-SAE עשוי להיות קשור להפעלה של איתות PI3K/Akt באמצעות הגברת ויסות ה-GDNF, ובכך לשפר את הפלסטיות הסינפטית ולהקל על תסמיני PSS. מחקר זה חקר את השפעות SAE בעכברים עם PSS וחקר את הקשר הפוטנציאלי בין התערבות SAE, פעילות מסלולי PI3K/Akt ופלסטיות סינפטית.
אוטם מוחי נותר גורם מוביל למוות ולנכות ברחבי העולם. איסכמיה והיפוקסיה פוגעות בנוירונים, משבשות את האיזון בין עירור לעיכוב במעגלים מוטוריים, ומובילות לתפקוד מוטורילקוי 1. ספסטיות לאחר שבץ מתבטאת בעלייה בטונוס השרירים ובירידה בתנועת המפרקים, מה שמפריע לפעילויות היומיום ומגביר את עומס המטפל2. למרות שחומרים אנטיספסטיים כמו בקלופן יכולים לספק הקלה זמנית בתסמינים, שימוש ממושך עלול להוביל לסבילות לתרופות ותופעות לוואי, ואינו משיב תפקוד עצבי פגום3. שיקום מוטורי קונבנציונלי מוגבל גם על ידי התחלה איטית של תועלת ומשך טיפול ממושך. לכן, נדרשות בדחיפות אסטרטגיות טיפוליות בטוחות ויעילות יותר, והמנגנונים הבסיסיים דורשים בדיקה נוספת. נוירופלסטיות היא מנגנון מרכזי בהתאוששות תפקודית לאחר שבץ וכוללת עיצוב מחדש סינפטי, התחדשות אקסונים והישרדות נוירונית4. לאחר שבץ איסכמי, נוירונים בליבת האוטפקט עוברים מוות מהיר, בעוד שתגובות דלקתיות מקומיות מחמירות את פגיעת הרקמה בפנומברה האיסכמית; ביחד, תהליכים אלו מניעים פגיעות מוח 5,6. פלסטיות סינפטית, רכיב מרכזי בנוירופלסטיות, ניתנת להערכה על ידי חלבונים הקשורים לסינפסות, כולל סמנים פרה-סינפטיים כגון סינפטופיזין (SYN) וחלבון 43 הקשור לצמיחה (GAP-43), וכן על ידי חלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD-95)7,8,9.
גורמים נוירוטרופיים מספקים בסיס מולקולרי לפלסטיות סינפטית. גורם נוירוטרופי מקו תאי גליה (GDNF) חשוב במיוחד משום שהוא מקדם הישרדות ותיקון נוירונים, מדכא דלקת ומשפר את המיקרוסביבה הסינפטית10. על ידי קישור לקולטן ה-Ret, GDNF יכול להפעיל את איתות PI3K/Akt11. מפל PI3K/Akt הוא מסלול מרכזי לתמיכה בהישרדות במערכת העצבים, והפעלתו מעכבת אפופטוזיס תוך תמיכה בסינתזת חלבונים הנדרשת לעיצוב מחדש סינפטי12,13. דיקור סיני בקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית (SAE) הוא אסטרטגיית שיקום אינטגרטיבית המשלבת גירוי דיקור קרקפת עם אימון מוטורי פעיל. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לווסת בו זמנית את הפעילות העצבית המרכזית ולקדם התאוששות מוטורית הקשורה למשימה, ובכך להפחית היפרטוניה של שרירים ולשפר תוצאות תפקודיות לאחר שבץ. SAE נמצא בשימוש נרחב בסין לטיפול בספסטיות לאחר שבץ (PSS). ההיגיון בגישה משולבת זו הוא שדיקור סיני בקרקפת עשוי לווסת את ההתעוררות הקורטיקלית ואת הפרפוזיה המוחית, בעוד שטיפול בפעילות גופנית מספק אימון מוטורי תלוי פעילות שמקדם התאוששות פונקציונלית ועיצוב מחדש סינפטי. בהשוואה לטיפול בפעילות גופנית בלבד, עדויות קליניות קודמות הראו כי דיקור קרקפת בנקודות הקרקפת בשילוב עם טיפול בפעילות גופנית מפחית עוד יותר את הספסטיות של הגפיים ומשפר את התפקוד המוטורי ואת הפעילות היומיומית אצל מטופלים עם עווית גפיים לאחר שבץ14.
סקירה שיטתית ומטא-אנליזה עדכנית הציעו גם כי דיקור קרקפת בסגנון תנועה או התערבויות דיקור-פעילות מקבילות בקרקפת מספקים שיפורים גדולים יותר בספסטיות, תפקוד מוטורי, שיווי משקל ופעילויות יומיומיות לעומת התערבויות חד-רכיביות או רציפות, התומכות ביתרון הפוטנציאלי של נוירומודולציה וחינוך מוטורימקביל 15. מחקרים פרה-קליניים הראו כי SAE או פרוטוקולי דיקור קרקפת בסגנון תנועה קשורים יכולים לשפר את זרימת הדם המוחית ולהפחית ספסטיות באמצעות הפעלה מחדש של KCC2 עמוד שדרה בתיווך קולטני 5-HT₂A16,17. מחקר עדכני מציע בנוסף כי דיקור מקדם נוירופלסטיות באמצעות איתות PI3K/Akt18. לכן, SAE עשוי להתאים במיוחד להקשרים ניסיוניים וקליניים שבהם מודולציה של פלסטיות עצבית לאחר שבץ, התאוששות מוטורית והפחתת ספסטיות הם מטרות טיפוליות מרכזיות. עם זאת, הקשר הפוטנציאלי בין SAE, איתות GDNF/PI3K/Akt ופלסטיות סינפטית בהקלה על PSS עדיין אינו מובן היטב. המחקר הנוכחי הקים מודל חולדה של PSS להערכת השפעות SAE על ליקויים נוירולוגיים וספאסטיות שרירים, ולאפיון שינויים בביטוי GDNF, פעילות מסלולי PI3K/Akt וחלבונים הקשורים לפלסטיות סינפטית לאחר התערבות. מחקר זה עשוי לספק ראיות ניסיוניות לקביעת האם SAE היא אסטרטגיית שיקום מתאימה ל-PSS ולהבהרת מנגנון הפעולה הפוטנציאלי שלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (אישור מס' 20251038) ובוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE 2.0 למחקר בעלי חיים: דיווח על ניסויים בחיים (ARRIVE 2.0) וכן למדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. כל החומרים ששימשו במחקר זה מוצגים בטבלת החומרים.
נהלים ניסיוניים
בעלי חיים ניסיוניים וקבוצות
שמונים עכברי Sprague–Dawley זכרים בוגרים ללא פתוגנים (SPF) (220–250 גרם) נרכשו מחוות הרבייה לבעלי חיים הונגדה (מחוז קואנצ'נג, צ'אנגצ'ון, סין). בעלי החיים אוחסנו במרכז הניסויים לבעלי חיים של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית בתנאים מבוקרים של 22–25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 50–60%, ומחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ולמים. לאחר שבוע של הסתגלות, חולדות הוקצו באקראי לקבוצה ריקה (n = 12), קבוצת שאם (n = 12), וקבוצת מודל-רזרבה (n = 56). הקבוצה הריקה נכללה כקבוצת ביקורת תקינה ולא מטופלת כדי לספק ערכי בסיס לביצועים התנהגותיים, תכונות היסטופתולוגיות וביטוי סמנים מולקולריים בעכברים בריאים. קבוצת שאם עברה את אותה הרדמה וחשיפה ניתוחית כמו קבוצת MCA, למעט שלא בוצעה סתימה עורקית; לכן, קבוצה זו שימשה כבקרה להשפעות הפוטנציאליות של הרדמה ומניפולציה כירורגית. הכללת שתי קבוצות בלנק ושאם אפשרה להבחין בין השפעות הפגיעה האיסכמית לאלו הקשורות להליך הכירורגי עצמו.
קבוצת המודלים-רזרבה עברה מידול של MCAO. שלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח הוגדרו כתקופת ההשראה למודל. במהלך תקופה זו, 8 מתוך 56 חולדות מתו, מה שמקביל לשיעור תמותה של 14.29%, ו-12 חולדות הוצאו מהמחלקה כי המודלים לא הצליחים. 36 העכברים הנותרים עם הקמת מודל מוצלחת הוקצו באקראי, באמצעות טבלת מספרים אקראית, לקבוצות MCAO, SAE ובקלופן, עם 12 חולדות בכל קבוצה. ההתערבויות הקבוצתיות היו כדלקמן: (I) קבוצה ריקה: האכלה שגרתית בלבד, ללא התערבות. (II) קבוצת שמים: חשיפה כירורגית של עורק הקרוטיד המשותף, עורקי הקרוטיד הפנימיים והחיצוניים, ועצב הואגוס, ללא קשירה או החדרת חוט. (III) קבוצת MCAO: MCAO הוקם תחת הרדמה תוך-פריטונלית עם 3% נתרן פנטוברביטל, ללא טיפול נוסף. (IV) קבוצת SAE: לאחר מידול ואימות מוצלח של MCAO, חולדות קיבלו דיקור סיני בקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית. הרדמה בשאיפת איזופלוראן ב-1.5%–2.0% שימשה רק בשלב החדרת המחט הקצר. אימון הליכון החל רק לאחר התאוששות מלאה של ההכרה והשבת יכולת ההליכה הספונטנית. דיקור סיני בוצע ב-GV20 וב-EX-HN1 דו-צדדי. המחטים הוכנסו לעומק של 1 מ"מ ונשמרו במהלך תקופת האימון בהליכון. תקופת ההחזקה/אימון הסטנדרטית של 30 דקות הוגדרה כתקופת האימון בהליכון וכללה 6 מ' לדקה במשך 10 דקות, ואחריה 12 מ'/דקה למשך 20 דקות בשיפוע 0°. ההתערבות ניתנה פעם ביום במשך 7 ימים רצופים. (V) קבוצת בקלופן: לאחר מידול ואימות מוצלח של MCAO, חולדות קיבלו בקלופן באמצעות גאבאז' תוך-קיביתי במינון 0.4 מ"ג/ק"ג פעם ביום במשך 7 ימים רצופים.
הקמת מודל MCAO
מודל MCAO של עכברוש הוקם באמצעות שיטת חוט תוך-לומי מותאם19. לאחר 12 שעות של צום וחוסר מים, חולדות הורדמו בהזרקה תוך-פריטונאלית של 3% נתרן פנטוברביטל והונחו על השכיבה. לאחר חיטוי העור, בוצע חתך צוואר הרחם במרכז הדרך כדי לחשוף את עורק התרדמה הימני (CCA) ואת העצבים והשרירים הסמוכים. העורק הקרוטידי החיצוני (ECA) זוהה וקשור, והעורק התרדמי הפנימי (ICA) בודד. קשירים הונחו ב-ICA ו-CCA הפרוקסימיים, וה-CCA הדיסטלי נלחץ זמנית. לאחר מכן בוצעה ארריוטומיה קטנה ב-CCA פרוקסימלי למהדק. חוט ניילון בקוטר 0.26 מ"מ הוכנס והתקדם 18–20 מ"מ דרך ה-ICA כדי לחסום את מקור העורק המוחי האמצעי. ה-ICA וה-CCA נקשרו לאחר מכן, והחתך נתפר. לאחר הניתוח, חולדות נשמרו חמות במהלך ההחלמה וקיבלו זריקה תוך-פריטוניאלית של פניצילין (40,000 U) למניעת זיהום. בקבוצת השאם בוצעה רק חשיפה וסקולרית, ללא הכנסת פילמנט; סגירת פצע וטיפול לאחר הניתוח היו זהים לאלו שבקבוצת MCAO. הקמת מודל מוצלחת הוגדרה כציון זיאה לונגה ≥ 2 ב-3 ימים לאחר הניתוח19 וציון טונוס שרירים בסולם אשוורת' (MAS) מותאם ≥ דרגה 120.
שיטות האינטרבינציה
דיקור סיני בקרקפת משולב עם התערבות בפעילות גופנית
מחקרים קודמים מראים כי בעכברי MCAO, הליקויים הנוירולוגיים מגיעים לשיא ביום השלישי ונשארים גבוהים תוך 10 ימים לאחר הניתוח, בעוד שהתנגדות השרירים ההיקפית עולה בהדרגה מיום 6 ועד יום9-21. לכן, הטיפול החל ביום השלישי לאחר הניתוח ונמשך פעם ביום במשך 7 ימים רצופים כדי למזער את השפעת ההחלמה הספונטנית. לפני המודל, חולדות שהוקצו לקבוצת SAE עברו 3 ימי אימון על הליכון אדפטיבי במהירות של 5 מ'/דקה במשך 10 דקות ביום22. אימון אדפטיבי זה שימש להכיר את העכברים לריצה על הליכון ולהפחית את הסיכוי להיאבק, נפילה, סירוב לרוץ או להפסיק במהלך תקופת ההתערבות הרשמית. במהלך אימון אדפטיבי והתערבות פורמלית, אירועים חריגים הקשורים להליכון הוגדרו כמאבק מתמשך, נפילה מנתיב הריצה, סירוב לרוץ יותר מדקה אחת, או עצירה של יותר מדקה במהלך אימוני הליכון. אירועים אלו תועדו ביומני ניסוי כאשר נצפו. היסוס קצר או עצירה זמנית לא הובילו להדרה אם ניתן היה לחדש את הריצה על ההליכון לאחר עידוד עדין. הנתונים הוצאו רק אם בעל חיים לא הצליח להשלים את סשן ההליכון היומי שהוקצה לו עקב נפילה חוזרת, סירוב מתמשך לרוץ או מצוקה חמורה. לאחר אימות מודל מוצלח ביום 3, התערבות SAE ניתנה פעם ביום במשך 7 ימים רצופים.
בכל מפגש טיפול, חולדות הורדמו עם 1.5%–2.0% איזופלורן. ההרדמה הופסקה מיד לאחר החדרת המחט. בפרקטיקה ניסויית, חולדות בדרך כלל חזרו להכרה מלאה בתוך כ-1–2 דקות לאחר גמילה מאיזופלורן. האימון על הליכון לא החל בזמן שהחולדות היו מורדמות. נקודות דיקור אותרו על ידי דיקורים מנוסים של בעלי חיים בהתאם לנומנקלטורה וללוקליזציה של נקודות אקופונט נפוצות בבעלי חיים ניסיוניים שפורסמו על ידי האגודה הסינית לדיקור-מוקסיובאסציה בשנת 2020. GV20 הוגדר כנקודת האמצע של הקו שמחבר בין הפונטנלים הקדמיים והאחוריים בקו האמצע הגולגולתי. נקודות EX-HN1 דו-צדדיות ממוקמות במרחק 2 מ"מ לרוחב GV20. מחטים חד-פעמיות בגודל 0.25 מ"מ × 13 מ"מ הוכנסו אנכית לעומק של 1 מ"מ ונשמרו לאורך כל תקופת האימון הסטנדרטית של 30 דקות בהליכון. המחטים הוחברו בסרט רפואי נושם למניעת הזזה, וחדירת הגולגולת נמנעה באמצעות מישוש כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית. מיקום המחט וקיבוע הסרט נבדקו לפני אימון ההליכון, במהלך הפסקות קצרות אם התרחשה התנהגות ריצה חריגה, ומיד לאחר סיום האימון. בנוסף, מיקום המחט נבדק ויזואלית כל 5 דקות במהלך אימוני הליכון, ללא קשר להתנהגות בעלי החיים. הזזת המחט הוגדרה כהרפיה נראית לעין, שינוי בזווית המחט, משיכה חלקית או התנתקות מוחלטת במהלך ריצה על הליכון. אם התרחש התרופפות קלה ללא אובדן מיקום המחט, הסרט חוזק בעדינות בזמן שההליכון הופסק לרגע. אם מחט נמשכה חלקית או שוחררה לחלוטין, המחט לא הוחזרה במהלך המפגש; העכברוש השלים את אימון ההליכון שנותר ללא מניפולציה נוספת במחטים, והאירוע תועד ביומן הניסוי. בעלי החיים לא הוצאו רק בגלל אירוע יחיד של הזזת מחטים, אלא אם כן האירוע לווה באי-יכולת להשלים את אימוני ההליכון או סימני מצוקה חמורה.
תקופת ההחזקה/האימון הסטנדרטית של 30 דקות החלה כאשר העכבר התחיל לרוץ על ההליכון לאחר החלמה מלאה מהרדמה איזופלורנית והסתיים מיד לאחר סיום אימוני ההליכון, כאשר המחטים הוסרו. מרווח ההחלמה הקצר לאחר הפסקת השימוש באיזופלוראן לא נכלל בתקופת האימון הסטנדרטית של 30 דקות. מכיוון שהמחטים הוכנסו לפני ההחלמה, זמן השהייה הפיזית בפועל היה ארוך בכ-1–2 דקות מתקופת האימון על ההליכון. הגדרה זו יושמה בעקביות על כל העכברים בקבוצת SAE. חולדה נחשבה להחלמה מספקת כדי להתחיל אימוני הליכון כאשר הקריטריונים הבאים התקיימו: התאוששות מלאה של הכרה, יכולת לעמוד באופן עצמאי, יכולת ללכת בעקביות על משטח ישר, ותגובה תקינה לגירוי חיצוני עדין. קריטריונים אלו נבדקו לפני ההצבה על ההליכון.
במהלך החזקת המחטים, העכברים ביצעו תרגיל הליכון בשיפוע 0°: 6 מ' לדקה במשך 10 דקות, ואחריו 12 מ' לדקה במשך 20 דקות. לא נעשה שימוש בשוק חשמלי בשום שלב במהלך המחקר. אם עכברוש הפסיק לרוץ או סירב לרוץ יותר מדקה במהלך האימון הפורמלי, נעשה שימוש בגירוי שמיעתי עדין ולא שלילי, כמו טפיחה קלה על קיר ההליכון, כדי לעודד תנועה. השימוש בהנעה כזו, כמו גם כל מאבק, נפילה, עצירה, סירוב לרוץ או הזזת מחטים, תועדו ביומן הניסוי כאשר נצפה. אירועים אלו נוטרו באופן תיאורי ותועדו ביומן הניסוי כאשר נצפו. עוצמת האימון הותאמה באופן מקיף בהתבסס על פרוטוקולים שדווחו בעבר ושילבו דיקור סיני בקרקפת עם אימון הליכון16,23. ההתערבות של SAE ניתנה פעם ביום במשך 7 ימים רצופים (איור 1A).
התערבות בקלופן
לאחר אימות מוצלח של המודלים, חולדות בקבוצת Baclofen קיבלו תמיסת בקלופן באמצעות גוואג' תוך-קיבתי במינון של 0.4 מ"ג/ק"ג. התרופה ניתנה פעם ביום בשעה 9:00 בבוקר במשך 7 ימים רצופים.
תוצאה בינונית
תצפית כללית
המצב הכללי נעקב מדי יום בכל הקבוצות, כולל משקל גוף, מצב נפשי, צריכת מזון ומים, ופעילות ספונטנית.
תפקוד נוירולוגי והערכת טונוס שרירים
ליקויים נוירולוגיים וספסטיות גפיים הוערכו בימים 1, 3, 5 ו-7 לאחר אימות המודל באמצעות ציון זיאה לונגה, ציון חומרת נוירולוגיה מותאם (mNSS) וסולם אשוורת' מותאם. כל ההערכות ההתנהגותיות בכל נקודות הזמן בוצעו באופן עצמאי על ידי שני חוקרים שהיו עיוורים להקצאת קבוצות לאורך תקופת התצפית. קריטריוני ניקוד מפורטים מוצגים (טבלאות 1–3).
קביעת נפח האוטם המוחי
נפח האוטם המוחי הוערך באמצעות צביעת 2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC). לאחר 7 ימי התערבות, שלושה חולדות מכל קבוצה נבחרו באקראי והועתו באמצעות מנת יתר תוך-פריטונאלית של נתרן פנטוברביטל, ואחריה כריתת ראש מהירה לאיסוף מוח מלא. המוחות הוקפא תחילה בטמפרטורה של −20°C ואז נחתך לחתכי קורונל בעובי 2 מ"מ. החתכים נדגרו בתמיסת TTC של 2% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך, ואז קיבעו ללילה בפרפורמלדהיד 4% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, כל הקטעים צולמו במצלמה דיגיטלית. רקמת המוח התקינה הייתה צבועה באדום כהה, בעוד שהרקמה המאותמת נראתה בלבן בהיר. אזורים של אינפרקט נמדדו באמצעות ImageJ, ונפח האימפרקט הובטא כאחוז באמצעות הנוסחה:
נפח האוטם (%) = שטח האוטם / שטח החתך הכולל במוח X 100%. (1)
בדיקה היסטופתולוגית של רקמת המוח
צביעת המטוקסילין–אאוזין (HE)
צביעת המטוקסילין ואאוזין שימשה להערכת שינויים היסטופתולוגיים בקורטקס הפריק-אפרקטי. לאחר 7 ימי התערבות, חולדות הושמעו בשל מנת יתר תוך-צפיקית של נתרן פנטוברביטל. לאחר מכן בוצעה פרפוזיה מהירה דרך הלב עם 0.01 מ' סליין פוספט-בופר (PBS) להסרת דם, ולאחר מכן 250 מ"ל פאראפורמלדהיד קר 4% (4 מעלות צלזיוס) לקיבוץ. נאספו מוחות שלמים, ורקמת הקורטיקה הפרי-אופרקטית בודדה ונקבעה ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. הרקמות הוטבעו בפרפין וחולקו באופן קורונלי בעוצמה של 5 מיקרון. החלקים הותקנו על שקופיות, נאפו בטמפרטורה של 60°C במשך 30 דקות, ופורקו מפרפין בקסילן I–III (10 דקות כל אחד). לאחר מכן בוצעו צביעת HE, ואחריה ייבוש ופינוי. לבסוף, החלקים כוסו בבלסם ניטרלי, והתמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור של ניקון.
צביעת Nissl
צביעת Nissl שימשה להערכת הישרדות הנוירונים וצפיפות הגוף של ה-Nissl באזור הפרי-אפרקט. לאחר 7 ימי התערבות, חולדות הושמתו ופרחו בלב עם 0.01 מיליון PBS (37 מעלות צלזיוס), ואחריהם 250 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד (4 מעלות צלזיוס). מוחות שלמים הוסרו, ורקמות הקורטקס הפרי-אפרקטיות והנגדיות ננתקו ונקבעו במהלך הלילה בפרפורמלדהיד 4% בטמפרטורה של 4°C. לאחר הטמעת פרפין, הוכנו מקטעים של 5 מיקרון. החתכים עברו דה-פרפין בקסילן למשך 10 דקות, הודרו מחדש באמצעות סדרת תמיסות אתנול מדורגות (95%, 90%, 80%, 70% ו-50%; 5 דקות לכל ריכוז), וצבועו בתמיסת עבודה Nissl למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה קצרה במים מזוקקים, החלקים יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן למשך 2 דקות, ולבסוף הותקנו עם משטחי כיסוי. התמונות צולמו ונותחו תחת מיקרוסקופ אור.
ניתוח כתם מערבי של חשיפת חלבונים
בוצעה ווסטרן בלוטינג להערכת חלבונים המעורבים באיתות PI3K/Akt ובפלסטיות הסינפטית. לאחר 7 ימי התערבות, חולדות הושמתו במנת יתר של נתרן פנטוברביטל, ונאספה רקמת הקורטקס המוטורי סביב האינקרט. רקמות עברו הומוגניזציה מלאה במבחן RIPA לליזיס על קרח וצונטריפוגה ב-1610 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להפקת חלבון מלא. ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת בדיקה מסחרית של חומצה ביצינכונינית (BCA). כמויות שוות של חלבון (50 מיקרוגרם לכל נתיב) הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) והועברו חשמלית לממברנות פוליווינילידן פלואוריד (PVDF). הממברנות נחסמו בתמיסת אלבומין סרום בקר (BSA) של 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לבטל קשר לא ספציפי, ולאחר מכן דגרו עם נוגדנים ראשוניים ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה סבבי שטיפה עם סליין טריס-בופר עם בופר Tween-20 (TBST), הממברנות נדגרו עם נוגדנים משני (יחס דילול 1:1000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות כימילומינסנציה מוגברת (ECL), ועוצמת הרצועה נמדדה באמצעות ImageJ. הביטוי היחסי של חלבון חושב כיחס בין חלבון המטרה לביקורת הפנימית. הנוגדנים העיקריים היו כדלקמן: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), פוספו-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), פוספו-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000), ו-GDNF (1:1000).
תצפית על אולטרה-מבנה סינפטי
מיקרוסקופ אלקטרוני העברה (TEM) שימש להערכת מספר הסינפסות ושלמות המבנה. לאחר 7 ימי התערבות, החולדות הורדמו והועברו לפיוז טרנסקרדיאלי עם תערובת קיבוע המכילה 4% פאראפורמלדהיד ו-2.5% גלוטראלדהיד. בלוקים קורטיקליים סביב האנקרטיום (1 מ"מ × 1 מ"מ × 1 מ"מ) נאספו וקבעו בגלוטראלדהיד של 2.5% למשך 2 שעות, ואחריהם קיבוע לאחר קיבוע עם 1% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעה. הדגימות עובדו לאחר מכן עם ייבוש אתנול מדורג, הטמעת שריון אפוקסי, חתך דק במיוחד (עובי 50 ננומטר), וצביעה כפולה עם אצטט אורניל וציטראט עופרת. אולטרה-מבנה סינפטי נבדק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר. התמונות נאספו ב-8,000× להערכה מבנית, וסינפסות נספרו ב-5,000×. שלושה שדות נוירופילים אקראיים בכל קבוצה נותחו לחישוב מספר הסינפסות הממוצע, והנתונים הושוו באמצעות ANOVA חד-כיווני.
מבחן סימון כפול באימונופלואורסצנציה
בוצע צביעת תיוג כפול באימונופלואורסצנציה להערכת הביטוי וההתפלגות של SYN ו-p-Akt בקורטקס הפריק-אפרקטי. לאחר 7 ימי התערבות, חולדות הושמתו בשל מנת יתר תוך-פריטונאלית של נתרן פנטוברביטל, ורקמת הקורטיקה הפרי-אפרקטית ננתקה במהירות. הדגימות קיבעו ב-4% פרפורמלדהיד במשך 24 שעות, הוטמעו בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), ונחתכו לחתכים בעובי 10 מיקרון. החלקים יובשו בטמפרטורת החדר למשך שעה ונשטפו שלוש פעמים עם בופר TBST להסרת תרכובת OCT שנותרה. החתכים היו חדירים עם 0.3% טריטון X-100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, נשטפו ב-PBS, ונחסמו בתמיסת BSA של 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר. בתנאים חשוכים, הקטעים הוגברו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים של אנטי-SYN (דילול 1:200) ואנטי-פ-אקט של ארנב (דילול 1:200). למחרת, החתכים נשטפו שלוש פעמים עם PBS ודגרו בחושך עם נוגדן משני (דילול 1:400) למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שש שטיפות נוספות עם בופר TBST, גרעיני התאים צוברו נגד בתמיסת עבודה 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התמונות צולמו תחת חשיפה ורקע זהים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות מייצגות שימשו להערכת דפוסי ביטוי SYN ו-p-Akt בקורטקס המוטורי בין קבוצות.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism 10.1.2 ו-IBM SPSS Statistics 25. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). נתוני התנהגות שנאספו במספר נקודות זמן, כולל ציון זיאה לונגה, ציון חומרת נוירולוגיה מותאם וסולם אשוורת' מותאם, נותחו באמצעות ANOVA דו-כיווני עם מדדים חוזרים, כאשר הקבוצה היא גורם שבין הנבדקים והזמן הוא גורם בתוך הנבדקים. כאשר זוהו השפעות עיקריות משמעותיות או אינטראקציות, מבחן ההשוואות המרובות של סידאק שימש לניתוח לאחר מכן. נתונים נוספים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריהם מבחן ההשוואות המרובות של סידאק להשוואות לאחר מכן. עמוד דו-זנבי < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. בגרפים עמודתיים, המובהקות הסטטיסטית מסומנת על ידי כוכביות כפי שמוגדרת במפת האיורים המתאימים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
SAE משפר תפקוד נוירולוגי ומפחית ספסטיות שרירים בעכברי PSS
ההשפעות הטיפוליות של SAE על תפקוד התנהגותי לקוי בעכברים עם ספסטיות לאחר שבץ הוערכו באמצעות ציון Zea Longa, ציון חומרת נוירולוגיה מותאם, וסולם אשוורת' מותאם בימים 1, 3, 5 ו-7 לאחר אימות המודל (n = 12 לכל קבוצה). ציון זיאה לונגה ו-mNSS שימשו להערכת ליקויים נוירולוגיים, בעוד שציון MAS שימש להערכת טונוס/ספסטיות שריר. לאחר המודלים, חולדות בקבוצות Blank ו-Sham הראו עלייה יציבה במשקל, התנהגות תקינה ופעילות נשמרת. לעומ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקרים קליניים קודמים הראו כי דיקור בקרקפת בשילוב עם פעילות גופנית יכול להקל על תסמינים ספסטיים אצל חולים עם ספסטיות לאחר שבץ, תוך שיפור התפקוד המוטורי והפעילויות היומיומיות (ADL)14,24. ממצאים אלו תומכים בערכה הקליני. המחקר הנוכחי אישר עוד את התועלת הטיפולית של SAE במודל חולדה באמצעות שלושה מדדים התנהגותיים, כולל ציון Zea Longa, mNSS ו-MAS. הערכה התנהגותית חוזרת הראתה כי SAE שיפר את החסרים הנוירולוגיים והפחית היפרטוניה של שרירים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תרומות המחבר:
סיינאן ג'או: קונספטואליזציה, מתודולוגיה, ניתוח פורמלי, חקירה, ניהול פרויקט, כתיבה – טיוטה מקורית, כתיבה – סקירה ועריכה. לינגשו לי: חקירה, איסוף נתונים, אימות. וונה לי: אוצרות נתונים, ניתוח פורמלי, ויזואליזציה. צ'ונמנג וואנג: חקירה, משאבים. יאנלונג ג'ין: תוכנה, אימות, כתיבה – סקירה ועריכה. גואנגצ'נג ג'י: פיקוח, רכישת מימון, משאבים, כתיבה – סקירה ועריכה.
המחברים מודים לכל המשתתפים שהשתתפו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט פיתוח המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין [No. YDZJ202401122ZYTS].
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution | Beyotime | C0651 | TTC staining |
| 3MM Filter Paper | Whatman, UK | 3030861 | Western blot transfer |
| AKT Antibody | Affinity | AF0836 | Primary antibody |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10000418 | Infiltration of electron microscopy specimens |
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html | 64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092683 | Deparaffinization of paraffin sections |
| Anti-fade mounting medium | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1020 | coverslipping |
| BCA Protein Assay Kit | MDL | MD913053 | Protein concentration determination |
| Bluishing solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2104 | Hematoxylin staining |
| Chemiluminescence Imaging System | CLINX, China | ChemiScope6100 | System Detect target protein |
| Concentrated normal goat serum | Boster Biological Technology | AR1009 | serum blocking |
| DAPI | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1030 | nuclear staining |
| Diamond Knife | Daitome | Ultra 45° | Slice ultrathin specimens |
| Differentiation solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2104 | HE staining |
| Drying Oven | Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd. | GFL-230 | Bake fixed tissue slices |
| EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1052 | Antigen retrieval |
| Electron microscopy fixative | ASPEN | AS1063 | Fixation of electron microscopy specimens |
| Electrophoresis Power Supply | Longfang | LF-2000 | Provide electrophoresis voltage |
| Embed 812 embedding medium | SPI | 90529-77-4 | Infiltration of electron microscopy specimens |
| EndNote X9 | Clarivate Analytics (US) LLC | Version X9, https://endnote.com/ | Used for reference management and academic citation formatting |
| Freezing Stage | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-L5 | Freeze frozen tissue blocks |
| GAP-43 Antibody | Affinity | Df7766 | Primary antibody |
| GAPDH Antibody | Affinity | AF7021 | Primary antibody |
| GDNF Antibody | Biosynthesis | Bs-1024r | Primary antibody |
| Glacial acetic acid | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2138 | Nissl staining |
| Glass Slides and Coverslips | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10212432C | Mount tissue sections |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/ | 64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting |
| Grinding machine | Beijing Herde | N.9548 | Grind tissue samples |
| HE staining solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2103 | HE staining |
| HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody | Servicebio | C030205 | Secondary Antibody |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | SeraCare | 5220-0336 | Secondary antibody |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C5101 | preparation of TSA reagents |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics | 64-bit version, used for statistical data analysis and processing |
| Imaging System | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | Capture microscopic images |
| Metal Bath | COYOTE | H203-H | Constant temperature incubation |
| Microwave Oven | Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd. | P70D20TL-P4 | Antigen retrieval |
| NC Membrane (0.22 μm) | GVS, USA | ISEQ00010 | Protein blot transfer |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10004160 | dehydration and coverslipping |
| PBS buffer | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C0003 | decolorization and washing |
| PI3K Antibody | Affinity | AF6241 | Primary antibody |
| PSD-95 Antibody | Affinity | Af5283 | Primary antibody |
| Pathological Microtome | Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | RM2016 | Cut paraffin sections |
| Phospho-AKT Antibody | Affinity | Af0832 | Primary antibody |
| Phospho-PI3K Antibody | Affinity | Af3241 | Primary antibody |
| Pipette | Dragonlab | KE0003087/KA0056573 | Quantitative liquid transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Beyotime | P1005 | Protease inhibition |
| RIPA Lysis Buffer (Medium) | Beyotime | P0013C | Tissue lysis |
| Refrigerated Centrifuge | SEILOGEX, China | CF1524R | Low-speed sample separation |
| SDS-PAGE Electrophoresis System | Beyotime | MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System | Protein electrophoretic separation |
| SDS-PAGE Precast Gel Kit | MDL | MD911919 | SDS-PAGE electrophoresis |
| SYN (Synapsin) Antibody | Biosynthesis | bs-3501R | Primary antibody |
| Shaker | Qilinbeier | TS-8 | Sample oscillation washing |
| Tissue Dehydrator | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JJ-12J | Dehydrate paraffin tissue |
| Tissue Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | Embed tissue in paraffin |
| Tissue Spreading Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | KD-P | Unfold paraffin slices |
| Toluidine blue staining solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2131 | Nissl staining |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 20 TWIN | Observe ultrastructure |
| Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa) | Servicebio | G2091 | SDS-PAGE electrophoresis |
| Tyramide-488 | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C6002 | TSA reagents |
| Tyramide-CY3 | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C6003 | TSA reagents |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC7 | Cut ultrathin EM sections |
| Ultrasonic Cell Disruptor |