מודל של אנטרוקוליטיס מואצת בפירוקסיקאם בעכברי הדחיפה אינטרלוקין-10 לצורך חקר שינויים מטבוליים הנגרמים מדלקת

סיכום

פרוטוקול זה עושה שימוש בפירוקסיקאם כדי להאיץ את התפתחות הקוליטיס במודל העכבר הנוקאאוט אינטרלוקין (IL-10). הפרוטוקול מבטיח סנכרון של קוליטיס, מה שמוביל לתוצאות קפדניות וניתנות לשחזור, ללא תלות במין, במאמץ רקע או בתנאי ויווריום. הוא משמש מודל שימושי לחקר שינויים מטבוליים במהלך דלקת במעי.

תקציר

מחלת מעי דלקתי (IBD) היא הפרעה דלקתית כרונית במערכת העיכול המשפיעה על למעלה מ-10 מיליון אנשים ברחבי העולם. בעוד שמחקרים נרחבים התמקדו במנגנונים ובהשלכות האימונולוגיות שמאחורי מחלת המעי הדלקתי, פחות ידוע על האופן שבו דלקת רירית תורמת לדיסרגולציה מטבולית, כולל ירידה במשקל וירידה בתיאבון. כאן, המחברים מתארים מודל עכבר של אנטרוקוליטיס מואצת בפירוקסיקאם בעכברים מסוג IL-10-KO, במטרה לחקור דיסרגולציה מטבולית הנגרמת מדלקת. עכברי IL-10-KO ידועים כמפתחים דלקת מעיים ספונטנית ויש להם רגישות מוגברת לדלקת מעיים הנגרמת על ידי זיהומים או תרופות. עם זאת, תנאי ויווריום ורקע מתח דווחו כמבלבלים בהתפתחות הקוליטיס במודל זה. פירוקסיקאם, תרופה אנטי-דלקתית לא-סטרואידית (NSAID), הוכחה כמפעילה או מאיצה אנטרוקוליטיס במודלים של בעלי חיים על ידי הגברת החשיפה לרירית לחיידקים לומינליים. בפרוטוקול זה, עכברי IL-10-KO הזכרים והנקבות קיבלו תזונה מועשרת בפירוקסיקאם במקום דיאטת אוכל רגילה. צריכת המזון ומשקל הגוף נמדדו מדי יום כדי לשקף שינויים מטבוליים בכל הגוף, יחד עם תופעות קליניות של דלקת מעיים כמו שלשול ודימום רקטלי. הפרוטוקול יעיל וניתן לשחזור, וגורם לדלקת מעיים בו-זמנית במספר עכברים, ומאפשר הערכה של חוסר ויסות מטבולי במודל מחלת מעי דלקתית. מחקרים נוספים המשתמשים בפרוטוקול זה עשויים לחקור את השפעות אנטרוקוליטיס על רכיבים אחרים של חוסר ויסות מטבולית, כגון הוצאת אנרגיה והרכב הגוף, ולחשוף קשרים רחבים יותר בין מחלת מעי דלקתית למטבוליזם של המארח.

מבוא

מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, הידועים יחד כמחלת מעי דלקתית (IBD), הם מחלות אוטואימוניות כרוניות במערכת העיכול המתאפיינות בדלקת רירית עם תופעות קליניות הכוללות כאבי בטן, ירידה במשקל, המטוכזיה ושלשול. מחלת מעי משפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם, כאשר השכיחות הגבוהה ביותר היא בחברות מערביות¹. בארה"ב, מעריכים כי מעל 3 מיליון אנשים מושפעים ^2,3, עם עלייה בשכיחות ובשכיחות, במיוחד בקרב ילדים ובני נוער ^4.5.

המנגנונים המדויקים שמאחורי פתוגנזה של IBD עדיין אינם מובנים במלואם, אך המחלה נחשבת לנובעת מתגובה חיסונית מוגזמת למיקרוביום המעי אצל אנשים רגישים גנטית. ציטוקינים שמווסתים תגובות דלקתיות ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס המעי ובהתפתחות מחלת המעי הדלקתית. מתוכם, אינטרלוקין-10 (IL-10) הוא ציטוקין אנטי-דלקתי שנחקר היטב, המסייע בשמירה על הומאוסטזיס אימונולוגי בבני אדם על ידי ויסות זרועות התגובה החיסונית המולדת והאדפטיבית ^6,7. ראוי לציין כי פולימורפיזמים ב-IL-10 ובקולטן שלו (IL-10RA/B) זוהו בתינוקות עם דלקת מעי פנימית מוקדמת מאוד (VEO-IBD), שהציגו באופן קלאסי מחלות פריאנליות בחודשים הראשונים^לחיים. קשר זה נתמך עוד יותר על ידי ריצוף אקסום בקנה מידה גדול של חולים בוגרים עם מחלת קרוהן, שזיהה את IL-10RA כמוקד רגישות למחלה ב-IBD⁹ שאינו מונוגני. יתרה מזאת, תואר מסלול לא גנטי הכולל נוגדנים מנטרלים של IL-10 בחולי VEO-IBD, מה שמדגיש עוד יותר את חשיבות מסלול זה בשמירה על הומאוסטזיס חיסוני רירית¹⁰.

בהתבסס על מחקרים אנושיים המעורבים ב-IL-10 במחלות מעי דלקתיות, פותחו עכברים מסוג אינטרלוקין-10-נוקאאוט (IL-10-KO) כמודל לחקר תפקידו של IL-10 במחלת מעי דלקתית. עכברי IL-10-KO ידועים כמפתחים דלקת מעיים ספונטנית עם תגובה מוגזמת של CD4+ Th1 לגירויים, בדרך כלל מתחילה בשבועות 8–12 לגיל¹¹. עם זאת, התפתחות אנטרוקוליטיס ספונטנית בעכברי IL-10-KO יכולה להיות בלתי צפויה בהיעדר סוכן מאיץ 12,13,14, בהתאם לזן הגנטי, להרכב המיקרוביום ולתנאי המגורים ^15,16. השימוש בפרוטוקול אמין לגרימת קוליטיס הוא קריטי כדי שמודל IL-10-KO יהיה שימושי מעשית. מחקרים קודמים השתמשו בתרופות אנטי-דלקתיות לא סטרואידיות (NSAIDs) כמו פירוקסיקאם כדי לגרום לאנטרוקוליטיס בעכברי IL-10-KO^17,18. עם זאת, מחקרים אלו התמקדו בעיקר בשינויים אימונולוגיים, עם דגש מועט יחסית על השפעות אנטרוקוליטיס על חילוף החומרים או על תפקיד המין בחומרת הקוליטיס¹⁹. המחברים כאן מתארים את השימוש בדיאטה מועשרת בפירוקסיקאם כדי לגרום לאנטרוקוליטיס בעכברי IL-10-KO ולאפיין דיסרגולציה מטבולית ותגובות דלקתיות ריריות במודל זה באמצעות עכברים זכרים ונקבות. פרוטוקול זה מודד משקל גוף וצריכת מזון כדי לשקף שינויים מטבוליים בכל הגוף, וכן תופעות קליניות של קוליטיס ושינויים היסטולוגיים וטרנסקריפטומיים המשקפים דלקת רירית. מודל יעיל וניתן לשחזור זה מספק כלי חשוב לחקירת הקשר בין IBD למטבוליזם של המארח.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) במרכז הרפואי סאות'ווסטרן של אוניברסיטת טקסס, בהתאם ל"מדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה" [מספר אישור: 2017-102011]. המתת חסד בוצעה בהתאם להנחיות המוסדיות. לא נדרשה הרדמה לביצוע ההליכים. פרטים ספציפיים לחומרים מתוארים בטבלת החומרים.

1. הקמת מודל דלקת מעי מואצת בפירוקסיקאם בעכברי IL-10-KO

1. לשמור על עכברי IL-10-KO במתקן ספציפי ללא פתוגנים (SPF) במחזור אור של 12 שעות עם גישה חופשית לאוכל ולמים.
2. מאכלסים עכברים בני 7–8 שבועות, בגיל ובמין בכלובים מיקרואיזולטורים. אפשר לעכברים להסתגל למגורים בודדים ולטיפול יומיומי לפחות שבוע לפני תחילת הניסוי.
   הערה: ודא שמשקל הגוף הוא >20 גרם לזכרים או >17 גרם לנקבות, ושהעכברים נקיים מפצעי קרב.
3. הקצו עכברים לקבוצת ניסוי ולקבוצת ביקורת. לקבוצת הניסוי, החליפו את הצ'או הסטנדרטי בצ'או מחוזק בפירוקסיקאם. לקבוצת הביקורת, תספק אוכל סטנדרטי חדש. הוסף 50 גרם אוכל לכל קופר כלוב.
   הערה: הקצה לפחות חמישה עכברים לכל מין לכל קבוצה. הצ'או המחוזק בפירוקסיקאם (200 ppm) הוכן על ידי טקלאד באמצעות פירוקסיקאם שסופקה על ידי החוקרים לייצור תזונה מותאמת אישית לבעלי חיים במעבדה. כדי למזער שונות בין אצווה, מומלץ שכל בעלי החיים בניסוי מסוים יקבלו אוכל מאותה אצווה ייצור. כאשר הדבר אפשרי, יש להשתמש באותה אצווה גם בניסויים שונים כדי לשפר את השחזור.

2. ניטור משקל גוף והתנהגות האכלה

1. באמצעות סולם אנליטי, רשמו את משקל הגוף של כל עכבר. שקלו כל עכבר בנפרד באותו זמן בכל יום, יומי במשך 7 ימים רצופים. דווח על משקל גוף יומי כאחוז מהמשקל הבסיסי ביום 0 (נקבע כ-100%).
   הערה: ירידה במשקל מעל 20% מצביעה על לחץ מופרז וסיכון למוות קרוב. עכברים צריכים להיות מוותרים אם מגיעים לסף זה.
2. באמצעות סולם אנליטי, ניתן לרשום את המשקל ההתחלתי של האוכל המגוזן בפירוקסיקאם ואת האוכל הסטנדרטי בכל כלוב.
3. לאחר מכן, מדדו את האוכל שנותר בכל קופר כלוב באותו זמן בכל יום, מדי יום במשך 7 ימים רצופים.
4. חשב את צריכת הצ'או היומית על ידי הפחתת משקל הצ'או היומי מהצ'או שנותר מהיום הקודם.
   הערה: בדוק באופן שגרתי את כמות האוכל וממלא אם היא מתחת ל-10 גרם. הטעם של אוכל פירוקסיקאם אינו משפיע על הצריכה וצריך להיות דומה מאוד לאוכל סטנדרטי.

3. ניטור פעילות מחלה

1. בימים 0 ו-7, בדקו ויזואלית כדורי צואה מעכברים בודדים וקבעו את נוכחות הדם בצואה.
2. אם אין דם נראה, בצע בדיקת דם אוקולטית בצואה על ידי מריחת כדור על כרטיס הבדיקה, ואז הוספת המגיב המפתח שסופק. תוצאות לפי טבלה 1.
3. בימים 0 ו-7, בדקו ויזואלית כדורי צואה שהתרוקנו זה עתה כדי להעריך את עקביות הצואה. השתמש במלקחיים שטוחים כדי לסייע בקביעת עקביות. תוצאות לפי טבלה 1.
4. בימים 0 ו-7, קבעו את דרגת צניחת הרקטום על ידי בדיקת אזור הפריאנל. תוצאות לפי טבלה 1.
5. מדדו את משקל הגוף כפי שתואר למעלה. תוצאות לפי טבלה 1.
   הערה: יש לבצע את מדד פעילות המחלה (DAI) באופן עיוור על ידי אותו חוקר לאורך כל הניסוי, כדי להבטיח עקביות, למזער הטיית צופה ולשפר את אמינות ההערכה.

4. כריתת רקמת המעי הגס

1. המתת חסד לעכברים באמצעות חנק_CO2 ופריקה צווארית כפי שדווח במקום אחר²⁰.
2. הניחו את העכבר בשכיבה ורססו 70% אתנול על הבטן התחתונה.
3. הרימו את העור עם מלקחיים והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך לאורך קו האמצע. חשפו את חלל הפריטונאל ואתרו את המעי הגס.
4. חשפו את המעי הגס והצקום באמצעות דיסקציה קהה. הסר את המעי הגס בבלוק, כולל הצקום והשרוול האנאלי.
5. הנח את המעי הגס על משטח שטוח והסר כל רקמת חיבור.
6. מדוד ורשם את אורך המעי הגס.
7. לאחר מדידת אורך המעי הגס, יש להסיר את הסקום על ידי חיתוך במפגש הצו-קולוני.
8. הכינו מזרק בנפח 10 מ"ל מלא במי מלח מפוזרים (PBS) עם מחט פלדה רב-פעמית בקצה כדורי 22 גייג'. השחיל את המחט למעי הגס ושטוף את תוכן המעיים.
9. הניחו את המעי הגס המושטף בצלחת פטרי המכילה PBS ושוטפים כדי להסיר את התכולה שנותרה. לאחר האישור, השתמש בזה לבדיקות בהמשך.

5. ניתוח היסטולוגיה

1. הנח את המעי על מגלש זכוכית. השתמשו במלקחיים כדי לעטוף את הרקמה סביב עצמה, החל מהקצה המרוחק, כדי ליצור "גליל שוויצרי". בדרך זו, הקצה הדיסטלי/אנאלי יישאר בגליל הפנימי כאשר האזורים הקרובים יותר יתפרסו אל הגליל החיצוני.
2. באמצעות מחט 27 גייג', הצמיד את המעי המגולגל לשמירת הגליל ומניחים אותו בתוך קלטת טישו מוטמעת.
3. כדי לקבע רקמות, טבלו את קלטות הרקמה בתמיסת פורמלין עם בופר של 10% למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   אזהרה: 10% פורמלין מזיק במגע עם העור ועלול לגרום לכוויות קשות ולנזק לעיניים. לטפל בזהירות עם כפפות מגן ומשקפי מגן מדעיים. יש לטפל בפורמלין שנותר כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות.
4. לאחר קיבוע פורמלין, מעבדים רקמות להטמעת פרפין וחתכו אותן להתקנה על שקופיות זכוכית.
   הערה: יש להגיש דגימות למעבדה היסטולוגית עם הציוד הנדרש לעיבוד קלטות רקמה בפרפין, חתך גליל, התקנת שקופית וצביעת המטוקסילין ואאוזין.
5. רקמת הצבע מחליקה עם המטוקסילין ואאוזין (HE), בהתאם לפרוטוקולים²¹ שנקבעו.
6. באמצעות מערכת הניקוד ההיסטולוגית המתוארת בטבלה 2, העריכו את המאפיינים ההיסטולוגיים הבאים בכל חלק: נזק לרקמה כתוצאה מאנטרוקוליטיס, חדירת תאי דלקת של למינה פרופריה, ואחוז השטח המעורב. משלבים את הציונים בכל חלק כדי ליצור ציון כולל (טבלה 2).
   ציון כולל = תכונות × מעורבות (נזק לרקמות) + תכונות × מעורבות (Lamina Propria Infilteration Inflammatory Cell Infilteration) (1)
7. תמונות היסטופתולוגיות מייצגות של נזק לרקמות וחדירת תאים ניתן למצוא בפרסום של ארבן ואח'²².
   הערה: יש לבצע ניקוד היסטולוגי בצורה עיוורת, רצוי על ידי פתולוג מוסמך, כדי להבטיח עקביות ואמינות של ההערכה.

6. צביעת אימונופלואורסצנטי ברקמה מוטמעת בפרפין עם פורמלין מקובע

1. הניחו מחסניות טישו במתקן שקופיות ובמייבש בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להמיס את הפרפין.
2. הניחו את הסליידס במתקן צביעה וטבול את המתקן ברצף למשך 3 דקות בצנצנות צביעה עם קסילן. חזור על השלב הזה בשלוש הזדמנויות.
3. טבלו את מתקן הצביעה למשך 3 דקות בצנצנות צביעה עם 100% אתנול. חזור על השלב הזה בשלוש הזדמנויות.
4. טבלו את מתקן הצביעה למשך 3 דקות בצנצנת הצביעה עם 95% אתנול.
5. טבלו את מתקן הצביעה במשך 3 דקות בצנצנת הצביעה עם 80% אתנול.
6. טבלו את מתקן הצביעה במשך 5 דקות בצנצנות צביעה עם מים דה-יוניים (DI).
   הערה: כל השלבים הקודמים חייבים להתבצע במכסה מאוורר בגלל אדי הקסילן. לטפל בזהירות עם כפפות מגן ומשקפי מגן מדעיים. שאריות הקסילן יש להיפטר כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות.
7. העבר את המחסניות למתקן שקופיות וטבול בצנצנת צביעה עם תמיסת שאיבה של 1× ציטראט.
8. הניחו את צנצנת הצבעה בתמיכה של הצלחת.
9. הניחו את תומכת התבנית בסיר לחץ.
10. בשלו 15 דקות בסיר לחץ.
11. החזר את הסליידס מסיר הלחץ ותן להן להתקרר לטמפרטורת החדר.
12. דגירה עם בופר חוסם של 300 מיקרוליטר (3.5% סרום עזים מדולל ב-PBS) למשך שעה בתא לח. ודא שהרקמה מכוסה לחלוטין על ידי בופר החסימה.
13. חשפו שקופיות ל-300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל בבופר חוסם למשך 16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, בתוך תא לח. ודא שהרקמה מכוסה לחלוטין בנוגדן הראשי. נעשה שימוש בנוגדן ראשוני הבא: אנטי-S100A8/S100A9 (1:500).
    הערה: דילול נוגדנים יהיה ספציפי לראגנט וצריך לעמוד בהמלצות הספק.
14. שטיפת סלייד על ידי טבילה סדרתית ב-PBS למשך 5 דקות בשלוש הזדמנויות בצנצנת צביעה.
15. חשפו שקופיות ל-300 מיקרוליטר של נוגדן משני פלואורסצנטי מדולל בבופר חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר, בתא לח. ודא שהרקמה מכוסה לחלוטין בנוגדן המשני. נעשה שימוש בנוגדן משני פלואורסצנטי הבא: אנטי-ארנב עזים אלקסה פלור 555 (דילול 1:150).
    הערה: מהנקודה הזו ואילך, יש להגן על המחסניות מאור כדי למנוע הלבנת פוטואורופורים. דילול נוגדנים משניים יהיה ספציפי לראגנט וצריך לעמוד בהמלצות הספק.
16. שטיפת סלייד על ידי טבילה סדרתית ב-PBS למשך 5 דקות בשלוש הזדמנויות בצנצנת צביעה.
17. חשפו שקופיות לצביעה גרעינית על ידי טבילה בתמיסת Hoechst מדוללת ב-1:5000 ב-PBS למשך 20 דקות בצנצנת צביעה.
18. שטיפת סלייד על ידי טבילה סדרתית ב-PBS למשך 5 דקות בשלוש הזדמנויות בצנצנת צביעה.
19. נגב בזהירות כל PBS מהשקופיות באמצעות טישו שאינו שוחק. הוסיפו 50 מיקרו ליטר של מדיום הרכבה נגד פייד וכיסוי מכסה.

7. חילוץ RNA

1. הקפיאו במהירות את כל המעי הגס או חתיכה בחנקן נוזלי ואז אחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C. לחילופין, טבלו ב-1.5 מ"ל של תמיסת שימור RNALater ואחסנו לפי הוראות היצרן.
2. הפשיר את המעי הגס שהוקפא קודם והנח על משטח שטוח. הפר והומוגני את הרקמה עם הומוגניזר ידני.
3. בודד RNA באמצעות הערכה, בהתאם להוראות היצרן.
4. למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. יחס₂₆₀/A₂₈₀ > 1.8 ויחס A₂₆₀/A₂₃₀ של 2.0–2.2 מצביעים על טוהר RNA מקובל.
5. המשיכו עם שעתוק הפוך, ואחריהם qPCR עם צבע אינטרקלציה ירוק SYBR.
6. נתח תוצאות באמצעות פלטפורמת הכימות או כלי דומה.

תוצאות

עכברים זכרים ונקבות מסוג IL-10-KO מפתחים דלקת מעי לאחר חשיפה קצרה לתזונה מועשרת בפירוקסיקאם (איור 1A–E). עד היום השני, עכברים שנחשפו לפירוקסיקאם הראו ירידה במשקל מובהקת יותר סטטיסטית לעומת עכברים שקיבלו אוכל קבוע מאותו מין, וירידה דומה במשקל נצפתה בין המינים (איור 1B). צריכת המזון היומית לכאורה נותרה ללא שינוי לאורך כל החשיפה לפירוקסיקאם והתפתחות דלקת המעיים, ודמה לצריכת אוכל סטנדרטי, מה שמעיד שהירידה במשקל במודל זה אינה נובעת בעיקר מהפחתת הצריכה אלא מגורמים אחרים המקדמים הוצאה מטבולית (איור 1C).

כדי לחקור לעומק את התקדמות הדלקת במעיים, פעילות המחלה הוערכה לפי ציון משולב של ירידה במשקל, דם בצואה, עקביות הצואה ומידת צניחת הרקטום. מדד פעילות המחלה המותאם (DAI) הוערך בבסיס וביום השביעי; תוצאות יום 7 מוצגות באיור 1D. בנוסף, התפתחות אנטרוקוליטיס שנצפתה בעכברים שנחשפו לפירוקסיקאם הייתה קשורה למגמה חזקה של עלייה בתמותה, אף על פי שההבדל לא היה מובהק סטטיסטית (p = 0.12; איור 1E). במודל זה, תמותה מוקדמת משנית לכך שעכברים מגיעים ליעדים הומניים (ירידה במשקל > 20%) ומשפיעה בעיקר על זכרים (איור 1E). אם תמותה היא נקודת סיום ניסיונית מבוקשת, ניתן לשקול מספר גדול יותר של בעלי חיים ניסיוניים ממה שמשתמשים בו כאן. במחקר זה, המחברים השתמשו במספר המינימלי של בעלי החיים הדרוש להשגת כוח סטטיסטי באמצעות השלמת המחקר, תוך התחשבות בתמותה הצפויה.

קיצור המעי הגס הוא תכונה הקשורה לחומרת הקוליטיס במודלים של עכברים. בקציר, גם עכברים זכרים וגם נקבות IL-10-KO שקיבלו תזונה פירוקסיקאם היו בעלי מעי גס קצרים יותר מאלו שקיבלו אוכל רגיל (איורים 2A–B). בהערכה היסטולוגית, המעי הגס מקבוצת המזון בפירוקסיקאם הראה נזק אפיתל ועלייה בחדירת תאי החיסון, שינויים הקשורים לקוליטיס (איור 2C). ממצאים אלו תורגמו לציון היסטולוגי גבוה יותר (איור 2D). בנוסף, רמות השעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים המעורבים במודלים של דלקת מעי מעי ועכברים בבני אדם הוערכו²³. בהתאם לדיווחים קודמים, מעי מעיים מעכברי IL-10-KO שהוזנו בפירוקסיקאם הראו עלייה משמעותית בציטוקינים פרו-דלקתיים ברמת התמלול (איור 3A–D). ראוי לציין כי שינוי השעתוק הזה לא נצפה בעכברי IL-10-KO שקיבלו אוכל רגיל או עכברים עם WT שקיבלו תזונה מועשרת בפירוקסיקם, מה שמעיד כי החתימה השעתוקית נבעה משילוב של חוסר ב-IL-10 ופירוקסיקם, ולא על ידי אף אחד מהגורמים בלבד. לבסוף, המחברים אישרו כי החתימה השעתוקית שנצפתה במעי הגס מעכברים שטופלו בפירוקסיקאם הייתה קשורה לעלייה בצביעת הקלפרוטקטין ברירית המעי הגס (איור 3E)^24,25.

איור 1: אנטרוקוליטיס מואצת בפירוקסיקאם בעכברי IL-10-KO. (א) סקירה סכמטית של פרוטוקול ניסוי. (B) משקל גוף, (C) צריכת מזון, (D) מדד פעילות מחלה ביום השביעי (DAI), (E) עקומת הישרדות אצל עכברים זכרים בני 8 שבועות ונקבות IL-10-KO בני 8 שבועות המקבלים דיאטה מועשרת בפירוקסיקאם או דיאטה רגילה. ביקורת גברית: n = 5, פירוקסיקאם זכרית: n = 5, ביקורת נקבה: n = 6, פירוקסיקאם נקבה: n = 6 אינץ' (B), (C) ו-(D). ביקורת גברית: n = 6, פירוקסיקאם זכרי: n = 10, ביקורת נשית: n = 6, פירוקסיקאם נקבה: n = 7 אינץ' (E). * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 בהשוואה זוגית בין עכברים זכרים (כוכבית עליונה) ונקבות (כוכבית תחתונה) ב-(B). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי לא מזווג ב-(B), (C) ו-(D), ומבחן לוג-דרגה ב-(E). ערכי ממוצע ופסי שגיאה המייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) מוצגים. בתרשימי עמודות, המדידות הבודדות מוצגות על ידי גרפים של ג'יטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: קיצור המעי הגס והערכה היסטולוגית. (א) דגימות מעי ייצוגיות מעכברים זכרים ונקבות בני 8 שבועות עם אינטרלוקין-10-נוקאאוט (IL-10-KO) המקבלים דיאטת פירוקסיקאם (למעלה) או תזונה רגילה (למטה) למשך 7 ימים. פס קנה מידה = 1 ס"מ. (B) אורך המעי הגס ביום השביעי (ביקורת גברית: n = 5, פירוקסיקאם זכרי: n = 5, נקבה בקרה: n = 6, פירוקסיקאם נקבה: n = 6). (ג) תמונות מייצגות של המעי הגס המוכתם ב-HE. פס סולם = 100 מיקרון. (D) ציון היסטולוגיה ביום השביעי. מבחן t דו-זנבי לא מזווג ב-(B) ו-(D). ערכי ממוצע ופסי שגיאה המייצגים SEM מוצגים. בתרשימי עמודות, המדידות הבודדות מוצגות על ידי גרפים של ג'יטר. לא מובהק (NS), * p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001 בהשוואה זוגית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: שינויים דלקתיים באנטרוקוליטיס מואצ בפירוקסיקאם. תוצאות RT-PCR כמותיות של (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b, ו-(D) Ifng ברקמת המעי הגס של עכברים זכרים בני 8 שבועות מסוג בר (WT) ואינטרלוקין-10-נוקאאוט (IL-10-KO) בזמן הקציר. בפאנלים A–D, WT פירוקסיקאם n = 7, KO piroxicam n = 6, KO control n = 3. (ה) צביעת אימונופלואורסצנציה מייצגת בקלפרוטקטין ברקמת המעי הגס של עכברי IL-10-KO בני 8 שבועות בזמן הקציר. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן t דו-זנבי וללא זוגיות. ערכי ממוצע ופסי שגיאה המייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) מוצגים. בתרשימי עמודות, המדידות הבודדות מוצגות על ידי גרפים של ג'יטר. פס קנה מידה ב-(E) = 200 מיקרון. לא מובהק (NS), * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 בהשוואה זוגית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תחום	פסקול
משקל	0 – ללא שינוי
	1 – ירידה של 1–5%
	2 – ירידה של 6–10%
	3 – הפסד של 11–20%
	4 – ; אובדן של יותר מ-20%
עקביות בצואה	0 – נורמלי ;
	1 - רך אך מעוצב
	2 – צואה רכה (לא מימית)
	4 – שלשול (צואה נוזלית)
דימום	0 – אף אחד
	2 – צואה חיובית למטואוקולט
	3 – דם נראה על הצואה
	4 – דימום גס לפי פי הטבעת
צניחת רקטום	0 – נעדר
	1 – הווה
ציון כולל	ציון כולל: סכום (ציוני תחום) עבור כל דומיין

טבלה 1: ציון פעילות מחלה (DAI). מערכת ניקוד לקביעת פעילות מחלה לפי ירידה במשקל, עקביות צואה, דם בצואה וצניחת רקטום. מותאם מסיפואנטס-דומינגז, ואחרים²⁶.

נזק לרקמות					חדירת תאים דלקתיים ללמינה פרופריה
מאפיינים		מעורבות			מאפיינים		מעורבות
0	אין	1	1–25% משטח		0	לא תכופה	1	1–25% משטח
1	נדיר ;	2	26–50% משטח		1	העלות, כמה נויטרופילים	2	26–50% משטח
2	שחיקה וכיבים ריריים	3	51–75% משטח		2	נוכחות תת-רירית של אשכולות תאים דלקתיים	3	51–75% משטח
3	נזק נרחב עמוק לדופן המעי	4	76–100% משטח		3	חדירות תאי טרנסמורל	4	76–100% משטח

טבלה 2: מערכת ניקוד היסטולוגית. מערכת ניקוד לקביעת שינויים היסטולוגיים ונזקים. מותאם מסיפואנטס-דומינגז, ואחרים²⁶.

דיון

מחלת מעי דלקתית היא הפרעה פוליגנית מורכבת שבה מודלים פרה-קליניים משמשים כלים יקרי ערך לניתוח מסלולים התורמים לפתוגנזה של IBD ולפיתוח אסטרטגיות אבחנתיות וטיפוליות חדשות. נכון להיום, מודלים פרה-קליניים רבים של IBD מסתמכים על חשיפה כימית, כגון דקסטרן סולפט נתרן (DSS), אוקסזולון וחומצה סולפונית טריניטרובנזן (TNBS), בשל קלות השימוש בהם. קיימים גם מודלים גנטיים שמפתחים קוליטיס ספונטני. מבין אלה, מודל IL-10-KO בעל ערך מיוחד משום ששינויים גנטיים במסלול IL-10 ידועים כגורמים לדלקת מעיים בבני אדם, ועכברי IL-10-KO מפתחים דלקת מעיים כרונית ספונטנית הדומה למחלה אנושית. עם זאת, מגבלה מרכזית של מודל זה היא חוסר היכולת שלו לקחת בחשבון שונות פנוטיפית. למרות שאנטרוקוליטיס מתפתחת באופן ספונטני, הופעתה יכולה להשתנות בהתאם לרקע הזן ולתנאי הוויואריום²⁷.

על ידי שילוב חשיפה כימית עם מודל גנטי, הפרוטוקול המתואר כאן מספק מודל עכברי אמין וניתן לשחזור של קוליטיס ניסיוני. אנטרוקוליטיס מואצת בעכברי IL-10-KO על ידי פירוקסיקאם, כאשר המחלה מתחילה תוך 7 ימים לאחר חשיפה לתזונה מועשרת בפירוקסיקאם. פרוטוקול זה מאפשר סנכרון של התפתחות הקוליטיס. המודל משחזר תכונות שנצפו במודלים נפוצים אחרים של קוליטיס בעכברים, כולל ירידה במשקל, דם בצואה, שלשולים, קיצור במעי הגס, נזק היסטולוגי ושינויים בתעתוק. יתרה מזאת, מודל זה ניתן לשחזור בזן C57Bl/6J הנפוץ, שמקל על חקירת פגמים גנטיים נוספים הקשורים ל-IBD באמצעות הקלות היחסית של יצירת עכברים הנושאים מוטציות נוספות בזן זה.

המודל המתואר כאן מספק כלי שימושי לחקר שינויים מטבוליים במהלך דלקת במעי. במודל זה, עכברים שנחשפו לפירוקסיקאם ומפתחים דלקת מעי מואצת ממשיכים להאכיל כרגיל ללא ירידה משמעותית בצריכה היומית. זה מצביע על כך שהירידה במשקל במודל זה אינה נובעת מהאכלה לקויה אלא מגורמים נוספים. נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע האם תוצאות אלו נובעות מהוצאה קלורית מוגברת עקב דלקת, אובדן קלוריות מופרז כתוצאה משלשול, או פגיעה בתרמוגנזה. יתרה מזאת, עכברים זכרים ונקבות מציגים דפוסי חומרת מחלה דומים, ממצא שמנוגד לתצפיות קודמות שנעשו במודלים IL-10-KO ו-DSS 28,29,30.

ישנם מספר שלבי פתרון תקלות חשובים להבטחת שחזוריות של דגם זה. ראשית, יש להסתגל לעכברים לטיפול ותצפיות יומיומיות למשך שבוע לפני החשיפה לפירוקסיקאם. זה מונע ירידה במשקל הקשורה ללחץ. שנית, כלובים צריכים להכיל לא יותר משלושה עכברים, ורק עכברים שנמצאים בהרמוניה צריכים להיכלל בניסוי. עכברים המפגינים התנהגות לחימה או פצעי קרב רגישים יותר להתפתחות קוליטיס ועלולים להיכנע לפני הקציר^31,32. שלישית, אם יש לעקוב אחר צריכת המזון לאורך כל הניסוי, יש לאחסן עכברים בנפרד כדי לאפשר מדידה מדויקת של צריכת האוכל. בנוסף, יש להניח רק כדורי מזון גדולים ושלמים בקופות ההזנה כדי למנוע מהם להתפורר לתוך המצע, מה שעלול להשפיע על המדידות. השיטות לכימות צריכת המזון המתוארות כאן תואמות את הנחיות צריכת המזון למכרסמים^{שפורסמו 33}. לבסוף, יש להימנע מהחלפת כלובים במהלך הניסוי, שכן שינויים סביבתיים פתאומיים עלולים להפחית את צריכת המזון למשך יום–יומיים, במיוחד בעכברים צעירים.

לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות. ראשית, הערכת שינויים מטבוליים מוגבלת למשקל גוף ולצריכת מזון, בעוד שמדדים אחרים של חילוף חומרים מערכתית, כגון יחס חילוף נשימה (RER), הוצאת אנרגיה ופעילות גופנית, לא הוערכו. בנוסף, המנגנונים שמאחורי הירידה במשקל לא נחקרו; לכן, התרומה היחסית של ירידה בצריכת מזון, שינוי בהוצאת האנרגיה, ספיגה לקויה וגורמים נוספים הקשורים לדלקת מעיים נותרות לא ברורות. שנית, נאספו ונותחו רק רקמת המעי הגס, בעוד שאיברים אחרים המעורבים בוויסות מטבוליזם, כולל רקמת שומן, כבד ושריר שלד, לא נבדקו. שלישית, פרוטוקול זה פותח באמצעות עכברי C57BL/6 IL-10-KO, שעשויים להראות רגישות שונה לקוליטיס לעומת רקעים גנטיים אחרים. למרות מגבלות אלו, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לשלב פנוטיפינג מטבולי נוסף וניתוח רקמות חוץ-מעיים, מה שמאפשר חקירה של המנגנונים שמאחורי הירידה במשקל וכן את הקשר בין דלקת מעיים לשינויים מטבוליים מערכתיים³⁴, או הערכת ננו-חומרים אנטי-דלקתיים חדשים³⁵. יתרה מזאת, הגישה צריכה להיות ישימה גם לזנים אחרים של עכברים מסוג IL-10-KO, אם כי נדרשים מחקרי אימות נוספים.

לסיכום, המחברים מדווחים על פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור שגורם בו זמנית לדלקת מעיים בעכברי IL-10-KO מרובים ומאפשר הערכת התנהגות האכלה. נדרשים מחקרים נוספים כדי לבדוק את השפעות הדלקת מעיים על צריכת האנרגיה והרכב הגוף במודל זה, ובכך לחשוף קשרים רחבים יותר בין IBD למטבוליזם של המארח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon