מאמר שיטה

מודל תרגומי של חזירון פג לספזיס יילוד

131 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71456

⸱

10 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מודלים של ספסיס חיידקי ביילודים פגים הם חיוניים, אך מודלים קיימים של מכרסמים חסרי רלוונטיות קלינית. מודל תרגומי מאוד של ספסיס יילודים פותח באמצעות גורי חזירים פגים שנדבקו ב-Staphylococcus epidermidis חי.

תקציר

תינוקות פגים פגיעים במיוחד לזיהומים חיידקיים שעלולים להתפתח במהירות לספסיס מסכן חיים, מצב של דלקת מוגזמת ותפקוד לקוי באיברים. כדי לחקור מנגנוני מחלה ולקדם את ההתפתחות הטיפולית, נדרשים באופן קריטי מודלים בעלי חיים תרגומיים חזקים המשכפלים את הפתופיזיולוגיה המורכבת וההופעה הקלינית של אלח דם יילודים. פרוטוקול זה מציג מודל קליני רלוונטי לחזירים פגים של ספסיס יילודי, המושרה באמצעות עירוי תוך-עורקי של Staphylococcus epidermidis חי זמן קצר לאחר הלידה או ביום השלישי לאחר הלידה. החזירונים נולדים ב-90% מההריון בניתוח קיסרי ומטופלים במסגרת טיפול נמרץ יילודים. אלה כוללים דוגמות מבוקרות טמפרטורה וחמצן וקטטר עורקי טבורי שמתקיים במקום, המאפשר אספקת תזונה פרנטרלית ודגימות דם סדרתיות. לאחר הזיהום ב-S. epidermidis, החזירונים מנוטרים במשך 24–48 שעות. השכיחות והחומרה של ספסיס ניתנות לוויסות על ידי מינון החיידקים ואספקת הגלוקוז הפרנטרלי. אספקה גבוהה יותר של גלוקוז פרנטרלי מאיצה את תגובות החיסון הפרו-דלקתיות, ומובילה להידרדרות קלינית. ספסיס קטלני ונקודות סיום אנושיות מוגדרות על ידי פרמטרים של גזי דם עורקיים (pH ≤ 7.1) בשילוב עם סימנים קליניים של פגיעה בהמודינמיקה כגון עייפות, שינוי צבע עור וטכיפנאה. מודל זה מספק פלטפורמה ייחודית לחקור כיצד מטבוליזם אנרגיה והתערבויות אימונומודולטוריות משפיעות על ניקוי חיידקים, דלקת מערכתית ופגיעת רקמות במהלך זיהום יילודים. יש לו פוטנציאל משמעותי להנחות אסטרטגיות קליניות למניעה וטיפול באלח דם יילודים.

מבוא

זיהום יילודים הוא גורם מוביל לתמותה ותחלואה ארוכת טווח ברחבי העולם, במיוחד בקרב תינוקות פגים, אך גם אצל תינוקות עם משקל לידה נמוך או סיבוכים פרינאטליים 1,2. אבחון מוקדם נותר מאתגר בשל סימנים קליניים לא ספציפיים, תגובות חיסוניות לא בוגרות ומשתנות מאוד, וחוסר בסמנים ביולוגיים רגישים וספציפיים המסוגלים להבחין בין זיהום לדלקת לא זיהומית 3,4. כתוצאה מכך, קלינאים מתחילים לעיתים קרובות טיפול אנטיביוטי אמפירי רחב-טווח, לעיתים לפני אישור מיקרוביולוגי, מה שתורם לשימוש יתר באנטיביוטיקה, להפרעה של קולוניזציה מיקרוביאלית מוקדמת ולפיתוחעמידות לאנטימיקרוביה.

אלח דם יילוד הוא מצב מסכן חיים הנגרם על ידי תגובה לא מאוזנת של המארח לזיהום, מה שמוביל לתפקוד לקוי של האיברים4. למרות שזיהום וספסיס מייצגים ישויות ביולוגיות וקליניות נפרדות, המונחים משמשים לעיתים קרובות לסירוגין בספרות הניאונטולוגיה. קלינית, אלח דם יילוד מסווג בדרך כלל כספסיס מוקדם או מאוחר (EOS, LOS), המתרחש לפני או אחרי 72 שעות חיים, בהתאמה1. EOS נגרם בדרך כלל על ידי פתוגנים המועברים בלידה, כגון Escherichia coli או סטרפטוקוקוס קבוצת B. לעומת זאת, LOS מופיע לעיתים קרובות עם תסמינים לא ספציפיים, עשוי להיות שלילי לתרבית, וקשור לגורמי סיכון כמו הליכים פולשניים, תזונה פרנטרלית ואשפוז ממושך. האורגניזמים הנפוצים ביותר כוללים סטפילוקוקים שליליים לקואגולאז, במיוחד Staphylococcus epidermidis, וכן חיידקים גרם-שליליים, אם כי גם זיהומים פטרייתיים ופולימיקרוביאליים מתרחשים 1,2,6. ללא קשר לאטיולוגיה, זיהומים יילודים יכולים להתכנס לפנוטיפ ספסיס נפוץ 1,2. חשוב לציין כי תינוקות פגים מראים חוסר בגרות התפתחותית הן של חיסון מולד והן של חיסון אדפטיבי, יחד עם רזרבות מטבוליות מוגבלות, מה שעשוי להשפיע על התגובה לזיהום.

ההתקדמות באבחון ובטיפול הוגעה בשל מגבלות של מערכות ניסוי קיימות. גישות במבחנה מאפשרות מחקרים מכניים של מסלולי חיסון אך אינן מצליחות ללכוד את הפיזיולוגיה המשולבת של תגובות חיסוניות מורכבות. מודלים של מכרסמים, אף שהם בעלי ערך למחקרים גנטיים ומולקולריים על תגובות חיסוניות של יילודים, שונים במידה ניכרת מבני אדם בהונטות חיסונית, חילוף חומרים וגודל 8,9. ניהול קליני של ספסיס קשה למחקר במודלים אלו בשל הזדמנויות מוגבלות למעקב אינטנסיבי, דגימת דם חוזרת ובדיקות טיפול תומך או טיפולי קליני ריאלי.

מודלים של בעלי חיים גדולים, במיוחד חזירים פגים, מציעים גישה משלימה עוצמתית. חזירים חולקים דמיון אנטומי, פיזיולוגי ואימונולוגי קרוב לבני אדם, כולל אוכלוסיות תאי חיסון דומות, איתות קולטני זיהוי דפוסים וויסות מטבולי 10,11,12,13,14. חשוב לציין שחזירים משמשים באופן נרחב כמודלים לאח דם בוגר13,15. ההיקף הפיזי של החזירים מאפשר שימוש במכשירים קליניים רלוונטיים, ניטור פיזיולוגי מתמשך, דגימה ביולוגית חוזרת והתערבויות טיפול נמרץ סטנדרטיות כגון תזונה פרנטרלית, טיפול בנוזלים, אנטיביוטיקה ותמיכה נשימתית. ניתן גם לחקור זיהום ניסיוני בהקשר של חוסר בגרות התפתחותית, מה שמאפשר חקירת מסלולי מחלה, תגובות המארח והשפעות טיפול בתנאים הדומים מאוד לפרקטיקה קלינית.

מאמר זה מתאר מודל סטנדרטי של אלח דם יילודים בחזירורים פגים, שתוכנן כפלטפורמה תרגומית גמישה. המודל מאפשר השראה מבוקרת של זיהום חיידקי מערכתי והערכה אורכית של תגובות קליניות, חיסוניות ומטבוליות, שיכולות לשמש לחקר הפתופיזיולוגיה של אלח דם יילוד ולהערכת יעילות של התערבויות מניעתיות וטיפוליות חדשניות.

פרוטוקול

כל ההליכים המפורטים בוצעו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU לניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי הפיקוח על ניסויים בבעלי חיים הדני (מספר רישיון: 2020-15-0201-00520).

1. הליכים סביב לידה

  1. לבצע ניתוח קיסרי אלקטיבי ללידת גורים פגים ב-90% מההריון (ימי הריון 106–107).
    1. השגת חזירה בהריון (Landrace × Large White, שלישי או רביעי) מחווה מסחרית ללא פתוגנים ספציפיים.
      הערה: יש להפריע את החזירה באמצעות הפריה מלאכותית (× Duroc) כדי להבטיח את התאריך המדויק של ההפריה.
    2. צום את החזירה ללילה (מינימום 12 שעות) עם גישה חופשית למים לפני הניתוח. השרה הרדמה באמצעות הזרקה תוך-שרירית של קוקטייל המכיל אטרופין (2 מ"ל לחזירה), בוטורפנול (2 מ"ל/100 ק"ג משקל גוף; 10 מ"ג/מ"ל), וזולטיל 50 וטרינר (3.3 מ"ל/100 ק"ג משקל גוף; טילטמין 25/מ"ל וזולזפאם 25 מ"ג/מ"ל).
    3. לאחר ההרדמה, הכנס קטטר וריד האוזן והשרה הרדמה כללית עם פרופופול (10 מ"ג/מ"ל), עם טיטרציה עד לאובדן הרפלקס הפלפברלי וטון הלסת.
    4. לבצע אינטובציה אנדוטרכיאלית תחת לרינגוסקופיה ישירה כדי לאבטח את דרכי הנשימה. שמרו על מישור הרדמה כירורגי לאורך כל הניתוח הקיסרי באמצעות איזופלורן מאודה המסופק ב-100% חמצן (1–2 ליטר לדקה) באמצעות מאדה מכויל.
    5. מתחילים ב-5% ושומרים על 1.5–2.5%, תוך שינוי הריכוז למינון האפקטיבי הנמוך ביותר בהתבסס על קצב הלב ורוויית החמצן ההיקפית.
      הערה: אם מתרחש דום נשימה, יש להתחיל בהנשמה מכנית כדי להבטיח חמצון מספק.
    6. מקם את החזירה בשכיבה לצד ימין. בצע הכנה אספטית באתר הניתוח. ניתן להזריק נפח כולל של 120 מ"ל לידוקאין (10 מ"ג/מ"ל) באמצעות חדירה תת-עורית ותוך-שרירית לאורך קו החתך המתוכנן בצד שמאל.
    7. בצע לפרוטומיה בצד שמאל באמצעות סכין מנתח כדי לחשוף ולהוציא את קרני הרחם. חרטו את קרני הרחם לאורך הקימור הגדול כדי ללדת גורים בודדים.
    8. לפני חיתוך חבל הטבור, יש לחלוב את החבל 2–3 פעמים לכיוון החזירון כדי להגדיל את ריכוז ההמוגלובין ואגרי הברזל. הניחו מהדק טבור מסומן A–Z סביב חבל הטבור יחד עם גזה למניעת דימום, וחתכו את החבל.
    9. מיד לאחר הלידה, מניחים כל חזירון בשקית פולית'ין, והשאירו את הראש חשוף. השקית ממזערת את אובדן החום, ובכך מפחיתה את הסיכון להיפותרמיה.
    10. יש להזריק נפח קבוע של 0.1 מ"ל דוקספראם (20 מ"ג/מ"ל) ו-0.1 מ"ל פלומאזניל (0.1 מ"ג/מ"ל) בתוך השריר בצוואר. דוקספרם מגרה נשימה ספונטנית, בעוד פלומאזניל, אנטגוניסט לבנזודיאזפיני, הופך חלקית הרדמה שהועברה מהנקרע במהלך הניתוח הקיסרי.
    11. העבר את החזירונים ליחידת טיפול נמרץ יילודים.
  2. החייאה, אקראיות וקטטריזציה
    1. שקלו וקבעו את מין כל חזירון עם העברתו ליחידת טיפול נמרץ יילודים.
    2. לחזירורים שאינם יכולים לנשום באופן ספונטני, יש לבצע החייאה באופן אישי. חזרו על מינוני הדוקספראם ו/או פלומזניל, וספקו אוורור בלחץ חיובי לפי הצורך לייצוב הנשימה.
    3. לאחר שהחזירורים יציבים פיזיולוגית ועדיין מורדמים מהרדמה שהועברה מהאימה, יש להשתמש בטכניקת אספטיקה להחדרת קטטר עורקי טבורי (צינור הזנה PVC 4 Fr) לאחד העורקים של חבל הטבור המועבר. קדם את קצה הקטטר לאאורטה הדורסלית. אבטח את הקטטר לעור באמצעות תפרים וחבר אותו לקו עירוי לצורך תזונה פרנטרלית.
      הערה: בחזיר פג, מתן תוך-עורקי הוא התקן הקבוע על וריד הטבור כדי למנוע נמק כבדי אפשרי הנגרם מסיכון גבוה למיקום לקוי של קצה הקטטר בתוך הפרנכימה של הכבד במקום בצינור הוורנוס21.
    4. מחלקים את החזירונים לפי משקל לידה ומין ושיכו אותם באקראי לקבוצות טיפול.
  3. תנאי הדיור
    1. מאחסנים כל חזירון בנפרד בתוך אינקובטור מחומם ומרופד עם אוורור מבוקר.
    2. לספק חמצן משלים (1–2 ליטר לדקה) עד 12 שעות לאחר הלידה כדי למנוע היפוקסיה.
    3. עקוב אחרי טמפרטורת הרקטום במהלך 12 השעות הראשונות לאחר הלידה. כוון את תנאי החימום לפי הצורך כדי לשמור על טמפרטורת ליבה של 38–39 מעלות צלזיוס (יעד: 38.5 מעלות צלזיוס).
      הערה: צפויה תקופה קצרה של היפותרמיה מיד לאחר הלידה ובמהלך הנחת הקטטר.

2. חיסון פסיבי באמצעות עירוי פלזמה

הערה: מכיוון שחזירים אינם מעבירים אימונוגלובולינים דרך השליה, יש לספק חיסון פסיבי חלקי לניסויים שנמשכים יותר מ-24 שעות כדי למנוע זיהומים ספונטניים.

  1. איסוף דם אם מהנקרע לאחר ניתוח קיסרי למיכל סטרילי מצופה הפארין. צנטריפוגה את הדם בצינורות פלקון סטריליים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 2500 × גרם, למשך 10 דקות, וחזרו על הפעולה פעם אחת. לאחר ההפרדה, אוספים בזהירות את הפלזמה לתוך צינורות פלקון סטריליים חדשים ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  2. בתוך 12 שעות לאחר הלידה, יש להזריק את הפלזמה במינון של 8 מ"ל/ק"ג כהזרקה תוך-עורבית רציפה של 30 דקות באמצעות משאבת עירוי.

3. השראה של זיהום ניסיוני

הערה: הזיהום הניסיוני יכול להיגרם 3–4 שעות לאחר הלידה או ביום השלישי לאחר הלידה.

  1. הכנת המתליין החיידקי
    1. יש להפשיר את בקבוקון S . epidermidis הקפוא (WT-1457, 15–25% גליצרול) בטמפרטורת החדר. מערבולת לזמן קצר (2–3 שניות) כדי לקבל תלייה הומוגנית.
      הערה: לפי סיווג קבוצת הסיכון לסוכנים זיהומיים, S. epidermidis מסווג כמיקרואורגניזם קבוצת סיכון 1 של ארגון הבריאות העולמי. מיקרואורגניזמים מקבוצת סיכון 1 של ארגון הבריאות העולמי אינם צפויים לגרום למחלות אנושיות ואינם דורשים שיקולים מיוחדים.
    2. הכינו תרבית לילה על ידי חיסון 20 מ"ל של מרק עירוי לב מוחי (BHI) עם 5 מיקרוליטר מאגר S. epidermidis המופשר בבקבוק Erlenmeyer סטרילי בנפח 100 מ"ל. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידת מסלול ב-180 סל"ד למשך ~16 שעות, מה שמאפשר לתרבות להגיע לשלב הנייח. לכלול שליטה לא מחוסנת בציר BHI בתנאים זהים כדי לאמת סטריליות בינונית.
    3. הכינו תרבית חדשה על ידי חיסון 20 מ"ל מרק BHI ב-200 מיקרוליטר מהתרבית הלילית (דילול של 1:100) בבקבוק סטרילי של 100 מ"ל Erlenmeyer. הכינו תרבית מספקת כדי להדביק את כל החזירים (ראו חישובים בשלבים 3.1.4 – 3.1.6). דגרו בטמפרטורה של 37°C עם רעידות אורביטליות ב-180 סל"ד למשך 2.5 שעות, עד שהחיידקים מגיעים לשלב הגדילה הלוגריתמי המוקדם (איור משלים 1A).
    4. הערכו את נפח התרבית הכולל הנדרש להדבקת כל החזירונים בהתבסס על מינון היעד המודרך, משקל גוף ממוצע, מספר הגורים וצפיפות התרבית.
    5. נניח שהתרבית תגיע לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD) של ≥1 (איור משלים 1B) לאחר דגירה של 2.5 שעות ולהשתמש בקצב המרה נקבע של OD של 1 = 3 × 108 יחידות יוצרות מושבות (CFU)/מ"ל.
    6. כלול 15% נפח נוסף כדי להתמודד עם הפסדי טיפול. חשב את נפח התרבית המשוער באמצעות הנוסחה:
      הערכת V = [מינון יעד (CFU/kg BW) × BW) × BW × N × 1.15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      כאשר:
      הערכת V = נפח התרבית הכולל המשוער הנדרש (מ"ל)
      BW = משקל גוף ממוצע של חזירון (ק"ג)
      N = מספר החזירים הכולל
    7. לאחר הדגירה, קבעו את המינון המיוזרי של התרבית. דילל את הדגימה לפי הצורך כדי לשמור על הקריאות בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר.
    8. חשב את נפח התרבית הסופי הנדרש להשגת ריכוז ה-CFU היעד באמצעות הנוסחה:
      גמר V = OD1 · הערכת V / OD נמדד (2)
      כאשר:
      Vסופי = נפח התרבית הסופי הנדרש (mL)
    9. העבר את ה-VFinal המחושב לצינורות פלקון ובצנטריפוגה של 50 מ"ל ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    11. החזירו את הכדור החיידקי ב-3 x VFinal של תמיסת מלח סטרילית של 0.9% כדי להתכונן למתן תוך-עורקי (3 מ"ל/ק"ג משקל גוף במשך 3 דקות). ודא שהפתרון נקי מאגרגטים.
    12. הכינו מזרקי עירוי של 50 מ"ל עם השעיה החיידקית.
    13. הכינו מזרק עירוי נפרד בנפח 50 מ"ל עם סליין סטרילי של 0.9% לביקורת לא נגועה.
  2. הליך זיהום
    1. הזרקו את התעלת חיידקית או תמיסת מלח סטרילית לכל חזיר דרך קטטר עורקי הטבור באמצעות משאבת עירוי שמספקת את המינון היעד במשך 3 דקות. שמרו על מרווח של 5 דקות בין החזירונים העוקבים.
    2. מיד לאחר ההדבקה, יש להתחיל בהזרקה רציפה של תזונה פרנטרלית כדי לשחרר את הקטטר ולהבטיח את כל המנה.
    3. אשר את המינון על ידי שמירת השעון החיידקי ב-4 מעלות צלזיוס. בהמשך, ניתן לדלל אותו ולפלוג אותו על פלטות אגר בדם כדי לקבוע את צפיפות החיידקים (ראה שלב 8)

4. תזונה פריאנטרלית

  1. לספק תזונה פרנטרלית מלאה (TPN) לחזירונים לאורך כל תקופת הניסוי. לדוגמה, השתמשו בשקית TPN אנושית בת שלושה תאים, כמו Kabiven 1900 קקלוריות, שעברה התאמה לדרישות המקרונוטריינטים של חזירונים שזה עתה נולדו.
  2. הכינו את תמיסת התזונה הפרנטרלית בתנאים סטריליים.
    1. הסר 300 מ"ל מתא הגלוקוז.
    2. הסר 70 מ"ל מתא השומן.
    3. הוסיפו 155 מ"ל של 50% גלוקוז לתא הגלוקוז.
    4. הוסף 214 מ"ל ואמין לתא הגלוקוז.
    5. הוסיפו 150 מ"ל מים סטריליים לתא הגלוקוז.
    6. הוסף 0.1 מ"ל הפארין (5000 IE/mL) לתא הגלוקוז.
    7. ערבבו היטב את תכולת שלושת התאים.
      הערה: זה מוביל לתמיסת תזונה פרנטרלית עם הרכב המקרונוטריינטים המוצג בטבלה 1. השתמשו בנוסחה זו כדיאטת ביקורת סטנדרטית בעת הערכת השפעות משטרי תזונה חלופיים על תגובות זיהומים.
    8. אחסן את התזונה הפורנטרלית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו את התמיסה במנות ואל תשתמשו בה מעבר ל-48 שעות לאחר ההכנה.
      הערה: ניתן לשנות את המודל להערכת השפעות האכלה האנטרלית וגירוי המעי על ידי התקנת צינורות האכלה אורוגסטריים לחזירורים.
  3. אספקת תזונה פרנטרלית
    1. מלאו מזרקי עירוי סטריליים בנפח 50 מ"ל בתזונה פרנטרלית והזריקו ברציפות דרך הקטטר התוך-עורקי באמצעות משאבת עירוי.
    2. הגדר את קצב ההזלפה ל-6 מ"ל/ק"ג/שעה. שקלו את החזירונים מדי יום והתאימו את המינון בהתאם למשקל הגוף המעודכן.
      הערה: למחקרים ארוכי טווח, אם נצפתה בצקת פריפרית (הידרציה יתר), יש להפחית את קצב העירוי ל-4 מ"ל/ק"ג/שעה.
    3. עקוב באופן קבוע אחרי משאבות ההזלפה כדי לוודא שהמזרקים אינם ריקים. מלא מחדש את המזרקים לפי הצורך.

5. מעקב קליני

  1. העריכו את החזירונים באופן קבוע במהלך המחקר כדי לקבוע אם יש צורך בפעולה. לאחר עירוי חיידקים, יש לעקוב אחרי בעלי חיים כל שעה עד שעתיים על ידי צוות מנוסה עד להמתת חסד מתוכננת.
    הערה: הידרדרות קלינית, ההתקדמות מללא תסמינים לנקודות סיום הומניות, יכולה להתרחש במהירות, תוך 30–60 דקות.
    1. צפה בתסמינים הקשורים לנשימה, כולל טכיפנאה, מצוקה נשימתית, ציאנוזיס ונשימה אגונלית.
      הערה: במקרים של היפוקסיה (רוויית חמצן < 80%), יש להתחיל או להגדיל את אספקת החמצן.
    2. הבחינו בתסמינים הקשורים למחזור הדם, כולל שינוי צבע, קפיות קורות, זמן מילוי נימי ממושך, טכיקרדיה וברדיקרדיה.
    3. הבחינו בתסמינים הקשורים לפעילות, כולל עייפות, חוסר יכולת לעמוד או ללכת (רלוונטי מהיום השלישי לאחר הלידה), ותגובתיות לגירוי כאב.
    4. הבחינו בתסמינים הקשורים לקרישה, כגון אקימיזה או דימום פטכיאלי בעור. לחץ בעדינות על אזורים עם צבע מגוון; אם האדמומיות אינה מתבהרת, סווג את הממצא כדימום עור.
  2. אם נצפים תסמינים קליניים, יש לבצע מדידות גזי דם להערכת pH, לקטט, רוויית חמצן ולחץ חלקי של פחמן דו-חמצני ביחס לערכי הבסיס (ראו שלב 6.3).
    הערה: ניתן להשתמש במעקב קליני רציף (למשל, לחץ דם, קצב לב וקצב נשימה) אך אינו מיושם באופן שגרתי בניסויים אלו.

6. דגימת דם

הערה: ניתן לבצע דגימת דם לאורך זמן אצל חזירונים באמצעות קטטר תוך-עורקי או באמצעות ורידים יוגולריים. נפח הדם הכולל שנלקח לא צריך לעלות על 7.5% מנפח הדם הכולל המשוער (~7% ממשקל הגוף). כל הליכי דגימות הדם חייבים לעמוד בהנחיות אתיות מקומיות.

  1. דגימת דם בקטטר תוך-עורקי
    1. באמצעות ידיים נקיות ומכוסות כפפות, יש לגשת בזהירות לפתח הקטטר. חטא את אתר הגישה באתנול לפני הפתיחה. הימנעו מזיהום בקו העירוי.
    2. יש למשוך מינימום של 2 מ"ל דם ולהניח אותו בצד, שכן נפח זה עלול להיות מזוהם בתזונה פרנטרלית מקו העירוי. שמור על סטריליות הדגימה שנמשכה.
    3. אסוף את נפח הדם הנדרש לניתוח. לדוגמה, יש לאסוף דם לניתוחי המטולוגיה בחצוצרות מצופות EDTA, בעוד שדגימות לניתוחי גזי דם צריכות להיאסף באמצעות מזרקים מצופים הפארין.
    4. לאחר סיום הדגימה, יש להחדיר מחדש את 2 מ"ל הדם שנמשכו בתחילה לתוך החזירול ומחבר בזהירות את הקטטר לקו ההזנה הפורנטרלי.
  2. דגימת דם עם דקירה ג'וגולרית
    1. הוציאו את החזירון מהאינקובטור והניחו אותו בשכיבה גבית כדי לחשוף את אזור הצוואר. הרסן את החזירון היטב כדי למנוע תנועה ולאפשר גישה בטוחה לווריד הצוואר.
      הערה: ורידו ג'וגולרי קשור לסיכונים פוטנציאליים, כולל דימום, היווצרות המטומה ופגיעות בדרכי הנשימה. ההחלטה לבצע הליך זה צריכה להישקל בקפידה מול החשיבות המדעית של התוצאות.
    2. זהה את המיקום האנטומי המשוער של הווריד היוגולרי וחטא את אתר הניקוב באתנול.
    3. בצע ניתוח וריד יוגולרי באמצעות מערכת ואקוטיינר ואיסוף נפח הדם הנדרש. לדוגמה, אסוף 0.2 מ"ל דם ואחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לציפוי חיידקים.
    4. הפעילו לחץ על אתר הווניפונקטורה עד להשגת המוסטזיס. ואז תחזיר את החזירון לאינקובטור שלו.
    5. המשך לעקוב אחרי החזירון לסימני דימום מחודש. אם מתרחש דימום משמעותי, יש להרדימו את החזירון. כמו כן, יש לעקוב אחר היווצרות המטומה תת-עורית או דימום פנימי שעלול לפגוע בדרכי הנשימה.
  3. מדידות גזי דם
    1. בדוק את דגימת הדם במזרק ההפאריני לבועות אוויר. אם יש בועות, יש להוציא או להוציא אותן בעדינות על ידי נגיעה במזרק כדי למנוע שינוי במדידות הגז.
    2. העבר את הדגימה למנתח גזי הדם ופעל לפי הוראות היצרן. ודא שהדגימה מעובדת במהירות כדי לשמור על דיוק.

7. קריטריוני ספסיס ונקודות סיום הומאניות

  1. המית גורים כאשר מגיעים לנקודות סיום אנושיות מוגדרות מראש המעידות על אלח דם.
    הערה: לפתולוגיות אחרות או פציעות איטרוגניות, יש לעיין בהנחיות אתיות מקומיות לנקודות קצה הומניות.
    1. השתמשו ב-pH בדם כמדד עיקרי לספסיס והנקודה האנושית העיקרית. הורד את הגורים עם pH דם ≤ 7.1 מיד. לחזירים עם pH בדם ≤ 7.2, חזרו על מדידות גזי הדם כל 15–30 דקות ועוקבו אחרי נקודות קצה אנושיות שניות.
    2. כנקודת סיום משנית הומנית, המית את החזירונים ללא קשר ל-pH הדם בעת הופעת קרישה תוך-כלי מפוזרת, כולל אקכימוזה או דימום פטכיאלי, עצם נשימה, עייפות עמוקה ו/או חוסר תגובה לגירויי כאב (מאומת על ידי היעדר רפלקס גמילה לאחר צביטה עדינה במרחב הבין-דיגיטלי עם מלקחיים אנטומיים).
  2. הרדמו את החזירון באמצעות הזרקה תוך-שרירית של תערובת מבוססת זולטיל (0.1 מ"ל/ק"ג).
    הערה: שחזרו בקבוקון אחד של זולטיל 50 וטריון (טילטמין 125 מ"ג, זולאזפאם 125 מ"ג) ל-10 מ"ל תוך שימוש ב-6.25 מ"ל זילזין (20 מ"ג/מ"ל), 1.25 מ"ל קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-2.5 מ"ל בוטורפנול (10 מ"ג/מ"ל). הריכוזים הסופיים הם 12.5 מ"ג/מ"ל כל אחד מטילטמין, זולאזפאם, זילזין, קטמין ו-2.5 מ"ג/מ"ל בוטורפנול.
  3. אשר עומק ההרדמה המתאים על ידי היעדר רפלקס גמילה בתגובה לגירוי כואב (ראו שלב 7.1.2).
  4. לבצע המתת חסד בהזרקה תוך-לבבית של מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (3 מ"ל/ק"ג; 400 מ"ג/מ"ל).
    הערה: ניתן לבצע דגימת דם תוך-לבבית לפני המתת חסד באמצעות מערכת ואקוטיינר.

8. ציפוי חיידקים וכימות

  1. כימות צפיפות חיידקי דם באמצעות דגימות של ורידים יוגולריים שנאספו במהלך הניסוי ודגימות ניקוב לב שנאספו בהמתת חסד.
    הערה: אין להשתמש בדם שנלקח מהקטטר העורקי, שכן ייתכן שהוא מכיל חיידקים שנותרו מהזיהום הניסיוני הראשוני, מה שעלול לבלבל את הכמות.
    1. הכינו צלחת אגר דם של כבשים לכל דגימת דם, סמנו רבעים 0, -1, -2 ו-3 בתחתית, וסמנו את הפלטה עם מזהה החיה ונקודת הזמן.
    2. באמצעות 50 מיקרוליטר דם מכל דגימה, יש להכין דילול פי 10 של 10-1, 10-2 ו-10-3 ב-450 מיקרוליטר של PBS סטרילי בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    3. יש למקם כל צלחת שלוש טיפות של 20 מיקרוליטר של הדילול המתאים ברבע שהוקצה, תוך ריווח טיפות כדי להימנע ממגע או העברה ולמנוע אירוסול.
    4. דגרו את הצלחות ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ואז מאחסנים את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לספירה.
    5. ספירו את כל מושבות החיידקים בדילול המכיל כ-10 מושבות בכל נקודה. כולל רק מושבות של S. epidermidis, שהן בדרך כלל לבנות, עגולות וחלקות קצוות. בדקו ורשמו בקפידה כל מושבה עם מורפולוגיה שונה, שכן ייתכן שהן מצביעות על זיהום, למשל, מדגימה. חשב את CFU/mL באמצעות המשוואה הבאה:
      (CFU/mL) = [(ספירת מושבות · גורם דילול)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

תוצאות

ניסוי מינון-תגובה בוצע בגורים פגים שגודלו עד היום החמישי לאחר הלידה (איור 1). ביום השלישי לאחר הלידה, החזירונים קיבלו עירוי של מינון נמוך של S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), מינון גבוה של S. epidermidis (5 ×10 9 CFU/kg, n = 9), או מיל בביקורת (n = 3), ונעקבו במשך 44 שעות.

לאחר עירוי S. epidermidis , עומס החיידקים בדם נותר גבוה יותר לאורך 44 שעות המעקב אצל חזירונים שקיבלו מינון גבוה בהשוואה לקבוצת המינון הנמוך (איור 2A, P < 0.05). רק החזירונים בקבוצת המינון הגבוה (3/9) פיתחו ספסיס, כאשר ההופעה מתרחשת כ-12–15 שעות לאחר ההדבקה (איור 2B). בהתאם לכך, גורים שקיבלו מינון גבוה של S. epidermidis הציגו pH נמוך בדם ב-12 שעות (איור 2C, P < 0.001), בליווי עלייה משמעותית בלחץ החלקי של פחמן דו-חמצני (pCO₂) (איור 2D, P < 0.01), בהשוואה לקבוצת המינון הנמוך.

במהלך השלב החריף של הזיהום (6 שעות), שתי הקבוצות הנדבקות הראו עודף בסיס נמוך יותר ורמות לקטט גבוהות יותר בהשוואה לביקורת מלוחה, עם שינויים בולטים יותר שנמשכו עד 12 שעות בקבוצת S . epidermidis במינון גבוה (איור 2E, F, P < 0.01 – 0.05). רמות הסוכר בדם לא השתנו בין הקבוצות (איור 2G).

ב-6 שעות, שתי הקבוצות הנדבקות הראו גם דלדול חזק של נויטרופילים בדם בהשוואה לקבוצת הביקורת הלא נגועה (איור 3A, שניהם P< 0.001). בהמשך תהליך ההדבקה, נצפה התחדשות נויטרופילים בשתי הקבוצות הנדבקות, אך הייתה גבוהה יותר בקבוצת S. epidermidis במינון נמוך (איור 3A, P < 0.05). שתי הקבוצות הנדבקות פיתחו תרומבוציטופניה במהלך הניסוי; עם זאת, ספירת הטרומבוציטים ירדה מוקדם יותר ובאופן משמעותי יותר בקבוצת S. epidermidis במינון גבוה בהשוואה לקבוצת הביקורת במינון נמוך וללא נגועים (איור 3B, P < 0.01–0.05). רמות הפלזמה של TNF-α, IL-6 ו-IL-10 היו גבוהות בשתי הקבוצות הנדבקות ב-6 ו-12 שעות לאחר ההדבקה בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3C, P < 0.001–0.05). לאחר 24 שעות, רמות TNF-α ו-IL-10 בפלזמה נשארו גבוהות רק בקבוצת S. epidermidis במינון גבוה בהשוואה לקבוצת ביקורת לא נגועה (P < 0.05), בעוד שעד 44 שעות רק רמות TNF-α נשארו גבוהות (P < 0.05).

בהמתת חסד, כאשר החזירונים הגיעו לנקודות סיום הומניות או הושמתו בנקודת הזמן המתוכננת של 44 שעות לאחר ההדבקה, נמדדו רמות פלזמה של מגיבים שליליים בשלב החריף וסמנים לפגיעה באיברים (איור 4A–G). מתוכם, רק הכולסטרול (תגובה חד-שלבית שלילית) היה נמוך משמעותית אצל חזירונים שנדבקו במינון גבוה של S. epidermidis בהשוואה לקבוצת המינון הנמוך (איור 4B, P < 0.05). רמות ממוצעות של סמני פגיעות בכבד, כולל אלנין אמינוטרנספראז ואספרטט אמינוטרנספראז, וכן סמנים לפציעת כליות כמו קריאטינין וחנקן אוריאה בדם, היו גבוהות מספרית בקבוצת S. epidermidis במינון גבוה מאשר בקבוצת הביקורת הלא נגועה (איור 4D–G).

figure-results-1
איור 1: עיצוב ניסוי. החזירונים המוקדמים נולדו בניתוח קיסרי ב-90% מההריון. ביום השלישי לאחר הלידה, החזירונים קיבלו עירוי תוך-עורקי של S. epidermidis חי ב-109 או 5 × 109 CFU/kg, או תמיסת מלח כביקורת. לאחר ההדבקה, החזירונים נבדקו במשך 44 שעות, ודגימת דם לאורך זמן בוצעה בנקודות זמן מוגדרות. דמות שנוצרה עם Biorender.com. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: עומס חיידקי דם, הישרדות ופרמטרי גזי דם בגורים פגים לאחר עירוי עורקי עם מי מלח (CON) או זיהום ב-S. epidermidis חי. (א) צפיפות S. epidermidis בדגימות דם שנאספו ב-6, 24 ו-44 שעות לאחר ההדבקה. (ב) עקומות הישרדות המראות זמן לנקודת סיום הומאנית או להמתת חסד מתוכננת ב-44 שעות לאחר ההדבקה. (C–G) פרמטרי גזי הדם העורקיים ב-0, 6, 12, 24 ו-44 שעות לאחר ההדבקה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. (A), עקומות הישרדות (B), או גרפים של נקודות כינור כולל חציון (קו מוצק) ו-IQR (קווים מקווקוים) (C–G). n = 9 לכל קבוצה נגועה; n = 3 עבור הבקרה הלא נגועה. הנתונים נותחו באמצעות מודל ליניארי עם השפעות מעורבות הכולל אינטראקציות זמן × קבוצתיות (A, C–G) או מודל סיכון פרופורציונלי Cox (B). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. קיצורים; CON = שליטה; pCO2 = לחץ חלקי של CO2; SE = S. epidermidis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: סמנים דלקתיים בסירקולציה אצל חזירורים פגים לאחר עירוי עורקי עם מי מלח (CON) או זיהום ב-S. epidermidis חי. (A, B) ספירות נויטרופילים וטסיות דם במחזור 6, 12, 24 ו-44 שעות לאחר ההדבקה. (ג) רמות הפלזמה של TNF-α, IL-6 ו-IL-10 ב-6, 12, 24 ו-44 שעות לאחר ההדבקה. הנתונים מוצגים כגרפים של נקודות כינור הכוללים חציון (קו מוצק) ו-IQR (קווים מקווקוים) (A–C). n = 9 לכל קבוצה נגועה; n = 3 עבור הבקרה הלא נגועה. הנתונים נותחו באמצעות מודל ליניארי של השפעות מעורבות כולל אינטראקציות קבוצתיות × בזמן (A–C). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. קיצורים; CON = שליטה; IL = אינטרלוקין; SE = S. epidermidis; TNF = פקטור נמק הגידול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: פרמטרים ביוכימיים בפלזמה בגורים פגים לאחר עירוי עורקי עם מלח (CON) או זיהום ב-S. epidermidis חי (109 או 5 × 109 CFU/ק"ג). (A–G) רמות אלבומין, כולסטרול, ALP, ALAT, ASAT, קריאטינין ו-BUN בפלזמה בנקודת הקצה ההומנית או בהמתת חסד מתוכננת ב-44 שעות לאחר ההדבקה. הנתונים מוצגים כגרפים המציגים את הטווח המלא (מינימום-מקסימלי) (A–G). נקודות נתונים בודדות בסגול כהה מצביעות על חזירונים שפיתחו ספסיס. n = 9 לכל קבוצה נגועה; n = 3 עבור הבקרה הלא נגועה. הנתונים נותחו באמצעות מודל רגרסיה ליניארית מרובה (A–G). *P < 0.05. קיצורים; ALAT = אלנין אמינוטרנספראז; ALP = פוספטאז בסיסי; ASAT = אספרטט אמינוטרנספראז; BUN = חנקן אוריאה בדם; CON = שליטה; SE = S. epidermidis. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

סכום כוללריכוז
אנרגיה7762kJ3525kJ/L
מאקרונוטריינטים
חומצות אמינו92g42g/L
שמן66g30g/L
גלוקוז221g100g/L
מיקרונוטריינטים
נה64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
מ"ג8MMOL4mmol/L
Ca4MMOL2mmol/L
נקודת משימה418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
קלי93MMOL42mmol/L
אצטט78MMOL35mmol/L

טבלה 1: הרכב תזונה פרנטרלית כוללת מותאמת. הכמויות והריכוזים הכוללים של אנרגיה, מאקרונוטריינטים (חומצות אמינו, שומן וגלוקוז) ומיקרונוטריינטים בתמיסת התזונה הפורנטרלית.

איור משלים 1: קינטיקת צמיחה של S. epidermidis WT-1457. חיידקים גודלו במרק עירוי לב במוח בטמפרטורה של 37°C עם רעידות אורביטליות ב-180 סל"ד. צפיפות אופטית נמדדה ב-600 ננומטר לאורך זמן. הנתונים מוצגים בסולם לוגריתמי (A) וסולם ליניארי (B) (n = 3 ניסויים עצמאיים). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מודל סטנדרטי של ספסיס יילודים בגורים פגים תוכנן לחקור זיהום חיידקי מערכתית בתנאים קליניים רלוונטיים של חוסר בגרות יילודים. המודל משלב שליטה בגיל הריון, החייאה ותמיכה בטיפול נמרץ, תזמון הזיהום ודגימת דם לאורך זמן. גישה זו שואפת לגשר על הפער בין מערכות ניסוי מכרסמים ומערכות אינ-ויטרו לבין הפיזיולוגיה המורכבת שנפגשת אצל תינוקות נגועים. חשוב לציין כי מודל זה שימש לאישור הקשר הידוע בין מין, משקל לידה נמוך וגיל הריון, עם רגישות לספסיס שנצפתה בתינוקות פגים בני אדם 16,17,18.

חזירים הם מודל בעלי חיים גדולים רלוונטי מאוד למחקר זיהומים, בשל דמיון משמעותי לבני אדם בתפקוד חיסון ובפיזיולוגיה. רכיבים מרכזיים במערכת החיסון המולדת, כולל תת-קבוצות של לויקוציטים, איתות קולטני זיהוי דפוסים ותגובות ציטוקינים, מראים התאמה קרובה בין חזירים לבני אדם. ההבדלים האימונולוגיים העיקריים בין גורי חזירים לבני אדם טמונים בתגובות חיסוניות אדפטיביות. מכיוון שאין העברת אימונוגלובולין G (IgG) דרך השליה במהלך הריון חזיר, גורי חזירים נולדים תמימים בהקשר זה19. באופן דומה, בעוד שתאי B של תינוקות אינם עוברים מעבר איזופורמי מ-IgM ל-IgG לפני גיל 3–6 חודשים, תאי B חזירים מסוגלים לבצע תגובות IgG זמן קצר לאחר הלידה20.

במערכת מודל זו, הבדלים אלו מתמודדים על ידי גרימת זיהום זמן קצר לאחר הלידה, לפני שיכולות להתרחש תגובות חיסוניות אדפטיביות, ועל ידי אספקת אימונוגלובולינים לאם באמצעות עירוי פלזמה. גישה זו מובילה לרמות IgG במחזור דומות לתינוקות פגים מאוד שזה עתה נולדו הנתונים להעברת IgG טרנסצנטלית מופרעת עקב לידה מוקדמת17. בנוסף, גודל הגוף הגדול יחסית בלידה (~800 גרם) מחזק עוד יותר את המודל, בהשוואה לעכברים שזה עתה נולדו (~3 גרם). כתוצאה מכך, השפעות סביבתיות כמו טמפרטורה, לחות ומתח חמצן דומות יותר לאלו שחווים יילודים אנושיים. קנה מידה זה מאפשר גם שימוש בציוד קליני, ניטור פולשני ואמצעי טיפול תומך, כגון גישה כלי דם, תמיכה נשימתית ומעקב פיזיולוגי רציף, שאינם אפשריים במודלים של מכרסמים יילודים. במיוחד, גישה וסקולרית להזלפות, כגון תזונה פרנטרלית, במודל החזיר הפג-מועד מושגת באמצעות קטטר עורקי טבורי. למרות שזה מנוגד לדרך הוורידית הסטנדרטית הנהובלה הקלינית, היא נחוצה בשל המגבלות האנטומיות של חזירורים פגים, שבהם קטטרים בווריד הטבור כמעט ולא עוברים את צינור הונוסוס באופן ספונטני ובמקום זאת מיקום לא נכון בתוך הפרנכימה של הכבד21. לידה תוך-עורקית מספקת מסלול אמין וניתן לשחזור לאינפוזיה רציפה ללא סיכון גבוה לנמק כבדי הקשור להחלפת וריד הטבור. באופן דומה, זה מאפשר לדגום דם עורקי לניתוח גזי דם.

זיהום מערכתית במודל זה נגרם על ידי עירוי תוך-עורקי של S. epidermidis חי, הגורם המוביל לאח דם מאוחר ביחידות טיפול נמרץ יילודים 1,2. עם זאת, מגוון רחב של פתוגנים גורמים לזיהום דם יילודים, וסטפילוקוקים שליליים לקואגולאז, כמו S. epidermidis, ידועים גם הם כגורמים לזיהומים פחות חמורים ולסיכון נמוך יותר לזיהום מאשר פתוגנים אחרים, אלימים יותר, כמו E. coli 1,2. בעוד שהמודל משתמש בפתוגן בעל אלימות נמוכה, ההידרדרות הקלינית שנצפה, ההפעלה הדלקתית וחוסר היציבות הפיזיולוגית משקפים כולם סימנים מרכזיים של ספסיס יילודים. קבוצת הביקורת הלא נגועה (n = 3) במחקר זה משמשת כנקודת ייחוס בסיסית להדגמת המצב הפיזיולוגי של חזירים "בריאים" פגים בתנאי טיפול נמרץ זהים. למרות שזה גורם לחוסר איזון עיצובי, השוואות אלו מיועדות לייצג את תגובת המאכסן לזיהום. כפי שמוצג באיור 2, היה קשר ברור בין מינון לתגובה עם עלייה במינונים של S. epidermidis, בהתאם לממצאים קודמים בחזירונים שנדבקו ביום הראשון של חיים22. רק חזירונים שקיבלו את המינון הגבוה ביותר של S. epidermidis הידרדרו עד לנקודות קצה הומניות שדרשו המתת חסד (המתת חסד). עם זאת, שתי הקבוצות הנדבקות פיתחו חומצת מטבולית, בעוד רכיב נשימתי משמעותי (pCO₂ גבוה) נצפה רק בקבוצת S. epidermidis במינון גבוה. באופן דומה, שתי הקבוצות הפגינו נויטרופניה בולטת ב-6 שעות לאחר ההדבקה, ואחריה התחדשות נויטרופילים ב-24 שעות, שהייתה גבוהה יותר בקבוצת המינון הנמוך. גם תרומבוציטופניה הייתה נוכחת בשתי הקבוצות, בליווי עלייה בציטוקינים בפלזמה ובסמני פגיעות באיברים, עם תגובות בולטות יותר אצל חזירונים שקיבלו את המינון הגבוה ביותר של S. epidermidis.

אצל חזירורים פגים, זיהום S. epidermidis ביום הראשון לאחר הלידה גורם לאותם תסמינים פאראקליניים של אלח דם יילוד (חמצת מטבולית, לויקופניה, טרומבוציטופניה, דלקת), וכן עייפות, קרישה קרישתית ואכילת משלים 17,22,23. הזיהום גורם גם להפרעות מערכתיות במטבוליזם האנרגיה, במיוחד לירידה בזרחון החמצוני של המיטוכונדריה, יחד עם שינויים בפרוטאום ובמטבולום הפלזמה בדומה לאלו שדווחו אצל חולי אלח דם יילודים 24,25,26. בנוסף, חזירונים פגים (90% בהריון) נוטים הרבה יותר לפתח ספסיס מאשר חזירורים שנולדו במועד17 מלא. הרכב התזונה משפיע עוד יותר על תגובות קליניות ואימונולוגיות. TPN מבוסס גלוקוז מניע את חילוף החומרים הגליקולטי, שמגביר תגובות חיסוניות פרו-דלקתיות, תוך פגיעה בסבילות למחלות ברקמות היקפיות24,26. השילוב של תגובות אלו קשור לפגיעה באיברים ולהתקדמות לעבר פנוטיפ ספסיס27. מודולציה של הרכב TPN, בין אם על ידי הפחתת תכולת הגלוקוז או החלפת גלוקוז במקרונוטריינטים חלופיים כמו גלקטוז, חומצות אמינו גלוקוגניות או β-הידרוקסיבוטיראט28,29, מחלישה את התגובה הדלקתית ושומרת על סבילות הרקמה למחלות. תוספי סוכר גבוהים באמצעות TPN גורמים גם להיפרגליקמיה (≈10–20 מ"מ). עם זאת, עדיין לא ברור עד כמה התגובות הדלקתיות הקשורות לגליקוליזה נצפו מתווכות ישירות על ידי רמות סוכר גבוהות בדם.

תצפיות ניסיוניות מצביעות על הבדלים ברורים בתגובות הקליניות בהתאם ליום ההדבקה שלאחר הלידה. גם הסיכון לפתח ספסיס וגם חומרת התסמינים הקליניים הם הגבוהים ביותר כאשר הזיהום נגרם זמן קצר לאחר הלידה. השראה לזיהום ביום השלישי לאחר הלידה מובילה לפנוטיפ קל יותר של ספסיס עם התנהגויות מחלה, חומצת נשימתית ומטבולית במהלך 24 השעות הראשונות לאחר ההשראה, ואחריה התאוששות קלינית למרות סימנים גבוהים לפגיעות איברים. המנגנונים העומדים מאחורי ההבדלים הללו בין אינדוקציה מוקדמת למאוחרת אינם ידועים כיום ומהווים תחום מחקר מתמשך. עם זאת, הומאוסטזיס הגלוקוז לאחר תחילת תזונה פרנטרלית משתפר בשלושת הימים הראשונים לאחר הלידה אצל גורים פגים, מה שמוביל להפחתת היפרגליקמיה למרות צריכת גלוקוז דומה. בסך הכול, שינוי יום ההדבקה לאחר הלידה ומתן הגלוקוז מאפשר למודל ללכוד תכונות של ספסיס חריף, חמור ומסכן חיים, או פנוטיפ קל יותר. יחד, התאמות אלו מאפשרות לבדוק התערבויות ממוקדות המותאמות לפנוטיפים ספציפיים של מחלה. היישום הקליני של מודל זה יכול להתחזק עוד יותר על ידי יישורו למערכות דירוג יילודים הקשורות לספסיס, כגון הערכת כשל איברים סדרתיים (nSOFA). מערכת ניקוד מבוססת nSOFA בזמן אמת לא יושמה במחקר הנוכחי בשל חוסר היתכנות של ניטור רציף של לחץ דם עורקי וספירת טסיות מיידית הנדרשות לניקוד קרדיווסקולרי והמטולוגי. שיפורים עתידיים של הפרוטוקול עשויים לשלב מסגרת nSOFA מותאמת כדי לסיווג טוב יותר את חומרת המחלה.

למרות חוזקותיו התרגומיות, למודל זה יש מספר מגבלות חשובות. ניסויים אלו דורשים משאבים גבוהים, ודורשים מתקנים מיוחדים ואנשי צוות מיומנים לביצוע לידה קיסרית, החייאת יילודים, דיור לאחר הלידה וטיפול בחזירונים פגים. ניסויי זיהום דורשים בנוסף ניטור מתמשך ומעשי על ידי שניים עד שלושה אנשי צוות מנוסים כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ואיסוף נתונים אמין, ומעקב ארוך טווח מעלה את העלויות. בהשוואה למודלים של מכרסמים, זמינות תגובות ספציפיות למין מוגבלת יותר, במיוחד באימונוהיסטוכימיה וציטומטריית זרימה, אם כי ניתן להשתמש בנוגדנים אנושיים רבים בהצלחה לאחר אימות מתאים. בנוסף, האופי החיצוני של החזירים גורם לשונות ביולוגית משמעותית בתוך ובין המלוטות, מה שמחייב גודל קבוצות גדול יותר כדי לזהות הבדלים מתונים בתגובות ההדבקה. בעוד ששונות זו מגבירה את המורכבות הניסיונית, היא גם משקפת בצורה מדויקת יותר את ההטרוגניות שנצפתה באוכלוסיות הניאונטליות הקליניות, ובכך מגבירה את הרלוונטיות התרגומית של המודל. לסיכום, פרוטוקול מאומת זה לספסיס יילודים יהיה כלי שימושי למחקרים עתידיים בניאונטולוגיה ולבדיקת התערבויות מניעתיות וטיפוליות חדשניות.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי צוות קבוצת Comparative Pediatrics באוניברסיטת קופנהגן, ומומנה על ידי קרן נובו נורדיסק (NNF23OC0085457 ו-NNF22OC0078747).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 0.1–10 µL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 µL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 µL pipetteSartorius46886095
200 µL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 µL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 µL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

מקורות

  1. Shane, A. L., Sánchez, P. J., Stoll, B. J. Neonatal sepsis. The Lancet. 390 (10104), 1770-1780 (2017).
  2. Strunk, T., Molloy, E. J., Mishra, A., Bhutta, Z. A. Neonatal bacterial sepsis. The Lancet. 404 (10449), 277-293 (2024).
  3. Wynn, J. L., et al. Time for a neonatal-specific consensus definition for sepsis. Pediatric critical care medicine : a journal of the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. 15 (6), 523-528 (2014).
  4. Schlapbach, L. J., et al. International Consensus Criteria for Pediatric Sepsis and Septic Shock. JAMA. 331 (8), 665-674 (2024).
  5. Fleiss, N., Hooven, T. A., Polin, R. A. Can we back off using antibiotics in the NICU?. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 26 (3), 101217 (2021).
  6. Strunk, T., et al. Impaired Cytokine Responses to Live Staphylococcus epidermidis in Preterm Infants Precede Gram-positive, Late-onset Sepsis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 72 (2), 271-278 (2021).
  7. Collins, A., Weitkamp, J. H., Wynn, J. L. Why are preterm newborns at increased risk of infection?. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 103 (4), F391-F394 (2018).
  8. Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
  9. Bailey, M., Christoforidou, Z., Lewis, M. C. The evolutionary basis for differences between the immune systems of man, mouse, pig, and ruminants. Veterinary Immunology and Immunopathology. 152 (1-2), 13-19 (2013).
  10. Mair, K. H., et al. The porcine innate immune system: An update. Developmental & Comparative Immunology. 45 (2), 321-343 (2014).
  11. Ezquerra, A., et al. Porcine myelomonocytic markers and cell populations. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 284-298 (2009).
  12. Gerner, W., Käser, T., Saalmüller, A. Porcine T lymphocytes and NK cells – An update. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 310-320 (2009).
  13. Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
  14. Pabst, R. The pig as a model for immunology research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 287-304 (2020).
  15. Goldfarb, R. D., Dellinger, R. P., Parrillo, J. E. Porcine models of severe sepsis: emphasis on porcine peritonitis. Shock (Augusta, Ga). 24 Suppl 1 (SUPPL. 1), 75-81 (2005).
  16. Bæk, O., Ren, S., Brunse, A., Sangild, P. T., Nguyen, D. N. Impaired neonatal immunity and infection resistance following fetal growth restriction in preterm pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1808 (2020).
  17. Bæk, O., et al. Diet Modulates the High Sensitivity to Systemic Infection in Newborn Preterm Pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1019 (2020).
  18. Bæk, O., et al. Sex-Specific Survival, Growth, Immunity, and Organ Development in Preterm Pigs as Models for Immature Newborns. Frontiers in Pediatrics. 9, (2021).
  19. Porter, P. Transfer of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM to lacteal secretions in the parturient sow and their absorption by the neonatal piglet. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 181 (2), 381-392 (1969).
  20. Butler, J. E., et al. The piglet as a model for B-cell and immune system development. Veterinary immunology and immunopathology. 128 (1-3), 147-170 (2009).
  21. Sangild, P. T., et al. The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91, 4713-6359 (2013).
  22. Brunse, A., Worsøe, P., Pors, S. E., Skovgaard, K., Sangild, P. T. Oral Supplementation with Bovine Colostrum Prevents Septic Shock and Brain Barrier Disruption During Bloodstream Infection in Preterm Newborn Pigs. SHOCK. , 1 (2018).
  23. Krogh, A. K. H., Brunse, A., Thymann, T., Bochsen, L., Kristensen, A. T. Staphylococcus epidermidis sepsis induces hypercoagulability in preterm pigs. Research in veterinary science. 127, 122-129 (2019).
  24. Bæk, O., et al. Altered hepatic metabolism mediates sepsis preventive effects of reduced glucose supply in infected preterm newborns. eLife. 13, (2024).
  25. Wu, Z., et al. Regulation of host metabolism and defense strategies to survive neonatal infection. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1870 (8), (2024).
  26. Muk, T., Brunse, A., Henriksen, N. L., Aasmul-Olsen, K., Nguyen, D. N. Glucose supply and glycolysis inhibition shape the clinical fate of Staphylococcus epidermidis–infected preterm newborns. JCI Insight. 7 (11), (2022).
  27. Zhong, J., et al. Reduced parenteral glucose supply during neonatal infection attenuates neurological and renal pathology associated with modulation of innate and Th1 immunity. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1871 (4), (2025).
  28. Wu, Z., et al. Harnessing systemic glycolysis-TCA cycle axis to boost host defense against neonatal infection. EMBO Molecular Medicine. , (2026).
  29. Bæk, O., et al. Rethinking parenteral nutrition as supportive therapy for neonatal sepsis. Med. , (2026).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים