הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דימוי בשקיעת זמן (Time-Lapse Imaging) של פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנציה ירוק על ידי מקרופאגים בהנחיית נוגדנים

219 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת דימות תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי מקרופגים תלויי-נוגדנים, תוך שימוש במקרופגים המופקים מתאי דם פריפריים חד-גרעיים (PBMC) ובמיקרוסקופ אוטומטי.

תקציר

בליעה תאית תלוית נוגדנים (Antibody-dependent cellular phagocytosis) היא מנגנון מרכזי שבאמצעותו מקרופגים בולעים תאי סרטן שעברו אופסוניזציה על ידי נוגדנים. פרוטוקול זה מתאר שיטת דימוי של תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית בליעה של מקרופגים התלויה בנוגדנים של תאי סרטן שד משולש-שלילי המבטאים CD24 ומסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. המקרופגים מופקים מתאי PBMC של בני אדם, מובחנים באמצעות macrophage colony–stimulating factor, ומקוטבים באמצעות interferon gamma ו-lipopolysaccharide כדי ליצור פנוטיפ פרו-דלקתי. תאי הסרטן עוברים אופסוניזציה עם נוגדן מונוקלונלי נגד CD24 לפני תרבית משותפת עם מקרופגים ביחס מוגדר של effector-to-target. אירועי הבליעה מוקלטים לאורך תקופה של 16 h באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי המצויד בבקרת סביבה לשמירה על תנאים פיזיולוגיים. ההדמיה מבוצעת באמצעות ערוצי שדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציה, מה שמאפשר זיהוי של תאי הסרטן ומעקב אחר הפנמתם על ידי המקרופגים. תמונות time-lapse מייצגות מדגימות את הבליעה הפרוגרסיבית של תאי סרטן פלואורסצנטיים לאורך זמן. כדי לאפשר הערכה כמותית, מבוצע במקביל ניסוי נקודת-סוף (endpoint assay) תחת תנאי תרבית משותפת זהים, שבו תאי סרטן שלא הופנמו מוסרים לפני ההדמיה כדי לאפשר מדידה מדויקת של אירועי הבליעה. שיטה זו מספקת גישה סטנדרטית וניתנת לשחזור להדמיה של בליעה של מקרופגים המונעת על ידי נוגדנים in vitro. חשוב לציין כי השילוב של הדמיית time-lapse עם כימות מבוסס נקודת-סוף מאפשר הערכה משלימה של הקינטיקה והעוצמה של הבליעה. פרוטוקול זה תומך בהערכה של נוגדנים טיפוליים ואימונותרפיות לסרטן המכוונות למקרופגים בסביבת in vitro מבוקרת.

מבוא

סרטן השדיים הוא המalignancy המאובחנת ביותר בקרב נשים ברחבי העולם, ומהווה כ-2.3 מיליון מקרים חדשים מדי שנה1. המחלה היא הטרוגנית מבחינה קלינית ומסווגת לפחות לארבעה תתי-סוגים מולקולריים עיקריים, המבוססים על מצב הקולטנים להורמונים — קולטן האסטרוגן (ER) וקולטן הפרוגסטרון (PR) — והבעת האונקוגן של קולטן הגורם לשאיפת גדילה אפיתליאלי אנושי 2 (HER2)2. גידולי Luminal A מביעים ER ו/או PR ללא ביטוי יתר של HER2 (ER/PR+ ו-HER2−); גידולי Luminal B מביעים שילוב של ER/PR ו-HER2 (ER/PR+ ו-HER2+); גידולי HER2+ מאופיינים בביטוי גבוה של HER2 ללא קשר למצב הקולטנים ההורמונליים; וסרטן שדיים טריפל-נגטיבי (TNBC) חסר ביטוי של שלושת הסמנים (ER−, PR−, ו-HER2−)2,3. מבין תתי-סוגים אלו, TNBC מייצג את הצורה המאתגרת ביותר מבחינה קלינית ומהווה כ-15%–20% מכלל מקרי סרטן השדיים. חולות עם TNBC מראות את מהלך המחלה האגרסיבי ביותר, עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר והישרדות כוללת קצרה ביותר ל-5 שנים, בשל תגובה דלה לכימותרפיה קונבנציונלית והיעדר טיפולים ממוקדים יעילים3,4. יתרה מכך, TNBC מראה נטייה גבוהה באופן משמעותי לגרורות ויסצראליות, במיוחד לריאות בתוך 5 שנים מהאבחנה, ולחולות עם TNBC מתקדם או גרורתי (mTNBC) יש הישרדות חציונית שרק לעיתים רחוקות עולה על שנתיים5,6. נתונים אלו מדגישים את הצורך הקריטי והבלתי מסופק באסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור TNBC.

מיקרו-סביבת הגידול (TME) ממלאת תפקיד מרכזי בהתקדמות סרטן השד ובחמיקה ממערכת החיסון. מקרופאגים הקשורים לגידול נמנים בין תאי החיסון השכיחים ביותר בתוך ה-TME, ולאחרונה הוכרו כמתווכים קריטיים של חסינות אנטי-גידולית מולדת7,8,9. בעוד שבעבר חולקו TAMs למצבים פרו-דלקתיים של "M1" ולמצבים פרו-גידוליים של "M2", מודל בינארי זה אינו מצליח לשקף את ההיקף האמיתי של ההטרוגניות של המקרופאגים. במקום זאת, TAMs תופסים ספקטרום תפקודי דינמי, המתפתח בתגובה לאותים ביוכימיים מגוונים בתוך ה-TME. בתוך נוף מורכב זה, תאי סרטן משבשים באופן פעיל את פעילות המקרופאגים באמצעות אסטרטגיות שונות של חמיקה חיסונית, ובמיוחד ביטוי יתר של אותות "אל תאכל אותי". ציר ה-CD47/SIRPα היה נקודת הבקרה החיסונית המולדת הראשונה שזוהתה בהקשר זה6,10, ולאחרונה, CD24 עלה כסיגנל אנטי-פגוציטי חדש ועוצמתי11,12. CD24 הוא גליקופרוטאין קטן מסוג מוצין בעל גליקוזילציה גבוהה, המעוגן לממברנת התא באמצעות קישור גליקוזילפוספטידילינוזיטול13. הוא מבוטא בשורות תאי חיסון שונות בתנאים פיזיולוגיים, אך מבוטא לעיתים קרובות ביתר בגידוליים מוצקים, כולל סרטן השד, השחלה, הלבלב והמעי הגס14. על תאי גידול, CD24 נקשר לקולטן המעכב sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) המבוטא על מקרופאגים. אינטראקציה זו מפעילה זירחון של דומייני immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif בזנב הציטופלזמי של Siglec-10, ובכך מפעילה את הפוספטאזים SHP-1 ו-SHP-2 המדכאים את סיגנל הפגוציטוזה הבא אחריו11. הוכח כי חסימה של האינטראקציה CD24/Siglec-10 באמצעות נוגדן מונוקלונאלי מגבירה באופן ניכר את הפגוציטוזה של גידולי אדם המבטאים CD24 על ידי מקרופאגים. מחקרנו האחרון הראה גם כי נוק-אאוט של CD24a בתאי סרטן השד מגביר את הרגישות שלהם לפגוציטוזה על ידי מקרופאגים במודל עכברי של סרטן שד טריפל-נגטיב9.

בליעה תאית תלוית נוגדנים (ADCP) היא מנגנון מרכזי שבו נוגדנים מכוונים מקרופאגים לבלוע תאי גידול15,16. עם הקישור לאנטיגנים המבוטאים בגידול, אזור ה-Fc של הנוגדן נקשר לקולטני Fcγ (FcγRs) על פני המקרופאגים, ובכך מעורר רצפי אותות תוך-תאיים המביאים לסידור מחדש של השלד התאי, להיווצרות גביע פגוציטי ולבליעת תא המטרה17.

במחקר זה, פיתחנו ותיקפנו פרוטוקול של דימוי תאי חיים בשיטת time-lapse למדידת פגוציטוזה של תאי סרטן השד על ידי מקרופאגים המונחית על ידי נוגדנים. השיטה משתמשת במקרופאגים המופקים מתאי דם פריפריים חד-גרעיניים (PBMC) מתורמים אנושיים בריאים, אשר בוצע להם בידול באמצעות macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) ולאחר מכן עברו גרייה באמצעות lipopolysaccharide (LPS) ו-interferon gamma (IFN-γ). ניתוח בציטומטריית זרימה אישר עלייה בביטוי של CD80 בתוך אוכלוסיית CD11b⁺ לאחר הגרייה (איור 1), מה שתומך בפנוטיפ של הפעלה קלאסית. מצב הפעלה זה מקנה יכולת פגוציטית חזקה המתווכת על ידי נוגדנים, מה שהופך אותו למתאים ביותר להערכת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP). תאי סרטן השד CD24-חיוביים המסומנים ב-GFP משמשים כתאי מטרה ועוברים אופסוניזציה עם נוגדן מונוקלונלי טיפולי נגד CD24 לפני תרבית משותפת. אירועי פגוציטוזה נרשמים לאורך תקופה של 16 h באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי תחת תנאים סביבתיים מבוקרים. כדי לאפשר הערכה כמותית במקביל להדמיה דינמית, מבוצעת בדיקת endpoint נפרדת תחת תנאי תרבית משותפת זהים, המאפשרת מדידה קפדנית של הפגוציטוזה לאחר הסרת תאי מטרה שלא הופנמו. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה סטנדרטית, הניתנת לשחזור ומספקת מידע ויזואלי להערכת ADCP המתווכת על ידי נוגדן anti-CD24. חשוב לציין כי השילוב של דימוי time-lapse עם אסטרטגיית כימות משלימה מבוססת endpoint מאפשר הערכה סימולטנית של קינטיקת הפגוציטוזה ועוצמתה. ניתן להתאים את השיטה לחקירת מטרות אימונו-תרפויטיות אחרות המכוונות למקרופאגים. פרוטוקול זה מתאים ביותר להערכת ADCP המתווכת על ידי נוגדנים מונוקלונליים טיפוליים נגד אנטיגנים על פני השטח של תאי סרטן. הוא מתאים לסריקה השוואית של נוגדנים מועמדים, אפיון תגובה למנה ומחקרים מכניסטיים של קשירת Fc–FcγR, כולל השפעות של חסימת אותות "אל תאכל אותי" (למשל, CD47–SIRPα). מכיוון שהבדיקה משתמשת במקרופאגים אנושיים ראשוניים, היא מתאימה גם למחקרים טרנסלציונליים הדורשים הערכה של שונות בין תורמים לפני פיתוח קליני.

figure-introduction-1
איור 1. ייצור ותיקוף באמצעות ציטומטריה זורמת של מקרופאגים המופקים מתאי דם לבנים חד-גרעיים (PBMCs) ועמולו ב-IFN-γ/LPS. פאנל עליון: תאי דם לבנים חד-גרעיים (PBMCs) מבודדים מתורמים בריאים באמצעות סבב צנטריפוגי במדרג צפיפות באמצעות תמיסת Ficoll ב-400 × g למשך 30 דקות ב-20°C, כאשר כל הרכיבים הובאו לטמפרטורה של 20°C ± 2°C מראש. ה-PBMCs המבודדים גודלו במדיום ImmunoCult-SF בתוספת 100 ng/mL של גורם מעורר התפתחות של מושבות מקרופאגים (M-CSF) למשך 7 ימים כדי להניע אתה התמיינות המקרופאגים (יום 0–7), עם תוספת מדיום ביום 5. ביום 8, מקרופאגים מובחנים עומולו ב-100 ng/mL IFN-γ ו-1 µg/mL LPS למשך 48 שעות (יום 8–10). התאים הועברו לאחר מכן לניתוח בציטומטריה זורמת. פאנל תחתון: ניתוח בציטומטריה זורמת של מקרופאגים. התאים נצבעו עם פאנל שטח הכולל CD11b-FITC, CD80-PE ו-CD206-PerCP-Cy5.5, ולאחר מכן נוסף DAPI לפני הרכישה לצורך החרגת תאים מתים. אסטרטגיית גייטינג: התאים סוננו תחילה לתאים חיים (DAPI⁻), ולאחר מכן בוצע זיהוי של CD11b⁺ בתרשים CD11b-FITC לעומת FSC-A כדי לאשר את זהות המקרופאגים. אירועי CD11b⁺ חיים נותחו לאחר מכן בתרשים פיזור של CD80 לעומת CD206 כדי לאשר את אוכלוסיית CD80⁺CD206⁻ שהושרה על ידי גירוי IFN-γ/LPS. ימין: תרשים פיזור מייצג של CD11b-FITC לעומת FSC-A המראה ש-99.8% מהתאים הגדודים היו CD11b⁺, מה שמאשר את זהות המקרופאגים. שמאל: מרבית תאי ה-CD11b⁺ נפלו בתוך הגייט של CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95.2%), מה שמעיד על הפנוטיפ הפרו-דלקתי הצפוי תחת תנאי הגירוי המיושמים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

על המשתמשים לשקול מספר מגבלות בעת יישום טכניקה זו. ראשית, שונות בין תורמים במקרופגים המופקים מ-PBMC עלולה להביא לשונות משמעותית בתוצר הפגוציטי, ולכן אנו ממליצים להשתמש במספר תורמים (n ≥ 3) תוך דיווח של נתוני תורמים בודדים לצד התוצאות המאוחדות. שנית, פורמט השיתוף-תרבייה (co-culture) הדו-ממדי אינו משחזר את מיקרו-סביבת הגידול, ויש לתקף את הממצאים במודלים תלת-ממדיים או במודלים in vivo לפני הסקת מסקנות קליניות. שלישית, חלון ההדמיה בן 16 השעות לוכד אירועים פגוציטיים מוקדמים אך אינו משקף תהליכים ארוכי טווח יותר, כגון הצגת אנטיגן או הפעלה חיסונית משנית. לפיכך, השימוש המשולב בהדמיה בזמן אמת ובכימות בנקודת הסיום מספק מסגרת משלימה המשפרת הן את יכולת הפרשנות והן את השחזור של מדידות ADCP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כולל שימוש במקרופאגים ראשוניים שהופקו מדגימות דם של תורמים בריאים. איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הלסינקי (IRB) של אוניברסיטת הרפואה של סין.

1. הכנת מקרופאגים המופקים מ-PBMC

הערה: בצע את כל ההליכים הכוללים דם אנושי תחת אישור IRB מוסדי (לדוגמה, CMUH IRB). קבל הסכמה מדעת מתורמים בריאים לפני איסוף הדם.

זהירות: יש לטפל בכל מוצרי דם אנושיים תחת תנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (Biosafety Level 2) תוך שימוש בנקיטת אמצעי זהירות אוניברסליים.

  1. איסוף דם
    1. אספו דם מלא מתורם בריא לתוך מבחנות vacutainer מצופות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) בנפח 10 mL.
  2. דילול דם
    1. דללו את הדם המלא ביחס של 1:1 עם תמיסת phosphate-buffered saline (PBS; נטולת Ca2⁺-/Mg2⁺-) קרה מהקרח (לדוגמה, 10 mL דם + 10 mL PBS).
    2. ערבבו על ידי הפיכת המבחנה שלוש עד חמש פעמים.
      הערה: שמרו את ה-PBS על קרח לפני השימוש. טמפרטורה נמוכה מסייעת בשימור חיוניות התאים במהלך העיבוד.
  3. שכובת מדרג צפיפות
    1. הניחו בזהירות את הדם המדולל מעל Ficoll–Paque PLUS ביחס נפחים של 2:1 (v/v) במבחנה קונית (לדוגמה, 8 mL דם מעל 4 mL Ficoll במבחנה של 15 mL, או 30 mL מעל 15 mL במבחנה של 50 mL).
    2. הביאו את הדם המדולל ואת ה-Ficoll–Paque PLUS לטמפרטורה של 20°C ± 2°C לפני השכובה.
    3. הוציאו את ה-Ficoll–Paque PLUS מאחסון בטמפרטורה של 4°C לפחות 30 דקות לפני השימוש, או חממו קצרית באמבט מים של 20°C ± 2°C.
    4. אין להשתמש בריאגנטים קרים, שכן צפיפות ה-Ficoll מכויילת ל-20°C ± 2°C, וסטיות מכך יפגעו ביעילות ההפרדה ובניבוי ה-PBMC.
      הערה: הטו את המבחנה בזווית של 45° והעבירו את הדם באיטיות לאורך הדופן כדי לשמור על ממשק חד. אין להפריע לשכבת ה-Ficoll.
  4. צנטריפוגציה
    1. בצעו צנטריפוגציה ב-400 × g למשך 30 דקות ב-20°C ללא בלימה (איור 1).
      הערה: בלימה תשבש את מדרג הצפיפות ותפחית את ניבוי ה-PBMC.
  5. איסוף PBMC
    1. שאבו בזהירות רק את שכבת ה-buffy coat (הממשק הלבנבן בין שכבת הפלסמה לשכבת ה-Ficoll), ללא הפרעה לפלסמה שמעליה או לשכבת ה-Ficoll שמתחתיה, באמצעות פיפט סרולוגית.
    2. העבירו את השכבה שנאספה למבחנה קונית חדשה של 50 mL.
  6. שטיפת PBMC
    1. הוסיפו PBS עד להגעה לנפח כולל של 25 mL במבחנה קונית של 50 mL.
    2. השתמשו במבחנה של 50 mL כדי להבטיח צנטריפוגציה ואיזון תקינים.
    3. בצעו צנטריפוגציה ב-300 × g למשך 10 דקות.
  7. ליסיס של RBC
    1. שפכו את הסופרנאטנט.
    2. שחזרו את המשקע ב-5 mL של בופר ליסיס של תאי דם אדומים (RBC) על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה עם פיפט סרולוגית, עד שהמשקע מפוזר לחלוטין ולא נותרו גושים נראים לעין.
    3. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      זהירות: פיזור מלא נדרש כדי להבטיח ליסיס אחיד; עם זאת, הימנעו מפיפוט חזק או מערבולת (vortexing), שעלולים לפגוע ב-PBMCs. אין לחרוג מ-5 דקות דגירה עם בופר ליסיס RBC, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בחיוניות ה-PBMC.
  8. שקיעת PBMC
    1. בצעו צנטריפוגציה ב-500 × g למשך 5 דקות כדי לשקיע את ה-PBMCs ולהסיר את שאריות ה-RBC שעברו ליסיס.
  9. שחזור סופי
    1. שפכו את הסופרנאטנט.
    2. שחזרו את המשקע ב-5 mL של מצע מקרופגים ImmunoCult-SF.
      הערה: בתנאים סטנדרטיים, 10 mL של דם מלא מניבים בדרך כלל 1.5–2.0 × 107 PBMCs.

2. דיפרנציאציה של מקרופאגים (ימים 0–7)

הערה: השתמשו בצלחות פטרי שאינן מטופלות לתרביות רקמה (non-TC treated) כדי לבחור מקרופגים מובחנים הגזורים ממונוציטים על ידי היצמדות. לימפוציטים שאינם נצמדים יישטפו במהלך התרבית העוקבת.

  1. יום 0: זריעת תאים
    1. בצעו ספירת תאים וזרעו 1 × 107 PBMCs לתוך צלחת פטרי בגודל 10 cm שאינה מטופלת ב-TC.
    2. השלימו את הנפח הכולל ל-10 mL באמצעות מצע גידול למקרופאגים מסוג ImmunoCult-SF המועשר ב-100 ng/mL M-CSF (הכנה על ידי הוספת מלאי M-CSF ישירות למצע המלא רגע לפני השימוש וערבוב באמצעות היפוך עדין).
      הערה: ניתן להתאים את הפרוטוקול באופן פרופורציונלי כדי להתאימו לשינויים בתשואת ה-PBMC של התורם, תוך שימוש בצפיפות זריעה המתחילה מ-1 × 106 תאים/mL כבסיס.
  2. אינקובציה ומעקב
    1. דגרו ב-37°C עם 5% CO₂ באינקובטור לח.
    2. עקבו מדי יום אחר היווצרות של מקבצי מונוציטים צפים והופעת תאים נצמדים.
      הערה: המונוציטים יגדלו בהדרגה בגודלם וייצרו מקבצים ככל שהדיפרנציאציה תתקדם. חלק מהמונוציטים יתחילו להיצמד לצלחת. אין צורך בהתערבות בשלב זה.
  3. יום 5: תוספת מצע
    1. הוסיפו בעדינות 5 mL של מצע גידול טרי למקרופאגים מסוג ImmunoCult-SF המועשר ב-100 ng/mL M-CSF לצלחת, תוך הקפדה לא להפריע למקרופאגים הנצמדים.
    2. המשיכו את התרבית למשך יומיים נוספים (עד ליום 7).
      זהירות: הוסיפו מצע טרי בעדינות לאורך דופן הצלחת כדי למנוע הפרעה למקרופאגים הנצמדים, שכן הפרעה מכנית עלולה להשפיע על יעילות הדיפרנציאציה ועל תשואת התאים.
      הערה: הימנעו מהחלפת המצע כדי לשמר גורמים אוטוקריניים/פאראקריניים התומכים בדיפרנציאציה של מקרופאגים.
  4. יום 7: הערכה מורפולוגית
    1. בחנו את יעילות הדיפרנציאציה של המקרופאגים תחת מיקרוסקופ הפוך.
    2. תאים נצמדים מראים מורפולוגיה אופיינית למקרופאגים: גדולים, שטוחים, בעלי צורה לא סדירה, עם פסאודופודיה (רגלי דמה) גלויות.
    3. ביום 7, מקרופאגים שעברו דיפרנציאציה טובה אמורים להיות גלויים.
      זהירות: הערכה מורפולוגית ביום 7 מהווה תנאי מקדים קריטי לתיקוף באמצעות ציטומטריה של זרימה בהמשך. מקרופאגים שעברו דיפרנציאציה טובה צריכים להיות גלויים בבירור תחת המיקרוסקופ, ושיעור גבוה יותר של תאים נצמדים בעלי מורפולוגיה של מקרופאגים משקף יעילות דיפרנציאציה גבוהה יותר (כ-70% קונפלואנס של מקרופאגים נצמדים עם מורפולוגיה אופיינית נחשב כמעיד על דיפרנציאציה מוצלחת). תרביות המראות היצמדות דלילה, תאים עגולים בעיקר, או דיפרנציאציה מורפולוגית לקויה אחרת, אינן צפויות להניב תוצאות ציטומטריה של זרימה מהימנות ואין להמשיך בהן לשלבי הגירוי והצביעה.

3. קיטוב מקרופגים (ימים 8–10)

  1. איסוף והבהרה של מצע מותנה
    1. ביום ה-8, שאבו בזהירות את 15 mL של המצע מכלי התרבית מבלי להפריע למקרופאגים הדבקים והעבירו אותו לפרועת קונית סטרילית של 50 mL.
    2. סבבו במרכזית (Centrifuge) את המצע שנאסף ב-400 × g למשך 5 min כדי לשקע פסדתיים תאיים.
    3. שמרו את העילוי המבהיר לשלב הבא.
  2. סטימולציה של interferon gamma (IFN-γ) ו-lipopolysaccharide (LPS)
    1. העבירו את 15 mL של העילוי המבהיר לפרועת סטרילית חדשה והוסיפו 100 ng/mL IFN-γ ו-1 µg/mL LPS.
    2. ערבבו היטב באמצעות פיפוט עדין למעלה ולמטה (5–10 פעמים) כדי להבטיח פיזור אחיד של הציטוקינים מבלי להחדיר בועות.
    3. החזירו את מלוא 15 mL של המצע המועשר בציטוקינים לכלי התרבית המקורי, תוך פיפוט עדין לאורך הדופן הפנימית כדי למנוע הפרעה למקרופאגים הדבקים.
    4. דגרו ב-37°C עם 5% CO₂ למשך 48 h (יום 8 עד יום 10).
      הערה: השתמשו במצע מותנה (ישן) כדי לשמר גורמים אוטוקריניים/פאראקריניים. שילוב זה של IFN-γ ו-LPS משמש להקטבה של מקרופאגים לפנוטיפ פרו-דלקתי. תחת תנאי הסטימולציה של IFN-γ (100 ng/mL) ו-LPS (1 µg/mL) המשמשים בפרוטוקול זה, המקרופאגים מראים שינויים מורפולוגיים אופייניים, כולל laemellipodia מוארכים התואמים למצב פרו-דלקתי מופעל, כמו גם ביטוי של CD11b ו-CD80.
      זהירות: טפלו ב-LPS בהתאם לנהלי הבטיחות במעבדה, הידוע כנדו-טוקסין ביו-אקטיבי העלול לגרום לתגובות דלקתיות במקרה של חשיפה.

4. אישור סמני פנוטיפ דלקתי של מקפגים שעברוו גירוי באמצעות IFN-γ ו-LPS באמצעות ציטומטריה של זרימה

  1. קציר תאים
    1. קצרו תת-קבוצה של מקרופאגים מוקטבים ביום ה-10 לצורך פנוטיפיה.
    2. הוסף 10 mM EDTA ב-PBS והדגר למשך 10–15 דקות ב- 37°C.
    3. נתקו את התאים באמצעות פיפוט עדין.
      הערה: האריכו את דגירת ה-EDTA ב-30 דקות נוספות ב- 37°C אם התאים נותרים דבקים, חזור על פעולת הפיפטינג העדין. הימנע מפיפטינג חזק או מגרידה מכנית כדי לשמור על חיוניות התאים ועל שלמות הסמנים השטחיים.
  2. הגדרת צביעה בנוגדנים
    1. צבע את התאים באמצעות נוגדנים מצומדים לפלואורוֹכְרוֹם נגד CD11b (סמן לשושלת מקרופאגים כללית), CD80 (סמן דלקתי) ו-CD206 (סמן אנטי-דלקתי המשמש כסמן החרגה שלילי לזיהוי פנוטיפ דלקתי).
  3. פרוטוקול צביעה
    1. העברה 5 × 105 העבר את המקרופאגים שהסרו למסורת פלוו-ציטומטריה המכילה 100 µL של PBS קר.
    2. הוסיפו נוגדנים CD11b-FITC, CD80-PE ו-CD206-PerCP-Cy5.5 עד לריכוז סופי של 1 µg/mL כל אחד.
    3. ערבבו את תרחיף התאים באמצעות פיפוט עדין.
    4. דגרו את הדגימות על קרח למשך שעה אחת, תוך הגנה מאור.
    5. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 300 × g למשך דקה אחת ב- 4°C.
    6. שאבו את העל-משקע בזהירות.
    7. הוסיפו 0.5 מ"ל של PBS קר כדי לשטוף את משקע התאים.
    8. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות 300 × g למשך דקה אחת ב- 4°C.
    9. שפוך את הנוזל העליון.
    10. השביה מחדש את משקע התאים ב- 200 µL של PBS קר.
    11. הוסף DAPI לריכוז סופי של 1 µg/mL.
      הערה: יש לכלול בקרות איזוטייפ (isotype controls) מתאימות וצבע לבדיקת חיוניות (למשל, DAPI או Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה
    1. רכשו דגימות צבועות באמצעות ציטומטר זרימה.
    2. אשרו את הביטוי של CD11b ו-CD80 באוכלוסיית המקרופגים.
    3. יש להמשיך לבדיקת הפגוציטוזה רק לאחר אישור ביטוי של סמנים התואמים לפנוטיפ דלקתי.
  5. רכישה והגדרה של ציטומטריית זרימה
    1. הגדרת המכשיר
      1. הגדירו את ציטומטר הזרימה באמצעות הערוצים הבאים: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80), ו-PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. הגדירו את פרמטר הרכישה כך שייאספו 10,000 אירועים לדגימה בתוך השער האב (parent gate) שהוגדר.
    2. כיול סף והגברה
      1. פתחו ארבעה תרשימי פיזור (dot plots) המציגים את ה-FSC בציר ה-x וערוץ פלואורופור אחד בציר ה-y.
      2. הכינו תאים שצבעו עם נוגדני בקרה מסוג isotype תואמים לכל פלואורופור.
      3. השג דגימות בקרה של איזוטיפ (isotype control).
      4. כוון את ההגבר (gain) עבור כל ערוץ כך שאוכלוסיית בקרת האיזוטייפ תמוקם מתחת ל-101 בסולם לוגריתמי.
      5. השתמשו בסף זה כדי להגדיר את רמות אות הרקע.
        הערה: השתמש בטווח סקלה לוגריתמית של 101 עד 101·5 כדי לבסס הפרדה מהימנה בין הרקע לבין אות ספציפי.
    3. פיצוי
      1. הוסיפו טיפה אחת של חרוזי פיצוי (compensation beads) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      2. הוסף את הנוגדן המשליש למולקולת פלואורופור התואמת עד לריכוז סופי של 1 µg/mL.
      3. דגרו למשך 30 דקות על קרח, בהגנה מאור.
      4. סבב במסננת (צנטריפוגה) במהירות של 400 × G למשך 1 דקה.
      5. יש להשליך את הנוזל העליון (supernatant).
      6. שחזר את החרוצים ב- 200 µL של PBS קר.
      7. השיגו בקרים של צבע יחיד.
      8. יש להחיל פיצוי ספקטרלי (spectral compensation) כדי לתקן זליגה (spillover) של פלואורופורים.
    4. אסטרטגיית הגבוב (Gating strategy)
      1. בחירת תאים חיים
        1. הצג את Pacific Blue/V450 (DAPI) בציר ה-y ואת ה-FSC בציר ה-x.
        2. בצע סינון (Gate) לאירועים שליליים ל-DAPI (מתחת ל-101) לבחירת תאים חיים.
      2. זיהוי מקרופאגים
        1. הגדירו את אוכלוסיית התאים החיים כשער ההורה (parent gate).
        2. הצג את FITC (CD11b) על ציר ה-y ואת FSC על ציר ה-x.
        3. הגדרת שער (Gate) על CD11b⁺ אירועים (מעל 101).
      3. זיהוי פנוטיפ דלקתי
        1. הגדירו את ה-CD11b⁺ אוכלוסייה כשער האב.
        2. הצג את PE (CD80) בציר ה-y ואת PerCP-Cy5.5 (CD206) בציר ה-x.
        3. החל applied quadrant gating ב-101.5 בשני הצירים.
        4. זיהוי CD80⁺CD206⁻ תאים ברביע השמאלי-עליון (Q1).
  6. קריטריוני קבלה
    1. יש לוודא כי ≥90% מהתאים בתוך אוכלוסיית ה-CD11b⁺ שער ההורה הוא CD80⁺CD206⁻.
    2. עברו לבדיקת הפגוציטוזה רק כאשר סף זה הושג.
    3. חזור על בידוד PBMC, גזירה באמצעות M-CSF, ו-IFN-γגירוי ב-LPS אם הדגימות אינן עומדות בקריטריון זה.

5. בדיקת פגוציטוזה תלוית נוגדנים

הערה: יש לוודא ביטוי יציב של GFP בתאי הסרטן לפני הקמת הבדיקה. יש לאשר את ביטויי ה-CD24 בתאי המטרה לפני הבדיקה. להשגת ביצועים אופטימליים, השתמשו בתאי סרטן עם 50%–100% חיוביות ל-CD24. תאי MDA-MB-468 המשמשים בפרוטוקול זה מראים 100% חיוביות ל-CD24.

  1. זריעת מקרופאגים
    1. זריעת מקרופאגים שעברו גירוי ב-IFN-γ וב-LPS, כפי שתוקף בשלב 4, בריכוז של 2 × 105 תאים לבאר בלוח תרבית רקמות בעל 24 בארות.
    2. דגירה של הלוח ב-37°C בתנאים סטטיים עם 5% CO₂ למשך 12–16 שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים (איור 2A).
      הערה: יש לוודא היצמדות תקינה של המקרופאגים לפני ההמשך. מקרופאגים שאינם היצמדים היטב עלולים להינתק במהלך הדימות ולהטות את התוצאות.
  2. הכנת תאי סרטן
    1. גידול תאי סרטן שד חיוביים ל-CD24 המסומנים ב-GFP (MDA-MB-468) עד להגעה ל-70%–80% התמלאות (confluency).
    2. שאיבת מצע התרבית.
    3. שטיפת שכבת התאים החד-שכבתית פעם אחת עם PBS.
  3. ניתוק תאי הסרטן
    1. הוספת 10 mM EDTA ב-PBS לכלי התרבית.
    2. דגירת התאים ב-37°C למשך 5–10 דקות.
    3. ניתוק התאים באמצעות פיפוט עדין להשגת שחרור מלא של התאים.
      הערה: יש להימנע משימוש בטריפסין לצורך ניתוק התאים. עיכול אנזימטי עלול לנתק את ה-CD24 מפני השטח של התא ולפגוע בקישור הנוגדנים.
  4. איסוף וספירת תאי הסרטן
    1. איסוף התאים המנותקים למבחנה לצנטריפוגה.
    2. צנטריפוגה של התאים ב-300 × g למשך 5 דקות.
    3. הסרת הנוזל העליון (supernatant).
    4. ריסוספנזיה של משקע התאים במצע RPMI מלא.
    5. ספירת תאים חיוניים.
  5. אופסוניזציה של תאי הסרטן באמצעות נוגדנים
    1. ריסוספנזיה של תאי הסרטן בריכוז של 2 × 105 תאים/מ"ל ב-0.5 מ"ל של מצע RPMI מלא.
    2. הוספת נוגדן מונוקלונלי נגד CD24 לריכוז סופי של 1 µg/mL.
    3. ערבוב תלי התאים באמצעות פיפוט עדין כדי להבטיח פיזור אחיד של הנוגדנים.
    4. דגירת התאים ב-37°C למשך 30 דקות בתנאים סטטיים.
      הערה: יש לכלול בקרת IgG תואמת איזוטייפ באותו ריכוז כביקורת שלילית לבליעה תלוית נוגדנים (antibody-dependent phagocytosis).
  6. הכנה לתרבית משותפת (co-culture)
    1. אין לשטוף את התאים לאחר האופסוניזציה.
    2. מעבר ישיר לתרבית משותפת כדי לשמר את ציפוי הנוגדנים על פני השטח של התאים.
  7. הקמת התרבית המשותפת
    1. הוספת 1 × 105 תאי סרטן שד המסומנים ב-GFP שעברו אופסוניזציה בנוגדנים לכל באר המכילה מקרופאגים.
    2. שמירה על יחס של 2:1 בין תאי אפקטור לתאי מטרה.
      הערה: יש להתאים את יחס האפקטור למטרה בהתאם לתכנון הניסוי. שימוש ביחסי מקרופאגים לתאי סרטן גבוהים יותר מהיחס המתואר של 2:1 (למשל, 3:1 או 5:1) יעלה את תדירות המגע בין התאים וישפר את זיהוי אירועי הבליעה.

figure-protocol-1
איור 2דימות במרווחי זמן של פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים. (A) סכמה כללית של מערכת התרבית המשולבת (co-culture) ומערך הדמיות ה-time-lapse. פרמטרי ההדמיה כללו מרווח של 10 דקות לאורך זמן רכישה כולל של 16 שעות (97 פריימים), תוך שימוש ב-10× עדשה עם ערוצי ניגודיות פאזה (phase contrast) ו-GFP. (B) תמונות מיימ-לאפס (time-lapse) מייצגות מ-1 עד 16 שעות, המראות אירועי פגוציטוזה המאופיינים בהפנמה של תאי סרטן חיוביים ל-GFP על ידי מקפגים לאורך זמן. עיגולים מקווקווים בצהוב מדגישים אירועי פגוציטוזה מייצגים. בערוץ ניגודיות הפאזה, תאי סרטן שנבלעו מופיעים כמבנים תוך-תאיים בהירים בתוך ציטופלזמת המקפג (חצים לבנים). בערוץ ה-GFP, פלואורסצנציה הממוקמת בתוך המקפגים מאשרת את ההפנמה. (C) תצפיות מוגדלות של אירועי פגוציטוזה מייצגים ב-0, 1, 4 ו-16 שעות, הממחישות את התהליך הרצופי של בליעה של תאי סרטן המסומנים ב-GFP על ידי מקפגים. רצף התמונות נבחר כמייצג על בסיס ויזואליזציה ברורה של אירועי פגוציטוזה המתווכים על ידי מקפגים. חצים לבנים מצביעים על מקפגים המקיימים אינטראקציה עם תאי מטרה ומפנימים אותם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. דימוי במרווחי זמן (מערכת אוטומטית לדימוי תאים חיים)

הערה: הגדירו את פרוטוקול ההדמיה באמצעות מערכת Lionheart להדמיה אוטומטית של תאים חיים ותוכנת Gen5 להדמיה אוטומטית של תאים חיים לפני ביצוע הבדיקה. עברו הכשרה מתאימה לפני הפעלת מערכת ההדמיה כדי להבטיח הגדרה מדויקת, ביצועים אופטימליים ושימוש בטוח.

  1. הכנת המכשיר
    1. הפעל את מערכת הדימוי, את מודול בקרת הסביבה ואת אספקת גז ה-CO₂ לפחות שעה אחת לפני הדימוי.
    2. פתח את פאנל בקרת הסביבה (Environment Control) בתוכנת הדימוי האוטומטית של תאים חיים.
    3. הגדר את הטמפרטורה ל-37°C ואת ה-CO₂ ל-5%.
    4. וודא שטמפרטורת התא מתייצבת בטווח של ± 0.2°C וה-CO₂ ב-5.0% ± 0.1% לפני טעינת הפלטה.
  2. הכנת הפלטה
    1. מקם את הפלטה בעלת 24 הבארים בתוך תא הדימוי של מערכת הדימוי.
  3. תצורה ראשונית
    1. פתח את מנהל המשימות (Task Manager) של תוכנת הדימוי האוטומטית של תאים חיים.
    2. בחר ב-[Imager manual mode].
    3. לחץ על [Capture now] כדי לאתחל את פרמטרי הדימוי.
    4. בחר בעדשה של 10×.
    5. בחר ב-microplate כהגדרת המסנן.
    6. בחר פלטה בעלת 24 בארים מספריית הפלטות של תוכנת הדימוי האוטומטית של תאים חיים.
  4. הגדרת פוקוס ודימוי
    1. בחר בערוץ ניגוד פאזה (Phase Contrast).
    2. בחר באר מייצגת (למשל, A1).
    3. הפעל פוקוס אוטומטי לפני רכישת ה-time-lapse.
    4. צלם תמונה באמצעות סמל המצלמה.
    5. וודא את מורפולוגיית התאים ואת איכות הפוקוס.
    6. עבור ל-[Process/Analyze].
    7. בחר ב-[Create experiment from an image set] כדי להגדיר את הניסוי.
  5. פרמטרי רכישת time-lapse
    1. פתח את פאנל הגדרות ה-[Procedure].
    2. הגדר את הטמפרטורה ל-37°C ואת ה-CO₂ ל-5%.
    3. תחת [Start Kinetic], הגדר את זמן ההרצה ל-16:00:00.
    4. הגדר את מרווחי הדימוי ל-0:10:00.
    5. הגדר את סך הקריאות ל-97.
    6. השתמש במרווחי דימוי של 10–15 דקות כדי לאזן בין הרזולוציה הזמנית לבין פוטוטוקסיות, תוך כדי לכידה של אירועי פגוציטוזה מוקדמים.
  6. תצורת ערוצי דימוי
    1. הגדר את ערוץ 1 לניגוד פאזה (Phase Contrast).
    2. הגדר את ערוץ 2 ל-GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. בחר בעדשה של 10× לשדה ראייה ורזולוציה אופטימליים.
    4. הגדר את התאורה, זמן האינטגרציה והגבר (gain) ל-[Auto], או כוונן אותם ידנית.
    5. השתמש בזמן חשיפה טיפוסי ל-GFP של 100–300 ms כדי למנוע רוויה של האות.
    6. החל הגדרות דימוי זהות על כל הבארים.
  7. הגדרת מיקומי דימוי
    1. פתח את תפריט [Define beacons].
    2. בטל את רכישת ה-Z-stack.
    3. בטל את רכישת המונטאז' (montage).
    4. בצע דימוי במישור מוקד אחד.
    5. הגדר מיקומי דימוי ידנית על ידי בחירה של אזורים מייצגים שאינם חופפים בתוך כל באר באמצעות סמל המיקרוסקופ.
    6. שמור על מיקומי דימוי זהים בכל נקודות הזמן.
    7. בחר לפחות 4–6 שדות ראייה לכל באר.
  8. רכישת time-lapse
    1. לחץ על [Play] כדי להתחיל את דימוי ה-time-lapse האוטומטי.
  9. ייצוא נתונים וויזואליזציה
    1. פתח את קובץ הניסוי השמור לאחר הרכישה.
    2. בחר את מיקומי הדימוי.
    3. ייצא את נתוני ה-time-lapse בפורמט MP4.
    4. פתח את ה-[Process Tool].
    5. החל [Image Deconvolution] במידת הצורך כדי לשפר את הוויזואליזציה ולזהות אירועי פגוציטוזה מייצגים.
      הערה: השתמש בדימוי time-lapse לוויזואליזציה איכותנית בלבד. תאי סרטן חיוביים ל-GFP שאינם נבלעים עלולים לחפוף או להתחבר באופן זמני למקרופאגים, מה שיוביל לאותים חיוביים שגויים. בצע ניתוח כמותי באמצעות בדיקת נקודת סיום (endpoint assay) נפרדת.

7. כימות פגוציטוזה בנקודת הסיום

  1. הסרה של תאים שאינם מופנמים
    1. בצע את הבדיקה תחת תנאי שיתוף-תרבית (co-culture) זהים.
    2. סיים את הניסוי לאחר 4 h.
    3. הסר את מצע התרבית.
    4. הוסף 10 mM EDTA ב-PBS.
    5. דגור ב-37°C למשך 5 min.
    6. שטוף בעדינות עם PBS כדי להסיר תאים חיוביים ל-GFP שאינם מופנמים.
    7. הוסף מצע מאקרופאגים טרי.
  2. רכישת תמונות לצורך כימות
    1. רכוש תמונות באמצעות ניגודיות פאזה (phase contrast) וערוצי GFP.
    2. דגום לפחות 4–6 שדות ראייה לכל באר.
    3. נתח מינימום של שלוש בארות לכל תנאי.
  3. הגדרת אירועי פגוציטוזה
    1. זהה מאקרופאגים המכילים אותות חיוביים ל-GFP המוכלים במלואם בתוך הגבול התאי.
  4. ניתוח תמונות
    1. פתח את התמונות בתוכנת ImageJ.
    2. השתמש בתוסף Cell Counter.
    3. ספור את סך המאקרופאגים.
    4. ספור מאקרופאגים המכילים תאים מופנמים חיוביים ל-GFP.
  5. חישוב מדד הפגוציטוזה
    1. חשב: figure-protocol-2
    2. בצע את הניתוח באופן סמיך (blinded).
    3. חזור על הפעולה בלפחות שלושה ניסויים עצמאיים.
  6. הצגת נתונים
    1. הצג תמונות מיימס-לאפס (time-lapse) מייצגות באופן כרונולוגי (איור 2B ו-איור 2C).
    2. הצג תמונות נקודת-סיום (endpoint) מייצגות (איור 3A ו-איור 3B).

figure-protocol-3
איור 3. כימות של פגוציטוזה של מקרופאגים התלויה בנוגדנים באמצעות ניתוח נקודת סוף. (A) תמונות מייצגות של ניגודיות מוטורים (phase-contrast) ופלואורסצנציית GFP של מקרופאגים שגודלו בשיתוף עם תאי סרטן השד המסומנים ב-GFP למשך 4 h, ולאחר מכן הוסרו תאים שלא נבלעו באמצעות טיפול ב-EDTA. ערוצי ניגודיות המוטורים ו-GFP מוזגו כדי לזהות מקרופאגים ומטרות חיוביות ל-GFP שהופנמו. מקרופאגים (מונה 0) ומקרופאגים בולעים חיוביים ל-GFP (מונה 1) נספרו באמצעות תוסף Cell Counter ב-ImageJ. בתנאי הבקרה של IgG, לא נצפו אירועי פגוציטוזה, בעוד שטיפול בנוגדן מונוקלונלי anti-CD24 הוביל לאותות GFP חיוביים תוך-תאיים ברורים בתוך המקרופאגים, המעידים על פגוציטוזה פעילה. סרגל קנה מידה = 200 µm. (B) כימות של מדד הפגוציטוזה, המוגדר כאחוז המקרופאגים המכילים תאים חיוביים ל-GFP שהופנמו ביחס לאוכלוסיית המקרופאגים הכוללת. נוגדן מונוקלונלי anti-CD24 העלה באופן מובהק את מדד הפגוציטוזה בהשוואה לבקרת IgG‏ (0.00 ± 0.00% לעומת 18.76 ± 4.01%, ממוצע ± SD; n = 6 שדות לכל קבוצה; ***p < 0.001, מבחן t לא מזווג של Welch). הנתונים מייצגים לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצלחת הייצור והקיטוב של מקרופגים מ-PBMCs אוששו באמצעות הערכה מורפולוגית ואנליזת ציטומטריה של זרימה (איור 1). PBMCs שבודדו באמצעות סנטריפוגציה במעבר דחיסות תרביתו במצע מועשר ב-M-CSF, מה שהוביל להיווצרות תאים נצמדים בעלי מורפולוגיה אופיינית למקרופגים עד היום ה-7. לאחר גירוי באמצעות IFN-γ ו-LPS, התאים הציגו פנוטיפ התואם להפעלה תחת התנאים שהוחלו. אנליזת ציטומטריה של זרימה הראתה כי 99.8% מהתאים שנבחרו (gated) היו חיוביים ל-CD11b, מה שמאשש דיפרנציאציה יעילה למקרופגים (איור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר שלבים בפרוטוקול זה הם קריטיים להשגת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ראשית, האיכות והטוהר של בידוד ה-PBMC משפיעים ישירות על תבואת המקרופאגים ועל יעילות הדיפרנציאציה. שכבה מדויקת של דם מהול מעל גרדיאנט ה-Ficoll וסנטריפוגציה עם בלם כבוי הם חיוניים כדי לשמר את ממשק שכבת ה-buffy coat. ליזיס חלקי של RBC או אינקובציה ממושכת מדי עם בופר ליזיס יפגעו בחיות ה-PBMC. שנית, יש לוודא פולריזציה של מקרופאגים פרו-דלקתיים באמצעות ציטומטריית זרימה לפני בדיקת הפגוציטוזה; מקרופאגים שלא יעלו את ביטוי ה-CD80 עלולים להפגין יכולת פגוציטית מופח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לביולוגיה של הסרטן וטיפוליות מדויקת, האוניברסיטה הרפואית של סין, במסגרת תוכנית מרכז מחקר לתחומים נבחרים (Featured Areas Research Center Program) תחת פרויקט Higher Education Sprout של משרד החינוך (MOE) בטאיוואן (CBPTC-PROJ-5-2).

אנו מודים למרכז לביולוגיה של הסרטן ולטיפול מדויק (Cancer Biology and Precision Therapeutics Center) על אספקת המימון והתמיכה האקדמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מס (stock solution) של חומצה אתילנדיאמינטטרה-אצטית (EDTA) בריכוז 0.5 MSigma-Aldrich (או מקבילו)E7889 (או מקבילו)משמש להכנת תמיסת עבודה של EDTA בריכוז 10 mM ב-PBS לצורך ניתוק תאים
פלטות לתרבית רקמות בעלות 24 בארות (שעברו טיפול TC)Corning (או מקבילו)3524משמש לתרבית משותפת (co-culture) של מקרופאגים ותאי סרטן במהלך בדיקת פגוציטוזה
נוגדן אנטי-CD206 אנושי (ציטומטריה של זרימה)BioLegend (או מקביל לו)321122 (או מקביל לו)סמן לפנוטיפ מאקרופאג חלופי
נוגדן מונוקלונלי אנטי-CD24 אנושיThermo Fisher Scientific (או מקבילו)MA1-91384 (או מקביל לו)משמש לאופסוניזציה של תאי סרטן לצורך פגוציטוזה תלוית נוגדנים
מערכת אוטומטית לדימוי תאים חיים עם תא בקרת סביבה (לדוגמה, Lionheart FX)Agilent Technologies (או שווה ערך)מיקרוסקופ אוטומטי BioTek Lionheart FXמאפשר דימות רב-זמני (time-lapse) לטווח ארוך תחת טמפרטורה מבוקרת ו- 2 תנאים
תוכנת דימות לדימות אוטומטי של תאים חיים (למשל, Gen5)Agilent Technologies (או מקביל לו)לא רלוונטימשמש לרכישה ולניתוח של נתוני דימוי בשיטת צילום רצף (time-lapse imaging)
צנטריפוגה (רוטור עם דליים נערכים)Thermo Fisher Scientific (או מקבילו)Multifuge X4R Pro עם רוטור TX-1000 (או מקביל לו)משמש לבידוד PBMC ולשלבי שטיפת תאים
2 אינקובטור (37°C)°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (או מקבילה לו)חימום ישיר של Forma 2 אינקובטור (או מקבילו)שומר על תנאים פיזיולוגיים עבור תרביות תאים
2 אספקת גז עם ווסתAgilent Technologies (או מקבילו)לא רלוונטיציוד וחומרים 2 לבקרת סביבה עבור אינקובטור ומערכת דימות
מבחנות קוניות (15 מ"ל ו-50 מ"ל)Corning (או מקבילו)352070 (או מקבילו)משמש לשלבי בידוד, שטיפה וסבוב (צנטריפוגציה) של PBMC
מבחנות לאיסוף דם מצופות EDTA (ווקוטיינרים)BD Biosciences (או מקביל לו)367863 (או מקבילו)משמש לאיסוף דגימות דם מלא מתורמים
Ficoll-Paque PLUSCytiva (או מקבילו)17144003 (או מקבילו)תווך מדרג צפיפות לבידוד PBMCs
ציטומטר זרימה (למשל, FACSCanto II)BD Biosciences (או מקבילו)BD FACSCanto II משמש לניתוח פנוטיפי של מקרופאגים
חרוזי פיצוי (ציטומטריית זרימה)Biolegend (או מקבילו)424602משמש לבקרות פיצוי בצבע בודד
נוגדן anti-human CD11b מסומן ב-FITC (ציטומטריית זרימה)BioLegend (או מקבילו)101205 (או מקבילו)סמן המשמש לזיהוי מקרופאגים
נוגדן PE anti-human CD80 (ציטומטריה של זרימה)BioLegend (או מקבילו)375410 (או מקבילו)סמן הקשור לפנוטיפ של מקרופאג מופעל
שורה של תאי סרטן שד המבטאים GFP ‏(MDA-MB-468)ATCC (או מקבילו)HTB-132 (או מקבילו)תאים מטרה המשמשים במבחן פגוציטוזה; GFP מאפשר ויזואליזציה
תווך ImmunoCult-SF למקרופאגיםSTEMCELL Technologies (או מקביל לו)10961 (או מקבילה לו)מצע ללא סרום המשמש להבחנה של מקרופאגים
דולבקו’תוכנית מזון של איגל המודגשת (DMEM)Thermo Fisher Scientific (או מקבילה לו)12100046משמש לתרבית ולריסוספנזיה (השהיה מחדש) של תאי סרטן
נוגדן בקרה איזוטייפית (IgG)Bio X Cell (או מקבילו)BE0297 (או מקבילו)ביקורת שלילית לבדיקת פגוציטוזה תלוית נוגדנים
ליפופוליסכריד (LPS)Sigma-Aldrich (או שווה ערך)L2630 (או מקבילו)גירוי המשמש להפעלת מקרופאגים בשילוב עם IFN-γ
אינטרפרון גמא אנושי רקומביננטי (IFN-γ)STEMCELL Technologies (או מקבילו)78020 (או מקבילו)ציטוקין המשמש להפעלת מקרופאגים
גורם מעכב להיווצרות מושבות מקרופאגים אנושי רקומביננטי (M-CSF)STEMCELL Technologies (או מקבילו)78057 (או מקביל לו)גורם גדילה המשמש לדיפרנציאציה של מקרופאגים
פיפטות פסטור או פיפטות סרולוגיותJetbiofil (או מקביל לו)GSP010010 (או מקבילו)משמש לטיפול בנוזלים במהלך בידוד של PBMC ותרבית תאים
PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)2+-/מגניזיום2+-free)Thermo Fisher Scientific (או מקבילו)BP399-500 (או מקבילו)בופר המשמש לשטיפת תאים ולשלבי דילול
צלחיות פטרי (100 מ"מ, לא–(מטופלת לתרביות רקמה)Corning (או מקבילו)430591משמש להבחנה של מקרופאגים באמצעות סלקציה על בסיס היצמדות
בופר לליזת תאי דם אדומים (RBC)BioLegend (או שווה ערך)420301 (או מקבילו)משמש להסרת תאי דם אדומים במהלך בידוד PBMC
צבע קיבוע Viability 405/452Miltenyi Biotec (או מקביל לו)130-130-404 (או שווה ערך)משמש להערכת חיוניות תאים במהלך אנליזה של ציטומטריה זרימה
DAPISigma-Aldrich (או מקבילו)D9542 (או מקבילו)משמש להדרה של תאים מתים בציטומטריית זרימה

מקורות

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  3. Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).
  4. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).
  5. Lin, N. U., et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).
  6. Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).
  7. Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).
  8. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  9. Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).
  10. Majeti, R., et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 138 (2), 286-299 (2009).
  11. Barkal, A. A., et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).
  12. Wang, X., et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).
  13. Chan, S. H., et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).
  14. Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 15, 1367959 (2024).
  15. Weiskopf, K., Weissman, I. L. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).
  16. Cao, X., et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).
  17. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).
  18. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  19. Denardo, D. G., Ruffell, B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).
  20. Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. (140), e57566 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בליעה תלוית נוגדניםחלבון פלואורסצנטי ירוקתאים המבטאים CD24דימוי תאים חייםאופסוניזציה באמצעות נוגדן מונוקלונליבדיקת נקודת סיוםאימונותרפיה לסרטן
דימוי בשקיעת זמן (Time-Lapse Imaging) של פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנציה ירוק על ידי מקרופאגים בהנחיית נוגדנים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.