הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דימוי בשקיעת זמן (Time-Lapse Imaging) של פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנציה ירוק על ידי מקרופאגים בהנחיית נוגדנים

164 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת דימות תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי מקרופגים תלויי-נוגדנים, תוך שימוש במקרופגים המופקים מתאי דם פריפריים חד-גרעיים (PBMC) ובמיקרוסקופ אוטומטי.

תקציר

בליעה תאית תלוית נוגדנים (Antibody-dependent cellular phagocytosis) היא מנגנון מרכזי שבאמצעותו מקרופגים בולעים תאי סרטן שעברו אופסוניזציה על ידי נוגדנים. פרוטוקול זה מתאר שיטת דימוי של תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית בליעה של מקרופגים התלויה בנוגדנים של תאי סרטן שד משולש-שלילי המבטאים CD24 ומסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק. המקרופגים מופקים מתאי PBMC של בני אדם, מובחנים באמצעות macrophage colony–stimulating factor, ומקוטבים באמצעות interferon gamma ו-lipopolysaccharide כדי ליצור פנוטיפ פרו-דלקתי. תאי הסרטן עוברים אופסוניזציה עם נוגדן מונוקלונלי נגד CD24 לפני תרבית משותפת עם מקרופגים ביחס מוגדר של effector-to-target. אירועי הבליעה מוקלטים לאורך תקופה של 16 h באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי המצויד בבקרת סביבה לשמירה על תנאים פיזיולוגיים. ההדמיה מבוצעת באמצעות ערוצי שדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציה, מה שמאפשר זיהוי של תאי הסרטן ומעקב אחר הפנמתם על ידי המקרופגים. תמונות time-lapse מייצגות מדגימות את הבליעה הפרוגרסיבית של תאי סרטן פלואורסצנטיים לאורך זמן. כדי לאפשר הערכה כמותית, מבוצע במקביל ניסוי נקודת-סוף (endpoint assay) תחת תנאי תרבית משותפת זהים, שבו תאי סרטן שלא הופנמו מוסרים לפני ההדמיה כדי לאפשר מדידה מדויקת של אירועי הבליעה. שיטה זו מספקת גישה סטנדרטית וניתנת לשחזור להדמיה של בליעה של מקרופגים המונעת על ידי נוגדנים in vitro. חשוב לציין כי השילוב של הדמיית time-lapse עם כימות מבוסס נקודת-סוף מאפשר הערכה משלימה של הקינטיקה והעוצמה של הבליעה. פרוטוקול זה תומך בהערכה של נוגדנים טיפוליים ואימונותרפיות לסרטן המכוונות למקרופגים בסביבת in vitro מבוקרת.

מבוא

סרטן השדיים הוא הממאירות המאובחנת ביותר בקרב נשים ברחבי העולם, והוא מהווה כ-2.3 מיליון מקרים חדשים מדי שנה1. המחלה היא הטרוגנית מבחינה קלינית ומסווגת ללפחות ארבעה תת-סוגים מולקולריים עיקריים, בהתבס על מצבם של קולטני ההורמונים – קולטן האסטרוגן (ER) וקולטן הפרוגסטרון (PR) – והבעת האונקוגן של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי האנושי 2 (HER2)2. גידולי Luminal A מביעים ER ו/או PR ללא ביטוי יתר של HER2 (ER/PR+ ו-HER2−); גידולי luminal B מביעים בו-זמנית ER/PR ו-HER2 (ER/PR+ ו-HER2+); גידולי HER2+ מאופיינים בביטוי גבוה של HER2 ללא קשר למצב קולטני ההורמונים; וסרטן שדיים טריפל-נגטיבי (TNBC) חסר ביטוי של כל שלושת הסמנים (ER−, PR−, ו-HER2−)2,3. בין תתי-סוגים אלה, TNBC מייצג את הצורה המאתגרת ביותר מבחינה קלינית ומהווה כ-15%–20% מכלל מקרי סרטן השדיים. מטופלים עם TNBC מראים את מהלך המחלה האגרסיבי ביותר, עם הפרוגנוזה הגרועה ביותר והישרדות כוללת קצרה ביותר ל-5 שנים, בשל תגובות דלות לכימותרפיה קונבנציונלית והיעדר טיפולים ממוקדים יעילים3,4. יתרה מכך, TNBC מראה נטייה גבוהה משמעותית למטסטזות ויסצראליות, ובמיוחד לריאות בתוך 5 שנים מהאבחנה, ולמטופלים עם TNBC מתקדם או גרורתי (mTNBC) יש הישרדות חציונית שנדירה שחורגת מ-2 שנים5,6. נתונים סטטיסטיים אלו מדגישים את הצורך הקריטי והבלתי מסופק באסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור TNBC.

מיקרו-סביבת הגידול (TME) ממלאת תפקיד מרכזי בהתקדמות סרטן השד ובחמיקה ממערכת החיסון. מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) נמנים עם תאי החיסון השכיחים ביותר ב-TME, ולאחרונה הם זוהו כמתווכים קריטיים של חסינות אנטי-גידולית מולדת7,8,9. בעוד שבעבר חולקו TAMs למצבים פרו-דלקתיים של "M1" ומצבים פרו-גידוליים של "M2", מודל בינארי זה אינו משקף את ההיקף האמיתי של ההטרוגניות של המקרופאגים. תחת זאת, TAMs תופסים ספקטרום תפקודי דינמי, המתפתח בתגובה לאיתותים ביוכימיים מגוונים בתוך ה-TME. בתוך נוף מורכב זה, תאי סרטן מכניעים באופן פעיל את פעילות המקרופאגים באמצעות אסטרטגיות שונות של חמיקה חיסונית, ובמיוחד באמצעות ביטוי יתר של אותות "אל תאכל אותי". ציר ה-CD47/SIRPα היה נקודת הבקרה (checkpoint) החיסונית המולדת הראשונה שזוהתה בהקשר זה6,10, ולאחרונה, CD24 התגלה כאות אנטי-פגוציטי חדש ועוצמתי1,12. CD24 הוא גליקופרוטאין קטן מסוג מוצין, בעל גליקוזילציה גבוהה, המעוגן לממברנת התא באמצעות קישור glycosylphosphatidylinositol13. הוא מבוטא בשוורות שונות של תאי חיסון בתנאים פיזיולוגיים, אך מבוטא לעיתים קרובות בביטוי יתר בגידוליים מוצקים, כולל סרטני שד, שחלה, לבלב ומעי גס14. על תאי גידול, CD24 נקשר לקולטן המעכב sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) המבוטא על מקרופאגים. אינטראקציה זו מפעילה זרחון של דומיינים מסוג immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif בזנב הציטופלזמי של Siglec-10, ובכך מפעילה את הפוספטאזים SHP-1 ו-SHP-2 המדכאים את איתות הפגוציטוזה במורד המסלול11. הוכח כי חסימה של האינטראקציה בין CD24 ל-Siglec-10 באמצעות נוגדן מונוקלונלי מגבירה באופן משמעותי את הפגוציטוזה של גידולי אדם המבטאים CD24 על ידי מקרופאגים. מחקרנו האחרון הראה גם כי נוק-אאוט (knockout) של CD24a בתאי סרטן השד מגביר את רגישותם לפגוציטוזה של מקרופאגים במודל עכברי של סרטן שד טריפל-נגטיב9.

פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP) היא מנגנון מרכזי שבו נוגדנים מכוונים מקפגים לבצע פגוציטוזה של תאי גידול15,16. לאחר קישור לאנטיגנים המובעים בגידול, אזור ה-Fc של הנוגדן מקשר עם קולטני Fcγ (FcγRs) על פני המקפגים, ובכך מעורר רצפי אותיות תוך-תאיים שהשיא שלהם הוא ארגון מחדש של השלד התאי, יצירת גביע הפגוציטוזה ובליעה של תא המטרה17.

במחקר זה, פיתחנו ותיקפנו פרוטוקול דימוי תאי-חי (live-cell imaging) בשיטת time-lapse למדידת פגוציטוזה של תאי סרטן השד על ידי מקרופאגים המונחית על ידי נוגדנים. השיטה משתמשת במקרופאגים המופקים מתאי דם פריפריים מונונוקלאריים (PBMC) מתורמים אנושיים בריאים, אשר עברו דיפרנציאציה בעזרת גורם מעורר מושבות של מקרופאגים (M-CSF) ולאחר מכן עוברו גירוי באמצעות ליפופוליסכריד (LPS) ואינטרפרון גמא (IFN-γ). ניתוח ציטומטריית זרימה אישר עלייה בביטוי של CD80 בתוך אוכלוסיית CD11b⁺ לאחר הגירוי (איור 1), דבר התומך בפנוטיפ המופעל קלאסית. מצב הפעלה זה מעניק יכולת פגוציטית חזקה המתווכת על ידי נוגדנים, מה שהופך אותו למתאים להערכת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP). תאי סרטן השד חיוביים ל-CD24 המסומנים ב-GFP משמשים כתאי מטרה ועוברים אופסוניזציה עם נוגדן חד-שבטי תרפויטי נגד CD24 לפני השקיעה המשותפת (co-culture). אירועי פגוציטוזה מוקלטים לאורך תקופה של 16 שעות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי תחת תנאים סביבתיים מבוקרים. כדי לאפשר הערכה כמותית במקביל לוויזואליזציה דינמית, מבוצע ניסוי נקודת-סוף (endpoint assay) נפרד תחת תנאי שקיעה משותפת זהים, המאפשר מדידה קפדנית של הפגוציטוזה לאחר הסרת תאי מטרה שלא נבלעו. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה סטנדרטית, הניתנת לשחזור ומספקת מידע חזותי להערכת ADCP המתווכת על ידי נוגדן anti-CD24. באופן חשוב, השילוב של דימוי time-lapse עם אסטרטגיית כימות משלימה מבוססת נקודת-סוף מאפשר הערכה סימולטנית של קינטיקת הפגוציטוזה והיקפה. ניתן להתאים את השיטה לחקירת מטרות אימונותרפויטיות אחרות המכוונות למקרופאגים. פרוטוקול זה מתאים ביותר להערכת ADCP המתווכת על ידי נוגדנים חד-שבטיים תרפויטיים נגד אנטיגנים שטח על תאי סרטן. הוא מתאים לסריקה השוואית של נוגדנים מועמדים, אפיון תגובת-מינון ומחקרים מכניסטיים של קשרי Fc–FcγR, כולל השפעות של חסימת אותות "אל תאכל אותי" (למשל, CD47–SIRPα). מכיוון שהבדיקה משתמשת במקרופאגים אנושיים ראשוניים, היא מתאימה גם למחקרים תרגומיים הדורשים הערכה של שונות בין תורמים לפני פיתוח קליני.

תרשים בידוד תאים מונוקליאריים מדם פריפרי (PBMC) עם ציטומטריה זרימתית לניתוח מקרופאגים.
איור 1הפקה ותיקוף באמצעות ציטומטריה של זרימה של מקפגים שעברו סטימולציה באמצעות IFN-γ/LPS, שהופקו מתאים חד-גרעיים של דם פריפרי. פאנל עליון: תאי מונונוקלאים של דם פריפרי (PBMCs) מבודדים מתורמים בריאים באמצעות צנטריפוגת מדרג צפיפות עם תמיסת Ficoll ב-40 × g למשך 30 דקות ב- 20°C, כאשר כל הריאגנטים הגיעו לשיווי משקל טמפרטורי ב- 20°C ± 2°CPBMCs מבודדים מתורגשים במצע ImmunoCult-SF בתוספת של 10 ng/mL של גורם מעכב התפתחות מושבות מקרופאגים (M-CSF) למשך 7 ימים כדי להניע דיפרנציאציה של מקרופאגים (ימים 0–7), עם תוספת מצע ביום 5. ביום 8, מקרופאגים מובחנים מעוררים באמצעות 10 ng/mL IFN-γ ו- 1 µg/mL LPS למשך 48 שעות (ימים 8–10). לאחר מכן התאים עוברים ניתוח בציטומטריה זרימה. פאנל תחתון: ניתוח בציטומטריה זרימה של מקרופאגים. התאים נצבעו עם פאנל שטח המורכב מ-CD11b-FITC, CD80-PE ו-CD206-PerCP-Cy5.5, ולאחריו הוסף DAPI לפני הרכישה לצורך הדרת תאים מתים. אסטרטגיית גייטינג: ראשית בוצע גייטינג לתאים חיים (DAPI⁻), ולאחר מכן זיהוי של CD1b⁺ באמצעות תרשים של CD1b-FITC לעומת FSC-A כדי לאשר את זהותם כמקרופאגים. אירועי CD1b⁺ חיים נותחו לאחר מכן בתרשים נקודות (dot plot) של CD80 לעומת CD206 כדי לאשר את אוכלוסיית CD80⁺CD206⁻ שהושרה על ידי גרייה של IFN-γ/LPS. ימין: תרשים נקודות מייצג של CD1b-FITC לעומת FSC-A המראה כי 9.8% מהתאים שעברו גייטינג היו CD1b⁺, מה שמאשר את זהותם כמקרופאגים. שמאל: מרבית תאי ה-CD1b⁺ נכנסו לגייט של CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95.2%), מה שמעיד על הפנוטיפ הפרו-דלקתי הצפוי תחת תנאי הגרייה שיושמו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.

על המשתמשים להביא בחשבון מספר מגבלות בעת יישום טכניקה זו. ראשית, שונות בין תורמים במקרופגים המופקים מ-PBMC עלולה להוביל לשונות משמעותית בתוצרי הפגוציטוזה, ולכן אנו ממליצים להשתמש במספר תורמים (n ≥ 3) ולדווח על נתוני תורמים בודדים לצד התוצאות המאוחדות. שנית, פורמט השיתוף-תרבית (co-culture) הדו-מדי אינו משחזר את הסביבה המיקרוסקופית של הגידול, ויש לתקף את הממצאים במודלים תלת-ממדיים או במודלים in vivo לפני הסקת מסקנות קליניות. שלישית, חלון ההדמיה של 16 שעות לוכד אירועי פגוציטוזה מוקדמים אך אינו משקף תהליכים ארוכי טווח יותר, כגון הצגת אנטיגן או הפעלה חיסונית משנית. לפיכך, השימוש המשולב בהדמיה בזמן אמת ובכימות בנקודת הסיום מספק מסגרת משלימה המשפרת הן את יכולת הפרשנות והן את השחזוריות של מדידות ADCP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כולל שימוש במקרופאגים ראשוניים שהופקו מדגימות דם של תורמים בריאים. איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת ההגנה על נבדקים (IRB) של אוניברסיטת סין לרפואה (China Medical University).

1. הכנת מקרופאגים המופקים מ-PBMC

הערה: בצע את כל הפרוצדורות הכוללות דם אנושי תחת אישור IRB מוסדי (למשל, CMUH IRB). השג הסכמה מדעת מתורמים בריאים לפני איסוף הדם.

אזהרה: יש לטפל בכל מוצרי דם אנושיים תחת תנאי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (Biosafety Level 2) תוך שימוש באמצעי זהירות אוניברסליים.

  1. איסוף דם
    1. אסוף דם מלא מתורם בריא למבחנות vacutainer מצופות ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) בנפח 10 mL.
  2. דילול דם
    1. דלל את הדם המלא ביחס של 1:1 עם תמיסת phosphate-buffered saline (PBS; נטולת Ca2⁺-/Mg2⁺-) קרה (למשל, 10 mL דם + 10 mL PBS).
    2. ערבב על ידי הפיכת המבחנה שלוש עד חמש פעמים.
      הערה: שמור את ה-PBS על קרח לפני השימוש. טמפרטורה נמוכה מסייעת בשמירה על חיוניות התאים במהלך העיבוד.
  3. שכבה של מדרג צפיפות
    1. שכב בזהירות את הדם המדולל מעל Ficoll–Paque PLUS ביחס נפחים של 2:1 (v/v) במבחנה קונית (למשל, 8 mL דם מעל 4 mL Ficoll במבחנה של 15 mL, או 30 mL מעל 15 mL במבחנה של 50 mL).
    2. הבא גם את הדם המדולל וגם את ה-Ficoll–Paque PLUS לטמפרטורה של 20°C ± 2°C לפני השכבה.
    3. הוצא את ה-Ficoll–Paque PLUS מאחסון בטמפרטורה של 4°C לפחות 30 דקות לפני השימוש, או חמם לזמן קצר באמבט מים של 20°C ± 2°C.
    4. אין להשתמש בריאגנטים קרים, מכיוון שצפיפות ה-Ficoll מכויילת ל-20°C ± 2°C, וסטיות יעכלו את יעילות ההפרדה ואת תנובת ה-PBMC.
      הערה: הטה את המבחנה בזווית של 45° וטפטף את הדם לאט לאורך הדופן כדי לשמור על ממשק חד. אין להפריע לשכבת ה-Ficoll.
  4. צנטריפוגה
    1. סב בצנטריפוגה ב-40 × g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 20°C ללא בלימה (איור 1).
      הערה: בלימה תשבש את מדרג הצפיפות ותפחית את תנובת ה-PBMC.
  5. איסוף PBMC
    1. שאב בזהירות רק את שכבת ה-buffy coat (הממשק הלבנבן בין שכבת הפלזמה לשכבת ה-Ficoll), ללא הפרעה לפלזמה שמעל או לשכבת ה-Ficoll שמתחת, באמצעות פיפט סרולוגי.
    2. העבר את השכבה שנאספה למבחנה קונית חדשה של 50 mL.
  6. שטיפת PBMC
    1. הוסף PBS עד להגעה לנפח כולל של 25 mL במבחנה קונית של 50 mL.
    2. השתמש במבחנה של 50 mL כדי להבטיח צנטריפוגה ואיזון תקינים.
    3. סב בצנטריפוגה ב-30 × g למשך 10 דקות.
  7. ליזיס של RBC
    1. שפוך את הנוזל העליון.
    2. שחזר את המשקע ב-5 mL של באפר ליזיס לתאי דם אדומים (RBC lysis buffer) על ידי פיפטור עדין מעלה ומטה עם פיפט סרולוגי, עד שהמשקע מתפזר לחלוטין ולא נותרים גושים נראים לעין.
    3. דגרי בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      אזהרה: פיזור מלא נדרש כדי להבטיח ליזיס אחיד; עם זאת, הימנע מפיפטור חזק או מערבב (vortex), העלולים לפגוע ב-PBMCs. אין לעבור 5 דקות של דגירה עם באפר ליזיס RBC, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בחיוניות ה-PBMC.
  8. שקיעת PBMC
    1. סב בצנטריפוגה ב-50 × g למשך 5 דקות כדי לשקיע את ה-PBMCs ולהסיר את שאריות ה-RBC הליטיים.
  9. שחזור סופי
    1. שפוך את הנוזל העליון.
    2. שחזר את המשקע ב-5 mL של מצע מקרופאגים ImmunoCult-SF.
      הערה: בתנאים סטנדרטיים, 10 mL של דם מלא מניבים בדרך כלל 1.5–2.0 × 107 PBMCs.

2. דיפרנציאציה של מקרופגים (ימים 0–7)

הערה: השתמשו בצלחות פטרי שלא עברו טיפול לתרביות רקמה (non-TC-treated) כדי לבחור מקרופאגים מובחנים המופקים ממונוציטים על ידי היצמדות. לימפוציטים שאינם נצמדים יישטפו במהלך התרבית העוקבת.

  1. יום 0: זריעת תאים
    1. בצעו ספירת תאים וזרעו 1 × 107 PBMCs לתוך צלחת פטרי 10 cm שאינה מטופלת TC.
    2. הביאו את הנפח הכולל ל-10 mL באמצעות מצע גידול למקרופאגים מסוג ImmunoCult-SF, מועשיר ב-100 ng/mL M-CSF (מוכן על ידי הוספת מלאי M-CSF ישירות למצע המלא רגע לפני השימוש וערבוב על ידי היפוך עדין).
      הערה: ניתן להתאים את הפרוטוקול באופן פרופורציונלי כדי להתאימו לשינויים ביבול ה-PBMC של התורם, תוך שימוש בצפיפות זריעה המתחילה מ-1 × 106 תאים/mL כבסיס.
  2. דגירה ומעקב
    1. דגרו ב-37°C עם 5% CO₂ באינקובטור לח.
    2. עקבו מדי יום אחר היווצרותם של אגרגטים צפים של מונוציטים והופעתם של תאים דבקים.
      הערה: גודלם של המונוציטים יעלה בהדרגה והם יצרו אגרגטים ככל שהדיפרנציאציה תתקדם. חלק מהמונוציטים יתחילו להיקשר לצלחת. בשלב זה אין צורך בהתערבות.
  3. יום 5: העשרת המצע
    1. הוסיפו בעדינות 5 mL של מצע גידול טרי למקרופאגים מסוג ImmunoCult-SF, מועשיר ב-10 ng/mL M-CSF, לצלחת, תוך הקפדה שלא להפריע למקרופאגים הדבקים.
    2. המשיכו בתרבית למשך יומיים נוספים (עד יום 7).
      זהירות: הוסיפו מצע טרי בעדינות לאורך דופן הצלחת כדי למנוע הפרעה למקרופאגים הדבקים, שכן שיבוש מכני עלול להשפיע על יעילות הדיפרנציאציה ועל יבול התאים.
      הערה: הימנעו מהחלפת המצע כדי לשמר גורמים אוטוקריניים/פאראקריניים התומכים בדיפרנציאציה של מקרופאגים.
  4. יום 7: הערכה מורפולוגית
    1. בחנו את יעילות הדיפרנציאציה של המקרופאגים תחת מיקרוסקופ הפוך.
    2. תאים דבקים מראים מורפולוגיה אופיינית למקרופאגים: גדולים, שטוחים ובעלי צורה לא סדירה, עם פסאודופודיה (רגליים תמיכות) גלויות.
    3. ביום 7, מקרופאגים בעלי דיפרנציאציה טובה אמורים להיות גלויים.
      זהירות: הערכה מורפולוגית ביום 7 מהווה תנאי מוקדם קריטי לאימות בציטומטריית זרימה בהמשך. מקרופאגים בעלי דיפרנציאציה טובה אמורים להיות גלויים בבירור תחת המיקרוסקופ, ושיעור גבוה יותר של תאים דבקים בעלי מורפולוגיה של מקרופאגים משקף יעילות דיפרנציאציה גבוהה יותר (קונפלואנס של כ-70% של מקרופאגים דבקים בעלי מורפולוגיה אופיינית נחשבת כמעידה על דיפרנציאציה מוצלחת). תרביות המראות הידבקות דלילה, תאים עגולים בעיקר, או דיפרנציאציה מורפולוגית דלה באופן כללי, אינן צפויות להניב תוצאות ציטומטריית זרימה אמינות ואין להמשיך איתן לשלבי הגירוי והצביעה.

3. קיטוב מקרופאגים (ימים 8–10)

  1. איסוף והבהרה של מצע מותנה
    1. ביום 8, שאבו בזהירות 15 mL של מצע מתוך צלחת התרבית מבלי להפריע למקרופאגים הדבקים והעבירו אותו לפרועת קונית סטרילית של 50 mL.
    2. סובבו במרכזית את המצע שנאסף ב-40 × g למשך 5 min כדי לשקע שאריות תאים.
    3. שמרו את העילאי המובהר לשלב הבא.
  2. סטימולציה של interferon gamma (IFN-γ) ו-lipopolysaccharide (LPS)
    1. העבירו את 15 mL של העילאי המובהר לפרועת סטרילית חדשה והוסיפו 10 ng/mL IFN-γ ו-1 µg/mL LPS.
    2. ערבבו היטב על ידי פיפטאציה עדינה למעלה ולמטה (5–10 פעמים) כדי להבטיח התפלגות אחידה של הציטוקינים מבלי להחדיר בועות.
    3. החזירו את מלוא 15 mL של המצע המועשר בציטוקינים לצלחת התרבית המקורית, תוך פיפטאציה עדינה לאורך הדופן הפנימית כדי למנוע הפרעה למקרופאגים הדבקים.
    4. דגרו ב-37°C עם 5% CO₂ למשך 48 h (מיום 8 עד יום 10).
      הערה: השתמשו במצע מותנה (ישן) כדי לשמר גורמים אוטוקריניים/פאראקריניים. שילוב זה של IFN-γ ו-LPS משמש להקטבת מקרופאגים לפנוטיפ פרו-דלקתי. תחת תנאי הסטימולציה של IFN-γ (100 ng/mL) ו-LPS (1 µg/mL) המשמשים בפרוטוקול זה, המקרופאגים מראים שינויים מורפולוגיים אופייניים, כולל lamellipodia מוארכים התואמים למצב פרו-דלקתי מופעל, כמו גם ביטוי של CD11b ו-CD80.
      זהירות: טפלו ב-LPS בהתאם לנהלי הבטיחות במעבדה, שכן זהו אנדוטוקסין ביו-אקטיבי העלול לגרום לתגובות דלקתיות בעת חשיפה.

4. אישור סמני פנוטיפ דלקתי של מקרופאגים שעברו סטימולציה של IFN-γ ו-LPS באמצעות ציטומטריה של זרימה

  1. קציר תאים
    1. קצור תת-קבוצה של מקרופאגים מוקטבים ביום 10 לצורך פנוטיפואידינג (phenotyping).
    2. הוסף 10 mM EDTA ב-PBS והדגר למשך 10–15 דקות ב-37°C.
    3. נתק את התאים באמצעות פיפטינג עדין.
      הערה: הארך את ההדגרה ב-EDTA ב-30 דקות נוספות ב-37°C אם התאים נותרים דבוקים, ולאחר מכן חזור על הפיפטינג העדין. הימנע מפיפטינג נמרץ או מגירוד מכני כדי לשמור על חיוניות התאים ועל שלמות הסמני השטח.
  2. הכנה לצביעה בנוגדנים
    1. צבע את התאים באמצעות נוגדנים המשורשריים לפלואורוכרום נגד CD11b (סמן שושלת פאן-מקרופאגי), CD80 (סמן דלקתי) ו-CD206 (סמן אנטי-דלקתי המשמש כסמן החרגה שלילי לזיהוי פנוטיפ דלקתי).
  3. הליך הצביעה
    1. העבר 5 × 105 מקרופאגים מנותקים למבחנת ציטומטריה זרימה המכילה 10 µL של PBS קר.
    2. הוסף נוגדני CD1b-FITC, CD80-PE ו-CD206-PerCP-Cy5.5 לריכוז סופי של 1 µg/mL לכל אחד.
    3. ערב את תסמיך התאים באמצעות פיפטינג עדין.
    4. הדגר את הדגימות על קרח למשך שעה אחת, תוך הגנה מהאור.
    5. צנטריפוג את הדגימות ב-300 × g למשך דקה אחת ב-4°C.
    6. שאב את העלייה בזהירות.
    7. הוסף 0.5 mL של PBS קר לשטיפת משקע התאים.
    8. צנטריפוג את הדגימות ב-30 × g למשך דקה אחת ב-4°C.
    9. השלך את העלייה.
    10. שחזר את משקע התאים ב-20 µL של PBS קר.
    11. הוסף DAPI לריכוז סופי של 1 µg/mL.
      הערה: כלול בקרות איזוטיפ מתאימות וצבע חיוניות (למשל, DAPI או Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. ניתוח בציטומטריה זרימה
    1. רכוש נתונים מהדגימות הצבועות באמצעות ציטומטר זרימה.
    2. אשר את הביטוי של CD1b ו-CD80 באוכלוסיית המקרופאגים.
    3. המשך לבדיקת הפגוציטוזה רק לאחר אישור ביטוי סמנים העולה בקנה אחד עם פנוטיפ דלקתי.
  5. רכישת נתונים והגדרות בציטומטריה זרימה
    1. הגדרת המכשיר
      1. הגדר את ציטומטר הזרימה באמצעות הערוצים הבאים: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD1b), PE (CD80), ו-PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. הגדר את פרמטר הרכישה לאיסוף של 10,0 אירועים לדגימה בתוך השער האב המוגדר.
    2. כיול סף (Threshold) והגבר (Gain)
      1. פתח ארבעה תרשימי נקודות (dot plots) המציגים את ה-FSC על ציר ה-x וערוץ פלואורופור אחד על ציר ה-y.
      2. הכן תאים הצבועים בנוגדני בקרת איזוטיפ תואמים לכל פלואורופור.
      3. רכוש נתונים מדגימות בקרת האיזוטיפ.
      4. כוונן את ההגבר לכל ערוץ כדי למקם את אוכלוסיית בקרת האיזוטיפ מתחת ל-101 בסולם לוגריתמי.
      5. השתמש בסף זה כדי להגדיר את רמות אות הרקע.
        הערה: השתמש בטווח סולם לוגריתמי של 101 עד 101·5 כדי לקבוע הפרדה מהימנה בין הרקע לאות הספציפי.
    3. פיצוי (Compensation)
      1. הוסף טיפה אחת של חרוזי פיצוי למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL.
      2. הוסף את הנוגדן המשורשר לפלואורופור התואם לריכוז סופי של 1 µg/mL.
      3. הדגר למשך 30 דקות על קרח, תוך הגנה מהאור.
      4. צנטריפוג ב-40 × g למשך דקה אחת.
      5. השלך את העלייה.
      6. שחזר את החרוזים ב-20 µL של PBS קר.
      7. רכוש נתונים מבקרי צבע יחיד.
      8. בצע פיצוי ספקטרלי כדי לתקן דליפת צבע (spillover) של הפלואורופורים.
    4. אסטרטגיית שערים (Gating strategy)
      1. בחירת תאים חיים
        1. הצג את Pacific Blue/V450 (DAPI) על ציר ה-y ואת ה-FSC על ציר ה-x.
        2. הגדר שער לאירועים שליליים ל-DAPI (מתחת ל-101) כדי לבחור תאים חיים.
      2. זיהוי מקרופאגים
        1. הגדר את אוכלוסיית התאים החיים כשער האב.
        2. הצג את FITC (CD1b) על ציר ה-y ואת ה-FSC על ציר ה-x.
        3. הגדר שער לאירועים CD1b⁺ (מעל 101).
      3. זיהוי פנוטיפ דלקתי
        1. הגדר את אוכלוסיית ה-CD1b⁺ כשער האב.
        2. הצג את PE (CD80) על ציר ה-y ואת PerCP-Cy5.5 (CD206) על ציר ה-x.
        3. בצע חלוקה לרבעים (quadrant gating) ב-101.5 בשני הצירים.
        4. זהה תאים CD80⁺CD206⁻ ברבע העליון-שמאלי (Q1).
  6. קריטריוני קבלה
    1. אשר כי ≥90% מהתאים בתוך שער האב של CD1b⁺ הם CD80⁺CD206⁻.
    2. המשך לבדיקת הפגוציטוזה רק כאשר סף זה הושג.
    3. חזור על בידוד ה-PBMC, דיפרנציאציה באמצעות M-CSF וסטימולציה של IFN-γ/LPS אם הדגימות אינן עומדות בקריטריון זה.

5. בדיקת בליעה תלויה בנוגדנים (Antibody-Dependent Phagocytosis Assay)

הערה: יש לוודא ביטוי יציב של GFP בתאי הסרטן לפני הגדרת הבדיקה. יש לאשר ביטוי של CD24 בתאי המטרה לפני הבדיקה. לביצועים מיטביים, יש להשתמש בתאי סרטן עם 50%–10% חיוביות ל-CD24. תאי MDA-MB-468 ששימשו בפרוטוקול זה מראים 10% חיוביות ל-CD24.

  1. זריעת מקרופאגים
    1. זרוע מקרופאגים שעברו סטימולציה של IFN-γ ו-LPS, כפי שתוּקף בשלב 4, בריכוז של 2 × 105 תאים לבאר בלוח תרבית רקמה בעל 24 בארות.
    2. דגרי את הלוח בטמפרטורה של 37°C בתנאים סטטיים עם 5% CO₂ למשך 12–16 שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים (איור 2A).
      הערה: ודא היצמדות חזקה של המקרופאגים לפני ההמשך. מקרופאגים שאינם היצמדים היטב עלולים להשתחרר במהלך ההדמיה ולהטות את התוצאות.
  2. הכנת תאי סרטן
    1. גדל תאי סרטן שד CD24-positive המסומנים ב-GFP (MDA-MB-468) עד להגעה ל-70%–80% התמזגות (confluency).
    2. שאב את מצע התרבית.
    3. שטוף את שכבת התאים החד-שכבתיים פעם אחת עם PBS.
  3. ניתוק תאי הסרטן
    1. הוסף 10 mM EDTA ב-PBS לכלי התרבית.
    2. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 5–10 דקות.
    3. נתק את התאים באמצעות פיפוט עדין כדי להשיג שחרור מלא של התאים.
      הערה: הימנע משימוש בטריפסין לניתוק התאים. עיכול אנזימטי עלול להסיר את CD24 מפני השטח של התא ולפגוע בקישור הנוגדנים.
  4. איסוף וספירה של תאי הסרטן
    1. אסוף את התאים המנותקים לתוך מבחנה לצנטריפוגה.
    2. צנטריפוג את התאים ב-30 × g למשך 5 דקות.
    3. שפוך את הנוזל העליון (supernatant).
    4. שחזר את משקע התאים במצע RPMI מלא.
    5. ספור את התאים החיים.
  5. אופסוניזציה של תאי הסרטן באמצעות נוגדנים
    1. שחזר את תאי הסרטן בצפיפות של 2 × 105 תאים/מ"ל ב-0.5 מ"ל של מצע RPMI מלא.
    2. הוסף נוגדן מונוקלונלי anti-CD24 עד לריכוז סופי של 1 µg/mL.
    3. ערב את ת сусפנסיית התאים באמצעות פיפוט עדין כדי להבטיח פיזור אחיד של הנוגדנים.
    4. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות בתנאים סטטיים.
      הערה: הוסף בקרת IgG תואמת-איזוטייפ באותו ריכוז כבקרת שלילה לבליעה תלויית נוגדנים (antibody-dependent phagocytosis).
  6. הכנה לתרבית משותפת (co-culture)
    1. אל תשטוף את התאים לאחר האופסוניזציה.
    2. עבור ישירות לתרבית המשותפת כדי לשמור על ציפוי הנוגדנים על פני השטח של התא.
  7. הקמת התרבית המשותפת
    1. הוסף 1 × 105 תאי סרטן שד מסומני-GFP שעברו אופסוניזציה בנוגדנים לכל באר המכילה מקרופאגים.
    2. שמור על יחס של תאי אפקטור למטרה (effector-to-target ratio) של 2:1.
      הערה: התאם את יחס האפקטור-מטרה בהתאם לתכנון הניסוי. השתמש ביחסי מקרופאגים-לתאי סרטן גבוהים יותר מהיחס המתואר של 2:1 (למשל, 3:1 או 5:1) כדי להגביר את תדירות המגע בין התאים ולשפר את הגילוי של אירועי בליעה (phagocytic events).

דיאגרמת Time-lapse של אינטראקציה בין מקפאג' לבין תא מסומן ב-GFP בניסוי הדמיה.
איור 2דימוי במרווחי זמן (Time-lapse) של פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים. (A) סכמה כללית של מערכת השיתוף-תרביות (co-culture) ומערך הדמיון במסך זמן (time-lapse). פרמטרי הדמיון כללו מרווח של 10 דקות לאורך זמן רכישה כולל של 16 שעות (97 פריימים), תוך שימוש בעדשה פי 10 עם ערוצי ניגודיות מופע (phase contrast) ו-GFP. (B) תמונות מייצגות של מסך זמן מ-1 עד 16 שעות המראות אירועי פגוציטוזה המאופיינים בהפנמה של תאי סרטן חיוביים ל-GFP על ידי מקרופאגים לאורך זמן. עיגולים מקווקווים בצהוב מדגישים אירועי פגוציטוזה מייצגים. בערוץ ניגודיות המופע, תאי סרטן שנבלעו מופיעים כמבנים תו-תאיים בהירים (phase-bright) בתוך הציטופלזמה של המקרופאג (חצים לבנים). בערוץ ה-GFP, פלואורסצנציה הממוקמת בתוך המקרופאגים מאשרת את ההפנמה. (C) תצוגות מוגדלות של אירועי פגוציטוזה מייצגים בשעות 0, 1, 4 ו-16, הממחישות את התהליך הרצפי של בליעה המתווכת מקרופאגים של תאי סרטן המסומנים ב-GFP. רצף התמונות נבחר כמייצג על בסיס ויזואליזציה ברורה של אירועי פגוציטוזה המתווכי מקרופאגים. חצים לבנים מצביעים על מקרופאגים המקיימים אינטראקציה עם תאי מטרה ומפנימים אותם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

6. דימוי במרווחי זמן (מערכת אוטומטית לדימוי תאים חיים)

הערה: הגדירו את פרוטוקול הדימוג באמצעות מערכת דימוג אוטומטית של תאים חיים מסוג Lionheart ותוכנת דימוג אוטומטית של תאים חיים מסוג Gen5 לפני ביצוע הבדיקה. עברו הכשרה מתאימה לפני הפעלת מערכת הדימוג כדי להבטיח הגדרה מדויקת, ביצועים אופטימליים ושימוש בטוח.

  1. הכנת המכשיר
    1. הפעילו את מערכת ההדמיה, את מודול הבקרה הסביבתית ואת אספקת גז ה-CO₂ לפחות שעה אחת לפני ההדמיה.
    2. פתחו את פאנל הבקרה הסביבתית (Environment Control) בתוכנת ההדמיה האוטומטית של תאים חיים.
    3. הגדירו את הטמפרטורה ל-37°C ואת ה-CO₂ ל-5%.
    4. וודאו שטמפרטורת התא מתייצבת בטווח של ± 0.2°C ורמת ה-CO₂ ב-5.0% ± 0.1% לפני טעינת הפלטה.
  2. הגדרת הפלטה
    1. הניחו את הפלטה בעלת 24 הבארים בתא ההדמיה של מערכת ההדמיה.
  3. הגדרה ראשונית
    1. פתחו את מנהל המשימות (Task Manager) של תוכנת ההדמיה האוטומטית של תאים חיים.
    2. בחרו ב-[Imager manual mode].
    3. לחצו על [Capture now] כדי לאתחל את פרמטרי ההדמיה.
    4. בחרו בעדשה המגדילה 10×.
    5. בחרו ב-microplate כהגדרת המסנן.
    6. בחרו פלטה בעלת 24 בארים מספריית הפלטות של תוכנת ההדמיה האוטומטית של תאים חיים.
  4. מיקוד והגדרת תמונה
    1. בחרו בערוץ ניגוד מופע (Phase Contrast).
    2. בחרו באר מייצגת (למשל, A1).
    3. הפעילו מיקוד אוטומטי לפני רכישת תצלומי time-lapse.
    4. צלמו תמונה באמצעות סמל המצלמה.
    5. וודאו את מורפולוגיית התאים ואת איכות המיקוד.
    6. נווטו ל-[Process/Analyze].
    7. בחרו ב-[Create experiment from an image set] כדי להגדיר את הניסוי.
  5. פרמטרי רכישת time-lapse
    1. פתחו את פאנל הגדרות ה-[Procedure].
    2. הגדירו את הטמפרטורה ל-37°C ואת ה-CO₂ ל-5%.
    3. תחת [Start Kinetic], הגדירו זמן הרצה ל-16:00:0.
    4. הגדירו מרווח הדמיה ל-0:10:0.
    5. הגדירו סך קריאות ל-97.
    6. השתמשו במרווח הדמיה של 10–15 דקות כדי לאזן בין הרזולוציה הטמפורלית לבין רעילות פוטוית תוך לכידה של אירועי פגוציטוזה מוקדמים.
  6. הגדרת ערוצי הדמיה
    1. הגדירו את ערוץ 1 לניגוד מופע (Phase Contrast).
    2. הגדירו את ערוץ 2 ל-GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. בחרו בעדשה המגדילה 10× לשדה ראייה ורזולוציה אופטימליים.
    4. הגדירו את התאורה, זמן האינטגרציה וההגבר (gain) ל-[Auto], או כוון אותם ידנית.
    5. השתמשו בזמן חשיפה טיפוסי ל-GFP של 10–300 ms כדי למנוע רוויית אות.
    6. החילו הגדרות הדמיה זהות על כל הבארים.
  7. הגדרת מיקומי הדמיה
    1. פתחו את תפריט [Define beacons].
    2. בטלו את רכישת Z-stack.
    3. בטלו את רכישת המונטאז' (montage).
    4. בצעו הדמיה במישור מוקד יחיד.
    5. הגדירו מיקומי הדמיה ידנית על ידי בחירת אזורים מייצגים שאינם חופפים בתוך כל באר באמצעות סמל המיקרוסקופ.
    6. שמרו על מיקומי הדמיה זהים בכל נקודות הזמן.
    7. בחרו לפחות 4–6 שדות ראייה לכל באר.
  8. רכישת time-lapse
    1. לחצו על [Play] כדי להתחיל הדמיית time-lapse אוטומטית.
  9. ייצוא נתונים וויזואליזציה
    1. פתחו את קובץ הניסוי השמור לאחר הרכישה.
    2. בחרו את מיקומי ההדמיה.
    3. ייצאו נתוני time-lapse בפורמט MP4.
    4. פתחו את [Process Tool].
    5. הפעילו [Image Deconvolution] במידת הצורך כדי לשפר את הוויזואליזציה ולזהות אירועי פגוציטוזה מייצגים.
      הערה: השתמשו בהדמיית time-lapse לוויזואליזציה איכותית בלבד. תאי סרטן חיוביים ל-GFP שאינם נבלעים עלולים לחפוף או להיות בקשר זמני עם מקפגים, מה שיוביל לאותים חיוביים כוזבים. בצעו ניתוח כמותי באמצעות בדיקת נקודת סיום (endpoint assay) נפרדת.

7. כימות פגוציטוזה בנקודת סיום

  1. הסרת תאים שאינם מופנמים
    1. בצע את הבדיקה תחת תנאי תרבית משותפת (co-culture) זהים.
    2. סיימו את הניסוי לאחר 4 שעות.
    3. הסיר את מצע התרבית.
    4. הוסיפו 10 mM EDTA ב-PBS.
    5. דגרו ב- 37°C למשך 5 דקות.
    6. שטפו בעדינות עם PBS כדי להסיר תאים חיוביים ל-GFP שלא הופנמו.
    7. הוסף מצע טרי למקרופאגים.
  2. רכישת תמונות לצורך כימות
    1. רכשו תמונות באמצעות ניגודיות פאזה (phase contrast) וערוצי GFP.
    2. צלמו לפחות 4–6 שדות ראייה לכל באער.
    3. יש לנתח לפחות שלושה בארות לכל תנאי.
  3. הגדרה של אירועי פגוציטוזה
    1. זהה מאקרופאגים המכילים אותות חיוביים ל-GFP המוקפים במלואם בגבול התאי.
  4. ניתוח תמונות
    1. יש לפתוח את התמונות בתוכנת ImageJ.
    2. השתמש בתוסף Cell Counter.
    3. ספירה של סך המקרופגים.
    4. ספרו מקרופאגים המכילים תאים פוזיטיביים ל-GFP שהפנימו.
  5. חישוב מדד פגוציטוזה
    1. חשב: נוסחת מדד פגוציטוזה; היחס בין תאים חיוביים ל-GFP שנבלעו לבין סך כל המקרופאגים; משוואה.
    2. יש לבצע את הניתוח באופן סמיך (blinded).
    3. חזור על הפעולה לפחות בשלושה ניסויים בלתי תלויים.
  6. הצגת נתונים
    1. הצג תמונות מייצגות של צילומי Time-lapse באופן כרונולוגי (איור 2B ו- איור 2C).
    2. הצג תמונות מייצגות של נקודת הסיום (איור 3A ו- איור 3B).

ניתוח פגוציטוזה: תרבית משותפת של מקרופאגים, נוגדן חד-סגמיי (mAb) נגד CD24; תמונות מיקרוסקופיה, השוואת תרשימי נתונים.
איור 3כימות של פגוציטוזיס של מקרופאגים התלויה בנוגדנים באמצעות אנליזת נקודת סיום. (A) תמונות מייצגות בניגודיות פאזה ובפלואורסצנציית GFP של מקפאגים שגודלו בתרבית משותפת עם תאי סרטן השד המסומנים ב-GFP למשך 4 שעות, ולאחר מכן הוסרו תאים שלא נבלעו באמצעות טיפול ב-EDTA. ערוצי ניגודיות הפאזה וה-GFP מוזגו כדי לזהות מקפאגים ומטרות חיוביות ל-GFP שהופנמו. מקפאגים (מונה 0) ומקפאגים בולעיים חיוביים ל-GFP (מונה 1) נספרו באמצעות תוסף ה-Cell Counter ב-ImageJ. בתנאי הבקרה של IgG לא נצפו אירועים פגוציטים, בעוד שטיפול בנוגדן מונוקלונאלי נגד CD24 הוביל לאותות ברורים של GFP חיובי בתוך התאים בתוך המקפאגים, דבר המעיד על פגוציטוזה פעילה. סרגל קנה מידה = 200 µm(B) כימות של מדד הפגוציטוזה, המוגדר כאחוז המקרופאגים המכילים תאים פוזיטיביים ל-GFP שהופנמו ביחס לאוכלוסיית המקרופאגים הכוללת. נוגדן מונוקלונאלי Anti-CD24 העלה באופן משמעותי את מדד הפגוציטוזה בהשוואה לבקרת IgG (‏0.0 ± 0.0% לעומת 18.76 ± 4.01%, ממוצע ± סטיית תקנית; n = 6 שדות לקבוצה; ***p < 0.01, מבחן t לא מזווג של וולש (Welch’s unpaired t-test)). הנתונים מייצגים לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מורחבת של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצלחת הייצור והקיטוב של מקרופגים מ-PBMCs אוששו באמצעות הערכה מורפולוגית ואנליזת ציטומטריה של זרימה (איור 1). PBMCs שבודדו באמצעות סנטריפוגציה במעבר דחיסות תרביתו במצע מועשר ב-M-CSF, מה שהוביל להיווצרות תאים נצמדים בעלי מורפולוגיה אופיינית למקרופגים עד היום ה-7. לאחר גירוי באמצעות IFN-γ ו-LPS, התאים הציגו פנוטיפ התואם להפעלה תחת התנאים שהוחלו. אנליזת ציטומטריה של זרימה הראתה כי 99.8% מהתאים שנבחרו (gated) היו חיוביים ל-CD11b, מה שמאשש דיפרנציאציה יעילה למקרופגים (איור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר שלבים בפרוטוקול זה הם קריטיים להשגת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ראשית, האיכות והטוהר של בידוד ה-PBMC משפיעים ישירות על תבואת המקרופאגים ועל יעילות הדיפרנציאציה. שכבה מדויקת של דם מהול מעל גרדיאנט ה-Ficoll וסנטריפוגציה עם בלם כבוי הם חיוניים כדי לשמר את ממשק שכבת ה-buffy coat. ליזיס חלקי של RBC או אינקובציה ממושכת מדי עם בופר ליזיס יפגעו בחיות ה-PBMC. שנית, יש לוודא פולריזציה של מקרופאגים פרו-דלקתיים באמצעות ציטומטריית זרימה לפני בדיקת הפגוציטוזה; מקרופאגים שלא יעלו את ביטוי ה-CD80 עלולים להפגין יכולת פגוציטית מופח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לביולוגיה של הסרטן וטיפוליות מדויקת, האוניברסיטה הרפואית של סין, במסגרת תוכנית מרכז מחקר לתחומים נבחרים (Featured Areas Research Center Program) תחת פרויקט Higher Education Sprout של משרד החינוך (MOE) בטאיוואן (CBPTC-PROJ-5-2).

אנו מודים למרכז לביולוגיה של הסרטן ולטיפול מדויק (Cancer Biology and Precision Therapeutics Center) על אספקת המימון והתמיכה האקדמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מס (stock solution) של חומצה אתילנדיאמינטטרה-אצטית (EDTA) בריכוז 0.5 MSigma-Aldrich (או מקבילו)E7889 (או מקבילו)משמש להכנת תמיסת עבודה של EDTA בריכוז 10 mM ב-PBS לצורך ניתוק תאים
פלטות לתרבית רקמות בעלות 24 בארות (שעברו טיפול TC)Corning (או מקבילו)3524משמש לתרבית משותפת (co-culture) של מקרופאגים ותאי סרטן במהלך בדיקת פגוציטוזה
נוגדן אנטי-CD206 אנושי (ציטומטריה של זרימה)BioLegend (או מקביל לו)321122 (או מקביל לו)סמן לפנוטיפ מאקרופאג חלופי
נוגדן מונוקלונלי אנטי-CD24 אנושיThermo Fisher Scientific (או מקבילו)MA1-91384 (או מקביל לו)משמש לאופסוניזציה של תאי סרטן לצורך פגוציטוזה תלוית נוגדנים
מערכת אוטומטית לדימוי תאים חיים עם תא בקרת סביבה (לדוגמה, Lionheart FX)Agilent Technologies (או שווה ערך)מיקרוסקופ אוטומטי BioTek Lionheart FXמאפשר דימות רב-זמני (time-lapse) לטווח ארוך תחת טמפרטורה מבוקרת ו- 2 תנאים
תוכנת דימות לדימות אוטומטי של תאים חיים (למשל, Gen5)Agilent Technologies (או מקביל לו)לא רלוונטימשמש לרכישה ולניתוח של נתוני דימוי בשיטת צילום רצף (time-lapse imaging)
צנטריפוגה (רוטור עם דליים נערכים)Thermo Fisher Scientific (או מקבילו)Multifuge X4R Pro עם רוטור TX-1000 (או מקביל לו)משמש לבידוד PBMC ולשלבי שטיפת תאים
2 אינקובטור (37°C)°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (או מקבילה לו)חימום ישיר של Forma 2 אינקובטור (או מקבילו)שומר על תנאים פיזיולוגיים עבור תרביות תאים
2 אספקת גז עם ווסתAgilent Technologies (או מקבילו)לא רלוונטיציוד וחומרים 2 לבקרת סביבה עבור אינקובטור ומערכת דימות
מבחנות קוניות (15 מ"ל ו-50 מ"ל)Corning (או מקבילו)352070 (או מקבילו)משמש לשלבי בידוד, שטיפה וסבוב (צנטריפוגציה) של PBMC
מבחנות לאיסוף דם מצופות EDTA (ווקוטיינרים)BD Biosciences (או מקביל לו)367863 (או מקבילו)משמש לאיסוף דגימות דם מלא מתורמים
Ficoll-Paque PLUSCytiva (או מקבילו)17144003 (או מקבילו)תווך מדרג צפיפות לבידוד PBMCs
ציטומטר זרימה (למשל, FACSCanto II)BD Biosciences (או מקבילו)BD FACSCanto II משמש לניתוח פנוטיפי של מקרופאגים
חרוזי פיצוי (ציטומטריית זרימה)Biolegend (או מקבילו)424602משמש לבקרות פיצוי בצבע בודד
נוגדן anti-human CD11b מסומן ב-FITC (ציטומטריית זרימה)BioLegend (או מקבילו)101205 (או מקבילו)סמן המשמש לזיהוי מקרופאגים
נוגדן PE anti-human CD80 (ציטומטריה של זרימה)BioLegend (או מקבילו)375410 (או מקבילו)סמן הקשור לפנוטיפ של מקרופאג מופעל
שורה של תאי סרטן שד המבטאים GFP ‏(MDA-MB-468)ATCC (או מקבילו)HTB-132 (או מקבילו)תאים מטרה המשמשים במבחן פגוציטוזה; GFP מאפשר ויזואליזציה
תווך ImmunoCult-SF למקרופאגיםSTEMCELL Technologies (או מקביל לו)10961 (או מקבילה לו)מצע ללא סרום המשמש להבחנה של מקרופאגים
דולבקו’תוכנית מזון של איגל המודגשת (DMEM)Thermo Fisher Scientific (או מקבילה לו)12100046משמש לתרבית ולריסוספנזיה (השהיה מחדש) של תאי סרטן
נוגדן בקרה איזוטייפית (IgG)Bio X Cell (או מקבילו)BE0297 (או מקבילו)ביקורת שלילית לבדיקת פגוציטוזה תלוית נוגדנים
ליפופוליסכריד (LPS)Sigma-Aldrich (או שווה ערך)L2630 (או מקבילו)גירוי המשמש להפעלת מקרופאגים בשילוב עם IFN-γ
אינטרפרון גמא אנושי רקומביננטי (IFN-γ)STEMCELL Technologies (או מקבילו)78020 (או מקבילו)ציטוקין המשמש להפעלת מקרופאגים
גורם מעכב להיווצרות מושבות מקרופאגים אנושי רקומביננטי (M-CSF)STEMCELL Technologies (או מקבילו)78057 (או מקביל לו)גורם גדילה המשמש לדיפרנציאציה של מקרופאגים
פיפטות פסטור או פיפטות סרולוגיותJetbiofil (או מקביל לו)GSP010010 (או מקבילו)משמש לטיפול בנוזלים במהלך בידוד של PBMC ותרבית תאים
PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)2+-/מגניזיום2+-free)Thermo Fisher Scientific (או מקבילו)BP399-500 (או מקבילו)בופר המשמש לשטיפת תאים ולשלבי דילול
צלחיות פטרי (100 מ"מ, לא–(מטופלת לתרביות רקמה)Corning (או מקבילו)430591משמש להבחנה של מקרופאגים באמצעות סלקציה על בסיס היצמדות
בופר לליזת תאי דם אדומים (RBC)BioLegend (או שווה ערך)420301 (או מקבילו)משמש להסרת תאי דם אדומים במהלך בידוד PBMC
צבע קיבוע Viability 405/452Miltenyi Biotec (או מקביל לו)130-130-404 (או שווה ערך)משמש להערכת חיוניות תאים במהלך אנליזה של ציטומטריה זרימה
DAPISigma-Aldrich (או מקבילו)D9542 (או מקבילו)משמש להדרה של תאים מתים בציטומטריית זרימה

מקורות

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD24

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.