הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול להפרדת חצאי המוח לצורך תצפית מורפולוגית ומיצוי משולב של RNA וחלבונים באזורי מוח של עכברים

71 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71465

⸱

1 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, 2The Transvascular Implant Instrument Research Institute, 3The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מבצע חיתוך של מוחות עכברים לשני חצאים. המיספירה אחת משמשת לצביעה מורפולוגית, והשנייה לחילוץ RNA וחלבונים. אסטרטגיה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים לניסוי, עומדת בעקרונות ה-3Rs וממזערת את השונות הבין-חייתית.

תקציר

במחקר יומי במדעי העצבים, צביעות מורפולוגיות ובדיקות מולקולריות של חומצות גרעין וחלבונים דורשות בדרך כלל חיות ניסוי נפרדות, דבר הגביר את השימוש בבעלי חיים ואינו עולה בקנה אחד עם עקרון ה-3Rs לרווחת בעלי חיים. פרוטוקול זה קובע זרימת עבודה להקצאת רקמות של רקמת מוח מעכברים, המאפשרת ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מקבילים מאותו בעל חיים. לאחר פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 0.9% saline, המוח מחולק לשני המיספרים. המיספר אחד מקובע ב-4% paraformaldehyde לצורך אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה; חיתוכים המאוחסנים בתמיסת sucrose-ethylene glycol-polyvinylpyrrolidone (PVP) שומרים על איכות צביעה אמינה למשך עד שבע שנים. המיספר הנגדי נשמר בקירור ב-80 °C- להפקה משולבת של RNA וחלבון, עם תנובה המספיקה לביצוע qPCR ו-Western Blot בהמשך. בבדיקה שבוצעה על punches של 9–10 mg מהקליפה האנטורינלית (entorhinal cortex), שיטה זו מניבה תנובות RNA וחלבון נמוכות יותר מאשר הפקה נפרדת של RNA או חלבון בלבד, אך הביומולקולות שהופקו נותרות מספיקות לזיהוי מולקולרי. זרימת עבודה זו מפחיתה את צריכת בעלי החיים ומסירה הבדלים בין-אינדיבידואליים בין ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מקבילים. היא מספקת שיטה ישימה להכנת רקמות לצורך פרופיל רב-ממדי של תתי-אזורים מובחנים במוח העכבר.

מבוא

מחקרים בתחום מדעי המוח התרחבו באופן דרמטי בעשורים האחרונים, וחשפו מנגנוני מפתח השולטים בפיזיולוגיה של המוח האנושי, בהופעת מחלות נוירולוגיות ובפיתוח טיפולים. מודלים של בעלי חיים נותרים חיוניים לחקירה נוירולוגית, שכן הם מספקים פלטפורמות ניתנות לשליטה ולשחזור לבחינת התפתחות עצבית, תפקוד פיזיולוגי ותהליכים פתולוגיים. מניפולציה ניסיונית ותצפית היסטולוגית בבעיות עכברים מאפשרות לחוקרים לאפיין העברה עצבית, בניית מעגלים עצביים וקשרים בין מערכת העצבים להתנהגות. במקביל להתקדמות הטכנולוגית, האתיקה של ניסויים בבעלי חיים הפכה לסוגיה מרכזית. עקרונות ה-3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement - החלפה, צמצום ושיפור) הם כיום סטנדרטים מקובלים גלובלית לכל מחקרי בעלי החיים1,2, והם מחייבים חוקרים למזער את השימוש בבעלי חיים תוך שמירה על תוצאות ניסיוניות מהימנות.

כלים חדשניים, כגון מערכות נוקאאוט מותנה (conditional knockout), מאפשרים מניפולציה גנטית מדויקת בתוך תתי-אזורים נפרדים של מוח העכבר3. התקדמויות אלו הניעו מחקר אינטנסיבי של מדורי מוח בקנה מידה מיקרוסקופי, כגון CA1, CA3 ו-DG של ההיפוקמפוס, המווסתים למידה, זיכרון ומצב רוח4. פענוח הפונקציות מסדר גבוה של אזורי מוח זעירים אלה דורש מדידות מתואמות ברמה המורפולוגית, התעתוקית ובחלבונים. למשך, נפח הרקמה המצומצם שלהם יוצר מכשולים טכניים מרכזיים לזיהוי מקבילי של מדדים מרובים.

צביעה מורפולוגית, כימות RNA וזיהוי אימונולוגי של חלבונים הן שלוש מדידות ליבה שגרתיות במדעי המוח. תכנוני מחקר מסורתיים דורשים שלוש קהילות נפרדות של עכברים כדי להשלים את שלושת סוגי הבדיקות הללו. נוהג זה מגדיל באופן דרסטי את מספר בעלי החיים המנוצלים ומכניס שונות ביולוגית ניכרת בין בעלי החיים, דבר המחליש את היכולת להשוות בין מערכי נתונים היסטולוגיים ומולקולריים. זרימת עבודה מאוחדת השולפת אותות מורפולוגיים ומולקולריים תואמים מאותו בעל חיים בודד תיתן מענה משמעותי לשתי מגבלות קריטיות אלו ותעמוד טוב יותר בעקרון ההפחתה (Reduction) של ה-3Rs.

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול הניתן לשחזור להפרדה המיספרית של רקמת מוח של עכברים. לאחר פרפוזיה סיסטמית של תמיסת סליין, המוח השלם מחולק לשני המיספריים: המיספרה אחת מקובעת לבדיקות מורפולוגיות, וההממיספרה הנגדית נשמרת בהקפאה (cryopreserved) לצורך מיצוי משותף של RNA וחלבון. רקמות שקובעו ואוחסנו במבuffer הגנה של סוכרוז-אתילנגליקול-פוליבינילפירולידון (PVP) שומרות על אותי צביעה יציבים ואיכותיים עבור אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה למשך תקופה של עד שבע שנים. תיקפנו שיטה זו באמצעות דגימות פאנץ' זעירות של 9–10 mg מהקליפה האנטורינלית (entorhinal cortex), רקמה קלה יותר מאזורים הנחקרים בדרך כלל כגון ההיפוקמפוס והקליפה הפרה-פרונטלית. הזיהוי המוצלח של דגימת רקמה זעירה זו מעיד כי תתי-אזורי מוח קטנים יותר, כגון ההיפותלמוס והאמיגדלה, תואמים אף הם לזרימת העבודה זו. על אף שהפרוטוקול מניב ריכוזי RNA וחלבון נמוכים יותר מאשר ערכות מיצוי ייעודיות למטרה בודדת, הביומולקולות המבודדות בעלות איכות מספקת לתמיכה בניתוחי qPCR ו-Western blot סטנדרטיים. זרימת עבודה זו מפחיתה את כמות בעלי החיים המשמשים למחקר ומסירה הבדלים בין-אישיים בין ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מזווגים. היא מספקת שיטה ישימה להכנת רקמה לצורך פרופיל רב-ממדי של תתי-אזורי מוח נפרדים בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה

כל ניסויי בעלי החיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דליאן לרפואה (אישור מס׳ AEE18026 עבור ניסויי חולדות ומס׳ AEE24261 עבור ניסויי עכברים), הרפובליקה העממית של סין. כל הפרוטוקולים הניסויים יושמו בהתאם להנחיות האתיקה לבעלי חיים במעבדה ועמדו באופן מלא בעקרונות ה-3Rs (צמצום, החלפה ושיפור) עבור ניסויים בבעלי חיים. לאורך כל תהליך הניסוי, ננקטו אמצעים קפדניים כדי להקל ביעילות על סבל ומצוקה של בעלי החיים. במקביל, מספר בעלי החיים בניסוי הוגבל לכמות המינימלית הנדרשת כדי להבטיח את המהימנות והתקפות של תוצאות הניתוח הסטטיסטי. ראו את טבלת החומרים לרשימה מלאה של הריאגנטים, consumables והציוד ששימשו בפרוטוקול זה.

1. הכנת חיות ניסוי וניתוח לפרפוזיה טרנס-קרדיאלית

  1. הרדמה והכנה טרום-ניתוחית
    1. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בחולדות זכרים בוגרות מסוג Sprague-Dawley או בעכברים מסוג C57BL/6 בדרגת SPF (נקיים מפתוגנים ספציפיים). שכן את בעלי החיים בסביבה מבוקרת טמפרטורה (22 ± 2 °C) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. ספקו לבעלי החיים גישה חופשית (ad libitum) למזון ומים סטריליים.
    2. הזריקו לבעלי החיים sodium pentobarbital בהזרקה תוך-בטנית (intraperitoneal) במינון של 80 mg/kg עבור חולדות או 50 mg/kg עבור עכברים כדי להשרות הרדמה (ראו איור 1).
  2. הליך פרפוזיה טרנסקרדיאלית (Transcardial perfusion)
    1. קבעו את בעלי החיים המורדמים בתנוחת שכיבה על הגב (supine) על לוח ניתוחים.
    2. גזרו את דופן הבטן לאורך קו האמצע, מהתהליך החרבני (xiphoid process) ועד לסימפיזה הפוביס, באמצעות מספריים ישרים. גזרו את דופן בית החזה הצידית משני הצדדים כדי לחשוף את הלב במלואו.
    3. בצעו פרפוזיה לבעל החיים עם תמיסת סליין נורמלית 0.9% קרה מאוד (ice-cold) בקצב זרימה קבוע: 100–150 mL במשך 10–15 דקות עבור חולדות, ו-20–30 mL במשך 5–8 דקות עבור עכברים.
  3. הוצאת המוח והפרדת המיספרים
    1. בצעו עקירה (decapitation) לבעלי החיים באמצעות מספרי ניתוח גדולים לאחר השלמת הפרפוזיה. גזרו את הקרקפת לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת.
    2. השתמשו בשפכטל סטרילי כדי להרים בעדינות את המוח מחלל הגולגולת. העבירו במהירות את המוח השלם לצחנת פטרי סטרילית המונחת על קרח.
    3. השתמשו בסכין גילוח סטרילית וללא RNase כדי לחלק את המוח באופן סימטרי להמיספרים שמאלי וימני לאורך התפר הסגיטלי.
    4. העבירו מיד את ההמיספר השמאלי למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL המכילה 10 mL של תמיסת paraformaldehyde 4% קרה מאוד לצורך קיבוע. העבירו את ההמיספר הימני למבחנת שימור קפואה (cryopreservation tube) מסומנת וללא RNase, הקפיאו אותה במהירות בחנקן נוזלי, ושמרו אותה בטמפרטורה של -80 °C עד למיצוי ה-RNA והחלבונים.

2. קיבוע רקמת מוח, חיתוך ואחסון לטווח ארוך

  1. קיבוע והתייבשות
    1. טבלו את ההמיספירה השמאלית לחלוטין בתמיסת פאראפורמאלדהיד 4% וקבעו את הרקמה בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 h. עם סיום הקיבוע, העבירו את המיספירה של המוח לפ menutupל צנטריפוגה של 15 mL המכיל תמיסת סוכרוז 30%, ובצעו התייבשות לרקמה בטמפרטורה של 4 °C.
    2. החליפו את תמיסת הסוכרוז 30% בכל 24 h עד שרקמת המוח שוקעת לתחתית הפפירה.
  2. הכנת חתכים קריוסטטיים
    1. הוציאו את המיספירה המיובשת של המוח מתמיסת הסוכרוז וסננו בעדינות נוזלים עודפים בעזרת נייר סינון סטרילי.
    2. הצמידו את המיספירה של המוח למסך הדגימות של הקריוסטט באמצעות חומר שיכון OCT (optimal cutting temperature).
    3. בצעו חתכים קורונליים סדרתיים של המוח בעובי של 30 µm באמצעות קריוסטט. אספו חתכים עוקבים לפלטה של 24 בארות המכילה 0.01 M PBS סטרילי.
  3. אחסון ארוך טווח של חתכי מוח
    1. הכינו מראש את תמיסת השימור הקריו-פרוטקטיבית לפלחי מוח: הוסיפו 2 g של PVP400, 60 g של סוכרוז ו-60 mL של אתילן גליקול ל-100 mL של 0.01 M PBS. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שכל הרכיבים נמסו לחלוטין ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש.

3. מיצוי RNA באמצעות TRIzol

  1. הומוגניזציה של רקמה והפרדת פאזות
    1. יש לבצע הומוגניזציה של רקמת קליפת הקורטקס האנטורינלי ב-1 mL של TRIzol reagent באמצעות הומוגנייזר אולטרה-פיין ולהדגיר את ההומוגנאט על קרח למשך 15 min. יש לסבב בצנטריפוגה במהירות של 8,000 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C.
    2. הוסף 200 µL של כלורופורם וערבב בורטקס למשך 10 s. סבב בצנטריפוגה במהירות של 5,600 × g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבר את הפאזה המימית העליונה לפחית נטולת RNase. הוסף 500 µL של איזוֹפרוֹפָּנוֹל והדגיר בטמפרטורה של -20 °C למשך לילה כדי להשקיע את ה-RNA. סבב שוב בצנטריפוגה.
  2. השקעת RNA, שטיפה ובקרת איכות
    1. שפוך את הנוזל העליון ושטוף את משקע ה-RNA ב-1 mL של 75% ethanol. סבב בצנטריפוגה במהירות של 5,600 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C. הסר את הנוזל העליון, ייבש את המשקע באוויר למשך 10 min, והמס את ה-RNA ב-20 µL של מים שעובדו ב-DEPC למשך 10 min.
    2. מדוד את ריכוז ה-RNA ואת טהורתו (A260/A280) באמצעות ספקטרופוטומטר. שמור את ה-RNA בטמפרטורה של -80 °C עד לניתוחים נוספים.

4. מיצוי חלבון כולל באמצעות ערכת Minute

  1. ליסיס והומוגניזציה של רקמה
    1. קררו מראש את עמודת הספין (spin column) ואת מבחנת האיסוף על קרח. הומוגניזיו את הרקמה ב-100 µL של באפר לליסיס תאים באמצעות הומוגניזר ultrafine. שטפו את ההומוגניזר ב-100 µL נוספים של באפר לליסיס תאים ואחדו את הליסאטים.
  2. השבה וכמות חלבון
    1. העבירו את ההומוגנאט לעמודת הספין והדגירו למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. סובבו בצנטריפוגה במהירות של 11,000–14,300 × g למשך 2 דקות.
    3. הניחו את מבחנת האיסוף על קרח מיד לאחר הצנטריפוגה והשליכו את עמודת הספין. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.

5. מיצוי בו-זמני של RNA וחלבון מקליפת המוח האנטורינלית (9–10 mg)

  1. הכנה מקדימה לניסוי והכנת ריאגנטים
    1. השתמשו בערכת DNA/RNA/protein עבור כל שלבי המיצוי. השתמשו אך ורק בחומרים מתכלים מאושרים נקיים מ-RNase ו-DNase (ראו איור 2).
    2. הכינו את באפר הליזיס (lysis buffer) מיד לפני השימוש: הוסיפו תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail) לבאפר הליזיס המסופק בערכה בדילול של 1:100.
  2. ליזיס רקמות והפרדת פאזות
    1. הוציאו את חצי המוח הימני הקפוא מאחסון ב-80 °C- והניחו אותו על קרח. השתמשו במנקב (punch) סטרילי ונקי מ-RNase כדי לאסוף 9–10 mg של רקמה מאזור המוח המיועד.
    2. בצעו הומוגניזציה מלאה של הרקמה על קרח באמצעות הומוגניזר רקמות חשמלי עד שלא יישארו רסיסי רקמה נראים לעין. הדגירו את ההומוגנאט על קרח למשך 10 min כדי להבטיח ליזיס מלא.
    3. הוסיפו 200 µL של ריאגנט ההפרדה המסופק בערכה להומוגנאט. בצעו וורטקס (vortex) חזק למבחנה למשך 30 s והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 3 min. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 15 min ב-4 °C כדי להשיג הפרדת פאזות מלאה.
  3. טיהור RNA ואלוציה
    1. אספו בזהירות את הפאזה המימית העליונה באמצעות טיפ פפיטה נקי מ-RNase. העבירו את הפאזה המימית שנאספה למבחנה חדשה של 1.5 mL נקייה מ-RNase. הוסיפו נפח שווה של 100% ethanol לפאזה המימית שנאספה וערבבו.
    2. העבירו 700 µL מהתערובת לעמודת טיהור ה-RNA המסופקת בערכה. צנטריפוגו את העמודה ב-5,600 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר.
    3. הוסיפו 500 µL של באפר שטיפת RNA 1 המסופק בערכה לעמודה. צנטריפוגו את העמודה ב-5,600 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר.
    4. הוסיפו 500 µL של באפר שטיפת RNA 2 המסופק בערכה לעמודה, וצנטריפוגו שוב. צנטריפוגו את העמודה הריקה ב-8,000 × g למשך 2 min בטמפרטורת החדר כדי להסיר לחלוטין שאריות ethanol מממברנת העמודה.
    5. העבירו את העמודה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה של 1.5 mL נקייה מ-RNase. הוסיפו 30–50 µL של מים נקיים מ-RNase (שחוממו מראש ל-60 °C) ישירות למרכז ממברנת העמודה. הדגירו את העמודה בטמפרטורת החדר למשך 2 min. צנטריפוגו את העמודה ב-8,000 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר כדי לבצע אלוציה של ה-RNA.
  4. השקעת חלבונים והמסה
    1. הוסיפו 750 µL של isopropanol לפאזה האורגנית ולפאזה הביניים שנותרו במבחנה המקורית לאחר הסרת הפאזה המימית למיצוי RNA. הדגירו את התערובת ב-20 °C- למשך 30 min כדי להשקיע את החלבונים.
    2. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 10 min ב-4 °C. השליכו את הסופרנטנט (נוזל העל) ושמרו על משקע החלבון שלם בתחתית המבחנה.
    3. הוסיפו 1 mL של 95% ethanol למשקע החלבון. בצעו וורטקס קצר למבחנה כדי לשטוף את המשקע. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 5 min ב-4 °C והשליכו את הסופרנטנט. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות.
    4. ייבשו את משקע החלבון באוויר בטמפרטורת החדר למשך 5–10 min עד שהמשקע הופך שקוף ולא נראות שאריות ethanol.
    5. הוסיפו 50–100 µL של תמיסת 5–10% SDS למשקע המיובש. בצעו וורטקס חזק למבחנה למשך 1 min והדגירו אותה על קרח למשך 10 min כדי להמיס את החלבון באופן מלא. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 5 min ב-4 °C. אספו את הסופרנטנט כתמצית החלבון הסופית.

6. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC)

  1. טיפול מקדים של חתכים והשבתה של אנזימים אנדוגניים
    1. הוצא את חתכי המוח מאחסון בקריו-פרוטקטור בטמפרטורה של -20 °C. השתמש במחט זכוכית כדי להעביר את החתכים לפלטה בעלת 24 בארות המכילה 0.01 M PBS (pH 7.4).
    2. שטוף את החתכים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, במשך 5 min לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר על שייקר.
    3. דגרי את החתכים עם חוסם פריוקסידאז של 3% מימן בטמפרטורת החਦਰ למשך 10 min כדי להשבית פעילות פריוקסידאז אנדוגנית. חזור על שלבי השטיפה לאחר החסימה.
  2. החדרה (Permeabilization) וחסימה לא ספציפית
    1. דגרי את החתכים ב-0.5% Triton X-100 למשך 30 min בטמפרטורת החדר על שייקר לצורך חדירה לממברנת התא. חזור על שלבי השטיפה.
    2. דגרי את החתכים ב-4% bovine serum albumin למשך 30 min בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרי עם מעכב צביעה לא ספציפי למשך 30 min נוספים בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה של נוגדנים ראשוניים ושניוניים
    1. דלל נוגדנים ראשוניים בתמיסת 1% BSA בדילולים האופטימליים הבאים: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000), ו-glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
    2. הוסף 200 µL של תמיסת נוגדן ראשוני מדולל לכל בארה, תוך הבטחת טבילה מלאה של החתכים.
    3. הוסף 200 µL של נוגדן שניוני מסומן בביוטין לכל בארה. דגרי את החתכים בטמפרטורת החדר למשך 30 min.
    4. שטוף את החתכים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, במשך 5 min לכל שטיפה. הוסף 300 µL של תצמידי streptavidin-peroxidase לכל בארה. דגרי את החתכים בטמפרטורת החדר למשך 30 min. חזור על שלבי השטיפה לאחר הדגירה.
  4. פיתוח כרומוגני של 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) והצמדת זכוכית
    1. הוסף 200 µL של תמיסת עבודה של DAB לכל בארה. עקוב אחר התגובה הכרומוגנית תחת מיקרוסקופ אור.
    2. הצמד את החתכים לשקופיות זכוכית מצופות ג'לטין באמצעות מחט זכוכית. ייבש את השקופיות לחלוטין באוויר בטמפרטורת החדר.
    3. בצע דהידרציה לשקופיות באמצעות סדרת אתנול מדורגת (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% אתנול, 5 min לכל שלב), ולאחריהם ביצוע שקיפות (clearance) ב-xylene פעמיים, 5 min בכל פעם.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF)

  1. טיפול מקדמי של נתחים וחדירות (Permeabilization)
    1. הוצא את נתחי המוח מאחסון במגן קריוגני בטמפרטורה של -20 °C. העבר את הנתחים לפלטה בעלת 24 בארות המכילה 0.01 M PBS (pH 7.4).
    2. שטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 5 דקות לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר על שייקר.
    3. דגור את הנתחים ב-0.5% Triton X-100 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
    4. שטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 10 דקות לכל שטיפה, לאחר תהליך החדירות.
  2. חסימה ודגירה עם נוגדן ראשוני
    1. דגור את הנתחים בתמיסת חסימה המכילה 4% BSA ומעכב צביעה לא ספציפי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח.
    2. שאב את תמיסת החסימה. דלל נוגדים ראשוניים בתמיסת 1% BSA בריכוזים אופטימליים והוסף 300 µL של תמיסת הנוגדן הראשוני המדוללת לכל בארה. דגור את הנתחים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C בתא לח ומוגן מאור.
  3. דגירה עם נוגדן משני
    1. חמם מחדש את הנתחים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בחושך למחרת. שאב את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 10 דקות לכל שטיפה, על שייקר בחושך.
    2. דלל נוגדים משניים מצומדים לפלואורופור בתמיסת 1% BSA לפי הדילול המומלץ על ידי היצרן. הוסף 300 µL של תמיסת הנוגדן המשני לכל בארה. דגור את הנתחים בטמפרטורת החדר למשך 1–2 שעות בחושך.
    3. שטוף את הנתחים חמש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 5 דקות לכל שטיפה, בחושך.

8. אנליזת PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

  1. הסרת gDNA מ-RNA ושעתוק הפוך
    1. בצע שעתוק הפוך לסנתזת cDNA באמצעות ערכה לשעתוק הפוך, עם 1 µg של RNA כולל ל-20 µL של מערכת התגובה. השתמש בתוכנית המחזורים התרמיים המומלצת על ידי היצרן: 25 °C למשך 5 min, 50 °C למשך 15 min, 85 °C למשך 5 min, ושמירה ב-4 °C.
    2. דלל את ה-cDNA המסנתז ביחס של 1:5 עם מים נקיים מ-RNase. שמור את ה-cDNA בטמפרטורה של -20 °C עד להגברה ב-qPCR.
  2. הכנת מערכת qPCR והגברה
    1. הכן את מערכת תגובת ה-qPCR על קרח במכסה PCR ייעודי ונקי מ-RNase. מערכת תגובה של 20 µL כוללת: 10 µL של qPCR Master Mix,‏ 0.4 µL של פריימר קדמי (10 µM),‏ 0.4 µL של פריימר אחורי (10 µM),‏ 2 µL של תבנית cDNA מדוללת, ו-7.2 µL של מים נקיים מ-RNase.
    2. בצע הגברת qPCR באמצעות התוכנית הבאה: 95 °C למשך 30 s של דנטורציה ראשונית; 40 מחזורים של 95 °C למשך 10 s ו-60 °C למשך 30 s; לאחר מכן ניתוח עקומה של דיסוציאציה מ-60 °C עד 95 °C, בגידולים של 0.5 °C בכל 5 s.

9. Western blot

  1. כימות חלבונים והכנת דגימה
    1. דללו את תמריתי החלבון לריכוזים שווים באמצעות תמיסת SDS בריכוז 5–10%, בהתבסס על תוצאות בדיקת BCA.
  2. אלקטרופורזה ב-SDS-PAGE והעברת חלבונים
    1. הכינו ג'ל הפרדה SDS-PAGE בריכוז 10% וג'ל ריכוז (stacking gel) בריכוז 5% בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית.
    2. העמיסו 20 µg של חלבון כולל לכל באר בג'ל. עבור ניסויי העמסה במדרג, העמיסו 15 µg, 30 µg ו-45 µg של חלבון לכל באר.
    3. בצעו אלקטרופורזה במתח של 80 V למשך 30 דקות עד שהמרקר של החלבונים נכנס לג'ל ההפרדה, ולאחר מכן הגבירו את המתח ל-120 V למשך 60–90 דקות עד שצבע הברומופנול בלו (bromophenol blue) מגיע לתחתית הג'ל.
    4. הרכיבו את "סנדוויץ' ההעברה" בסדר הבא (מהקתודה לאנודה): ספוג, נייר סינון, ג'ל, ממבנאת PVDF, נייר סינון וספוג. ודאו שלא נשארו בועות אוויר בין הג'ל לממברנה.
    5. בצעו העברה רטובה (wet transfer) בזרם קבוע של 300 mA למשך 90 דקות באמבט קרח.
  3. חסימת ממברנה ודגירה עם נוגדנים
    1. שטפו קצרות את ממבנאת ה-PVDF בתמיסת TBST לאחר השלמת ההעברה. דגרו את הממברנה ב-5% BSA למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים.
    2. דללו את הנוגדנים הראשוניים בתמיסת 5% BSA בריכוזים אופטימליים. דגרו את הממברנה עם תמיסת הנוגדן הראשוני למשך לילה ב-4 °C על שייקר.
    3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים בתמיסת TBST, 10 דקות לכל שטיפה, על שייקר למחרת.
    4. דללו נוגדן משני המשורשר ל-horseradish peroxidase (HRP) בתמיסת חלב דל שומן 5% בדילול המומלץ על ידי היצרן. דגרו את הממברנה עם תמיסת הנוגדן המשני למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר.
    5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים בתמיסת TBST, 10 דקות לכל שטיפה, לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני. דגרו את הממברנה עם תמיסת substrat מסוג ECL למשך 1–2 דקות בחושך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת ריכוז RNA,האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-qPCR

כפי שמוצג, RNA וחלבון כוללים הופקו יחד מדגימות (punches) של קליפה אנטורינלית (9–10 mg) באמצעות ערכת DNA/RNA/protein. דגימות מקבילות שעובדו עם TRIzol (עבור RNA) או עם ערכת הפקת חלבון שימשו כביקרות. הפרוטוקול הניב 235 ± 12 ng µL⁻1 RNA, פחות ב-36 % מאשר ב-TRIzol (p < 0.05) (Figure 3A). למרות זאת, ג'לים של אגרוז גילו פסי 28S ו-18S rRNA חדים ואותות 5S, המעידים על RNA שלם (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר בעכברים, ניתוחים מורפולוגיים ובדיקות של חומצות גרעין/חלבונים דורשים לרוב דגימות בעלי חיים נפרדות בשל נהלי ההכנה השונים שלהם. דבר זה מגביר את מספר בעלי החיים המשמשים למחקר ומכניס שונות ביולוגית בין בעלי חיים, מה שעלול להפחית את היכולת להשוות בין מערכי נתונים היסטולוגיים ומולקולריים. כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו זרימת עבודה המאפשרת להפיק נתונים היסטולוגיים ומולקולריים מאותו בעל חיים.

העיצוב המרכזי של זרימת העבודה הזו הוא הקצאה המיספירה של רקמת מוח לאחר פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 0.9% sali...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגש הדדיים פיננסיים ידועים או מערכות יחסים אישיות שעלולות היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, נקיות מ-RNaseAxygenMCT-150-C-Sאיסוף דגימות רקמה בשיטת פאנץ' (tissue punches) והפרדת פראקציות להפקת RNA וחלבון.
מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 15 מ"לביופילםCFT010150קיבוע, דהידרציה בסוכרוז ואחסון תמיסות.
פלטות גידול תאים בעלות 24 בארייםNEST702001איסוף, צביעה ואחסון לטווח ארוך של חתכי מוח צפים באופן חופשי.
תמיסת סוכרוז 30%הוכן במעבדהלא רלוונטיהגנה קריוגנית של חצאי המוח מקובעים לפני חיתוך קריוסטטי.
תמיסת פאראפורמאלדהיד 4%BiosharpBL539Aקיבוע בטבילה של המיספרת המוחית המיועדת לבדיקת מורפולוגיה.
5× בופר טעינה לחלבוניםBeyotime BiotechnologyDL101הכנת דגימות חלבון ל-SDS-PAGE.
אגרוזSolarbioקט: A8201הערכת שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
נוגדן אנטי-דאבלקורטין (Anti-doublecortin antibody)Abcamab18723נוגדן ראשוני לצביעה אימונוהיסטוכימית של doublecortin.
נוגדן Anti-ERKBeyotimeAB2014נוגדן ראשוני עבור Western blotting של ERK כולל.
נוגדן Anti-GFAPAbcamab10062נוגדן ראשוני עבור אימונופלואורסצנציה של חלבון חומצתי סיבי גליאלי (glial fibrillary acidic protein).
נוגדן Anti-Iba1WakoNCNP24נוגדן ראשוני עבור אימונופלואורסצנציה של מולקולת מתאם קושרת סידן מיונן 1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1).
נוגדן Anti-NeuNMilliporeA60נוגדן ראשוני לצביעת אנטיגן גרעיני עצבי.
Anti-NF-κנוגדן B p65HUABIOET1603-12נוגדן ראשוני ל-NF-κוסטרן בלוטינג של B p65.
נוגדן Anti-phospho-ERKBeyotimeET1610-13נוגדן ראשוני ל-Western blotting של ERK מפוספור.
נוגדן Anti-PSD95HUABIOET1602-20נוגדן ראשוני עבור Western blotting של PSD95.
נוגדן Anti-ULK1HUABIOET1704-63נוגדן ראשוני עבור Western blotting של ULK1.
אנטי-βנוגדן ל-tubulinABclonalAC021נוגדן ראשוני לבקרת העמסה עבור Western blotting.
תוסף למניעת דהייה (Antifade) למדיום קיבוע פלואורסצנטיBeyotimeP0126-5תוך הרכבה עבור חיתוכים שנצבעו באימונופלואורסצנציה.
ערכה לזיהוי פראוקסידאז באמצעות ביוטין-סטרפטאווידיןFuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720מערכת זיהוי משנית עבור אימונוהיסטוכימיה של DAB.
אלבמין משרת בקרQiansheng Biotech Co., Ltd.QO3000תמיסת חסימה לצביעה אימונוהיסטוכימית ול-Western blotting.
עכברי C57BL/6Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTDעכברי C57BL/6 בני 4 שבועותבעלי חיים ניסיוניים לאיסוף רקמת מוח מעכבר, במידה ונכללו.
מערכת לדימות כימילומינצנציהClinx Science Instruments Co., Ltd.ChemiScope 6200 Touchגילוי אותות כימילומינסנציה ב-Western blot.
מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקליLeica Microsystems CMS GmbHמספר סידורי: 591974רכישת תמונות עבור חתכים באימונופלואורסצנציה.
תמיסת שימור עם חומר מגן מפני קיפאון (Cryoprotectant)הוכן במעבדהלא רלוונטיאחסון לטווח ארוך של חיתוכי מוח צפים באופן חופשי ב- −20 °C.
קריוסטטLeicaCM1950הכנה של 30 μm חתכים קורונליים של המוח.
ערכה לתסבסומט כרומוגני DABסיגמאSLBP7387Vפיתוח כרומוגני עבור אימונוהיסטוכימיה.
תמיסה לצביעת גרעינים ב-DAPICoolaberSL7100צביעה נגדית של הגרעין עבור אימונופלואורסצנציה.
מיקרוסקופ אור דיגיטליNingbo Yongxin Optics Co., Ltd.דגם NE910+FL-900מעקב אחר התפתחות ה-DAB ודימוג של חתכים שנצבעו בשיטת שדה בהיר (bright-field).
DNase IVazymeR223-01הסרה של DNA גנומי שיורי לפני שעתוק הפוך.
נוגדן Donkey anti-rabbit IgG, המשורשב ל-488Thermo Fisher ScientificA21206נוגדן משני פלואורסצנטי עבור אימונופלואורסצנציה.
נוגדן חמור נגד IgG של ארנב, מצומד ל-594Abcamab150076נוגדן משני פלואורסצנטי עבור אימונופלואורסצנציה.
ערכה להביאת DNA/RNA/חלבון E.Z.N.A.Omega Bio-TekD3892-01
ספק כוח לאלקטרופורזהBio-Rad1645050ספק כוח עבור אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-SDS-PAGE.
אתילן גליקולSinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10009828רכיב של תמיסת שימור קריו-פרוטקטיבית.
מערכת לדימות ג'לClinx Science Instruments Co., Ltd.ChemiScope 6200 Touchדימוי של ג'לי אגרוז להערכת איכות RNA.
שקופיות זכוכית מצופות ג'לטיןCITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTDREF: 10127105P P/N: 80312-2101הטמעה של חתכי מוח צפים בצורה חופשית שצבעו ב-DAB.
תוכנה לניתוח תמונותהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health)ImageJ/Fijiניתוח דנסיתומטרי של פסי Western blot ועיבוד תמונה.
איזופרופנולSinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.80109218שיקיעת חלבונים מחלק הפאזה האורגנית/הביניים.
מיקרוצנטריפוגה, מקוררתYancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.TGL16Mסבב צנטריפוגה במהלך שלבי מיצוי ושטיפה של RNA/חלבונים.
ערכה למיצוי חלבונים מהיר (Minute Protein Extraction Kit)המצאהMS-026
תוך הרכבה של בלסם ניטרלי Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., שנגחאי, סיןמספר קטלוג S30509, CAS 96949-21-2כיסוי זכוכית של חתכים שעברו צביעה ב-DAB והתייבשו.
תווך שיקוע OCTסאקורה4583תווך שיכון לחיתוך קריו-סרירי (cryosectioning) של חצאי מוח קבועים.
פלטות או מבחנות qPCR אופטיותAxygenPCR-0208-Cכלי תגובה להגברה ב-qPCR.
ParafilmamcorPM996איטום פלטות רב-בארים לאחסון ארוך טווח של חתכים.
פנטוברביטל נתרןHualan Bio57-33-0חומר הרדמה לפני פרפוזיה טרנסקרדיאלית (transcardial perfusion).
צלחות פטריBiosharpBS-90-Dטיפול במוח על קרח והפרדת המיספרות.
ריאגנט להפקת RNA המבוסס על פנול/גואנידיניוםSparkladeAC0101-Bריאגנט השוואה עבור ניסויי בקרה של מיצוי RNA.
תערובת מעכבי פוספטאז (Phosphatase inhibitor cocktail)APExBIOK1015-100שימור פוספורילציה במהלך מיצוי חלבונים.
סלויין בופר פוספט (Phosphate-buffered saline)BiosharpBL601Aבופר שטיפה, ממס תמיסת סוכרוז וממס קריו-פרוטקטור.
ממברנת פוליוינילידן פלואורידMilliporeIPVH08100ממברנה להעברה ב-Western blot.
Polyvinylpyrrolidone K40סיגמא9003-39-8מרכיב של תמיסת שימור קריו-פרוטקטיבית.
תערובת מעכבי פרוטאז (Protease inhibitor cocktail)BeyotimeP1045מניעת דגרדציה של חלבונים במהלך ליזיס של רקמה.
ערכה למיצוי חלבוניםלהמציאMS-026ערכה להשוואה עבור ניסויי בקרה של מיצוי חלבון כולל.
מערכת PCR בזמן אמתAmolarrayMA6000הגברה באמצעות PCR כמותי (Quantitative PCR) ואנליזה של עקומת המסה.
סודיום דודציל סולפטBioFroxx3250GR500המסת חסון חלבון והכנת דגימות ל-SDS-PAGE.
להבי תער סטרילייםBiosharpBS-RB-11הפרדת חצאי המוח וקיטום רקמה על קרח.
צמיד סטריפטאבידין-פרוקסידאזFuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720ריאגנט להגברה/גילוי של אות עבור אימונוהיסטוכימיה ב-DAB.
סוכרוזחושי57-50-1תמיסת קריו-הגנה ותמיסת שימור קריו-הגנתית.
תערובת מאסטר ל-qPCR מסוג SYBRVazymeQ711-02הגברה באמצעות PCR כמותי.
מ apparatus להעברהBio-Rad1703930העברה רטובה של חלבונים מג'ל SDS-PAGE לממברנה.
תמיסת סלין עם בופר Tris ו-Tween 20הוכן במעבדהלא רלוונטיבופר שטיפה לממברנת Western blot.
Triton X-100Sinopharm9002-93-1חדירות (Permeabilization) של חתכי מוח לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
TrizolSparkladeAC0101-B
ערכה לגילוי אימונוהיסטוכימי UltraSensitive SP (עבור נוגדן ראשוני מעכבר/ארנב)Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720נוגדן משני/סוכן זיהוי עבור אימונוהיסטוכימיה בשיטת DAB.
חולדת ויסטאר (Wistar rat)Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD280-320 גרם, זכרבעלי חיים ניסיוניים לאיסוף רקמות ממוח של חולדה, במידה ונכללו.
קסילןSinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10023418הבהרה של שקופיות שנצבעו ב-DAB לפני כיסוי בזכוכית כיסוי.
תוך הרכבה של בלסם ניטרלי Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., שנגחאי, סיןמספר קטלוג S30509, CAS 96949-21-2כיסוי בזכוכית מכסה של חתכים מיובשים שנצבעו ב-DAB.
צמיג סטרפטיווידין-פרוקסידאזFuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720ריאגנט להגברה/גילוי אות עבור אימונוהיסטוכימיה של DAB.
Triton X-100Sinopharm9002-93-1חדירות (Permeabilization) של חתכי מוח לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
ערכה לגילוי אימונוהיסטוכימי SP בעוצמה גבוהה (עבור נוגדן ראשוני של עכבר/ארנב)Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720נוגדן משני/סוכן זיהוי לצביעה אימונוהיסטוכימית ב-DAB.
קסילןSinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10023418הבהרה של סליידים שנצבעו ב-DAB לפני כיסוי בזכוכית כיסוי.

מקורות

  1. Lauwereyns J, et al. Toward a common interpretation of the 3Rs principles in animal research. Lab Anim. 2024;53(12):347-50.
  2. Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and humane experimental technique: implementing change. Animals (Basel). 2019;9(10):754.
  3. Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 2007;113(3):619-34.
  4. Basu J, Siegelbaum SA. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(11):a021733.
  5. Wu J, et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 2021;11(5):e3988.
  6. Taves MD, et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: Effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PLoS One. 2010;5(12):e15727.
  7. Jordan JT. The rodent hippocampus as a bilateral structure: A review of hemispheric lateralization. Hippocampus. 2020;30(3):278-92.
  8. Mundorf A, Ocklenburg S. Looking at both sides: Integrating data from both hemispheres is crucial in rodent neuroscience. Eur J Neurosci. 2025;62(5):e70249.
  9. Watson RE, et al. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 1986;7(1):155-9.
  10. Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides. 2004;25(3):425-31.
  11. Rajput SK, et al. A column-based rapid method for the simultaneous isolation of DNA, RNA, miRNA and proteins. Cell Biol Int. 2012;36(9):779-83.
  12. Morse SMJ, Shaw G, Larner SF. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 2006;40(1):54-8.
  13. Puchades M, Westman A, Blennow K, Davidsson P. Removal of sodium dodecyl sulfate from protein samples prior to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(5):344-9.
  14. Kachuk C, Stephen K, Doucette A. Comparison of sodium dodecyl sulfate depletion techniques for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1418:158-66.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הפרדת המיספרותצביעה מורפולוגיתאימונוהיסטוכימיהאימונופלואורסנציההקצאת רקמותהקפאה של רקמת מוחWestern Blotאנליזת qPCR

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.