פרוטוקול להפרדת חצאי המוח לצורך תצפית מורפולוגית ומיצוי משולב של RNA וחלבונים באזורי מוח של עכברים

Xinyu Zhu; Yukun Li; Lianjun Zhang; Yiyun Zou; Shanxiang Gao; Yuan Tian; Jing Xu; Chunqing Liu

doi:10.3791/71465

מאמר שיטה

פרוטוקול להפרדת חצאי המוח לצורך תצפית מורפולוגית ומיצוי משולב של RNA וחלבונים באזורי מוח של עכברים

2 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71465

⸱

1 בספטמבר 2026

Xinyu Zhu^*¹^,² , Yukun Li^*³ , Lianjun Zhang³ , Yiyun Zou³ , Shanxiang Gao³ , Yuan Tian³ , Jing Xu⁴ , Chunqing Liu¹

¹College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, ²The Transvascular Implant Instrument Research Institute, ³The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, ⁴College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מבצע חיתוך של מוחות עכברים לשני חצאים. המיספירה אחת משמשת לצביעה מורפולוגית, והשנייה לחילוץ RNA וחלבונים. אסטרטגיה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים לניסוי, עומדת בעקרונות ה-3Rs וממזערת את השונות הבין-חייתית.

תקציר

במחקר יומי במדעי העצבים, צביעות מורפולוגיות ובדיקות מולקולריות של חומצות גרעין וחלבונים דורשות בדרך כלל חיות ניסוי נפרדות, דבר הגביר את השימוש בבעלי חיים ואינו עולה בקנה אחד עם עקרון ה-3Rs לרווחת בעלי חיים. פרוטוקול זה קובע זרימת עבודה להקצאת רקמות של רקמת מוח מעכברים, המאפשרת ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מקבילים מאותו בעל חיים. לאחר פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 0.9% saline, המוח מחולק לשני המיספרים. המיספר אחד מקובע ב-4% paraformaldehyde לצורך אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה; חיתוכים המאוחסנים בתמיסת sucrose-ethylene glycol-polyvinylpyrrolidone (PVP) שומרים על איכות צביעה אמינה למשך עד שבע שנים. המיספר הנגדי נשמר בקירור ב-80 °C- להפקה משולבת של RNA וחלבון, עם תנובה המספיקה לביצוע qPCR ו-Western Blot בהמשך. בבדיקה שבוצעה על punches של 9–10 mg מהקליפה האנטורינלית (entorhinal cortex), שיטה זו מניבה תנובות RNA וחלבון נמוכות יותר מאשר הפקה נפרדת של RNA או חלבון בלבד, אך הביומולקולות שהופקו נותרות מספיקות לזיהוי מולקולרי. זרימת עבודה זו מפחיתה את צריכת בעלי החיים ומסירה הבדלים בין-אינדיבידואליים בין ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מקבילים. היא מספקת שיטה ישימה להכנת רקמות לצורך פרופיל רב-ממדי של תתי-אזורים מובחנים במוח העכבר.

מבוא

מחקרים בתחום מדעי המוח התרחבו באופן דרמטי בעשורים האחרונים, וחשפו מנגנוני מפתח השולטים בפיזיולוגיה של המוח האנושי, בהופעת מחלות נוירולוגיות ובפיתוח טיפולים. מודלים של בעלי חיים נותרים חיוניים לחקירה נוירולוגית, שכן הם מספקים פלטפורמות ניתנות לשליטה ולשחזור לבחינת התפתחות עצבית, תפקוד פיזיולוגי ותהליכים פתולוגיים. מניפולציה ניסיונית ותצפית היסטולוגית בבעיות עכברים מאפשרות לחוקרים לאפיין העברה עצבית, בניית מעגלים עצביים וקשרים בין מערכת העצבים להתנהגות. במקביל להתקדמות הטכנולוגית, האתיקה של ניסויים בבעלי חיים הפכה לסוגיה מרכזית. עקרונות ה-3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement - החלפה, צמצום ושיפור) הם כיום סטנדרטים מקובלים גלובלית לכל מחקרי בעלי החיים¹^,², והם מחייבים חוקרים למזער את השימוש בבעלי חיים תוך שמירה על תוצאות ניסיוניות מהימנות.

כלים חדשניים, כגון מערכות נוקאאוט מותנה (conditional knockout), מאפשרים מניפולציה גנטית מדויקת בתוך תתי-אזורים נפרדים של מוח העכבר³. התקדמויות אלו הניעו מחקר אינטנסיבי של מדורי מוח בקנה מידה מיקרוסקופי, כגון CA1, CA3 ו-DG של ההיפוקמפוס, המווסתים למידה, זיכרון ומצב רוח⁴. פענוח הפונקציות מסדר גבוה של אזורי מוח זעירים אלה דורש מדידות מתואמות ברמה המורפולוגית, התעתוקית ובחלבונים. למשך, נפח הרקמה המצומצם שלהם יוצר מכשולים טכניים מרכזיים לזיהוי מקבילי של מדדים מרובים.

צביעה מורפולוגית, כימות RNA וזיהוי אימונולוגי של חלבונים הן שלוש מדידות ליבה שגרתיות במדעי המוח. תכנוני מחקר מסורתיים דורשים שלוש קהילות נפרדות של עכברים כדי להשלים את שלושת סוגי הבדיקות הללו. נוהג זה מגדיל באופן דרסטי את מספר בעלי החיים המנוצלים ומכניס שונות ביולוגית ניכרת בין בעלי החיים, דבר המחליש את היכולת להשוות בין מערכי נתונים היסטולוגיים ומולקולריים. זרימת עבודה מאוחדת השולפת אותות מורפולוגיים ומולקולריים תואמים מאותו בעל חיים בודד תיתן מענה משמעותי לשתי מגבלות קריטיות אלו ותעמוד טוב יותר בעקרון ההפחתה (Reduction) של ה-3Rs.

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול הניתן לשחזור להפרדה המיספרית של רקמת מוח של עכברים. לאחר פרפוזיה סיסטמית של תמיסת סליין, המוח השלם מחולק לשני המיספריים: המיספרה אחת מקובעת לבדיקות מורפולוגיות, וההממיספרה הנגדית נשמרת בהקפאה (cryopreserved) לצורך מיצוי משותף של RNA וחלבון. רקמות שקובעו ואוחסנו במבuffer הגנה של סוכרוז-אתילנגליקול-פוליבינילפירולידון (PVP) שומרות על אותי צביעה יציבים ואיכותיים עבור אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה למשך תקופה של עד שבע שנים. תיקפנו שיטה זו באמצעות דגימות פאנץ' זעירות של 9–10 mg מהקליפה האנטורינלית (entorhinal cortex), רקמה קלה יותר מאזורים הנחקרים בדרך כלל כגון ההיפוקמפוס והקליפה הפרה-פרונטלית. הזיהוי המוצלח של דגימת רקמה זעירה זו מעיד כי תתי-אזורי מוח קטנים יותר, כגון ההיפותלמוס והאמיגדלה, תואמים אף הם לזרימת העבודה זו. על אף שהפרוטוקול מניב ריכוזי RNA וחלבון נמוכים יותר מאשר ערכות מיצוי ייעודיות למטרה בודדת, הביומולקולות המבודדות בעלות איכות מספקת לתמיכה בניתוחי qPCR ו-Western blot סטנדרטיים. זרימת עבודה זו מפחיתה את כמות בעלי החיים המשמשים למחקר ומסירה הבדלים בין-אישיים בין ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מזווגים. היא מספקת שיטה ישימה להכנת רקמה לצורך פרופיל רב-ממדי של תתי-אזורי מוח נפרדים בעכברים.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה

כל ניסויי בעלי החיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דליאן לרפואה (אישור מס׳ AEE18026 עבור ניסויי חולדות ומס׳ AEE24261 עבור ניסויי עכברים), הרפובליקה העממית של סין. כל הפרוטוקולים הניסויים יושמו בהתאם להנחיות האתיקה לבעלי חיים במעבדה ועמדו באופן מלא בעקרונות ה-3Rs (צמצום, החלפה ושיפור) עבור ניסויים בבעלי חיים. לאורך כל תהליך הניסוי, ננקטו אמצעים קפדניים כדי להקל ביעילות על סבל ומצוקה של בעלי החיים. במקביל, מספר בעלי החיים בניסוי הוגבל לכמות המינימלית הנדרשת כדי להבטיח את המהימנות והתקפות של תוצאות הניתוח הסטטיסטי. ראו את טבלת החומרים לרשימה מלאה של הריאגנטים, consumables והציוד ששימשו בפרוטוקול זה.

1. הכנת חיות ניסוי וניתוח לפרפוזיה טרנס-קרדיאלית

הרדמה והכנה טרום-ניתוחית
1. עבור פרוטוקול זה, השתמשו בחולדות זכרים בוגרות מסוג Sprague-Dawley או בעכברים מסוג C57BL/6 בדרגת SPF (נקיים מפתוגנים ספציפיים). שכן את בעלי החיים בסביבה מבוקרת טמפרטורה (22 ± 2 °C) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. ספקו לבעלי החיים גישה חופשית (ad libitum) למזון ומים סטריליים.
2. הזריקו לבעלי החיים sodium pentobarbital בהזרקה תוך-בטנית (intraperitoneal) במינון של 80 mg/kg עבור חולדות או 50 mg/kg עבור עכברים כדי להשרות הרדמה (ראו איור 1).
הליך פרפוזיה טרנסקרדיאלית (Transcardial perfusion)
1. קבעו את בעלי החיים המורדמים בתנוחת שכיבה על הגב (supine) על לוח ניתוחים.
2. גזרו את דופן הבטן לאורך קו האמצע, מהתהליך החרבני (xiphoid process) ועד לסימפיזה הפוביס, באמצעות מספריים ישרים. גזרו את דופן בית החזה הצידית משני הצדדים כדי לחשוף את הלב במלואו.
3. בצעו פרפוזיה לבעל החיים עם תמיסת סליין נורמלית 0.9% קרה מאוד (ice-cold) בקצב זרימה קבוע: 100–150 mL במשך 10–15 דקות עבור חולדות, ו-20–30 mL במשך 5–8 דקות עבור עכברים.
הוצאת המוח והפרדת המיספרים
1. בצעו עקירה (decapitation) לבעלי החיים באמצעות מספרי ניתוח גדולים לאחר השלמת הפרפוזיה. גזרו את הקרקפת לאורך קו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת.
2. השתמשו בשפכטל סטרילי כדי להרים בעדינות את המוח מחלל הגולגולת. העבירו במהירות את המוח השלם לצחנת פטרי סטרילית המונחת על קרח.
3. השתמשו בסכין גילוח סטרילית וללא RNase כדי לחלק את המוח באופן סימטרי להמיספרים שמאלי וימני לאורך התפר הסגיטלי.
4. העבירו מיד את ההמיספר השמאלי למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL המכילה 10 mL של תמיסת paraformaldehyde 4% קרה מאוד לצורך קיבוע. העבירו את ההמיספר הימני למבחנת שימור קפואה (cryopreservation tube) מסומנת וללא RNase, הקפיאו אותה במהירות בחנקן נוזלי, ושמרו אותה בטמפרטורה של -80 °C עד למיצוי ה-RNA והחלבונים.

2. קיבוע רקמת מוח, חיתוך ואחסון לטווח ארוך

קיבוע והתייבשות
1. טבלו את ההמיספירה השמאלית לחלוטין בתמיסת פאראפורמאלדהיד 4% וקבעו את הרקמה בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 h. עם סיום הקיבוע, העבירו את המיספירה של המוח לפ menutupל צנטריפוגה של 15 mL המכיל תמיסת סוכרוז 30%, ובצעו התייבשות לרקמה בטמפרטורה של 4 °C.
2. החליפו את תמיסת הסוכרוז 30% בכל 24 h עד שרקמת המוח שוקעת לתחתית הפפירה.
הכנת חתכים קריוסטטיים
1. הוציאו את המיספירה המיובשת של המוח מתמיסת הסוכרוז וסננו בעדינות נוזלים עודפים בעזרת נייר סינון סטרילי.
2. הצמידו את המיספירה של המוח למסך הדגימות של הקריוסטט באמצעות חומר שיכון OCT (optimal cutting temperature).
3. בצעו חתכים קורונליים סדרתיים של המוח בעובי של 30 µm באמצעות קריוסטט. אספו חתכים עוקבים לפלטה של 24 בארות המכילה 0.01 M PBS סטרילי.
אחסון ארוך טווח של חתכי מוח
1. הכינו מראש את תמיסת השימור הקריו-פרוטקטיבית לפלחי מוח: הוסיפו 2 g של PVP400, 60 g של סוכרוז ו-60 mL של אתילן גליקול ל-100 mL של 0.01 M PBS. ערבבו את התמיסה בטמפרטורת החדר עד שכל הרכיבים נמסו לחלוטין ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש.

3. מיצוי RNA באמצעות TRIzol

הומוגניזציה של רקמה והפרדת פאזות
1. יש לבצע הומוגניזציה של רקמת קליפת הקורטקס האנטורינלי ב-1 mL של TRIzol reagent באמצעות הומוגנייזר אולטרה-פיין ולהדגיר את ההומוגנאט על קרח למשך 15 min. יש לסבב בצנטריפוגה במהירות של 8,000 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C.
2. הוסף 200 µL של כלורופורם וערבב בורטקס למשך 10 s. סבב בצנטריפוגה במהירות של 5,600 × g למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבר את הפאזה המימית העליונה לפחית נטולת RNase. הוסף 500 µL של איזוֹפרוֹפָּנוֹל והדגיר בטמפרטורה של -20 °C למשך לילה כדי להשקיע את ה-RNA. סבב שוב בצנטריפוגה.
השקעת RNA, שטיפה ובקרת איכות
1. שפוך את הנוזל העליון ושטוף את משקע ה-RNA ב-1 mL של 75% ethanol. סבב בצנטריפוגה במהירות של 5,600 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4 °C. הסר את הנוזל העליון, ייבש את המשקע באוויר למשך 10 min, והמס את ה-RNA ב-20 µL של מים שעובדו ב-DEPC למשך 10 min.
2. מדוד את ריכוז ה-RNA ואת טהורתו (A₂₆₀/A₂₈₀) באמצעות ספקטרופוטומטר. שמור את ה-RNA בטמפרטורה של -80 °C עד לניתוחים נוספים.

4. מיצוי חלבון כולל באמצעות ערכת Minute

ליסיס והומוגניזציה של רקמה
1. קררו מראש את עמודת הספין (spin column) ואת מבחנת האיסוף על קרח. הומוגניזיו את הרקמה ב-100 µL של באפר לליסיס תאים באמצעות הומוגניזר ultrafine. שטפו את ההומוגניזר ב-100 µL נוספים של באפר לליסיס תאים ואחדו את הליסאטים.
השבה וכמות חלבון
1. העבירו את ההומוגנאט לעמודת הספין והדגירו למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
2. סובבו בצנטריפוגה במהירות של 11,000–14,300 × g למשך 2 דקות.
3. הניחו את מבחנת האיסוף על קרח מיד לאחר הצנטריפוגה והשליכו את עמודת הספין. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.

5. מיצוי בו-זמני של RNA וחלבון מקליפת המוח האנטורינלית (9–10 mg)

הכנה מקדימה לניסוי והכנת ריאגנטים
1. השתמשו בערכת DNA/RNA/protein עבור כל שלבי המיצוי. השתמשו אך ורק בחומרים מתכלים מאושרים נקיים מ-RNase ו-DNase (ראו איור 2).
2. הכינו את באפר הליזיס (lysis buffer) מיד לפני השימוש: הוסיפו תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail) לבאפר הליזיס המסופק בערכה בדילול של 1:100.
ליזיס רקמות והפרדת פאזות
1. הוציאו את חצי המוח הימני הקפוא מאחסון ב-80 °C- והניחו אותו על קרח. השתמשו במנקב (punch) סטרילי ונקי מ-RNase כדי לאסוף 9–10 mg של רקמה מאזור המוח המיועד.
2. בצעו הומוגניזציה מלאה של הרקמה על קרח באמצעות הומוגניזר רקמות חשמלי עד שלא יישארו רסיסי רקמה נראים לעין. הדגירו את ההומוגנאט על קרח למשך 10 min כדי להבטיח ליזיס מלא.
3. הוסיפו 200 µL של ריאגנט ההפרדה המסופק בערכה להומוגנאט. בצעו וורטקס (vortex) חזק למבחנה למשך 30 s והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 3 min. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 15 min ב-4 °C כדי להשיג הפרדת פאזות מלאה.
טיהור RNA ואלוציה
1. אספו בזהירות את הפאזה המימית העליונה באמצעות טיפ פפיטה נקי מ-RNase. העבירו את הפאזה המימית שנאספה למבחנה חדשה של 1.5 mL נקייה מ-RNase. הוסיפו נפח שווה של 100% ethanol לפאזה המימית שנאספה וערבבו.
2. העבירו 700 µL מהתערובת לעמודת טיהור ה-RNA המסופקת בערכה. צנטריפוגו את העמודה ב-5,600 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר.
3. הוסיפו 500 µL של באפר שטיפת RNA 1 המסופק בערכה לעמודה. צנטריפוגו את העמודה ב-5,600 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר.
4. הוסיפו 500 µL של באפר שטיפת RNA 2 המסופק בערכה לעמודה, וצנטריפוגו שוב. צנטריפוגו את העמודה הריקה ב-8,000 × g למשך 2 min בטמפרטורת החדר כדי להסיר לחלוטין שאריות ethanol מממברנת העמודה.
5. העבירו את העמודה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה של 1.5 mL נקייה מ-RNase. הוסיפו 30–50 µL של מים נקיים מ-RNase (שחוממו מראש ל-60 °C) ישירות למרכז ממברנת העמודה. הדגירו את העמודה בטמפרטורת החדר למשך 2 min. צנטריפוגו את העמודה ב-8,000 × g למשך 1 min בטמפרטורת החדר כדי לבצע אלוציה של ה-RNA.
השקעת חלבונים והמסה
1. הוסיפו 750 µL של isopropanol לפאזה האורגנית ולפאזה הביניים שנותרו במבחנה המקורית לאחר הסרת הפאזה המימית למיצוי RNA. הדגירו את התערובת ב-20 °C- למשך 30 min כדי להשקיע את החלבונים.
2. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 10 min ב-4 °C. השליכו את הסופרנטנט (נוזל העל) ושמרו על משקע החלבון שלם בתחתית המבחנה.
3. הוסיפו 1 mL של 95% ethanol למשקע החלבון. בצעו וורטקס קצר למבחנה כדי לשטוף את המשקע. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 5 min ב-4 °C והשליכו את הסופרנטנט. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות.
4. ייבשו את משקע החלבון באוויר בטמפרטורת החדר למשך 5–10 min עד שהמשקע הופך שקוף ולא נראות שאריות ethanol.
5. הוסיפו 50–100 µL של תמיסת 5–10% SDS למשקע המיובש. בצעו וורטקס חזק למבחנה למשך 1 min והדגירו אותה על קרח למשך 10 min כדי להמיס את החלבון באופן מלא. צנטריפוגו את המבחנה ב-8,000 × g למשך 5 min ב-4 °C. אספו את הסופרנטנט כתמצית החלבון הסופית.

6. צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC)

טיפול מקדים של חתכים והשבתה של אנזימים אנדוגניים
1. הוצא את חתכי המוח מאחסון בקריו-פרוטקטור בטמפרטורה של -20 °C. השתמש במחט זכוכית כדי להעביר את החתכים לפלטה בעלת 24 בארות המכילה 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. שטוף את החתכים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, במשך 5 min לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר על שייקר.
3. דגרי את החתכים עם חוסם פריוקסידאז של 3% מימן בטמפרטורת החਦਰ למשך 10 min כדי להשבית פעילות פריוקסידאז אנדוגנית. חזור על שלבי השטיפה לאחר החסימה.
החדרה (Permeabilization) וחסימה לא ספציפית
1. דגרי את החתכים ב-0.5% Triton X-100 למשך 30 min בטמפרטורת החדר על שייקר לצורך חדירה לממברנת התא. חזור על שלבי השטיפה.
2. דגרי את החתכים ב-4% bovine serum albumin למשך 30 min בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרי עם מעכב צביעה לא ספציפי למשך 30 min נוספים בטמפרטורת החדר.
דגירה של נוגדנים ראשוניים ושניוניים
1. דלל נוגדנים ראשוניים בתמיסת 1% BSA בדילולים האופטימליים הבאים: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000), ו-glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
2. הוסף 200 µL של תמיסת נוגדן ראשוני מדולל לכל בארה, תוך הבטחת טבילה מלאה של החתכים.
3. הוסף 200 µL של נוגדן שניוני מסומן בביוטין לכל בארה. דגרי את החתכים בטמפרטורת החדר למשך 30 min.
4. שטוף את החתכים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, במשך 5 min לכל שטיפה. הוסף 300 µL של תצמידי streptavidin-peroxidase לכל בארה. דגרי את החתכים בטמפרטורת החדר למשך 30 min. חזור על שלבי השטיפה לאחר הדגירה.
פיתוח כרומוגני של 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) והצמדת זכוכית
1. הוסף 200 µL של תמיסת עבודה של DAB לכל בארה. עקוב אחר התגובה הכרומוגנית תחת מיקרוסקופ אור.
2. הצמד את החתכים לשקופיות זכוכית מצופות ג'לטין באמצעות מחט זכוכית. ייבש את השקופיות לחלוטין באוויר בטמפרטורת החדר.
3. בצע דהידרציה לשקופיות באמצעות סדרת אתנול מדורגת (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% אתנול, 5 min לכל שלב), ולאחריהם ביצוע שקיפות (clearance) ב-xylene פעמיים, 5 min בכל פעם.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF)

טיפול מקדמי של נתחים וחדירות (Permeabilization)
1. הוצא את נתחי המוח מאחסון במגן קריוגני בטמפרטורה של -20 °C. העבר את הנתחים לפלטה בעלת 24 בארות המכילה 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. שטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 5 דקות לכל שטיפה, בטמפרטורת החדר על שייקר.
3. דגור את הנתחים ב-0.5% Triton X-100 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
4. שטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 10 דקות לכל שטיפה, לאחר תהליך החדירות.
חסימה ודגירה עם נוגדן ראשוני
1. דגור את הנתחים בתמיסת חסימה המכילה 4% BSA ומעכב צביעה לא ספציפי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח.
2. שאב את תמיסת החסימה. דלל נוגדים ראשוניים בתמיסת 1% BSA בריכוזים אופטימליים והוסף 300 µL של תמיסת הנוגדן הראשוני המדוללת לכל בארה. דגור את הנתחים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C בתא לח ומוגן מאור.
דגירה עם נוגדן משני
1. חמם מחדש את הנתחים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בחושך למחרת. שאב את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטוף את הנתחים שלוש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 10 דקות לכל שטיפה, על שייקר בחושך.
2. דלל נוגדים משניים מצומדים לפלואורופור בתמיסת 1% BSA לפי הדילול המומלץ על ידי היצרן. הוסף 300 µL של תמיסת הנוגדן המשני לכל בארה. דגור את הנתחים בטמפרטורת החדר למשך 1–2 שעות בחושך.
3. שטוף את הנתחים חמש פעמים עם 0.01 M PBS, למשך 5 דקות לכל שטיפה, בחושך.

8. אנליזת PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

הסרת gDNA מ-RNA ושעתוק הפוך
1. בצע שעתוק הפוך לסנתזת cDNA באמצעות ערכה לשעתוק הפוך, עם 1 µg של RNA כולל ל-20 µL של מערכת התגובה. השתמש בתוכנית המחזורים התרמיים המומלצת על ידי היצרן: 25 °C למשך 5 min, 50 °C למשך 15 min, 85 °C למשך 5 min, ושמירה ב-4 °C.
2. דלל את ה-cDNA המסנתז ביחס של 1:5 עם מים נקיים מ-RNase. שמור את ה-cDNA בטמפרטורה של -20 °C עד להגברה ב-qPCR.
הכנת מערכת qPCR והגברה
1. הכן את מערכת תגובת ה-qPCR על קרח במכסה PCR ייעודי ונקי מ-RNase. מערכת תגובה של 20 µL כוללת: 10 µL של qPCR Master Mix,‏ 0.4 µL של פריימר קדמי (10 µM),‏ 0.4 µL של פריימר אחורי (10 µM),‏ 2 µL של תבנית cDNA מדוללת, ו-7.2 µL של מים נקיים מ-RNase.
2. בצע הגברת qPCR באמצעות התוכנית הבאה: 95 °C למשך 30 s של דנטורציה ראשונית; 40 מחזורים של 95 °C למשך 10 s ו-60 °C למשך 30 s; לאחר מכן ניתוח עקומה של דיסוציאציה מ-60 °C עד 95 °C, בגידולים של 0.5 °C בכל 5 s.

9. Western blot

כימות חלבונים והכנת דגימה
1. דללו את תמריתי החלבון לריכוזים שווים באמצעות תמיסת SDS בריכוז 5–10%, בהתבסס על תוצאות בדיקת BCA.
אלקטרופורזה ב-SDS-PAGE והעברת חלבונים
1. הכינו ג'ל הפרדה SDS-PAGE בריכוז 10% וג'ל ריכוז (stacking gel) בריכוז 5% בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית.
2. העמיסו 20 µg של חלבון כולל לכל באר בג'ל. עבור ניסויי העמסה במדרג, העמיסו 15 µg, 30 µg ו-45 µg של חלבון לכל באר.
3. בצעו אלקטרופורזה במתח של 80 V למשך 30 דקות עד שהמרקר של החלבונים נכנס לג'ל ההפרדה, ולאחר מכן הגבירו את המתח ל-120 V למשך 60–90 דקות עד שצבע הברומופנול בלו (bromophenol blue) מגיע לתחתית הג'ל.
4. הרכיבו את "סנדוויץ' ההעברה" בסדר הבא (מהקתודה לאנודה): ספוג, נייר סינון, ג'ל, ממבנאת PVDF, נייר סינון וספוג. ודאו שלא נשארו בועות אוויר בין הג'ל לממברנה.
5. בצעו העברה רטובה (wet transfer) בזרם קבוע של 300 mA למשך 90 דקות באמבט קרח.
חסימת ממברנה ודגירה עם נוגדנים
1. שטפו קצרות את ממבנאת ה-PVDF בתמיסת TBST לאחר השלמת ההעברה. דגרו את הממברנה ב-5% BSA למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים.
2. דללו את הנוגדנים הראשוניים בתמיסת 5% BSA בריכוזים אופטימליים. דגרו את הממברנה עם תמיסת הנוגדן הראשוני למשך לילה ב-4 °C על שייקר.
3. שטפו את הממברנה שלוש פעמים בתמיסת TBST, 10 דקות לכל שטיפה, על שייקר למחרת.
4. דללו נוגדן משני המשורשר ל-horseradish peroxidase (HRP) בתמיסת חלב דל שומן 5% בדילול המומלץ על ידי היצרן. דגרו את הממברנה עם תמיסת הנוגדן המשני למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר.
5. שטפו את הממברנה שלוש פעמים בתמיסת TBST, 10 דקות לכל שטיפה, לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני. דגרו את הממברנה עם תמיסת substrat מסוג ECL למשך 1–2 דקות בחושך.

תוצאות

הערכת ריכוז RNA,האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-qPCR

כפי שמוצג, RNA וחלבון כוללים הופקו יחד מדגימות (punches) של קליפה אנטורינלית (9–10 mg) באמצעות ערכת DNA/RNA/protein. דגימות מקבילות שעובדו עם TRIzol (עבור RNA) או עם ערכת הפקת חלבון שימשו כביקרות. הפרוטוקול הניב 235 ± 12 ng µL⁻¹ RNA, פחות ב-36 % מאשר ב-TRIzol (p < 0.05) (Figure 3A). למרות זאת, ג'לים של אגרוז גילו פסי 28S ו-18S rRNA חדים ואותות 5S, המעידים על RNA שלם (Figure 3B). qPCR עבור CD86, IL-1β, TNF-α ו-IL-6 הניב עקומות דיסוציאציה סימטריות ובודדות (Figure 3C), ונצפו ערכי Ct נמוכים יותר בקבוצה זו (Figure 3D); עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים, כולל ניתוחי שלמות של RNA, כדי לקבוע אם הבדלים אלו משקפים איכות RNA משופרת או יעילות הפקה גבוהה יותר. למרות שתפוקת ה-RNA הייתה נמוכה מזו שהתקבלה בהפקה באמצעות TRIzol, פסי 28S ו-18S rRNA מובחנים ועקומות הגברה ספציפיות ב-qPCR העידו על כך שה-RNA שהופק היה באיכות מספקת עבור אנליזות qPCR המשך.

הערכת ריכוז חלבון, SDS-PAGE ואנליזה באמצעות Western blot

בדומה לנתוני ה-RNA, פרוטוקול ההפקה הכפול הניב ריכוזי חלבון כולל נמוכים יותר מאשר ערכת החלבון (p < 0.05). עם זאת, סמיכות מערב западית (Western blot) חשפה פסות תגובתיות חיסונית חזקות באופן משמעותי עבור כל יעד שנבדק (איור 4A). בדומה לתוצאות כימות ה-RNA, פרוטוקול השליפה המשותפת של RNA וחלבון משחזר פחות חלבון כולל מאשר ערכת החלבון הייעודית בעלת המטרה הבודדת, דבר שניתן להבחין בו באמצעות צביעת CBB של כלל החלבונים (איור 4B–C). חלבון הבית β-Tubulin הראה פסות ברורות ויציבות תחת שתי שיטות ההפקה, עם עוצמת אות דומה. חלבון ULK, הנמצא בריכוז נמוך, זוהה אף הוא בהצלחה בדגימות השליפה המשותפת. בולט במיוחד כי אותות הפסות של PSD-95, p-ERK ו-p-NFκB p65 היו חזקים משמעותית בקבוצת השליפה המשותפת ביחס לערכת הפקת החלבון הבודדת. טעינה סדרתית של חלבון מ-15 µg עד 45 µg יצרה מדרגי פסות תלויי-מינון עבור כל היעדים שזוהו בשתי הקבוצות. לסיכום, למרות שתפוקת החלבון הכוללת של זרימת העבודה להפקה כפולה נמוכה יותר, איכות החלבון מספקת לניתוח Western blot סטנדרטי, וביצועי הזיהוי הכלליים אינם נחותים מערכות הפקה קונבנציונליות של חלבון בודד.

אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה

אימונוהיסטוכימיה של חתכי מוח שנשמרו למשך 0.5–7 שנים חשפה סימון חזק של נוירונים רכים DCX⁺, תאים הפרשתיים AVP⁺, ונוירונים MAP2/NeuN⁺ עם מורפולוגיה וסיבים שלמים (איור 5A). אימונופלואורסצנציה של חתכים בני 5–7 שנים הראתה אסטרוציטים GFAP⁺ ברורים, מיקרוגליה Iba-1⁺, ונוירונים פעילים FosB⁺ (איור 5B). חתכים מייצגים שנשמרו למשך 0.5–שבע שנים שימרו אותות אימונוהיסטוכימיים ואימונופלואורסצנטיים שניתן לזיהוי תחת התנאים שנבדקו. לפיכך, תמיסת השימור שומרת על שלמות הרקמה ועל האנטיגניות, ובכך מאפשרת אחסון אמין לטווח ארוך.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה משולבת להפרדת המיספירות לצורך זיהוי מורפולוגי ומולקולרי של המוח. סכימה זו ממחישה את כל השלב הניסויים, כולל פרפוז סליני טרנסקרדיאלי למכרסמים, חלוקה לשניים של המוח השלם המבודד בקו האמצע, קיבוע והכנת חיתוכי קריו של ההמיספירה השמאלית לצביעת IHC/IF, ושמירה בקריו של ההמיספירה הנגדית לצורך מיצוי סימולטני של RNA וחלבון, qPCR ואנליזת Western blot. כל איורי העכברים הופקו במקור על ידי Jimeng AI. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

figure-results-2
איור 2תהליך עבודה להפקה סימולטנית (מקבילית) של RNA וחלבון מרקמת מוח קפואה של מכרסמים. התרשים מציג שלבים עוקבים הכוללים דגימה (punching) של רקמת מטרה מהמיספרות קפואות, ליזיס של הרקמה והפרדה תלת-פאזית, טיהור ואלוציה של RNA עבור qPCR, וכן שקיעת חלבונים, שטיפה והמסה להכנת דגימות עבור זיהוי בשיטת Western blot. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הערכת תבעת RNA, שלמות ה-RNA ותאימות ל-qPCR באמצעות דגימות במיקרו-קנה מידה של קליפת הקורטקס האנטורינלי בחולדה. (A) ריכוזי RNA שקומיתו בוצעה באמצעות ערכת co-extraction לעומת שיטת TRIzol (ממוצע ± SEM). (B) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה המראה פסים של rRNA 28S ו-18S שלמים משתי קבוצות ההפקה. (C) עקומות המסה בודדות מאשרות הגברה ספציפית של גנים דלקתיים מטרים ושל GAPDH כגן ייחוס. (D) ערכי Ct של גנים דלקתיים שזוהו תחת כמות קלט של RNA זהה בשתי שיטות הפקה. *p < 0.05, **p < 0.01 לעומת קבוצת TRIzol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4הערכת Western blot של חלבונים שחולצו באמצעות פרוטוקול קו-אקסטרקציה (מיצוי משותף) של RNA/חלבון. (A) טעינת חלבון במדרג (15/30/45 µg) המראה אותי פסים תלויים במינון של חלבוני סינפסה ואיתות. (Bגילוי חלבון ULK1 בעל משקל מולקולרי גבוה באמצעות צביעת חלבוני CBB (Coomassie Brilliant Blue) כוללת כייחוס להטענה.Cהשוואת Western blot בטעינה שווה של חלבוני מטרה בין שני תהליכי מיצוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: צביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנטית של חתכי מוח צפים חופשייה שנשמרו למשך 0.5–7 שנים. (A) מיקרוגרפים של צביעה אימונוהיסטוכימית בשדה בהיר שתועדו בהגדלה של 200× ו-400×. צביעה של DCX ו-AVP בוצעה בדגימות רקמה של עכבר, בעוד שצביעה של MAP2 ו-NeuN בוצעה בדגימות רקמה של חולדה. (B) תמונות אימונופלואורסצנציה מייצגות שהתקבלו מדגימות רקמה של חולדה. GFAP מסמן אסטרוציטים, IBA-1 מסמן מיקרוגליה, ו-FOSB מעיד על פעילות נוירונלית. כל ניסויי צביעת האימונופלואורסצנציה המוצגים בפאנל זה בוצעו באמצעות דגימות של חולדה כדי להעריך ביטוי של סממנים נוירונליים ולוקליזציה תאית, מיקרוגרפים בהגדלה של 200×. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במחקר בעכברים, ניתוחים מורפולוגיים ובדיקות של חומצות גרעין/חלבונים דורשים לרוב דגימות בעלי חיים נפרדות בשל נהלי ההכנה השונים שלהם. דבר זה מגביר את מספר בעלי החיים המשמשים למחקר ומכניס שונות ביולוגית בין בעלי חיים, מה שעלול להפחית את היכולת להשוות בין מערכי נתונים היסטולוגיים ומולקולריים. כדי להתגבר על מגבלות אלו, פיתחנו זרימת עבודה המאפשרת להפיק נתונים היסטולוגיים ומולקולריים מאותו בעל חיים.

העיצוב המרכזי של זרימת העבודה הזו הוא הקצאה המיספירה של רקמת מוח לאחר פרפוזיה טרנסקרדיאלית עם 0.9% saline⁵^,⁶. המיספירה אחת מקובעת ב-4% paraformaldehyde לצורך אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה, בעוד שהמיספירה הנגדית מאוחסנת ב-−80 °C לצורך co-extraction של RNA וחלבון, qPCR ו-Western blotting בעתיד. עם זאת, ייתכן שהמדדים הנבחרים לא יהיו ברי השוואה באופן מלא בין שתי המיספירות המוחיות. לטרליזציה מבנית ותפקודית תועדה במוחות של מכרסמים, והבדלים מיספירים שכאלו עשויים להוסיף שונות כאשר ניתוחים מבוצעים בצדדים מנוגדים⁷^,⁸. לכן, על חוקרים לבחור בעקביות רקמה מאותה המיספירה מוחית בהתאם למטרות המחקר שלהם.

יתרון בולט של שיטה זו הוא השימור לטווח ארוך של חתכי מוח צפים וקבועים. לאחר דהידרטציה באמצעות 30% sucrose, חתכים קורונליים בעובי 30 µm מאוחסנים בתמיסת שימור של sucrose-ethylene glycol-PVP. מחקרים קודמים הראו כי תמיסות קריו-פרוטקטיב של sucrose–ethylene glycol–PVP מסייעות בשימור המורפולוגיה של הרקמה והאנטיגניות במהלך אחסון לטווח ארוך⁹^,¹⁰. עם זאת, מחקרים מעטים העריכו משכי אחסון הנפרשים על פני מספר שנים. נתוני המעבדה שלנו מרחיבים ממצאים אלה: חתכים מייצגים שנשמרו למשך עד שבע שנים שימרו אותות אימונוהיסטוכימיים ואותות של אימונופלואורסנציה הניתנים לזיהוי תחת התנאים שנבדקו. תצפיות אלו תומכות בהיתכנות של אחסון חתכי מוח צפים למשך מספר שנים לצורך ניתוחים רטרוספקטיביים וניסויי מעקב.

ראוי לציין כי תהליך עבודה זה מציע יתרון מרכזי נוסף באמצעות מיצוי משותף כפול של RNA וחלבון מהמיספרה אחת קפואה של המוח. למרות שפרוטוקול מיצוי משותף זה מניב כמויות RNA וחלבון נמוכות מעט משיטות מיצוי קונבנציונליות של מטרה בודדת, הביומטריאלים המתקבלים עדיין מספיקים לזיהוי חסון באמצעות qPCR ו-Western blot. באופן קריטי, מיצוי משותף מאפשר כימות של שפע התמלילים והחלבונים מאותן דגימות רקמה בדיוק, ובכך מבטל שונות ביולוגית הנובעת מעיבוד נפרד של דגימות ומאפשר פרופיל מולקולרי משולב ועקבי ביותר¹¹^,¹². יתרה מכך, גישה זו דורשת מסה קטנה של רקמה, בערך 9–10 mg, מה שהופך אותה למתאימה מאוד לניתוחים של תתי-אוכלוסיות מובחנות וספציפיות לאזורים במוח עם זמינות דגימות מוגבלת.

למרות יתרונות משמעותיים אלו, למתודה זו ישנן גם מגבלות מסוימות שחשוב לציין. ראשית, תנובות ה-RNA והחלבון הנמוכות יחסית עשויות להגביל את ישימותה בניסויים הדורשים כמויות גדולות של חומצות גרעיניות או חלבונים, כגון טיהור חלבונים בקנה מידה רחב או ריצוף RNA בעומק גבוה. שנית, בעוד שאחסון לטווח ארוך של חתכים יעיל למשך שבע שנים, עדיין עלול להתרחש פירוק הדרגתי של אנטיגנים לביליים מסוימים או של חומצות גרעיניות לאורך תקופות ממושכות, דבר שעלול לפגוע בעוצמת הצביעה או ברגישות הגילוי המולקולרי. שלישית, המתודה מותאמת כיום לרקמת מוח של עכברים ועשויה לדרוש התאמה ליישום ברקמות אחרות או במודלים חלופיים של בעלי חיים, כיוון שהרכב הרקמה והמאפיינים המבניים משתנים בין מינים ואיברים שונים. לבסוף, 5–10% SDS עלולים להפריע לספקטרומטריית מסות, לבדיקות פעילות אנזימטית, למחקרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון¹³^,¹⁴, וליישומים אחרים הרגישים ל-SDS. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך בפרוצדורות נוספות להסרת דטרגנטים או להחלפת בופר.

לסיכום, זרימת עבודה זו של הקצאה המיספרית מאפשרת ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים מקבילים מאותו בעל חיים, תוך הפחתת מספר בעלי החיים בשימוש והפחתת השונות בין בעלי חיים שונים. זרימת עבודה זו תהיה שימושית במחקרים הדורשים ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים מקבילים, ובמיוחד כאשר זמינות הרקמה מוגבלת. היכולת לאחסון נתחים לטווח ארוך עשויה לסייע גם לניתוחים רטרוספקטיביים ולארכיונ של דגימות סטנדרטי, בעוד שהשימוש בדגימות קטנות מאזורי מוח תומך במחקרי אזורים ספציפיים. המגבלות העיקריות שלה הן תנובת RNA וחלבון נמוכה יותר, אסימטריה המיספרית פוטנציאלית, הגבלה לרקמת מוח של עכברים ותאימות מוגבלת ליישומים הרגישים ל-SDS. מחקרים עתידיים צריכים למטב את השחזור של ביו-מולקולות, לתקף את זרימת העבודה ברקמות ובמינים אחרים, ולהעריך את היציבות לטווח ארוך של מטרות מולקולריות נוספות.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגש הדדיים פיננסיים ידועים או מערכות יחסים אישיות שעלולות היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, נקיות מ-RNase	Axygen	MCT-150-C-S	איסוף דגימות רקמה בשיטת פאנץ' (tissue punches) והפרדת פראקציות להפקת RNA וחלבון.
מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 15 מ"ל	ביופילם	CFT010150	קיבוע, דהידרציה בסוכרוז ואחסון תמיסות.
פלטות גידול תאים בעלות 24 באריים	NEST	702001	איסוף, צביעה ואחסון לטווח ארוך של חתכי מוח צפים באופן חופשי.
תמיסת סוכרוז 30%	הוכן במעבדה	לא רלוונטי	הגנה קריוגנית של חצאי המוח מקובעים לפני חיתוך קריוסטטי.
תמיסת פאראפורמאלדהיד 4%	Biosharp	BL539A	קיבוע בטבילה של המיספרת המוחית המיועדת לבדיקת מורפולוגיה.
5× בופר טעינה לחלבונים	Beyotime Biotechnology	DL101	הכנת דגימות חלבון ל-SDS-PAGE.
אגרוז	Solarbio	קט: A8201	הערכת שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
נוגדן אנטי-דאבלקורטין (Anti-doublecortin antibody)	Abcam	ab18723	נוגדן ראשוני לצביעה אימונוהיסטוכימית של doublecortin.
נוגדן Anti-ERK	Beyotime	AB2014	נוגדן ראשוני עבור Western blotting של ERK כולל.
נוגדן Anti-GFAP	Abcam	ab10062	נוגדן ראשוני עבור אימונופלואורסצנציה של חלבון חומצתי סיבי גליאלי (glial fibrillary acidic protein).
נוגדן Anti-Iba1	Wako	NCNP24	נוגדן ראשוני עבור אימונופלואורסצנציה של מולקולת מתאם קושרת סידן מיונן 1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1).
נוגדן Anti-NeuN	Millipore	A60	נוגדן ראשוני לצביעת אנטיגן גרעיני עצבי.
Anti-NF-κנוגדן B p65	HUABIO	ET1603-12	נוגדן ראשוני ל-NF-κוסטרן בלוטינג של B p65.
נוגדן Anti-phospho-ERK	Beyotime	ET1610-13	נוגדן ראשוני ל-Western blotting של ERK מפוספור.
נוגדן Anti-PSD95	HUABIO	ET1602-20	נוגדן ראשוני עבור Western blotting של PSD95.
נוגדן Anti-ULK1	HUABIO	ET1704-63	נוגדן ראשוני עבור Western blotting של ULK1.
אנטי-βנוגדן ל-tubulin	ABclonal	AC021	נוגדן ראשוני לבקרת העמסה עבור Western blotting.
תוסף למניעת דהייה (Antifade) למדיום קיבוע פלואורסצנטי	Beyotime	P0126-5	תוך הרכבה עבור חיתוכים שנצבעו באימונופלואורסצנציה.
ערכה לזיהוי פראוקסידאז באמצעות ביוטין-סטרפטאווידין	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	מערכת זיהוי משנית עבור אימונוהיסטוכימיה של DAB.
אלבמין משרת בקר	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	תמיסת חסימה לצביעה אימונוהיסטוכימית ול-Western blotting.
עכברי C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	עכברי C57BL/6 בני 4 שבועות	בעלי חיים ניסיוניים לאיסוף רקמת מוח מעכבר, במידה ונכללו.
מערכת לדימות כימילומינצנציה	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	גילוי אותות כימילומינסנציה ב-Western blot.
מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקלי	Leica Microsystems CMS GmbH	מספר סידורי: 591974	רכישת תמונות עבור חתכים באימונופלואורסצנציה.
תמיסת שימור עם חומר מגן מפני קיפאון (Cryoprotectant)	הוכן במעבדה	לא רלוונטי	אחסון לטווח ארוך של חיתוכי מוח צפים באופן חופשי ב- −20 °C.
קריוסטט	Leica	CM1950	הכנה של 30 μm חתכים קורונליים של המוח.
ערכה לתסבסומט כרומוגני DAB	סיגמא	SLBP7387V	פיתוח כרומוגני עבור אימונוהיסטוכימיה.
תמיסה לצביעת גרעינים ב-DAPI	Coolaber	SL7100	צביעה נגדית של הגרעין עבור אימונופלואורסצנציה.
מיקרוסקופ אור דיגיטלי	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	דגם NE910+FL-900	מעקב אחר התפתחות ה-DAB ודימוג של חתכים שנצבעו בשיטת שדה בהיר (bright-field).
DNase I	Vazyme	R223-01	הסרה של DNA גנומי שיורי לפני שעתוק הפוך.
נוגדן Donkey anti-rabbit IgG, המשורשב ל-488	Thermo Fisher Scientific	A21206	נוגדן משני פלואורסצנטי עבור אימונופלואורסצנציה.
נוגדן חמור נגד IgG של ארנב, מצומד ל-594	Abcam	ab150076	נוגדן משני פלואורסצנטי עבור אימונופלואורסצנציה.
ערכה להביאת DNA/RNA/חלבון E.Z.N.A.	Omega Bio-Tek	D3892-01
ספק כוח לאלקטרופורזה	Bio-Rad	1645050	ספק כוח עבור אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ו-SDS-PAGE.
אתילן גליקול	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	רכיב של תמיסת שימור קריו-פרוטקטיבית.
מערכת לדימות ג'ל	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	דימוי של ג'לי אגרוז להערכת איכות RNA.
שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	הטמעה של חתכי מוח צפים בצורה חופשית שצבעו ב-DAB.
תוכנה לניתוח תמונות	המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health)	ImageJ/Fiji	ניתוח דנסיתומטרי של פסי Western blot ועיבוד תמונה.
איזופרופנול	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	שיקיעת חלבונים מחלק הפאזה האורגנית/הביניים.
מיקרוצנטריפוגה, מקוררת	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	סבב צנטריפוגה במהלך שלבי מיצוי ושטיפה של RNA/חלבונים.
ערכה למיצוי חלבונים מהיר (Minute Protein Extraction Kit)	המצאה	MS-026
תוך הרכבה של בלסם ניטרלי	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., שנגחאי, סין	מספר קטלוג S30509, CAS 96949-21-2	כיסוי זכוכית של חתכים שעברו צביעה ב-DAB והתייבשו.
תווך שיקוע OCT	סאקורה	4583	תווך שיכון לחיתוך קריו-סרירי (cryosectioning) של חצאי מוח קבועים.
פלטות או מבחנות qPCR אופטיות	Axygen	PCR-0208-C	כלי תגובה להגברה ב-qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	איטום פלטות רב-בארים לאחסון ארוך טווח של חתכים.
פנטוברביטל נתרן	Hualan Bio	57-33-0	חומר הרדמה לפני פרפוזיה טרנסקרדיאלית (transcardial perfusion).
צלחות פטרי	Biosharp	BS-90-D	טיפול במוח על קרח והפרדת המיספרות.
ריאגנט להפקת RNA המבוסס על פנול/גואנידיניום	Sparklade	AC0101-B	ריאגנט השוואה עבור ניסויי בקרה של מיצוי RNA.
תערובת מעכבי פוספטאז (Phosphatase inhibitor cocktail)	APExBIO	K1015-100	שימור פוספורילציה במהלך מיצוי חלבונים.
סלויין בופר פוספט (Phosphate-buffered saline)	Biosharp	BL601A	בופר שטיפה, ממס תמיסת סוכרוז וממס קריו-פרוטקטור.
ממברנת פוליוינילידן פלואוריד	Millipore	IPVH08100	ממברנה להעברה ב-Western blot.
Polyvinylpyrrolidone K40	סיגמא	9003-39-8	מרכיב של תמיסת שימור קריו-פרוטקטיבית.
תערובת מעכבי פרוטאז (Protease inhibitor cocktail)	Beyotime	P1045	מניעת דגרדציה של חלבונים במהלך ליזיס של רקמה.
ערכה למיצוי חלבונים	להמציא	MS-026	ערכה להשוואה עבור ניסויי בקרה של מיצוי חלבון כולל.
מערכת PCR בזמן אמת	Amolarray	MA6000	הגברה באמצעות PCR כמותי (Quantitative PCR) ואנליזה של עקומת המסה.
סודיום דודציל סולפט	BioFroxx	3250GR500	המסת חסון חלבון והכנת דגימות ל-SDS-PAGE.
להבי תער סטריליים	Biosharp	BS-RB-11	הפרדת חצאי המוח וקיטום רקמה על קרח.
צמיד סטריפטאבידין-פרוקסידאז	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	ריאגנט להגברה/גילוי של אות עבור אימונוהיסטוכימיה ב-DAB.
סוכרוז	חושי	57-50-1	תמיסת קריו-הגנה ותמיסת שימור קריו-הגנתית.
תערובת מאסטר ל-qPCR מסוג SYBR	Vazyme	Q711-02	הגברה באמצעות PCR כמותי.
מ apparatus להעברה	Bio-Rad	1703930	העברה רטובה של חלבונים מג'ל SDS-PAGE לממברנה.
תמיסת סלין עם בופר Tris ו-Tween 20	הוכן במעבדה	לא רלוונטי	בופר שטיפה לממברנת Western blot.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	חדירות (Permeabilization) של חתכי מוח לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
ערכה לגילוי אימונוהיסטוכימי UltraSensitive SP (עבור נוגדן ראשוני מעכבר/ארנב)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	נוגדן משני/סוכן זיהוי עבור אימונוהיסטוכימיה בשיטת DAB.
חולדת ויסטאר (Wistar rat)	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 גרם, זכר	בעלי חיים ניסיוניים לאיסוף רקמות ממוח של חולדה, במידה ונכללו.
קסילן	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	הבהרה של שקופיות שנצבעו ב-DAB לפני כיסוי בזכוכית כיסוי.
תוך הרכבה של בלסם ניטרלי	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., שנגחאי, סין	מספר קטלוג S30509, CAS 96949-21-2	כיסוי בזכוכית מכסה של חתכים מיובשים שנצבעו ב-DAB.
צמיג סטרפטיווידין-פרוקסידאז	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	ריאגנט להגברה/גילוי אות עבור אימונוהיסטוכימיה של DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	חדירות (Permeabilization) של חתכי מוח לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית.
ערכה לגילוי אימונוהיסטוכימי SP בעוצמה גבוהה (עבור נוגדן ראשוני של עכבר/ארנב)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	נוגדן משני/סוכן זיהוי לצביעה אימונוהיסטוכימית ב-DAB.
קסילן	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	הבהרה של סליידים שנצבעו ב-DAB לפני כיסוי בזכוכית כיסוי.

מקורות

Lauwereyns J, et al. Toward a common interpretation of the 3Rs principles in animal research. Lab Anim. 2024;53(12):347-50.
Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and humane experimental technique: implementing change. Animals (Basel). 2019;9(10):754.
Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 2007;113(3):619-34.
Basu J, Siegelbaum SA. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(11):a021733.
Wu J, et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 2021;11(5):e3988.
Taves MD, et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: Effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PLoS One. 2010;5(12):e15727.
Jordan JT. The rodent hippocampus as a bilateral structure: A review of hemispheric lateralization. Hippocampus. 2020;30(3):278-92.
Mundorf A, Ocklenburg S. Looking at both sides: Integrating data from both hemispheres is crucial in rodent neuroscience. Eur J Neurosci. 2025;62(5):e70249.
Watson RE, et al. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 1986;7(1):155-9.
Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides. 2004;25(3):425-31.
Rajput SK, et al. A column-based rapid method for the simultaneous isolation of DNA, RNA, miRNA and proteins. Cell Biol Int. 2012;36(9):779-83.
Morse SMJ, Shaw G, Larner SF. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 2006;40(1):54-8.
Puchades M, Westman A, Blennow K, Davidsson P. Removal of sodium dodecyl sulfate from protein samples prior to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(5):344-9.
Kachuk C, Stephen K, Doucette A. Comparison of sodium dodecyl sulfate depletion techniques for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1418:158-66.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blot qPCR