פרוטוקול הדמיה רב-צבעוני 3D-STORM ברזולוציה גבוהה למינרליזציה של קולגן בסיבי קולגן מסוג I מורכבים בעצמם

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להבחנה בין מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרפיברילרית בסיבי קולגן רקומביננטיים באמצעות STORM רב-צבעוני, תוך שילוב תיוג אופטימלי, הדמיה וניתוח קולוקליזציה כמותית.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ שחזור אופטי תלת-ממדי תלת-ממדי רב-צבעונית (3D-STORM) להמחשה בקנה מידה ננומטרי של מינרליזציה של קולגן במודל סיבי מורכב בקולגן מסוג I רקומביננטי. השיטה מאפשרת הדמיה סימולטנית של קולגן, חלבונים לא קולגניים (למשל, כונדרויטין סולפט) ופאזות מינרליות של סידן פוספט. הכנת הדגימה כוללת אמינו-סילניזציה והרכבה עצמית של קולגן, ולאחר מכן מינרליזציה באמצעות מדיום סידן פוספט שיוצר סידן פוספט אמורפי (ACP) בשלב מוקדם (30 דקות) ומבשיל להידרוקסיאפטיט (HAP) תוך 6 שעות. לאחר מכן מתבצעת סימון אימונופלואורסצנציה מרוב-פלקס, והדגימות מוערכות תחילה במיקרוסקופיה קונפוקלית לפני רכישת תמונה ב-3D-STORM באמצעות בופר הדמיה לאיסוף חמצן. עיבוד וניתוח נתונים מתבצעים באמצעות תוכנה זמינה לציבור. בהשוואה למיקרוסקופיה אלקטרונית או קונפוקלית קונבנציונלית, פרוטוקול זה משלב ספציפיות מולקולרית עם רזולוציה ננומטרית (דיוק אופייני לרוחבי 20–30 ננומטר, צירי 50–60 ננומטר), ומאפשר הדמיה תלת-ממדית של דפוסי מינרליזציה תוך-פיברילרית לעומת אקסטר-פיברילרית. תוצאות מייצגות מראות הדמיה ברורה של רשתות קולגן, חלבונים לא קולגניים נלווים ופאזות מינרליות במרחב תלת-ממדי. מדדים כמותיים כולל מקדם המתאם של פירסון (0.89 ± 0.04) ומקדם החפיפה של מנדרס (0.91 ± 0.03) מסופקים בסעיף התוצאות. פרוטוקול זה מציע כלי עוצמתי לחוקרים במדעי הביומטריאלים, ביומינרליזציה והנדסת רקמות עצם הזקוקים לתובנות בקנה מידה ננומטרי בדינמיקת המינרליזציה.

Introduction

מינרליזציה של קולגן היא תהליך ביולוגי בסיסי המרכזי ביצירת רקמות קשות כמו עצמות ושיניים¹. המבנה המורכב של סיבי הקולגן, יחד עם ויסות מדויק של הצטברות מינרלים, מעניק לרקמות אלו חוזק מכני מרשים ושלמות מבנית^2. קולגן משמש לא רק כפיגום פסיבי אלא גם כמשתתף פעיל, המנצמר את ההפקדה המדויקת של מינרלים דרך אינטראקציות מולקולריות ופיזיקליות מורכבות³. הבהרת מנגנונים אלו חיונית להבנת מצבים פתולוגיים כמו אוסטאופורוזיס ועששת שיניים, ולפיתוח חומרים ביומימטיים לטיפולים רגנרטיביים⁴.

קוטר סיבי הקולגן ברקמות קשות נע בין כ-50 ל-100 ננומטר, כאשר חלקיקי הידרוקסיאפטיט (HAP) קטנים אף יותר (בדרך כלל 2–5 ננומטר בעובי ואורך 20–30 ננומטר) ומשולבים בתוך פערים פיברילריים⁵. בעוד שאזורי פער יכולים לשמש כאתרי גרעין, ברקמות מקומיות, מינרלים נוצרים תחילה במרחבים בין-פיבריליים ובהמשך מתרחבים למחלקות תוך-פיברילריות. שיטות אפיון מסורתיות כוללות צביעה היסטולוגית, מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי ^6,7, ומיקרוסקופיית אלקטרונים ^8,9. צביעה היסטולוגית מספקת הערכה מקרוסקופית אך אינה יכולה להעריך מצבי מינרליזציה בקנה מידה ננו. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת תצפית על רכיבים מסוימים אך מוגבלת בדיפרקציה (~200 ננומטר לרוחבית), ואינה מצליחה לפענח מינרליזציה תוך-פיברילית לעומת אקסטרפיברילית¹⁰. מיקרוסקופ אלקטרוני מציע רזולוציה גבוהה אך חסר ספציפיות מולקולרית. למרות שתיווג אימונוזולד יכול לספק ספציפיות מולקולרית למיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא דורש עיבוד מיוחד ופחות נוח לוויזואליזציה תלת-ממדית מרובת רכיבים בהשוואה ל-STORM, וכולל מחזורי ניסוי ארוכים^{ועלויות} גבוהות.

מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) מתגבר על מגבלת הדיפרקציה על ידי מיקום פלואורופורים בודדים בדיוק גבוה, ומגיע לרזולוציה רוחבית ~20 ננומטר¹². בהשוואה לטכניקות סופר-רזולוציה אחרות כמו מיקרוסקופ פליטה מגורה (STED)¹³ומיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM)¹⁴, STORM מציע דיוק מיקום גבוה יותר (~20 ננומטר לרוחב ו~50 ננומטר צירי) ותואם לטווח רחב יותר של פלואורופורים אורגניים. במיוחד, STED דורש צבעים מיוחדים ועוצמת לייזר גבוהה שעלולים להזיק לדגימות ביולוגיות, בעוד ש-SIM מציע רזולוציה של ~~100 ננומטר, שאינה מספקת לפתרון תכונות בקנה מידה סיבי (50–100 ננומטר). STORM מספק איזון מעשי בין רזולוציה, יכולת מולטי-פלקסינג ותאימות דגימות. הנחיות שפורסמו תיארו דגימות בדיקה סטנדרטיות כדי להקל על אופטימיזציה של פרמטרי הדמיית STORM והערכת רזולוציה¹⁵. כאשר משולב עם יכולות הדמיה תלת-ממדית, 3D-STORM מאפשר הדמיה בקנה מידה ננומטרי של מספר רכיבים בו-זמנית^. התקדמות אחרונה הרחיבה את STORM להדמיה רב-צבעונית ומולטי-פלקס, ואפשרה ויזואליזציה של מספר מטרות בתוך אותו מדגם^17,18.

פרוטוקול זה עושה שימוש במודל ביומימטי במבחנה המבוסס על סיבי קולגן רקומביננטיים מסוג I מורכבים בעצמם, והוא מיועד במפורש למודלים של סיבים מורכבים בעצם קולגן מסוג I במבחנה, כדי להבחין בין מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרפיברילרית בקנה מידה ננומי. היא אינה מתאימה להדמיה של תאים חיים, שכן STORM דורש דגימות קבועות ומחסני חמצן. הוא גם אינו מתאים לרקמות מקומיות עם מינרלים גבוהים (למשל, עצם בוגרת) ללא דה-קלציפיקציה מוקדמת או שליפת אנטיגן. אם רק צפיפות מינרלים כוללת או מורפולוגיה של שטחים גדולים זקוקים להערכה, מיקרוסקופיה קונפוקלית או אלקטרונית קונבנציונלית יעילה יותר.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק תהליך עבודה סטנדרטי, שלבי-שלבי, לשימוש ב-3D-STORM רב-צבעוני להמחשת התפלגות ננומטרית של מינרלים וחלבונים לא-קולגניים בתוך סיבי קולגן בודדים, עם דגש מיוחד על הבחנה בין מינרליזציה תוך-פיברילרית למינרליזציה אקסטרפיברילרית. פרוטוקול זה משלב תיוג חיסוני אופטימלי עם בופר הדמיה מותאם כדי לאפשר מעקב סימולטני אחר רכיבים אורגניים מרובים (קולגן, חלבונים לא קולגניים) ופאזות אנאורגניות (ACP, HAP) בשלושה ממדים¹⁹. חידוש מרכזי הוא הערכה כמותית של דפוסי מינרליזציה תוך-פיברילרית לעומת אקסטר-פיברילרית. כימות מושג באמצעות שני קריטריונים בלתי תלויים: (1) חישוב מקדם הקולוקליזציה של פירסון בין ערוצי המינרל (צבע סידן אינדיקטור (למשל, קלצאין)) וקולגן (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק) באמצעות מודול הקולוקליזציה בתוכנת ניתוח תמונה (מקדם >0.8 מצביע על אסוציאציה חזקה); (2) ניתוח ההתמדה של אות מינרלי לאורך פרוסות Z של סיבים בודדים: אם האות המינרלי קיים בפרוסות המרכזיות (Z = 0 עד ±120 ננומטר ממרכז האנכי של הסיב) בעוצמה ≥50% מהמקסימום), הוא מסווג כתוך-פיברילר. בניגוד למיקרוסקופיה אלקטרונית או קונפוקלית קונבנציונלית, פרוטוקול זה משלב ספציפיות מולקולרית עם רזולוציה ננומטרית, ומאפשר פיזור מרחבי תלת-ממדי של מינרליזציה תוך-פיברילרית.

פרוטוקול זה מיועד לחוקרים במדעי הביומטריאלים, ביומינרליזציה והנדסת רקמות עצם הדורשים תובנות בקנה מידה ננומטרי בדינמיקת המינרליזציה. ההליך הסטנדרטי יכול להיות מותאם גם לחקר מערכות קולגן מינרליות אחרות, כגון פרוסות דנטין מפורקות מינרליות או הידרוג'לים מבוססי קולגן, על ידי התאמת שלבי הכנת הדגימה הראשוניים בהתאם.

Protocol

כל הניסויים שכללו דגימות ביולוגיות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של מתקני הליבה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג ואושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (תעודת אישור מס' BSL20235710079). הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן עושה שימוש במקור מסחרי ובמערכות ביומימטיות חוץ-גופיות. הוא אינו כולל משתתפים אנושיים, נבדקים של בעלי חיים או דגימות רקמה אנושית, ולכן אינו דורש אישור אתי מוועדת ביקורת מוסדית.

אזהרה: כל ההליכים הכוללים כימיקלים מסוכנים חייבים להתבצע במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות, משקפי בטיחות). להשליך פסולת כימית לפי תקנות מוסדיות. עבור NaN₃, יש לאסוף פסולת במיכל ייעודי המסומן "פסולת אזיד" ואל תתערבב עם חומצות (סיכון לגז נפיץ). לגלוטראלדהיד, יש להשבית עם עודף של 10% נתרן ביסולפיט לפני ההשלכה. ל-β-מרקפטואנול, יש לחמצן עם אקונומיקה (1:10 וולט/וולט) במשך שעה לפני הפינוי.

הערה: יש לבצע סימון אימונופלואורסצנציה לפני המינרליזציה כדי למנוע הסתרת אפיטופים על ידי משקעים מינרליים. ליישומים הדורשים סימון לאחר מינרליזציה, ייתכן שיהיה צורך בשליפת אנטיגן.

1. הכנת מדיום המינרליזציה

1. הכנת מדיום מינרליזציה לסיבי קולגן משוחזרים
   1. הכינו תמיסת מלאי סידן על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל חומצה פוליאספרטית (p-Asp, Mw 9-11 kDa) בנפילה ל-5 מ"ל של תמיסת CaCl₂ של 3.44 מ"מ בצינור קוני של 15 מ"ל.
   2. מערבב Vortex בצינור במשך 30 שניות עד שהוא הומוגני.
   3. הוסף p-Asp לאט וערבב היטב כדי לייצב סידן פוספט אמורפי (ACP).
   4. הוסף 5 מ"ל תמיסת פוספט (19 מ"מ Na₂HPO₄ + 300 מ"מ NaCl) לתמיסת מלאי הסידן.
   5. מערבב מערבולת לדקה אחת.
      הערה: ריכוזים סופיים לאחר הערבוב: 1.67 mM CaCl₂, 9.5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl, ו-50 מיקרוגרם/מ"ל p-Asp.
   6. הכינו את מדיום המינרליזציה מיד לפני השימוש. אל תאחסן; השתמשו מיד בחומר הקדם-יציב של ACP כדי להשיג תוצאות עקביות.
      הערה: אחסון מוביל להתגבשות מוקדמת.
2. הכנת מדיום מינרליזציה לג'לים קולגן/דנטין דה-מינרלי
   1. הכינו תמיסה המכילה סידן על ידי המסה של 8.77 גרם NaCl, 0.01 גרם NaN₃, 6.06 גרם טריס ו-1.11 גרם CaCl₂ במים דה-יוניים של 800 מ"ל.
   2. העלה את הנפח ל-1 ליטר עם מים דה-יוניים.
   3. הוסף 350 מיקרוגרם/מ"ל חומצה פוליאקרילית (PAA, Mw ~1800) לתמיסה המכילה סידן.
   4. מערבולת לדקה אחת.
      הערה: השתמש ב-PAA במקום p-Asp לייצוב טוב יותר בריכוזי סידן גבוהים.
   5. הכינו תמיסת פוספט על ידי המסה של 0.85 גרם Na₂HPO₄ במים דה-יוניים של 1 ליטר כדי לקבל 6 mM Na₂HPO₄.
   6. סינון את תמיסת הפוספט באמצעות ממברנה של 0.22 מיקרון.
   7. שלבו נפחים שווים (למשל, 500 מ"ל כל אחד) של תמיסות סידן ופוספט עם ערבוב מגנטי ב-300 סל"ד.
   8. כוונן את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl או NaOH תוך כדי ניטור עם מד pH.
      הערה: שמרו על pH של 7.4 ± 0.1. אין לאפשר סטיות pH >0.2, שגורמות להתגבשות מוקדמת.

2. הכנת סיבי קולגן רקומביננטיים

1. אמינו-סילניזציה של כלים עם תחתית זכוכית
   הערה: טיפול זה עושה שימוש בטריאתוקסילן (3-אמינופרופיל) (APTES) כדי להכניס קבוצות אמינו במטען חיובי (-NH₂) על פני הזכוכית, מה שמקדם ספיחה אלקטרוסטטית וייצוב של מונומרים קולגן טעונים שליליים.
   1. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת APTES (5% v/v באתנול אבסולוטי) לכל צלחת תרבית עם תחתית זכוכית (35 מ"מ, עובי #1.5H, 0.17 מ"מ ± 0.005 מ"מ).
   2. ודא כיסוי מלא של משטח הצלחת עם תמיסת APTES.
   3. דגרו בחושך במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס).
   4. שטוף את הכלים שלוש פעמים באתנול מוחלט (2 מ"ל בכל שטיפה).
   5. אולטרסוניקט במים דה-יוניים למשך 10 דקות ב-40 קילוהרץ. הסר לחלוטין את ה-APTES השאריים כדי למנוע קישור לא ספציפי.
   6. ניתן לאחסן כלים מסוילנים יבשים בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
   7. (אופציונלי) אפו לשיפור היציבות: הניחו כלים שטופים ומיובשים בתנור בטמפרטורה של 100–120 מעלות צלזיוס למשך 30–60 דקות.
   8. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים.
      הערה: אם משתמשים בכלים מפלסטיק, להוריד את הטמפרטורה מתחת ל-80 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיוות. להתאים את תהליך הסילניזציה מ-Bitter ו-Muir²⁰.
2. הרכבה עצמית של קולגן וקישורים צולבים
   1. פיפט של 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגן-I (50 מיקרוגרם/מ"ל בחומצה אצטית של 0.1 מ') על כל צלחת סילנית.
   2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות בתא לחות (> לחות יחסית ). שמור על לחות יציבה כדי למנוע אידוי תמיסה.
   3. אימות היווצרות הסיבים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או קונפוקלית; הכנה מוצלחת מראה רשת סיבים איכותית, דמוית רשת.
   4. כדי לאמת את היווצרות הסיבים הנכונה ברמה האולטרה-מבנית, יש להכין דגימה נפרדת על רשת TEM פוליוויניל פורמלית/מצופה פחמן, בהתאם לאותם תנאי הרכבה עצמית (קולגן-I 50 מיקרוגרם/מ"ל, 37°C, 10 שעות, לחות > 90%).
   5. צבעו עם 1% חומצה פוספוטונגסטית (pH 7.0) למשך 10 דקות.
   6. שטוף עם מים דה-יוניים.
   7. בדוק תחת מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר. פיברילוגנזה מוצלחת מתבטאת בדפוס הפסים המחזוריים של 67 ננומטר (ראו איור 3).
   8. שאפו בזהירות את שאריות תמיסת הקולגן מהכלים עם תחתית הזכוכית.
   9. הוסיפו 2 מ"ל תמיסת כונדרויטין סולפט (CS) (50 מ"ג/מ"ל ב-PBS, pH 5.5) לכל צלחת.
   10. דגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות כדי לאפשר ספיחה אלקטרוסטטית של CS על סיבי קולגן.
   11. הכינו תמיסת קישור צולב EDC/NHS²¹: המיס 0.2 M EDC (1-אתיל-3-(3-דימתילמינופרופיל) קרבודימיד) ו-0.05 M NHS (N-הידרוקסיסוקסינימיד) בבופר MES (0.1 מיליון MES, pH 5.5).
       הערה: ניתן להכין מאגר MES על ידי המסה של חומצה חופשית MES במים דה-יוניים וכיוון ה-pH ל-5.5 עם NaOH.
   12. הסר את תמיסת ה-CS והוסף 2 מ"ל של תמיסת קישור צולב EDC/NHS.
   13. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים כדי לשתק קוולנטית את ה-CS על קולגן.
   14. שטוף כלים שלוש פעמים עם PBS (5 מ"ל כל אחד, 5 דקות כל אחד) כדי להסיר תגובות שלא הגיבו.
   15. אחסן סיבי קולגן מעובדים ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות לפני המינרליזציה.

3. תיוג אימונופלואורסצנציה (מבוצע לפני המינרליזציה)

1. הכנת דוגמאות
   1. שטוף את סיבי הקולגן שלוש פעמים עם תמיסת NaCl של 500 מ"מ (10 מ"ל בכל שטיפה, 5 דקות כל אחד).
   2. שטוף שלוש פעמים עם מים דה-יוניים (10 מ"ל לכל שטיפה, 5 דקות כל אחת).
   3. בצע שטיפות על פלטפורמת שייקר אופקית שמסתובבת ב-50 סל"ד כדי להבטיח שטיפה יסודית תוך מזעור כוחות גזירה שעלולים לנתק סיבים שהורכבו.
2. חסימה ודגירה ראשונית של נוגדנים
   1. דגרו עם בופר חוסם (אלבומין סרום בקר 5% ב-PBS) בטמפרטורה של 37°C למשך שעה בתא לח.
   2. הכינו קוקטייל נוגדנים בבופר חסימה: אנטי-קולגן-I של ארנב (דילול 1:100) ואנטי-כונדרויטין סולפט לעכבר (דילול 1:100).
   3. הוסיפו 200 מיקרול קוקטייל נוגדנים לכל דגימה.
   4. כסה דגימות עם סרט איטום במעבדה.
   5. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה (12–16 שעה).
   6. הגן מפני אור באמצעות נייר אלומיניום. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, ניתן לאחסן דגימות ב-PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד 24 שעות.
3. צביעת נוגדנים משנית
   1. הסר נוגדנים ראשוניים לא קשורים על ידי שטיפת כלים שלוש פעמים עם בופר שטיפה (0.1% טווין-20 ב-PBS), 10 דקות בכל שטיפה.
   2. הכינו את תערובת הנוגדן המשנית הפלואורסצנטית בבופר חסימה (200 מיקרוליטר לכל צלחת 35 מ"מ) המכילה : IgG אנטי-ארנב עז מצורף לצבע פלואורסצנטי אדום רחוק (1:100) ו-IgM אנטי-עכבר לעזים המשולב לצבע פלואורסצנטי אדום (1:100).
      הערה: מהשלב הזה ואילך, יש להגן על דגימות מאור כדי למנוע הלבנת פוטואורופור.
   3. דגרו דגימות בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך שעה בחושך.
   4. שטוף כלים שלוש פעמים עם בופר שטיפה (10 דקות כל אחת) כדי להסיר נוגדנים משניים שלא קשורים.
      הערה: אחסן דגימות מסומנות ב-PBS בטמפרטורה של 4°C (מוגנת מאור) עד 48 שעות לפני ההדמיה. כלול בקרות ללא נוגדנים ראשוניים כדי לבדוק אוטופלואורסנציה.

4. מינרליזציה של סיבי קולגן (מבוצעת לאחר סימון סימון)

1. תהליך המינרליזציה
   1. הוסיפו 2 מ"ל מדיום מינרליזציה טרי לכל מנה.
   2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (לטווח קצר) ליצירת מינרלים (ACP) בשלב מוקדם.
   3. חלופה נוספת היא דגירה בטמפרטורה של 37°C למשך 6 שעות (לטווח ארוך) להתגבשות מינרלים בוגרים (HAP).
      הערה: שמרו על טמפרטורה מדויקת של 37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות דוגמה מכוילת.
   4. שאיבת עדינות מדיום מינרליזציה.
   5. שטוף שלוש פעמים במים דה-יוניים (5 מ"ל בכל שטיפה, מרווחים של דקה).
2. סימון פוספט סידן
   1. הוסיפו 4 מיקרומום של צבע סידן (למשל, קלצאין) ב-PBS (200 מיקרוליטר למנה).
   2. דגרו בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות בחושך.
      הערה: צבע סידן אינדיקטור (למשל, קלצאין) נקשר ליוני סידן ואינו מבחין בין פאזות אמורפיות לגבישיות; הקצאת פאזה מבוססת על זמן המינרליזציה (30 דקות = ACP, 6 שעות = HAP). יש להגן עליו מאור באמצעות צינורות ענבר או עטיפת נייר כסף.
   3. שטוף חמש פעמים: שלוש שטיפות עם מים דה-יוניים ושתי שטיפות עם 70% אתנול (דקה אחת כל אחת), לסירוגין בין השניים.
3. הכנת דגימה להדמיה
   1. דגימות טבילה בבופר הדמיה: 10% (עם וולט) גליצרול ב-PBS. באופן אופציונלי, להוסיף תגובת אנטי-פייד לפי הוראות היצרן.
   2. יש להניח נפח מספיק (20–50 מיקרוליטר) של בופר הדמיה כדי לכסות את הדגימה.
   3. הנח כיסוי מעל הדגימה.
   4. אחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך עד 72 שעות.

5. תצפית תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי

1. העברת דגימות מאחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס).
2. אפשר שיווי משקל של 10 דקות כדי למנוע עיבוי.
3. שמרו על הגנה קלה באמצעות מיכלים ענברים או עטיפת נייר כסף.
4. וודא שבופר ההדמיה מכסה את כל הדגימה.
5. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי עם ההגדרות הבאות:
   1. להדמיית קולגן (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק): לייזר 647 ננומטר, פילטר פליטה 650-710 ננומטר.
   2. להדמיית סידן פוספט (צבע אינדיקטור סידן (למשל, קלצאין)): לייזר 488 ננומטר, מסנן פליטה 500-550 ננומטר.
   3. מטרה: טבילה בשמן 100× (NA 1.4).
   4. קוטר חור סיכה: יחידת אוורייה אחת (AU).
   5. זמן השהייה בפיקסלים: 1-2 מיקרושניות.
      הערה: בצע יישור לייזר וכיול חורים סיכות לפני ההדמיה.
6. בצע סריקה רציפה: סריקה ראשונה עם עירור של 647 ננומטר (קולגן).
7. בצע סריקה שנייה עם עירור של 488 ננומטר (מינרלי).
   הערה: אסוף ערוצים ברצף כדי למנוע דליפה.
8. לשחזור תלת-ממדי, הגדר את גודל שלב ה-Z-stack ל-0.5 מיקרון או פחות כדי להבטיח דגימה מספקת.
9. שמירת קבצים עם מטא-דאטה שמורה.
10. לניתוח קולוקליזציה, השתמשו בתוכנות ניתוח תמונות המסוגלות לחשב את מקדם הקורלציה של פירסון (למשל, תוכנה זמינה לציבור עם תוספים מתאימים).

6. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי תלת-ממדי סטוכסטי (3D-STORM)

1. הכנת בופר הדמיה STORM²²
   הערה: גלוקוז אוקסידאז וקטלז מתווספים לבופר ההדמיה כדי לאסוף חמצן, ובכך מפחיתים את הפוטו-לבינה ומאריכים את הבהוב הפלואורופורים, דבר חיוני למיקום מולקולה בודדת ב-STORM.
   1. הכינו תמיסת גלוקוז אוקסידאז (GOx) במיכל 8 מ"ג/מ"ל בבופר אצטט נתרן של 50 מ"מ (pH 5.1).
   2. הכינו תמיסת קטלז ב-160 מיקרוגרם/מ"ל ב-1× PBS.
      הערה: יש להפריד את מלאי האנזים, להקפיא אותם באמצעות חנקן נוזלי או אמבט קרח יבש/אתנול, ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.
   3. הכינו בופר חדש של צילום STORM על קרח, מוגן מאור.
   4. משלבים את הרכיבים הבאים בסדר המפורט לנפח הסופי של 1 מ"ל: H₂O סטרילי ללא נוקלאז (עד 1 מ"ל), 1 M NaCl (10 מיקרוליטר, 10 מ"מ גמר), 1 M טריס-HCl pH 8.0 (50 מיקרוליטר, 50 מ"מ סופי), 1 M ציסטימין (MEA) שהוכנה טרי ל-pH ~7.0 (50 מיקרוליטר, 50 מ"מ מולר סופי), גלוקוז 50% (עם וולט) (200 מיקרו-ליטר, 10% ללא סולם סופי), מאגר GOx (200 מיקרוליטר, 1.6 מ"ג/מ"ל סופי), מאגר קטלז (200 מיקרוליטר, 32 מיקרוגרם/מ"ל סופי).
   5. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג או היפוך. אל תעשי מערבולת.
      הערה: יש להכין את הבופר טרי ולשמור על קרח מוגן מאור. השתמש תוך 30 דקות מההכנה. לאופטימיזציה מפורטת של תנאי הדמיית STORM, יש לעיין בפרוטוקולים שנקבעו באמצעות דגימות בדיקה¹⁵.
   6. הוסיפו 200 מיקרוליטר של בופר הדמיה טרי של STORM כדי לכסות את הדגימה במלואה.
2. תצורת מערכת 3D-STORM
   1. ודא שמסלול ההדמיה מופנה למצלמת ECD (EMCCD) שמכפילה אלקטרונים.
   2. הפעל את מודול העדשה הצילינדרית לצילום תלת-ממדי.
   3. הגדר את התוכנה למצב רכישה 3D STORM.
   4. הגדר מסנני מסלול אופטיים לצבעים בהם משתמשים.
   5. הפעל את הלייזר 647 ננומטר והגדר את ההספק לרמה נמוכה (1-5 מיליוואט).
   6. באמצעות אובייקט טבילה בשמן 100× (NA ≥1.4), אתר את אזור העניין במצב תצוגה חיה רחבת שדה או TIRF.
   7. רכוש תמונת פלואורסצנציה רחבת שדה קונבנציונלית להשוואה מאוחרת יותר.
   8. עבור למצב תאורה TIRF.
   9. כיילן את זווית ה-TIRF כדי להשיג שדה תאורה דק (~100-200 ננומטר) כדי למזער פלואורסצנציה ברקע.
   10. כוונן את זמן החשיפה למצלמה (10-30 מילישניות) בהתאם לעוצמת האות ההתחלתית.
   11. כוון את עוצמת הלייזר בהדמיה לפי עוצמת האות ההתחלתית.
   12. בצע רכישת בדיקה קצרה.
   13. וודא שהפרמטרים מוגדרים נכון מבלי לגרום להלבנה מהירה בפוטו.
       הערה: ודאו יישור מדויק של ציר העדשה הצילינדרית עם מישור הדגימה. רוב המערכות המודרניות כוללות כיול אוטומטי. לכיול ידני, השתמשו בחרוזי פלואורסצנט של 100 ננומטר לאימות פונקציות פיזור נקודות סימטריות ועגולות (PSFs).
   14. התחל בחשיפה של 10–30 מילישניות בעוצמת לייזר של 647 ננומטר של 1–2 קילוואט/סנטימטר^רבוע.
   15. ודאו שצפיפות הבהוב היא 0.1–1 מולקולה/^{מיקרום 2}.
   16. אם הצפיפות נמוכה מדי או גבוהה מדי, התאימו את עוצמת הלייזר או את זמן החשיפה בהתאם.
   17. חזור על האימות וההתאמה עד להשגת הצפיפות האידיאלית.
3. איסוף נתונים ב-3D-STORM
   1. הגדר את תוכנת הרכישה למצב "הפעלה רציפה".
   2. הגדר את לייזר ההדמיה (647 ננומטר) לעוצמה גבוהה (כניסת סיבים של 100-500 mW) כדי להעביר את רוב הפלואורופורים למצב כהה.
   3. כוון את לייזר ההפעלה (405 ננומטר) להספק נמוך (0.1–5 mW).
   4. אופטימיזציה אמפירית של 405 ננומטר כדי לשמור על 100–200 מולקולות מקומיות לכל פריים באזור של 256×256 פיקסלים.
   5. קבע את מספר הפריימים הכולל ל-10,000–20,000.
   6. השתמש בפריים אחד של אור הפעלה (405 ננומטר) ואחריו 5 פריימים של אור הדמיה (647 ננומטר) בכל מחזור.
   7. התחל לרכוש.
   8. הפעל EMCCD עם רגישות מקסימלית (הגבר EM מיושם)
   9. השתמש בחשיפה של 10–30 מילישניות לכל פריים.
   10. במהלך הרכישה, יש לנטר צפיפות מולקולות פעילות.
   11. כוון את עוצמת הלייזר של 405 ננומטר כדי לשמור על זרם קבוע של אירועים חד-מולקולריים.
       הערה: ניתן לאחסן נתוני סרטים גולמיים בכונן קשיח סטנדרטי לצורך ארכוב ארוך טווח לפני השחזור.
4. ניתוח נתונים של מינרליזציה של קולגן (באמצעות תוכנת ניתוח תמונות עם מודול STORM)
   1. בתוכנת הניתוח, בחר את דרייבר המצלמה המתאים (מודול STORM).
   2. לחצו על [Analysis GUI] בפאנל STORM. חלון הניתוח נפתח.
   3. לחץ על [File Open]. בחר את קובץ התמונה הגולמי של מיקרוסקופיה לניתוח. לחץ על פתיחה.
   4. קבעו את ערך הפלואורסצנציה המינימלי (גובה מינימלי) עבור אותות תקפים.
   5. מצא את הנקודה האפלה ביותר שעדיין מזוהה כאות של מולקולה אחת.
   6. הזז את העכבר למרכזו.
   7. קרא את ערך גובה השיא (Peak Height).
   8. רשום את הערך הזה.
   9. לחץ על [הגדרות זיהוי]. בדיאלוג, הגדר את הפרמטרים הבאים: גובה מינימלי (הזן את הערך שנרשם בשלב 6.4.8), גובה מקסימלי (20000), קו בסיס CCD (100), ולנתוני 3D-STORM יש לבדוק "3D" (הסר סימון עבור 2D).
   10. לחצו >> להרחבת פרמטרים נוספים. הגדרה: רוחב מינימלי (ננומטר) ל-200, רוחב מקסימלי (ננומטר) ל-700 (400 לדו-ממד), רוחב התאמה התחלתי (ננומטר) ל-300, יחס ציר מקסימלי ל-2.5 (1.3 ל-2D), והדחפה מקסימלית (פיקס) ל-1.
   11. לחץ על אישור כדי לסגור את הדיאלוג.
   12. בצע ניתוח בדיקה כדי לאמת את הפרמטרים. בטל את סימון תיקון ההסחה.
   13. הגדר תקופות ל-1.
   14. לחץ על [בדיקה].
   15. לאחר הניתוח, לחץ על אישור בדו-שיח הקופץ.
   16. בדוק שנקודות האות מזוהות נכון. רעש רקע לא צריך להיבחר בטעות. אסור לפספס נקודות אמיתיות.
   17. אם לא מספקים, חזור על שלבים 6.4.9–6.4.16 כדי להתאים את הפרמטרים עד לנכון.
   18. לאחר שהניתוח עבר, בצע את הניתוח המלא. בדוק תיקון דריפט.
       הערה: תוכנת הניתוח מבצעת תיקון סטייה באמצעות אלגוריתם קורלציה צולבת מיותרת (RCC) שממקסם את המתאם בין מקטעי זמן של לוקליזציות מולקולריות. אין צורך בחרוזים פידוציאליים²³.
   19. שמירת תקופות = 1.
   20. לחץ על [Start] (או לחץ שוב על [Test] , ואז על [Start]).
   21. חכה לסיום הניתוח. לחץ על OK בדו-שיח הקופץ.
   22. לאחר ניתוח, נוצרים שני קבצי תוצאות (.bin ו-.txt) באותה תיקיה כמו קובץ .nd2.
   23. לניתוח קולוקליזציה (ערוצי 647 ננומטר ו-488 ננומטר), הצג את שני הערוצים בו-זמנית ברשימת הערוצים של חלון הניתוח.
   24. בחר אזור עניין מתאים (ROI).
   25. השתמש במודול הקולוקליזציה כדי לחשב את מקדם המתאם של פירסון. אם לא ניתנים אוטומטית, יש לייצא ידנית נתוני ענן נקודות לתוסף קולוקליזציה בתוכנת ניתוח תמונות זמינה לציבור. תעד את הערך.
   26. בצע ניתוח פרוסת Z לאישור מינרליזציה תוך-פיברילרית. בתפריט הראשי, בחר ב-View > Z-stepping > Slice.
   27. חלץ מישורים בודדים במרווחי 60 ננומטר.
   28. התבונן באות המינרלי (ירוק, ערוץ 488 ננומטר). בדוק אם האות נשאר בפרוסות המרכזיות (Z = 0 ננומטר ±120 ננומטר). ההתמדה מאשרת מינרליזציה תוך-פיברילרית.
   29. אופציונלי: לבצע סינון צפיפות כדי להפחית ספירה מופרזת מפולטים צפופים. פתח את התמונה המחודשת של STORM בתוכנת ניתוח תמונות זמינה לציבור באמצעות תוסף לניתוח לוקליזציה של מולקולה בודדת²⁴.
   30. כדי להפחית ספירת יתר מפולטים צפופים, יש להחיל סינון צפיפות (למשל, מסנן חציוני או סף צפיפות מקומי) בהתבסס על צפיפות האות.
   31. אם תיקון הסחפה לא הופעל בשלב 6.4.18 או נדרש תיקון נוסף, יש לבצע תיקון הסחף. נכון בהתבסס על ה-PSF של סימני פידוציה. חלופה נוספת היא להשתמש באלגוריתמים של קורלציה צולבת (למשל, תיקון סטייה שמיושם באותו תוסף).
   32. בצע פירוק ספקטרלי כדי לבטל את התערבות בין ערוצים. בחלון ניתוח STORM, לחץ על כלי הסרת ה-crosstalk (בדרך כלל בפינה הימנית התחתונה).
   33. הגדר את הרדיוס ל-25.0 ננומטר (מומלץ). בחר את ערוץ המקור. בחר את שיטת ההסרה: מומלץ להשתמש בשיטות סטטיסטיות.
   34. כדי להסיר הפעלה צולבת הנגרמת על ידי לייזר הגירוי, בחרו ב-Subtract בנוסף ל-NSA > Cross Activation. לחץ אוקיי. ערוץ חדש, Nonspecific Activation-Xt, נוצר אוטומטית.
   35. אימות רמות אוטופלואורסצנציה ואותות רקע באמצעות דגימות בקרה לא מוצבעות. ודא שכל האותות מסומנים במפורש.
   36. בצע ויזואליזציה תלת-ממדית. בחר אזור עניין (ROI) בחלון הניתוח.
   37. לחץ על כפתור [3D] (או [הצג 3D]). יצר הקרנה תלת-ממדית או רינדור נפח.
   38. לחץ קליק ימני כדי להתאים את פרמטרי הרינדור. ייצא סרטונים בפורמטים נפוצים (למשל, .avi או .mp4).
   39. כדי לסווג אות מינרלי כאות תוך-פיברילר, יש לבצע ניתוח פרוסת Z כמו ב-6.4.26–6.4.28. פרופילי עוצמת ייצוא.
   40. הגדר את מרכז הסיבים כמישור Z שבו אות הקולגן הוא המקסימלי.
   41. אות מינרלי נחשב תוך-פיברילרי אם עוצמתו ב-Z = 0 (מרכז) וב-Z = ±60 ננומטר היא ≥50% מהעוצמה המרבית של המינרל באותו סיב. אם האות יורד מתחת ל-30% ב-Z = 0, סווג כאקסטרפיברילר.
   42. רשמו את הסיווג של לפחות 50 סיבים לכל מצב כדי לחשב את אחוז המינרליזציה התוך-פיברילרית.
       הערה: תוספים אלטרנטיביים זמינים לציבור זמינים גם הם לסינון צפיפות, תיקון סטייה והפרת ערבוב ספקטרלי.

Results

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מניב ויזואליזציה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של סיבי קולגן מינרליים באמצעות Multicolor 3D-STORM. התוצאות הבאות ממחישות תוצאות טיפוסיות, בקרות איכות והערכות כמותיות.

איור 1 מציג שחזור רב-צבעוני של רשת קולגן במינרלית בסידן פוספט אמורפי (ACP) באמצעות 3D-STORM. קולגן (מסומן בצבע פלואורסצנטי אדום רחוק) מופיע כרשת פיברילרית מוגדרת היטב. כונדרויטין סולפט (GAG, מסומן בצבע אדום) קשור קשר הדוק לסיבי הקולגן, והאזורים של הקולוקליזציה נראים בציאן בתמונה הממוזגת. חשוב לציין כי חלקיקי ACP (ירוקים, מסומנים בצבע סידן) נצפים בתוך גבולות סיבי הקולגן, מה שמדגים מינרליזציה תוך-פיברילרית בשלב מוקדם (30 דקות). איור זה מדגיש את יכולת הפרוטוקול לפתור בו-זמנית שלושה רכיבים מובחנים (קולגן, GAG, מינרל) בקנה מידה ננומטרי – הישג שלא ניתן להשגה במיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית (ראו איור 5 להשוואת רזולוציית הדמיה). הקולוקליזציה בקנה מידה ננומטרי של ACP בתוך סיבים מאשרת שהקדם-אמורפי יכול לחדור לפנים הסיביות לפני טרנספורמציה גבישית.

איור 2 מספק ראיות כמותיות לחדירה תוך-פיברילרית של הידרוקסיאפטיט בוגר (HAP) לאחר 6 שעות של מינרליזציה. איור 2A מציג תמונות STORM דו-ממדיות המראות קולוקליזציה נרחבת של קולגן (אדום) ו-HAP (ירוק), כאשר ערוצים ממוזגים נראים בצהוב. איור 2B הוא שחזור נפח תלת-ממדי הממחיש אדריכלות משולבת. איור 2C מציג ניתוח פרוסות ציר Z במרווחי 60 ננומטר מהחלק העליון (Z = −120 ננומטר) למרכז (Z = 0) ועד לחתכים עמוקים יותר (Z = +120 ננומטר). אות ה-HAP נשאר בפרוסות המרכזיות (Z = 0 עד ±120 ננומטר) בעוצמה של ≥50% מהמקסימום, העומדת בקריטריוני הסיווג למינרליזציה תוך-פיברילרית המוגדרים בשלבים 6.4.39–6.4.41. ניתוח קולוקליזציה כמותית משלושה ניסויים עצמאיים (n = 3 שכפולים, כל אחד עם 5 אזורים מעניינים) הניב מקדם קורלציה של פירסון של 0.89 ± 0.04 ומקדם חפיפה של מנדרס של 0.91 ± 0.03 (ממוצע ± SD). ערכים אלו מצביעים על קשר חזק וספציפי בין קולגן ל-HAP בתוך הסיבים, ומאשרים כי השלב הגבישי הבשל נמצא גם בתוך הסיבים.

איור 3 מאמת את שלמות המבנה של פיגום הקולגן המורכב בעצמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר. סיבי קולגן המוצבעים בחומצה פוספוטונגסטית של 1% (pH 7.0) מציגים דפוס חוצה מחזורי אופייני של 67 ננומטר, שהוא אבחון של פיברילוגנזה דמוית טבעית. שלב בקרת איכות זה חיוני לפני המשך לניסויי מינרליזציה, שכן הוא מאשר שהפיגום שלם מבחינה מבנית ויכול לתמוך בשקיעת מינרלים תוך-פיברילריים. ללא דפוס פסים זה, הקולגן עלול להיות מפורק או מורכב בצורה לא נכונה, מה שמוביל לדפוסי מינרליזציה ארטיפקטיים.

איור 4 ממחיש תוצאה שלילית מייצגת המתקבלת כאשר תנאי המינרליזציה אינם נשלטים כראוי (למשל, היעדר חומצה פוליאספרטית או pH > 7.6). בתנאים תת-אופטימליים אלה, משקעי HAP (ירוקים) נצפים אך ורק על מצע הזכוכית מחוץ לסיבי הקולגן (אדום), ללא פלישה תוך-פיברילרית. תוצאה זו משמשת כבקרה חשובה: היא מראה כי המינרליזציה התוך-פיברילרית שנצפתה באיורים 1 ו-2 אינה נובעת ממשקעים לא ספציפיים או שטיפה לא שלמה, אלא דורשת שליטה מדויקת בסביבה הכימית (pH 7.4 ± 0.1, נוכחות חומצה פוליאספרטית ושימוש מיידי במדיום מינרלי טרי). חוקרים צריכים לכלול בקרות שליליות כאלה כדי לאמת את המערכת שלהם.

איור 5 מציג תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מייצגות שצולמו לפני רכישת STORM לצורך סקר דגימות ראשוני. ערוץ הקולגן (איור 5A) חושף רשת פיברילרית ברורה, וערוץ HAP (איור 5B) מציג מינרל הקשור לסיבים. התמונה המאוחדת (איור 5C) מאשרת את הקולוקליזציה ברמת הדיפרקציה המוגבלת (~200 ננומטר). תמונות אלו משרתות שתי מטרות: (1) הן מאמתות את איכות הדגימה (תיוג מתאים, צבירה מינימלית, ואסוציאציה מינרלית ספציפית) לפני המשך להדמיית STORM שגוזלת זמן; ו-(2) הם מנחים בחירת אזורים רלוונטיים לרכישת 3D-STORM. חשוב לציין שהתמונות הקונפוקליות חסרות את הרזולוציה להבחין בין מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרפיברילרית. שימו לב שהאות המינרלי נראה רציף לאורך הסיבים מבלי לחשוף אם הוא בפנים או בחוץ. מגבלה זו מדגישה את הצורך בגישה של סופר-רזולוציה המתוארת כאן.

איור 6 מציג שני ניסויים ביקורתיים. איור 6A (בקרה ללא נוגדנים ראשוניים) אינו מראה אות ספציפי כאשר מופעל רק הנוגדן המשני, מה שמאשר שהאותות שנצפו בדגימות מסומנות אינם נובעים מקישור נוגדנים משני לא ספציפי. איור 6B (בקרה לא מוצבעת) מראה שאין אות פלואורסצנציה (שחור לחלוטין), מה ששולל אוטופלואורסצנציה משמעותית מהדגימה או הסובסטרט. בקרות אלו חיוניות לאימות הספציפיות של סימון האימונופלואורסצנציה. כל אות שניתן לזהות בבקרות אלו היה מצביע על הצורך להתאים את שלבי החסימה או השטיפה.

בתנאי ההדמיה האופטימליים שלנו, מערכת 3D-STORM השיגה דיוק מיקום טיפוסי של 20–30 ננומטר לרוחב ו-50–60 ננומטר צירית, בהתאם לספרות המקורית של 3D-STORM²⁵. תיקון הסטייה בוצע במהלך העיבוד לאחר מכן באמצעות אלגוריתם הקורלציה הצולבת המיותרת (RCC) המובנה, שמבטל את הצורך בסמנים פידוציאליים חיצוניים²³. לצורך הקצאת פאזה, ACP הוקצה ל-30 דקות של מינרליזציה ו-HAP ב-6 שעות, בהתבסס על קינטיקת הבשלה שנקבעו. היכולת להבחין בין שני הפאזות הללו בזמן, בשילוב עם מיקום בקנה מידה ננומי, מאפשרת לחוקרים לחקור את הדינמיקה של טרנספורמציה מינרלית תוך-פיברילית.

לסיכום, התוצאות המייצגות מראות כי פרוטוקול זה מאפשר הבחנה בקנה מידה ננומטרי בין מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרסיביליארית במודל קולגן רקומביננטי, עם מדדי קולוקליזציה כמותיים ובקרות שליליות מתאימות. השיטה חשובה במיוחד לחוקרים החוקרים מנגנוני ביומינרליזציה, חומרים ביומימטיים והנדסת רקמות עצם.

טבלה משלימה 1 מסכמת את הבעיות הנפוצות שנתקלו בהן במהלך הליכי המינרליזציה וההדמיה STORM, יחד עם הגורמים האפשריים והפתרונות המומלצים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור 1: שחזור Multicolor 3D-STORM של סיבי קולגן מינרליים. קולגן (צבע פלואורסצנטי אדום, אדום רחוק) וכונדרויטין סולפט (GAG, צבע פלואורסצנטי כחול, אדום) מוצגים בו-זמנית. הקולוקליזציה של קולגן ו-GAG מופיעה כמג'נטה בתעלה המאוחדת, והאזורים שבהם כל שלושת החפיפות נראים לבנים. מוצג גם פוספט סידן אמורפי (ACP, צבע סידן ירוק) ACP נצפה בתוך גבולות סיבי הקולגן, מה שמעיד על מיקום תוך-פיברילי. פס קנה מידה: 1 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

איור 2: הדמיית 3D-STORM של מינרליזציה תוך-פיברילרית של הידרוקסיאפטיט (HAP). (A) תמונות STORM דו-ממדיות של קולגן (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק), HAP (צבע סידן ירוק), ותעלה משולבת. (B) שחזור נפח תלת-ממדי. (C) ניתוח פרוסות ציר Z במרווחי 60 ננומטר (Z = −120, −60, 0, +60, +120 ננומטר). אות HAP מתמשך בפרוסות המרכזיות (Z = 0 עד ±120 ננומטר) עומד בקריטריוני הסיווג למינרליזציה תוך-פיברילרית (עוצמה ≥50% מהמקסימום). הקולוקליזציה הכמותית חושבה מהאיור הזה: r של פירסון = 0.89 ± 0.04, חפיפת מנדר = 0.91 ± 0.03. פסי קנה מידה: 0.1 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

איור 3: אימות מיקרוסקופ אלקטרוני העברה (TEM) של סיבי קולגן מורכבים בעצמם. סיבי קולגן צוברו ב-1% חומצה פוספוטונגסטית (pH 7.0). דפוס החצי-פסי D-תקופתי באבחון של 67 ננומטר מאשר הצלחה בפיברילוגנזה ושלמות מבנית. פס קנה מידה: 200 ננומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תוצאה שלילית מייצגת: מינרליזציה אקסטרפיברילרית. קולגן (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק) ו-HAP (צבע סידן ירוק). HAP מצטבר אך ורק על מצע הזכוכית מחוץ לסיבי הקולגן, ללא פלישה תוך-פיברילרית. תוצאה תת-אופטימלית זו נכללת כבקרה שלילית כדי להמחיש את טווח התוצאות האפשריות. פס קנה מידה: 0.1 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

איור 5: תמונות קונפוקליות מייצגות המשמשות לסקר ראשוני. (A) ערוץ הקולגן (צבע פלואורסצנטי אדום רחוק) מציג רשת פיברילרית ברורה. (B) ערוץ HAP (צבע סידן ירוק) מראה קשר מינרלי. (ג) התמונה הממוזגת מראה קולוקליזציה של קולגן ו-HAP. פס קנה מידה = 2 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 6: ניסויי ביקורת. (א) שליטה ללא נוגדנים ראשוניים: רק נוגדן משני שהוחל; אין אות ספציפי. (ב) בקרה לא מוכתמת: לא הוחל פלואורופור או נוגדן; אין אות פלואורסצנציה (שחור לחלוטין). פס קנה מידה = 1 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור.

טבלה משלימים 1: מדריך לפתרון תקלות. בעיות נפוצות שנתקלו בהן במהלך מינרליזציה ורכישת/ניתוח של 3D-STORM, יחד עם הגורמים האפשריים והפתרונות המומלצים. ראו את הטקסט למספרי שלבים מפורטים. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מקיף להמחשה בקנה מידה ננומטרי של מינרליזציה של קולגן באמצעות תלת-ממד רב-צבעוני. מספר צעדים קריטיים דורשים תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח תוצאות מוצלחות.

ראשית, הכנת דגימות היא יסוד להדמיית STORM איכותית. האמינו-סילניזציה של כלים עם תחתית זכוכית חייבת להיות יסודית כדי להבטיח חיבור יציב של סיבי הקולגן במהלך שלבי הכביסה והתיוג הבאים. APTES שנותר עלול לגרום לקישור לא ספציפי ולרקע גבוה, בעוד שסילניזציה לא שלמה עלולה לגרום להיפרדות סיבים. שלב האולטרסוניקציה המומלץ (10 דקות בתדר 40 קילוהרץ) מסיר ביעילות את הסילאן הלא קשור תוך שמירה על פונקציונליזציה של פני השטח. לקישור צולב של סיבי קולגן, מומלץ EDC/NHS²¹ לספציפיות גבוהה. חלופה נוספת היא להשתמש ב-0.1% גלוטראלדהיד (דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז שטיפה יסודית), אבל זה פחות ספציפי. חשוב לציין, אנו ממליצים לבדוק את היווצרות הסיבים התקינה על ידי TEM לפני המשך המינרליזציה. כפי שמוצג באיור 3, נוכחות תבנית הפסים המחזורית האופיינית של 67 ננומטר D-מחזורית מאשרת שתהליך ההרכבה העצמית יצר סיבי קולגן²⁶ שנשארו שלמים מבנית, דמויי ילידים. שלב בקרת האיכות הזה מונע פרשנות שגויה של תוצאות הנובעות מפיגום קולגן שנוצר בצורה לקויה או מפורקת.

שנית, יש להכין את מדיום המינרליזציה עם שליטה מדויקת ב-pH (7.4 ± 0.1) ולהשתמש בו מיד. הקדם-פספט הסידן האמורפי (ACP) רגיש מאוד ל-pH ולעוצמה יונית; סטיות קטנות עלולות לגרום להתגבשות מוקדמת. לכן, יש להשתמש במדיום המינרליזציה מיד לאחר ההכנה. למחקרים הדורשים השוואות בין נקודות זמן שונות, יש להכין מדיום חדש לכל ניסוי במקום להשתמש בפתרונות מאוחסנים. כאשר תנאי המינרליזציה אינם נשלטים כראוי (למשל, חומצה פוליאספרטית לא מספקת או pH שגוי), מינרליזציה אקסטרסיבילירילית שולטת, כפי שמוצג באיור 4. בבקרה שלילית זו, HAP מצטבר אך ורק על מצע הזכוכית מחוץ לסיבי הקולגן, ללא פלישה תוך-פיברילרית. הכללת תוצאות שליליות כאלה חיונית כדי לאמת שהאות התוך-פיברילרי הנצפה באיור 1 ובאיור 2 אכן נובע ממינרליזציה תוך-פיברילית מבוקרת ולא ממשקעים לא ספציפיים או שטיפה לא שלמה. יתרה מזאת, מחקרים קודמים הדגישו כי הבחנה בין מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרפיברילרית דורשת שליטה קפדנית בסביבה הכימית המקומית ונוכחות של תוספים מייצבים כמו חומצה פוליאספרטית²⁷.

שלישית, תיוג אימונופלואורסצנציה דורש אופטימיזציה קפדנית. ריכוז הנוגדנים (1:100) שסופק עובד היטב עבור מערכת הקולגן והכונדרואיטין סולפט המתוארת, אך ייתכן שיהיה צורך בכיווץ נוגדנים או סוגי דגימות שונים. תמיד כלול בקרה ללא נוגדנים ראשוניים להערכת אוטופלואורסצנציה וקישור לא ספציפי. מהשלב עם הנוגדן המשני ואילך, הגנה קפדנית מפני אור חיונית למניעת הלבנת פוטואורופור.

רביעית, יש להכין את בופר ההדמיה STORM טרי ולשימוש תוך 30 דקות. מערכת איסוף החמצן (גלוקוז אוקסידאז/קטלז) מאבדת פעילות עם הזמן, והציסטמין רגיש לאור ורגיש לחמצן. הקצאה מוקדמת של מלאי האנזימים ואחסונן בטמפרטורה של -80°C מבטיחה ביצועים עקביים לאורך כל הניסויים. יש לנטר את צפיפות ההבהוב בזמן אמת ולכוונן על ידי מודולציה של עוצמת הלייזר של 405 ננומטר; מעט מדי מולקולות מאריכות את זמן הרכישה, בעוד שיותר מדי מולקולות גורמות ל-PSFs חופפים ולירידה בדיוק הלוקליזציה. לאופטימיזציה מפורטת של פרמטרי התמונה של STORM, אנו מפנים את הקוראים לפרוטוקולי דגימות בדיקה^{מוכרים 15}.

חמישית, עיבוד נתונים דורש פרמטרים סטנדרטיים להשוואות משמעותיות בין מדגמים. סף ספירת הפוטונים המינימלי (בדרך כלל 500-1000 פוטונים) אינו כולל לוקאליזציות בביטחון נמוך. אם אותות הדגימה חלשים, ניתן לצמצם אותם ל-300 פוטונים, אך לא מומלץ לרדת מתחת ל-200 פוטונים. תיקון דריפט באמצעות סמנים פידוקיאליים או אלגוריתמים של קורלציה צולבת הוא חיוני לשמירה על רזולוציה, במיוחד בשחזורים תלת-ממדיים²⁸. פירוק ספקטרלי מסייע בביטול אינטראקציה בין ערוצים, דבר קריטי לניתוח קולוקליזציה מדויק. פתרון בעיות נפוצות מפורט בטבלה משלימה 1.

לפרוטוקול יש מספר מגבלות. הוא מותאם למודלים ביומימטיים במבחנה; יישום על רקמות מקומיות ומורכבות מאוד (למשל, עצם בוגרת) עשוי לדרוש שלבים נוספים כמו דה-קלציפיקציה או שליפת אנטיגנים אגרסיבית יותר, מה שעלול להשפיע על אולטרהסטרוקטורם. הסתמכות על נוגדנים ספציפיים עלולה לגרום לבעיות בצפיפות תיוג או להפרעה סטרית, במיוחד במבנים צפופים. הטכניקה דורשת ציוד, ודורשת גישה למיקרוסקופ STORM מתקדם עם קווי לייזר מתאימים ומצלמת EMCCD. בנוסף, הזמן הכולל הנדרש (~53 שעות מהכנת הדגימה ועד ניתוח הנתונים) עשוי להגביל את קצב התפוקה עבור יישומים מסוימים.

למרות מגבלות אלו, פרוטוקול זה מציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות חלופיות. בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרוני, הוא מספק ספציפיות מולקולרית באמצעות תיוג אימונופלואורסצנציה, המאפשר הדמיה סימולטנית של רכיבים אורגניים ואנאורגניים מרובים. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא משיג רזולוציה מרחבית גבוהה פי ~10, ומאפשר הבחנה בין דפוסי מינרליזציה תוך-פיברילרית לאקסטרפיברילרית. היכולת התלת-ממדית מספקת מידע נפחי חיוני להבנת התפלגות המינרלים במטריצת הקולגן.

לשיטה יש ישימות רחבה במחקר ביומינרליזציה. יישומים פוטנציאליים כוללים חקר תפקידם של חלבונים לא-קולגניים ביצירת גרעין מינרלים, הערכת חומרים ביומימטיים להתחדשות עצם, חקירת מינרליזציה פתולוגית במחלות כמו אוסטאופורוזיס ועששת שיניים, והערכת השפעות של התערבויות טיפוליות על הפצת המינרלים. עם התאמות מתאימות, ניתן להתאים את הפרוטוקול לחקר ממשקים אורגניים-אנאורגניים אחרים ברקמות או ביומטריאלים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומצה פוליאספרטית (p-Asp)	סיגמא-אלדריץ'	P9903	מייצב לסידן פוספט אמורפי
כלוריד סידן (CaCl2)	סיגמא-אלדריץ'	C1016	מקור סידן
נתרן פוספט די-בסיסי (Na2HPO4)	סיגמא-אלדריץ'	S0876	מקור הפוספט
נתרן כלוריד (NaCl)	סיגמא-אלדריץ'	S9888	מתאם כוח יוני
חומצה פוליאקרילית (PAA)	סיגמא-אלדריץ'	323667	מייצב לסידן בריכוז גבוה
בסיס טריס	סיגמא-אלדריץ'	T1503	רכיב מאגר
נתרן אזיד (NaN3)	סיגמא-אלדריץ'	S2002	סוכן אנטימיקרוביאלי
(3-אמינופרופיל) טריאתוקסילן (APTES)	סיגמא-אלדריץ'	440140	סוכן פונקציונליזציה של פני זכוכית
אתנול מוחלט	סיגמא-אלדריץ'	459836	ממס
תמיסת קולגן סוג I (50μ g/mL ב-0.1 M חומצה אצטית)	קורנינג	354249	פיגום להרכבה עצמית
כונדרויטין סולפט (CS)	סיגמא-אלדריץ'	C9819	מחקה חלבון לא קולגני
EDC (1-אתיל-3-(3-דימתילמינופרופיל)קרבודימיד)	סיגמא-אלדריץ'	E7750	קרוסלינקר
NHS (N-הידרוקסיסוקסינימיד)	סיגמא-אלדריץ'	130672	מפעיל קרוסלינקר
חומצה חופשית MES	סיגמא-אלדריץ'	M5287	בופר לקישורים צולבים
סליין ממוגן בפוספט (PBS)	גיבקו	10010023	בופר שטיפה ודילול
אלבומין סרום בקר (BSA)	סיגמא-אלדריץ'	A3059	סוכן חוסם
נוגדן אנטי-קולגן-I של ארנב	אבקאם	AB34710	נוגדן ראשי לקולגן
נוגדן אנטי-כונדרויטין סולפט לעכברים	סיגמא-אלדריץ'	C8035	נוגדן ראשי ל-CS
IgG אנטי-ארנב לעזים בצורת צבע פלואורסצנטי אדום רחוק (Alexa Fluor 647)	תרמו פישר סיינטיפיק	A-21244	נוגדן משני לקולגן
IgM אנטי-עכבר עז שמחובר לצבע פלואורסצנטי אדום (Alexa Fluor 568)	תרמו פישר סיינטיפיק	A-11031	נוגדן משני ל-CS
קלצאין (צבע סידן)	סיגמא-אלדריץ'	C0875	תווית סידן פוספט
טווין-20	סיגמא-אלדריץ'	P1379	חומרי ניקוי לבופר כביסה
גליצרול	סיגמא-אלדריץ'	G5516	רכיב בופר הדמיה
גלוקוז אוקסידאז (GOx)	סיגמא-אלדריץ'	G7141	אוסף חמצן
קטלאז	סיגמא-אלדריץ'	C1345	אוסף חמצן
סיסטימין (MEA)	סיגמא-אלדריץ'	M6500	תיול להבהוב פלואורופור
D-גלוקוז	סיגמא-אלדריץ'	G6152	סובסטרט לגלוקוז אוקסידאז
נתרן אצטט	סיגמא-אלדריץ'	S2889	בופר עבור מלאי GOx
חומצה כלורית (HCl)	סיגמא-אלדריץ'	320331	התאמת pH
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	סיגמא-אלדריץ'	71690	התאמת pH
חומצה פוספוטונגסטית	סיגמא-אלדריץ'	P4006	כתם שלילי ל-TEM
מנות גידול עם תחתית זכוכית (35 מ"מ, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	מצע דגם; עובי 0.17 מ"מ
מנקה אולטרסוני (40 קילוהרץ)	ברנסון	B200	מכשיר ניקוי
תא לחות	תרמו פישר סיינטיפיק	11-432-10	להרכבה עצמית של קולגן
מיקרוסקופ אלקטרונים מעבריים	היטאצ'י	HT7800	הדמיית TEM
רשתות TEM מצופות Formvar/פחמן (200 רשתות)	סיגמא-אלדריץ'	FCF200-Cu	תמיכה בדגימות TEM
פלטפורמת רעידה אופקית	Labnet	S2030-RC	שטיפה עדינה
מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי	ניקון	A1	סינון ראשוני
מערכת מיקרוסקופ 3D-STORM (עם לייזרים 405/488/647 ננומטר, עדשה גלילית, EMCCD)	ניקון	N-STORM	הדמיה ברזולוציה על-אנושית
100 פעמים; מטרה לטבילה בשמן (NA 1.49)	ניקון	MRD01991	הדמיה ברזולוציה גבוהה
מד pH	מטלר טולדו	FiveGo F2	בקרת pH
תוכנת רכישה וניתוח STORM	ניקון	NIS-Elements (מודול STORM)	איסוף ועיבוד נתוני STORM
פורמט קובץ .nd2 (קובץ תמונה מיקרוסקופי גולמי)	ניקון	לא זמין	פורמט קובץ תמונה גולמי שנוצר על ידי מיקרוסקופים של ניקון.
תוכנת ניתוח תמונות זמינה לציבור	קוד פתוח	לא זמין	לדוגמה, ImageJ עם תוסף ThunderSTORM לניתוח לוקליזציה של מולקולה בודדת (קולוקליזציה, תיקון דריפט)
פאראפילם	בימיס	PM996	כיסוי הדגימה במהלך הדגירה
נייר אלומיניום	כל ספק מעבדה	לא זמין	להגנה מפני אור (למשל, עטיפת דגימות עטיפה)
צינורות מיקרוצנטריפוגה ענברים	פישר סיינטיפיק	05-669-21	להגנה מאור על פלואורופורים
קאבסליפס (מס' 1.5)	קורנינג	2855-18	הרכבה לדוגמה