מאמר שיטה

היברידיזציה של mRNA פלואורסצנטי במולטיפלקס במקום של רקמות קרניופציאליות מתפתחות בדגימות עכברי FFPE

DOI:

10.3791/71475

⸱

8 במאי 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היברידיזציה מקומית קונבנציונלית מתקשה להמחיש mRNA ברקמות גולגולת-פנים בשל ארכיטקטורה מורכבת, רקע גבוה, ספציפיות מוגבלת של הגשוש ורגישות. פרוטוקול זה מתאר שיטת RNA פלואורסצנטי מרובה במקום לזיהוי רגיש וספציפי של מטרות mRNA מרובות ברקמות הגולגולת של עכבר FFPE, תוך התגברות על מגבלות קודמות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות קרניופציאלית תלויה בפעילות מתואמת של אוכלוסיות תאים מגוונות ומיוחדות, המתקשרות בתוך ארכיטקטורות רקמה מורכבות כדי ליצור ולשמור על מבנה ותפקוד רקמתי תקין. הבנת האופן שבו תאים אלו מתקשרים זה עם זה ועם המיקרו-סביבה המקומית שלהם חיונית להגדרת המנגנונים המולקולריים שמווסתים את היווצרותם וההומאוסטזיס. הפרעה של תהליכים אלו עלולה להוביל למצבים מולדים בגולגולת, כולל אגנזיה של השן, חיך שסוע ושפה שסועה, בין אם לבד ובין אם כחלק מהפרעות סינדרומיות. בעוד שטכניקות כמותיות כמו RT-PCR מציעות רגישות גבוהה וטווח דינמי גבוה, הן דורשות חילוץ RNA מרקמה הומוגנית, מה שמוביל לאובדן הקשר מרחבי ותאי, מגבלה קריטית במיוחד לרקמות קרניופציאליות הטרוגניות, שבהן לא ניתן לפתור את מקור התמלילים התאית. היברידיזציה של RNA פלואורסצנטי במולטיפלקס מתגברת על מגבלה זו בכך שהיא מאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של תמלילי mRNA מרובים תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמה. גישה מתקדמת זו מאפשרת מיקום מדויק של ביטוי גנים ברמה התאית, ומספקת תובנות חשובות על הוויסות המרחבי של תהליכי התפתחות ומנגנוני מחלות בביולוגיה קרניופציאלית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) היא התקן הזהב לניתוח ביטוי גנים בשל רגישותו הגבוהה וטווח הדינמי הרחב שלה; עם זאת, הוא דורש הפקת RNA מרקמות הומוגניות, מה שמוביל לאובדן הקשר מרחבי ותאי1. מגבלה זו בעייתית במיוחד לרקמות הטרוגניות כמו רקמות קרניופציאליות במהלך התפתחות עוברית, שבהן המקור התאי של התמלילים שזוהו אינו ניתן לפענח. היברידיזציה RNA במקום (ISH), טכניקה שפותחה בשנת 1968 על ידי ג'וזף גאל ומרי לו פארדו, מתגברת על מגבלה זו על ידי אפשרות ללוקליזציה של ביטוי mRNA בתוך ארכיטקטורת רקמה שלמה2. עם זאת, RNA ISH קונבנציונלי הוא טכנית תובעני ותלוי מאוד בקיבוע רקמתי אופטימלי ובהכנת דגימה לשמירת שלמות ה-RNA3. אתגרים אלו מחמירים ברקמות עם סייד גבוה, שדורשות הליכי דה-קלציפיקציה שלעיתים כוללים כימיקלים קשים או עיבוד ממושך, מה שמוביל להתדרדרות RNA. כתוצאה מכך, RNA ISH ברקמות קרניופציאליות, המורכבות מתערובות מורכבות של סוגי תאים, דורש אופטימיזציה קפדנית ומומחיות טכנית, דורש זמן רב ונושא סיכון משמעותי לצביעה לא אופטימלית. האתגר בהמחשת ביטוי mRNA בולט אף יותר ברקמות שיניים, שלהן מבנה והרכב מורכבים מאוד. השיניים מורכבות מרכיבים מינרליים כגון אמייל, דנטין, צמנטום והעצם הסובבת, לצד רקמות רכות כמו העיסה והרצועה החניכית. רקמות אלו מאוכלסות במגוון רחב של סוגי תאים הממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות השיניים4. תכונות אלו דורשות תקינה קפדנית כדי להבטיח זיהוי אותות אמין. כתוצאה מכך, הפרוטוקול המתואר מתאים במיוחד לחקירת ביטוי גנים בשלבי ההתפתחות ואחרי הלידה של יצירת השן.

קיימות טכניקות מבוססות היברידיזציה במיקום מרובה (FISH) לגילוי RNA מרחבי, כולל RNA מוגבר מבוסס פרוב FISH 5,6,7,8,9, תגובת שרשרת היברידיזציה FISH 6, RNA מולקולה בודדת FISH10, הגברת אותות באמצעות תגובת חילוף FISH 5, ופלטפורמות FISH מרובות מאוד כמו MERFISH 11 ו-seqFISH12,13. מתוכם, RNA פלואורסצנטי ISH 7,8,9 במולטיפלקס נמצא בשימוש נרחב בשל רגישותו הגבוהה בזיהוי מולקולת RNA בודדת הנובעת מעיצוב גלאי Z כפול, שבו שני גשושים סמוכים חייבים להיבריד לרצף המטרה כדי להתחיל הגברת אות. עיצוב זיהוי כפול זה משפר משמעותית את הספציפיות ומפחית אותות מחוץ למטרה. השיטה תומכת בזיהוי מולטיפלקס של 2–4 מטרות (ניתנות להרחבה עד 12 מטרות או יותר בטכניקות דומות), משמרת על מורפולוגיית הרקמות, ותואמת לרקמות פרפין משובצות בפורמלין (FFPE)7,8,9, טרי-קפוא ומסויד נבחר, מה שהופך אותה למתאימה לדגימות מורכבות כמו אלו שנפגשות בהתפתחות קרניופציאלית ושיניים. השיטה סטנדרטית, ניתנת לשכפול, נתמכת על ידי ספריות בדיקה מבוססות ומאומתת באופן נרחב, מה שמבטיח תוצאות נגישות ואמינות במעבדות שונות.

RNA פלואורסצנטי מרובה ISH משתמש במספר גשושים המיועדים לאזורים שונים של אותו תמלול בשילוב עם הגברת אות משופרת, המאפשרים זיהוי רגיש וספציפי במיוחד גם עבור mRNA בעלי שפע נמוך או חלקית14,15. בעוד ש-ISH RNA פלואורסצנטי במולטיפלקס יושם בהצלחה על דגימות עצם מפוצרות16, והשימוש בו ברקמות קרניו-פנים מורכבות דווח בעבר 7,8,9; עם זאת, עדיין לא דווח פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב המתאר את יישומו בהקשר זה.

מבנים קרניופציאליים מורכבים מארכיטקטורות רקמה מורכבות עם סוגי תאים מגוונים, כולל אוסטאובלסטים, אוסטאוקלסטים, אוסטאוציטים, אמלבלסטים, אודונטובלסטים, פיברובלסטים, תאי גזע, תאי חיסון, כלי דם ונוירונים חושיים, שהאינטראקציות המתואמות במרחב שלהם חיוניות להיווצרות, תפקוד, התחדשותוהגנה אימונולוגית. לכן, חקר ביטויי גנים מקומיים ברקמות אלו הוא קריטי, ו-RNA פלואורסצנטי ISH במולטיפלקס מהווה גישה מובילה לניתוחים כאלה.

במחקר זה תיארנו כיצד ניתן ליישם RNA פלואורסצנטי ISH מרובי פלואורסצנטיים המבוסס על גשושי RNAscope וטכנולוגיה לחקר רקמות קרניופציאליות מורכבות (איור 1). יתרה מזאת, הקמנו תהליך חיתוך FFPE אופטימלי השומר על שלמות ה-RNA ומאפשר ניתוח ביטוי גנים איכותי ומפוזר מרחבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים (IACUC) של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (IACUC), במסגרת פרוטוקול מחקר בעלי חיים #24-031.

1. הזדווגות מתוזמנת ואיסוף רקמות עובר

  1. קבע הזדווגות מתוזמנת.
    1. זוג זכר ונקבה Musculus musculus בריאים ופוריים בשעות אחר הצהריים המאוחרות. למחרת בבוקר, בדקי אם יש פקק וגינלי. הגדר את היום שבו נצפת פקק כיום עוברי (E) 0.5.
  2. הורד את האישה ההרה.
    1. בשלב ההתפתחותי הרצוי, יש להמתים את העכבר ההרה באמצעות שאיפת CO₂ ואחריה פריקת צוואר הרחם, בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים המוסדיים.
    2. מקם את העכבר על גבו על משטח סופג סטרילי. חטא את אזור הבטן ב-70% אתנול לאורך אזור החתך המיועד.
  3. חשפו ובודדו את קרני הרחם.
    1. עשו חתך בטן בקו אמצעי עם מספריים כירורגיים סטריליים, ואז פתחו את דופן הפריטונאלית עם מספריים מיקרוכירורגיים כדי לחשוף את קרני הרחם.
    2. השתמשו במלקחיים קהים כדי להוציא בעדינות את שרשרת הרחם החוצה. שחררו את רקמת הרחם לאורך המיומטריום וחתכו את צינור הביצים ואת חיבור קרן הרחם המרכזית כדי לבודד את העוברים.
  4. העבר עוברים שלמים.
    1. העבר מיד את שרשרת הרחם המכילה עוברים לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה PBS 1× קר וסטרילי (pH 7.4).
  5. נתח עוברים בודדים.
    1. הפרדו בזהירות כל עובר מהקרומברנות הרחם, השפיר והכוריוניות הסובבות.
    2. העבר את העוברים הנקיים לצלחת טרייה בגודל 10 ס"מ המכילה PBS קר וסטרילי.
  6. נתח ראשי עוברים של עכברים.
    1. באמצעות להב כירורגי סטרילי, נתח את הראשים ושוטף את הראשים המנותחים פעם אחת ב-PBS קר לפני המשך העיבוד.
      הערה: איסוף וניתוח של העכברים התינוקיים בשלב ההתפתחות הרצוי בהתאם לפרוטוקול החי.

2. קיבוע ועיבוד רקמה

  1. תקן את הרקמה.
    1. טבלו מיד את הרקמה המנותקת בפורמלין ניטרלי 10% וקיבעו אותו בטמפרטורת החדר למשך הלילה על שייקר.
      הערה: שימור נכון של RNA הוא קריטי להצלחת ניתוחי היברידיזציה במקום. מחקרים רבים הראו כי הגישה הסטנדרטית — קיבוע דגימות רקמה בפורמלין בופר ניטרלי של 10% למשך תקופות הנעות בין 6 ל-48 שעות, בהתאם לגודל ולגיל הספציפי של הרקמה — מניבה תוצאות אמינות לשימור RNA 16,17,18,19. בשלבים עובריים מוקדמים יותר (E12.5 ומטה), חדירת הקיבוע מהירה, ויש לקצר את זמן הקיבוע בהתאם כדי למנוע קיבוע יתר. מהיום העוברי ה-17.5 (E17.5) ואילך, וכן בדגימות לאחר הלידה, חדירת הקיבע יכולה להיות פחות יעילה בשל נוכחות עור על הראש, הפועל כמחסום פיזי. לכן, יש להסיר את העור מכל הראש כדי לאפשר חדירה יעילה לתמיסת הקיבע. ניתן לבצע דה-קלציפיקציה ב-0.5 M EDTA (pH 8.0) המכיל 0.5% פורמלדהיד ללא מתנול בטמפרטורה של 4°C7. משך הדקלציפיקציה ניתן למעקב באמצעות סריקת מיקרו-CT מהירה וניתן להתאים אותו בהתאם לרמת המינרליזציה ולסוג הרקמה הספציפי; לעוברים E18.5, בדרך כלל מספיק 24–48 שעות.
  2. שטוף ועבד את הרקמה.
    1. הסר את הקיבע ושוטף את הדגימות ב-PBS. העבר את הרקמה ל-70% אתנול ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף (1–4 שבועות)20. בצע ייבוש, ניקוי והזרמת פרפינים באמצעות מעבד רקמות אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: פרוטוקול עיבוד הרקמות הטיפוסי הוא כדלקמן: 70% אתנול למשך 30 דקות, אחריו 95% אתנול למשך 30 דקות (פעמיים), ו-100% אתנול למשך 30 דקות (3 פעמים) לייבוש; ניקוי בקסילן למשך שעה (3 פעמים), ולאחר מכן חדירה עם שעוות פרפין בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה (3 פעמים) לפני הטמעה בבלוקי רקמת פרפין.
  3. להטמיע את הרקמה.
    1. הטמעת הראשים בפרפין וכיוון את הדגימות במישור הקורונלי או הסגיטלי, בהתאם לדרישות הניסוי.
    2. העבר את הבלוקים המוטמעים לפלטת קר עם בלוק פרפין כדי לאפשר לשעווה להתקשות למשך כ-30 דקות, כאשר התזמון מותאם לפי גודל הבלוק.
  4. אחסן את בלוקי ה-FFPE.
    1. תן לפרפין להתגבש לגמרי. הוציאו בלוקים מתבניות, שימו אותם במיכלים אטומים עם תוויות או בשקיות זיפ-לוק, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד שהכנה לחתיכה.
      הערה: בלוקי FFPE עם RNA משומר היטב יכולים להיאחסן במשך מספר שנים לפני החתך מבלי לפגוע בשלמות הרקמה.

3. עיבוד רקמת FFPE עבור RNA פלואורסצנטי במולטיפלקס ISH

  1. הכינו סביבת עבודה ללא RNase.
    1. חטא את כל משטחי העבודה והכלים עם 70% אתנול. טפלו במשטחים, בכלים ובכפפות בתמיסת ניקוי RNase כדי למזער את התדרדרות ה-RNA.
    2. התקן את המיקרוטום והתקן להב חדש. הגדר את זווית המרווח ל-10°. טפל בפינצטה ומברשות בתמיסת ניקוי RNase לפני השימוש.
      הערה: תמיד השתמשו בלהב חדש לחתכים כדי לקבל פרוסות רקמה מדויקות. זווית הלהב משפיעה באופן משמעותי על איכות החתך, שלמות הרקמות, עובי, אחידות ושימור תכונות מורפולוגיות.
  2. תכין את אמבט המים.
    1. מלאו אמבט מים ציפה במים טהורים במיוחד ברמת מעבדה.
    2. כוונו את הטמפרטורה בין 40–43 מעלות לפי הצורך, בהתאם לשלב העוברי ולמאפייני הרקמה.
  3. תצמצם ותתקין את בלוק ה-FFPE.
    1. גזום עודפי פרפין מסביב לרקמה המוטמעת. קרר את בלוק ה-FFPE על קרח והתקן אותו על שלב הקר של מיקרוטום.
  4. גזום לפי אזור העניין.
    1. יישר את פני בלוק הפרפין עם להב המיקרוטום וגזם בשלבים של 12 מיקרון עד שהאזור הרצוי (למשל, הסמוך לשן הטוחנת או השיניים השינית) יופיע בחתכים הקורונליים.
    2. מיקום מחדש של הבלוק והלהב לפי הצורך עבור חתכים קורונליים או סגיטליים סימטריים ומכוונים נכון.
  5. חתך את הרקמה.
    1. כאשר מגיעים לאזור הרצוי, חתכו 5–7 מיקרון. הצף את החלקים על אמבטיית המים כדי לאפשר הרפיה עדינה ולהשטחה לפני העברתם למגלשות.
  6. התקן וייבש את החלקים.
    1. התקן את החלקים על מחסניות זכוכית טעונות חיובית. בדקו את השקופיות תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכיוון הנכון ושלמות הרקמה.
    2. ייבשו את המגלשות על מחמם מגלשה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני ביצוע בדיקת RNA פלואורסצנטי ISH במולטיפלקס.

4. יום 1: דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים

  1. אפה את השקופיות.
    1. יש לאפות את השקופיות עם מקטעי FFPE למשך שעה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם לא משתמשים במחסנית מיד, יש לאחסן אותה ללא אפוי בטמפרטורת החדר (RT) עם חומרי ייבוש למשך 1–4 שבועות. אחסון ממושך עלול לגרום להידרדרות RNA.
  2. לאזן את השקופיות.
    1. אפשר לרקמת ה-FFPE להחליק לאיזון בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
  3. דה-פרפין והרטיב מחדש את החלקים.
    1. טבלו את השקופיות בקסילן או תחליף קסילן עם ערבוב עדין למשך 5–10 דקות ב-RT. חזרו על שלב זה פעם אחת כדי להבטיח הסרה מלאה של הפרפין.
      הערה: עבודה עם קסילן צריכה להתבצע במכסה אדים כימיקלי. אם משתמשים בתחליף קסילן בעל רעילות נמוכה, ניתן להשתמש בו מחוץ למכסה האדים הכימי.
    2. העבר את הסליידס ל-100% אתנול ודגר במשך 2 דקות ב-RT. חזור על זה פעם אחת כדי להסיר שאריות קסילן. הרטיב מחדש את החלקים ב-70% אתנול למשך 2 דקות.
    3. שטוף את החלקים 3 פעמים עם PBS. ואז להוסיף טיפה של PBS מספיק כדי לכסות את כל החלקים ומיד לעבור לשלב הבא.

5. RNA פלורסצנטי ISH במולטיפלקס על חתכי רקמת FFPE

הערה: מחקר זה התבצע לפי הוראות היצרן לביצוע RNA פלואורסצנטי ISH במחלקת רקמות FFPE באמצעות טכנולוגיית RNAscope21.

  1. יום 1: טיפול מקדים והיברידיזציה של פרוב
    1. צייר מחסום הידרופובי.
      1. באמצעות עט מחסום, צייר מחסום הידרופובי סביב כל חתך רקמה. אפשר למחסניות להתייבש באוויר למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      2. ודאו שחלקי הרקמה נשארים מכוסים ב-PBS בכל עת כדי למנוע ייבוש.
        הערה: השתמשו במגבון ללא סיבים (מגבון עדשה) כדי לייבש את הסלייד סביב הרקמה תוך שמירה על הלחות של הרקמה. ודאו שדיו עט המחסום אינו בא במגע עם חלק הרקמה.
    2. בצע טיפול מקדים.
      1. מרחו את התגובה המקדימה המותאמת אישית כדי לכסות כל חלק. דגרו את המחסניות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בתא לח המונח בתוך תנור היברידיזציה.
        הערה: לכל החומרים המסופקים בבקבוקי טפטפת, הוסף מספיק טיפות כדי לכסות במלואו את החלק בתוך המחסום. ודא שכל החומרים מובאים ל-RT לפני השימוש.
    3. שטוף את החלקים.
      1. שטוף את החלקים מספר פעמים עם PBS, ואז דגור ב-PBS טרי למשך 2 דקות ב-RT.
        הערה: השתמש בפיפטה בהעברה בנפח 5 מ"ל כדי לשטוף כל סלייד בנפרד עם PBS. במהלך הכביסה של שתי דקות, ודא שהחלקים נשארים מכוסים במלואם ב-PBS.
    4. כיבוי פעילות פרוקסידאז אנדוגנית.
      1. מרחים 3% מי חמצן לכל מקטע ודגרו ב-RT למשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית.
    5. חזור על הכביסה.
      1. שטוף את השקופיות ב-PBS למשך 2 דקות ב-RT. חזור על זה פעמיים.
    6. הכינו את הגשושים.
      1. חממו את הגשושים מראש בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. תן לגלאים להתקרר ל-RT לפני השימוש.
    7. הכינו את תערובת הגשושים.
      1. גלאי C1 מסופק כפתרון 1× שפועל; תשתמש בזה ישירות.
      2. לעומת זאת, גשושי C2, C3 ו-C4 מסופקים בריכוזים של 50×; לדלל את הגשושים הללו באמצעות תמיסת גלאי C1. אם לא נעשה שימוש בגלאי C1, יש לדלל את גלאי C2, C3 ו/או C4 עם מדלל הגשן שסופק על ידי היצרן.
    8. היברידיז את הגשושים.
      1. יש להניח 30–40 מיקרוליטר של תערובת פרוב על כל חתך רקמה, כדי להבטיח כיסוי מלא. דגרו את המחסניות למשך שעתיים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בתא לחות בתנור ההיברידיזציה.
        הערה: בעת למידת טכניקת RNAscope, מומלץ לכלול גם גלאי בקרה שליליים וגם חיוביים במהלך ריצות הניסוי. גישה זו מסייעת לאמת את הבדיקה ולאשר את איכות התהליך. מגבלה פוטנציאלית שיש לשים לב אליה היא שחלק מהגלאים החיוביים שסופקו על ידי היצרן עשויים שלא להיות מבוטאים ברקמה הרלוונטית. כדי להתמודד עם זה, ניתן להשתמש בגשואים ספציפיים לסוג תא. לדוגמה, Col1a1 הוא בקרה חיובית אמינה לרקמות חיבור. צביעת Col1a1 (או גן אחר עם ביטוי גבוה ידוע) יכולה להתבצע כשלב ראשון להערכת שימור ה-RNA ומורפולוגיית הרקמות בדגימות. לאחר השגת מיומנות בטכניקה, בקרות שליליות מתבצעות בדרך כלל על ידי עיבוד שקופיות ללא גלאים אך טיפול בהן עם כל שאר התרונות. שיטה זו מספקת מידע קריטי לגבי אות הרקע בכל ערוצי הגילוי. ערכת Multiplex V2 הסטנדרטית מאפשרת צביעה והדמיה סימולטנית של עד ארבעה גשושים שונים. כאשר רמות ביטוי הגנים נקבעו באמצעות מחקרים קודמים בטרנסקריפטומיקס, מומלץ להקצות גנים בעלי ביטוי נמוך לערוצי Cy5 ו-Cy7. גנים המובעים מאוד צריכים להיות מוצבים בערוצי GFP ו-RFP לזיהוי מיטבי. במקרים שבהם אף אחד מהגשושים לא מכוון לגנים בעלי ביטוי גבוה, ערוץ ה-GFP צריך להישאר ללא שימוש. דבר זה מאפשר לערוץ ה-GFP לשמש כנקודת ייחוס לחיסור ברקע מערוץ ה-RFP, ולשפר את דיוק זיהוי האות עבור מטרות עם ביטוי נמוך.
    9. שטוף עם בופר כביסה.
      הערה: Wash Buffer 20× הזמין מסחרית דולל ל-1× עם מים ללא RNase לפני השימוש.
      1. שטוף את המחסניות למשך 2 דקות ב-RT ב-1× Wash Buffer שסופק עם הערכה. חזור פעמיים.
    10. דגרו ב-5 פעמים בופר מלח-נתרן ציטראט (SSC).
      הערה: בופר SSC 20× הזמין מסחרית (3 מיליון NaCl, 0.3 מיליון נתרן ציטראט, pH 7.0) דולל ל-5× עם מים ללא RNase לפני השימוש.
      1. אחרי הכביסה, דגר את החלקים למשך הלילה בבופר SSC 5× ב-RT.
  2. יום 2: הגברת אותות, תיוג פלואורסצנטי והרכבה
    1. שטוף את השקופיות.
      1. שטוף את המחסניות ב-1× Wash Buffer למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). חזור פעמיים.
    2. בצע את שלבי ההגברה.
      1. מרחו מגיב הגברה 1 על כל קטע ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בתא לח.
      2. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      3. מרח תגובת Amplification 2 ודגרה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      4. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      5. מרח את תגובת הגברה 3 ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
        הערה: כל שלושת שלבי ההגברה נדרשים ללא קשר לאילו ערוצים (פרובים) מתפתחים.
      6. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
    3. לפתח פרוקסידאז צנון (HRP) ופלואורופור.
      1. מחשבים את נפח הפלואורופור הנדרש (בדרך כלל 100–200 מיקרולטר לשקופית) ודיללו את מלאי הפלואורופור של אופל.
        הערה: טווח הדילול המומלץ לפלואורופור הוא 1:300–1:1500. בניסויים אלו, אופל פולאריס 780 (תגובת פלואורופור) דוללה ב-1:500 בדילול נוגדנים, וכל שאר הצבעים דוללו ב-1:1000 בבופר TSA. מזער את החשיפה לאור על המגלשות ככל האפשר.
      2. מרחו את תגובת HRP-C1 ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      3. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      4. מרחו 30–40 מיקרוליטר של צבע אופל (למשל, אופל 570 או אופל 690) על כל חלק. דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      5. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      6. מרח חוסם HRP ודגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      7. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      8. מרחו תגובת HRP-C2 או HRP-C3 ודגרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      9. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      10. מרחו 30–40 מיקרוליטר מהצבע השני של אופל ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      11. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      12. מרח חוסם HRP ודגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      13. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      14. מרח HRP-C3 או מגיב HRP-C4 ודגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      15. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
    4. בצע הגברת אות טירמיד - דיגוקסיגנין (TSA-DIG) וסימון פלואורופור (אם רלוונטי).
      1. מרחו 30–40 מיקרוליטר של תגובת TSA-DIG מדוללת לכל מקטע ודגרו במשך 30 דקות ב-RT.
      2. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      3. מרחו חומר חוסם ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      4. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
      5. מרחו 30–40 מיקרוליטר של תגובת פלואורופור מדוללת ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.
      6. שטוף פעמיים ב-1× Wash Buffer במשך 2 דקות ב-RT.
    5. בצע צביעת נגד והרכבה.
      1. מרחו 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגרו במשך 5 דקות ב-RT בחושך.
      2. שטוף את DAPI והתקן מיד את החלקים באמצעות הרכבה נגד דעיכה, מרח בעדינות את הכיסוי והימנע מלכידת בועות אוויר. בחרו גודל כיסוי שמתאים לכיסוי הרקמה.
      3. ייבשו את המגלשות במשך שעתיים ב-RT בחושך, ואז שמרו על 4 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
        הערה: ניתן לשמר פלואורסצנציה עד שנה אם נשמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עם התקנת אנטי-דהייה נכונה.
    6. בצע הדמיה.
      1. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה רב-ערוצי עם תאורת LED ומסננים להפרדה ספקטרלית (איור 2A). השתמש באורכי הגל של עירור ופליטה כך: DAPI (353/465 ננומטר), FITC (495/519 ננומטר), Cy3 (548/561 ננומטר), Cy5 (650/673 ננומטר), ו-Cy7 (747/773 ננומטר). מסננים ספציפיים ממזערים חפיפות ספקטרליות ומבדילים אותות כחולים, ירוקים, כתומים, אדומים ואותות אינפרא-אדום קרובים.
      2. רכוש את כל התמונות באמצעות הגדרות חשיפה ותאורה זהות בין הדגימות, כדי להבטיח עקביות ולאפשר ניתוח השוואתי אמין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הפרוטוקול המתואר (איור 1), אנו מדגימים גילוי תמלול mRNA פלואורסצנטי מרובה פלואורסצנטי ב-ISH בעכבר שלם וצולם על פלטפורמת מיקרוסקופ של Zeiss (איור 2B). ניתן לבחור תצוגות תמונה ספציפיות באמצעות לשונית הצד (התיבה הצהובה), בעוד שניתן להציג מספר ערוצים בו-זמנית באמצעות לשונית הערוצים (התיבה האדומה). הבהירות, הגמא והניגודיות של התמונה החיה ניתנים לכוונון ישיר באמצעות השליטה תחת לשונית התצוגה (התיבה הירוקה) כדי למקסם את הנראות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היברידיזציה במקום היא כלי יסודי לחקר ביטוי גנים במשך יותר מארבעה עשורים ועברה שיפור מתמשך. עם זאת, גישות ISH קונבנציונליות מוגבלות לעיתים קרובות בשל רגישות נמוכה, אות רקע גבוה ופרוצדורות ארוכות ודורשות עבודה רבה. מגבלות אלו הגבילו את היישום הרחב יותר שלהן, במיוחד ברקמות קרניופציאליות מורכבות, שבהן רזולוציה מרחבית מדויקת וזיהוי תמלולים בעלי שפע נמוך הם חיוניים. RNA פלואורסצנטי במולטיפלקס ISH מתגבר על רבים מהאתגרים הללו באמצעות עיצוב הגשוש הייחודי שלו ואסטרטגיית הגברת האותות, שמגב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לצוות מתקן בעלי החיים של NICHD על הסיוע בגידול בעלי חיים ובגידול. אנו מודים לד"ר וינסנט שרם מליבת מיקרוסקופיה והדמיה (NIH/NICHD) על הסיוע בהדמיית פלואורסצנציה. כתב היד הנוכחי נתמך על ידי מימון מ-NIH/NIDCR RO1DE033520 ל-M.B., תוכנית המחקר הפנימית, המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) ועד ל-E.M., ומזהה מענק מחקר של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) ZIA HD009015. למממן לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1× PBSתרמו פישר10010023שימוש  לבצע שטיפות במהלך תהליך העבודה
20&00; SSCתרמו פישרJ60839. K2השתמש בו כדי ליצור את ה-1´ בופר שטיפה
צינורות חרוטיים של 50 מ"ל (Ambion) ללא RNAseתרמו פישרAM12502להשתמש באחסון דגימות בתמיסות שונות
מזעזע מסלול מתקדםVWR6683-470להשתמש בו לנער רקמות בתמיסת קיבוע במהלך הדגירה
אלכוהול, 70%, פישרברנד, היסטופרפפישר סיינטיפיקHC-1000-1GLלהשתמש בו לניקוי וחיטוי כל שטח העבודה
מדלל נוגדנים אקויה ביוסיינסיסARD1001EAמדלל עבור TSA-DIG
מעבד רקמות ואקום אוטומטיLeica BiosystemsASP300Sשימוש לניקוי, ייבוש, הידרציה מחדש וחדירת שעווה של דגימות
עובי זכוכית כיסוי 1.5, 25 מ"מ x 25 מ"מ;קורנינג2850-25שימוש בהרכבת סלייד בתהליך עבודה של Visium HD
תגובת טיפול מקדים מותאמת אישיתACD, ביו-טכנה300040לאופטימיזציה של חדירות רקמות ונגישות מיקוד
EDTAמיליפור סיגמא03690שימוש לדקלציפיקציה של רקמות מינרליות
אתנול 100%קבוצת AeroBase6505001050000השתמש להסרת קסילין ולהחזרת נוזלים במהלך העיבוד
אמבט מים HistoCore & nbsp;Leica BiosystemsHIS2326משתמשים בציפה של הקטעים ב-40-43 ו-°ג; C להסרת קמטים מחלקי FFPE  
נייר הלחות של HybEZACD, ביו-טכנה310015השתמש בתנור HybEZ לשמירה על לחות ומניעת ייבוש חלקי רקמה במהלך ההיברידיזציה
תנור, מגש ומדף HybEZACD, ביו-טכנה310011, 310012, 310014השתמש לספק טמפרטורה מבוקרת, לחות ומיקום נכון של הסלייד במהלך שלבי ההיברידיזציה והדגירה
עט מחסום הידרופובי ImmEdgeמעבדת וקטוריםH-4000משתמשים בציור גבולות הידרופוביים על שקופיות כדי להגביל את החומרים לחלק הרקמה במהלך הליכי צביעה.
להבים חד-פעמיים בפרופיל נמוך DB80LXLeica Biosystems14035843496השתמש בבלוקים של FFPE  
פורמלין ניטרלי עם בופר 10%אזר סיינטיפיקNBF-4-Gשימוש לתיקון הרקמות
חבילת התגובה OPAL 520Akoya Biosciences, Inc.FP1487001KTלהגביר ולזהות אותות RNA מטרה באמצעות סימון פלואורסצנטי.
חבילת התגובה OPAL 570Akoya Biosciences, Inc.FP1488001KTלהגביר ולזהות אותות RNA מטרה באמצעות סימון פלואורסצנטי.
חבילת ריאגנט OPAL 620Akoya Biosciences, Inc.FP1495001KTלהגביר ולזהות אותות RNA מטרה באמצעות סימון פלואורסצנטי.
חבילת התגובה OPAL 690Akoya Biosciences, Inc.FP1497001KTלהגביר ולזהות אותות RNA מטרה באמצעות סימון פלואורסצנטי.
חבילת התגובה Opal Polaris 780Akoya Biosciences, Inc.FP1501001KTלהגביר ולזהות אותות RNA מטרה באמצעות סימון פלואורסצנטי.
יהלום פרולונגתרמו פישרP36970מדיום הרכבה נגד פייד לשימור אותות פלואורסצנטיים והגנה על אות RNAscope במהלך הדמיה
RNAscope 4-Plex kit נלווים UI ספציפיACD, ביו-טכנה323120חומרים נוספים המשמשים במבחן RNAscope Multiplex Fluorescent v2
RNAscope DAPIACD, ביו-טכנה320858צבע גרעיני פלואורסצנטי המשמש בבדיקות RNAscope להצגת גרעיני תא
ערכת RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent v2ACD, ביו-טכנה323100לביצוע היברידיזציה פלואורסצנטית במולטיפלקס במקום
RNAscope Multiplex TSA BufferACD, ביו-טכנה322810בופר המשמש ב-RNAscope לדילול צבעי אופל
RNAscope מגיבים לבופר וושACD, ביו-טכנה310091השתמש בשטיפת חלקי הרקמה על שקופיות במהלך הבדיקה
תמיסת ניקוי זיהום RNaseZap RNaseתרמו פישרAM9782שימוש לניקוי והסרה של RNase
מיקרוטום סיבובי חצי-אוטומטיLeica BiosystemsRM2245השתמשו במסגרת חסימות FFPE כפי שמדווח בהנחיות.
סלייד ברייטמדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים23401-01לשלב דה-פרפיניזציה לפני עיבוד RNAscope.
מחמם סלייד עם כיסויבכורה  XH2004שימוש בדגירת מגלשות בטמפרטורות שונות
מגלשות סופרפרוסט פלוס פישר סיינטיפיק12-550-15 שימוש לחיבור מקטעים ל-Vsium HD
הפרפלסט של הניתוחLeica Biosystems39601006שימוש לביצוע חדירת רקמות והטמעה של רקמות
תרבית רקמה DISH 100 X 20 MM 500/CSפישר סיינטיפיק877222שימוש לאיסוף וניתוח דגימות ב-1´ PBS
קסילןפישר סיינטיפיק6.81001E+12משמש כסוכן ניקוי להסרת אלכוהול והפיכת הרקמות לשקופות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Artika, I. M., et al. Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis. Genes. 13 (12), 2387(2022).
  2. Chu, Y. H., et al. In situ hybridization: introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 36 (5), 336-341 (2019).
  3. Atout, S., et al. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review. Mol Diagn Ther. 26 (1), 19-37 (2022).
  4. Tseng, K. C., Crump, J. G. Craniofacial developmental biology in the single-cell era. Development. 150 (19), dev202077(2023).
  5. Kishi, J. Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods. 16 (6), 533-544 (2019).
  6. Lovely, A. M., et al. Hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2562, 109-122 (2023).
  7. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  8. Piña, J. O., et al. Multimodal spatiotemporal transcriptomic resolution of embryonic palate osteogenesis. Nat Commun. 14, 5687(2023).
  9. Piña, J. O., et al. Spatial multi-omics reveals the role of the Wnt modulator Dkk2 in palatogenesis. J Dent Res. 103 (13), 1412-1420 (2024).
  10. Raj, A., et al. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  11. Xia, C., et al. Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 116, 19490-19499 (2019).
  12. Lubeck, E., et al. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods. 11, 360-361 (2014).
  13. Shah, S., et al. In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  14. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  15. Erben, L., Buonanno, A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Curr Protoc Neurosci. 87, e63(2019).
  16. Makareeva, E., et al. RNA-based bone histomorphometry: method and its application. J Bone Miner Res. 39 (2), 177-189 (2024).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  18. Monné Rodríguez, J. M., et al. Review of in situ hybridization techniques for drug research and development. Toxicol Pathol. 51 (3), 92-111 (2023).
  19. Colburn, M. E., et al. Effect of formalin-fixation and paraffin-embedded tissue storage times on RNAscope signal amplification. J Vet Diagn Invest. 36 (4), 498-505 (2024).
  20. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium. Am J Clin Pathol. 137 (3), 429-436 (2012).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , ACDbio. Available from: https://manuals.plus/m/0f24eea864dcf70b83735b261589c2e98f9c707b01c1c9c0455f349c8ab2eb0c (2025).
  22. Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  23. Hernández, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomic profiling of cardiac fibroblasts following myocardial infarction. Sci Data. 13, 216(2026).
  24. Dropmann, A., et al. The TGF-β1 target WISP1 is highly expressed in liver cirrhosis and cirrhotic HCC microenvironment. Biochem Biophys Res Commun. 732, 150409(2024).
  25. Stolley, D. L., et al. RNA in situ hybridization with sequential protein immunofluorescence in tandem assay. J Vis Exp. (224), e68615(2025).
  26. Anderson, C. M., et al. Visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context. J Vis Exp. (138), e58097(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Multiplex Fluorescent HybridizationIn Situ HybridizationCraniofacial DevelopmentFFPE Mouse SamplesmRNA DetectionGene Expression LocalizationTissue ArchitectureCraniofacial TissuesCongenital Craniofacial DisordersSpatial Gene Expression

מאמרים קשורים