פלטפורמה ביואנליטית היברידית מבוססת תרבית תאים תלת-ממדית להדמיה אופטית באמצעות ספוגי פיברואין משי

סיכום

המאמר מתאר מתודולוגיה פשוטה, נגישה וניתנת לשחזור לייצור ופידול פיגומי משי של תאי סרטן השד 4T1-iRFP720 בתנאים מבוקרי זרימה, לתמיכה בתרבות דינמית. גדילה והגירה תאית הוערכו כהוכחת היתכנות באמצעות מכשיר הדמיה אופטית in vivo כקריאה הלא-פולשנית העיקרית.

תקציר

אנו מציגים פלטפורמה היברידית ביואנליטית חדשנית שנועדה להערכה פרה-קלינית של תכונות תאיות. המערכת משלבת תרבית תאים תלת-ממדית (3D) שגדלה על מטריצה מלאכותית חוץ-תאית עם תצורת מערך בהשראת כרומטוגרפיה. ספוגים, המורכבים מחלבון המשי המבנה פיברואין, משמשים הן כמטריצה חוץ-תאית ביוממטית והן כשלב נייח. ספוגי פיברואין משי יוצרו בתוך הבית בתהליך רב-שלבי שכלל הסרת חלבוני סריצין מובנים מסיבי משי גולמיים, לאחר מכן המסה ודיאליזה לטיהור תמיסת הפיברואין, המסה בממס אורגני, ויציקת מיטת מלח ליצירת ספוגים מבוססי משי עם נקבוביות/נקבוביות מבוקרת של 500–800 מיקרון. קווי תאים מהונדסים גנטית של סרטן השד 4T1-iRFP720 ו-4T1-wt (בקרה לא פלואורסצנטית) גודלו בתוך פיגומי משי באמצעות זרימת מדיה רציפה דרך משאבה, וצמיחתם ומאפייני התאים שלהם נותחו באופן לא פולשני באמצעות טכניקות הדמיה אופטית (מכשיר דימות אופטי in vivo ). על ידי שילוב יתרונות מרכזיים של מערכות כרומטוגרפיה (אוטומציה, שכפול) עם הרלוונטיות הביולוגית של תרביות תאים תלת-ממדיות מתקדמות, הפלטפורמה מאפשרת מידול חוץ גופני של ארכיטקטורה ומורפולוגיה דמוית רקמה תוך הקלה על ניטור התנהגות תאית דינמית. במקביל, יישום טכנולוגיית הדמיה רפואית מאפשר ניטור בזמן אמת וממושך של נדידת תאים וצמיחה, בין גורמים נוספים. גישה זו מציעה פוטנציאל משמעותי לחקירת התנהגויות תאיות בקנה מידה מקרוסקופי במערכת זרימה למינרית. על ידי שיפור הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים במבחנה , שיטה זו עשויה לסייע בגישור על הפער התרגומי למחקרים בתוך החיים , והיא תואמת את מסגרת ה-redic, rechange, refresh (3R) לניסויים בבעלי חיים.

מבוא

ברקמות חיות, נדידת תאים וצמיחה מתרחשות בתוך מטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית והטרוגנית (ECM), המונחית על ידי רמזים ביופיזיקליים וביוכימיים, כגון זרימת נוזלים אינטרסטיציאלית ואינטראקציות בין תאים. גורמים אלו מווסתים את קוטביות התאים, הטרנסדוקציה המכאנית והתנועה המתואמת, ומהווים תהליכים ביולוגיים מרכזיים כולל תיקון רקמות ופלישה לסרטן 1,2,3,4.

למרות חשיבותן, רוב בדיקות ההגירה במבחנה, כמו בדיקות scratch ו-Transwell, מעריכות תנועת תא בודד על מצעים שטוחים וסטטיים. למרות שהן פשוטות וחסכוניות, גישות דו-ממדיות אלו משחזרות בצורה לקויה את המאפיינים המבניים והדינמיים של מיקרו-סביבת ה-in vivo ^5,6. מגבלה זו הופכת לקריטית במיוחד בהקשר של גרורות סרטן, כאשר תאי הגידול נודדים יחד דרך מטריצות רקמות מגוונות מכנית וכימית ^3,7,8. בעוד שבדיקות גירוד דו-ממדיות עדיין פופולריות כי הן קלות לביצוע, הן אינן משקפות את המורכבות של ה-ECM או את השפעות זרימת הנוזל⁶. גישות מבוססות טרנסוול מספקות קריאות כמותיות, אך רק בנקודות קצה קבועות, ומונעות תצפית רציפה על ההגירה ^6,9.

מחקרים עדכניים הראו שזרימה בין-תקופתית מגבירה את הפוטנציאל הגרורתי, בעוד שנוקשות והרכב ECM מקדמים מעבר אפיתליאלי-מזנכימי והגירה קולקטיבית ^4,10. מערכות תלת-ממד מתקדמות יותר, כמו ספרואידים ואורגנידים, מקרבות טוב יותר סביבות ECM מקוריות; עם זאת, השימוש בהם מוגבל לעיתים קרובות על ידי שונות, נגישות ניסויית מוגבלת וקושי בניתוח סטנדרטי^11,12. פלטפורמות מיקרופלואידיות מציעות שליטה מעולה על תנאים מכניים ונוזליים, אך התלות שלהן בשיטות ייצור וציוד מיוחדים מגבילה את השימוש הנרחב^{שלהן 13}. לכן, שחזור הסימנים המשולבים הללו במבחנה בצורה מבוקרת, נגישה, לא פולשנית וחסכונית נותרת אתגר מרכזי ^5,14.

כדי להתמודד עם האתגרים הללו ולגשר על הפער בין בדיקות דו-ממדיות קונבנציונליות למודלים מורכבים ב-invivo , פיתחנו פלטפורמה תלת-ממדית פשוטה עם זרימה המבוססת על פיגוג ספוג משי. המערכת משתמשת בספוג משי עם תכונות מכניות ניתנות לכיוונון כפיגום דמוי ECM. משי נבחר בשל המבנה הנקבובי שלו, המאפשר פרפוזיה עדינה ותומך בזרימה אינטרסטיציאלית רלוונטית פיזיולוגית¹⁵. התאימות הביולוגית שלו והשימוש המבוסס בהנדסת רקמות ביו-רפואית ורקמות הופכים אותו לחומר מתאים ליישום זה. פרסום עדכני הדגים עוד את הקיימות הסביבתית של הפיגום ואת פוטנציאל המיחזור¹⁶. במחקר נוסף, הראינו את היכולת שלהם להסתגלות בשיטות דימות שונות, כמו טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים¹⁷. עבודה קודמת זו שימשה בסיס לתיאור המתודולוגיה הנוכחי, שבה אנו בונים על אותו קונספט פלטפורמה בתצורה מפושטת המבוססת על דימות אופטי ב-vivo . יחד, מחקרים אלו מדגימים את הפוטנציאל של המערכת להערכה מבוססת דימות רב-מודלי של מבני רקמה מהונדסים ותומכים בשימושה כפלטפורמה ניסויית רב-שימושית לשילוב תרביות חוץ גופית וקריאות רלוונטיות ל-in vivo בין מודלים שונים של תאי סרטן.

כהוכחת מושג, תרבתנו תאי סרטן שד משולש שליליים עם 4T1 מסומנים ב-iRFP720 בתוך הפיגום תחת שני תנאי זרימת גזירה נמוכה במשך חמישה ימים. ניטור דימות אופטי לא פולשני בגוף חשף דפוסי גדילה מובחנים מונחי זרימה ושינויים משמעותיים בדינמיקת אוכלוסיית התאים בהשוואה לבקרות סטטיות. על ידי הדגשת פשטות הנדסית ושחזוריות, מודל זה מספק גשר מעשי בין בדיקות דו-ממדיות למחקרים ב-vivo, ומאפשר לחוקרים לבחון, בקנה מידה מקרוסקופי ובאופן לא פולשני, תכונות תאיות המתווכות בזרימה בפורמט פיזיולוגי רלוונטי אך נגיש. בניגוד לשיטות קודמות שלעיתים קרובות הסתמכו על ניתוחי נקודות קצה הרסניות או חסרות קריטריוני זריעה סטנדרטיים, פרוטוקול זה מציג מסגרת שיטתית לאופטימיזציה של ייצור פיגומים, ולאחר מכן לזריעה והדמיה של תאים. גישה זו משפרת את החוסן הניסויי ומספקת מבט מקיפה וארוך יותר על דינמיקת התאים הקולקטיבית בתוך מטריצות תלת-ממדיות, ומייצגת שיפור משמעותי לעומת השיטות הקיימות למעקב אחר צמיחה ונדידה.

פרוטוקול

החלק הראשון מתאר את הכנת פיגומי פיברואין משי בהתבסס על עבודות קודמות^{שפורסמו 16}. הסעיפים הבאים מתארים אופטימיזציה של צפיפות זריעת תאים, שילוב זרימה ודימות אופטי למעקב אחר תנועת וגדילת התאים. מחקר זה השתמש אך ורק בקווי תאים מבוססים של סרטן השד של עכברים (4T1-wt ו-4T1-iRFP720) ולא כלל משתתפים אנושיים, דגימות מטופלות, רקמות ראשוניות או בעלי חיים חיים. בהתאם להנחיות מוסדיות וארציות, לא נדרשה אישור אתי. סקירה סכמטית של תהליך העבודה מוצגת באיור 1.

1. הכנת ספוג המשי הפיברואין

1. ניקוי וניקוי גומי של הגולם.
   1. חתכו את הפקעות של תולעת המשי Bombyx mori L. באמצעות סכין מנגנון בטיחות.
   2. הסר את הזחלים וחלץ את שכבת הפקעת הפנימית ביותר (שכבה דחוסה שמקיפה ישירות את חלל הזחל) באמצעות מחט ניתוח סטנדרטית.
   3. מלאו בקבוק ב-1.6 ליטר מים מזוקקים כפול (ddH₂O).
   4. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי והביאו את המים לרתיחה תוך כדי ערבוב; כסה את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי להאיץ את החימום ולהפחית אובדן מים.
   5. הוסף 3.4 גרם Na_{2CO 3} כאשר טמפרטורת המים מגיעה לכ-70 מעלות צלזיוס.
   6. כשהתערובת מתחילה לרתוח, שים 4 גרם פקעות מוכנות לתמיסה וערבב עם מוט זכוכית.
   7. הרתיחו את הגולמים במשך 30 דקות, ערבבו עם מוט זכוכית כל 10 דקות כדי להבטיח חשיפה נכונה.
   8. הסר את המשי מהתמיסה ושוטף אותו מספר פעמים במי ברז כדי להסיר את שארית הסריסין.
   9. סחטו מים מופרזים ופזרו את סיבי המשי על תבנית אלומיניום מוכנה.
   10. ייבשו את סיבי המשי בתנור מחומם מראש בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד שהם יבשים לחלוטין (כ-18 שעות).
2. פירוק ודיאליזה
   1. השתמשו באתנול אבסולוטי וב-CaCl₂ חסר מים בשלבים הבאים. מטריצת המסה מורכבת מחלק אחד של CaCl₂, 2 חלקים של אתנול, ו-8 חלקים של ddH₂O. היחס בין משי יבש ללא גומי למטריצת התמוססות הוא 1:10 [ברוחב/לוח].
   2. שקלו את המשי היבש וחשבו בהתאם את הכמויות הנכונות של הרכיבים למטריצת ההמיסה.
   3. מלאו את הכמות המתאימה של CaCl₂ בבקבוק עגול עם מוט ערבוב.
   4. מדוד את כמות האתנול וה-DDH_2Oהנדרשת ומשלב ביניהם.
   5. הוסיפו את תערובת אתנול-ddH₂O ל-CaCl₂ בזמן ערבוב.
   6. התקן מכשיר ריפלוקס וחמם את התערובת ל-100 מעלות צלזיוס באמבט שמן, מאפשר ל-CaCl₂ להמיס ולהביא את התערובת לרתיחה.
   7. כשהתערובת מתחילה לרתוח, הוסיפו את המשי היבש וחממו אותו בריפלוקס למשך 45 דקות.
   8. הכינו צינורות דיאליזה תאית באורך 15 ס"מ בנפח 3.5 קילו-דלטון על ידי שטיפתם מספר פעמים במים כדי להידרדר מחדש, ואז לאבטח קצה אחד כרוך סביב מוט זכוכית עם קליפס איטום.
   9. לאחר הרתיחה, מעבירים את תמיסת המשי החמה לצינור ואוטמים את הקצה הנגדי עם קליפס, תוך השארה רווח של 2–3 ס"מ בין הנוזל לקליפס האיטום, ללא כלבי אוויר.
   10. שים את צינור הדיאליזה המלא בכוס של 2 ליטר מלא ב-DDH₂O ובצע דיאליזה בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות, תוך החלפת מים פעמיים ביום כדי להבטיח טיהור יעיל.
   11. צנטריפוגה את התמיסה ב-4500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   12. שפוך בעדינות את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה מבלי להפריע לכדור, ואחסן את הצינורות בטמפרטורה של מינוס 20°C.
       הערה: מלאו את צינורות הצנטריפוגה עד לא יותר מחצי מהקיבולת שלהם והקפיאו במצב אופקי.
3. ליופיליזציה
   1. חמם מראש את משאבת הוואקום למשך 20 דקות והפעיל את הליופילייזר לפי הוראות היצרן.
   2. הניחו את צינורות הצנטריפוגה הקפואים ישירות מהמקפיא בתוך בקבוק עם תחתית עגולה.
   3. חבר את הבקבוקון לליופילייזר ועשה ליופיליזציה למשך 24 שעות.
   4. עד לשימוש נוסף, יש לאחסן את פיברואין המשי הליופילי במקום יבש בטמפרטורת החדר.
4. יציקת ממס ודליפת חלקיקים
   1. הוסף את הכמות הנדרשת של משי ליופילי ל-1,1,1,3,3,3-הקספאפלואוראיזופרופנול (HFIP) במיכל דגימת שתן מתחת למכסה אדים לקבלת תמיסה של 16% [w/v] בנפח סופי של 30 מ"ל, וסגרו את המיכל במכסה.
      זהירות: HFIP הוא קורוזיבי ומזיק אם נשאפ, נבלע או נספג דרך העור; לטפל בממס בתוך מכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, והימנע ממגע עם עור, עיניים ואדים. במקרה של דליפה, אספו את הנוזל באמצעות חומרים סופגים ונקו את האזורים הפגועים. העבר חומרים מזוהמים למיכלי פסולת מסוכנת ייעודיים.
   2. אטום את המיכל היטב והניח אותו על שייקר אורביטלי במהירות של 70 סל"ד למשך 18 שעות כדי לאפשר למשי להמיס.
   3. מסננת NaCl באמצעות רשתות שונות ומניחה את השבר של 500–800 מיקרון בצד.
   4. מלאו צלחת פטרי (קוטר 9 ס"מ, קוטר תחתית 8.5 ס"מ) ב-100 גרם מלח מנופה (חלק של 500–800 מיקרון), מה שמוביל לגובה של 1.2 ס"מ. תוודא שהמשטח מאוזן באופן אחיד.
   5. שפכו בעדינות 25.5 מ"ל מתמיסת המשי המוכן מעל מיטת המלח (פורוגן ליצירת נקבוביות ספוג).
   6. כסו את צלחת הפטרי עם המכסה והניחו אותה על שייקר אורביטלי למשך 10 דקות במהירות של 70 סל"ד, לחדירה אחידה של תמיסת המשי למיטת המלח.
   7. לדוג את צלחת פטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם המכסה סגור; לאחר מכן דגרו את צלחת פטרי הפתוחה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות נוספות.
   8. כדי לגרום להיווצרות יריעת בטא, טובלים את הקומפוזיט המשי בכוס המכילה מתנול למשך 20 דקות, ואז מוציאים אותו ומייבשים אותו בתנור בטמפרטורה של 50°C (כ-1 שעה).
      זהירות: מתנול הוא רעיל מאוד; להחזיק בכובע אדים תוך כדי לבישת ציוד מגן מתאים, להימנע ממגע עור וחשיפה לאדים. במקרה של דליפה, אספו את הנוזל באמצעות חומרים סופגים ונקו את האזורים הפגועים. העבר חומרים מזוהמים למכלי פסולת רעילה ייעודיים.
   9. הסר את הפורגן NaCl על ידי הטבלת הקומפוזיט המשי בכוס עם מים חמים מהברז למשך לפחות 3 שעות עם החלפת מים כל 20–30 דקות עד שהחומר מגיע למרקם רך ודמוי ספוג ללא חלקים קשים שנותרו.
   10. אחסן את ספוג המשי ב-70% אתנול לחיטוי ולשימור קצר טווח בטמפרטורה של 4°C.
       הערה: תמיסות המכילות HFIP נאספו כפסולת ממס הלוגן, בעוד שפסולת מתנול הושלכה בנפרד כפסולת ממס אורגנית לא הלוגנית בהתאם להנחיות בטיחות כימית מוסדיות. לצורך ניקוי לאחר השימוש, מיכלים ומשטחי עבודה שנחשפו ל-HFIP או מתנול נשטפו בממס תואם ונוקו בתמיסת חומר ניקוי. שטיפות ראשוניות וחומרים מזוהמים נאספו כפסולת כימית מסוכנת.

2. הכנת פיגום משי ואיזון

1. חתכו ספוגי פיברואין משי באמצעות מחורר ביופסיה בקוטר 6 מ"מ לקבלת פיגומים גליליים בקוטר 6 מ"מ וגובה 12 מ"מ.
   הערה: פיגומי ספוג פיברואין משי מוכנים יכולים להיאחסן ב-70% אתנול בטמפרטורה של 4°C עד 4 חודשים; לאחסון ממושך, מומלץ להחליף תקופתי באתנול טרי. פיגומים מאוזנים יכולים להיאחסן בתווך תרבית תאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד.
2. הכניסו את הדגימות לצינורות הצנטריפוגה עם 70% אתנול לחיטוי.
3. בצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית מוסמך כדי למנוע זיהום.
4. שאיבת אתנול באמצעות פיפטה תוך כדי לחיצה על הספוג עם פינצטה.
5. הניחו את הספוגים בצלחת פטרי המכילה 10–20 מ"ל מדיה של Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 כדי לטבול אותם במלואם.
6. החלפת המדיה שלוש פעמים עם ניעור קל בין כל החלפה.
7. אחרי הכביסה השלישית, הוסיפו חומר טרי, סגרו את המכסה היטב ועטפו אותו בניילון פרפין.
8. אחסן את הספוגים לפחות שבוע במקרר בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש בתרבית תאים. במהלך תקופה זו, החליפו את התקשורת 4–5 פעמים.
   הערה: ודאו הסרה מלאה של אתנול, שכן אתנול שנותר הוא ציטוטוקסי ופוגע בחיבור התאים ובחיוניותו.

3. מדידת רקע ואופטימיזציה של הדמיה

1. העבירו צינורות סינון שקופים אופטית ריקים וצינורות סינון שקופים אופטית המכילים פיגומי משי לא זרועים, להדמיה אופטית in vivo .
   הערה: ההדמיה בוצעה באמצעות הדמיה אופטית in vivo במצב אפיפלואורסצנציה דו-ממדי.
2. בצע הדמיה בזוגות מסננים שונים (עירור: 675 ננומטר, 745 ננומטר; פליטה: 720 ננומטר, 800 ננומטר), זמני חשיפה (4–60 שניות), מספרי f-stop (1–8), שדה ראייה (13.5–22.5 ס"מ), ורמות מנורות שונות (נמוכות וגבוהות).
3. הערכת אוטופלואורסצנציה על ידי הדמיית שתי הפלטפורמות בתנאים זהים לפני שימוש בפיגומים עם זרעי תאים.
4. החליפו את פתח הכניסה הזכר של Luer-lock במחבר נקבה ל-Luer-lock שנחתך להגדרות הדמיה בלבד, כדי לבטל ארטיפקט של אוטופלואורסצנציה בעוצמה גבוהה מהמחבר הזכרי של Luer-lock. אם החומרים זהים בכל הניסויים, שלב זה נדרש רק פעם אחת.
    

4. הכנת תליות תאים וזריעה על פיגומי סיברואין משי

הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגי בתנאים סטריליים, שכן הליכים אלו כוללים טיפול בתאים חיים ובדגימות המכילות תאים.

1. יש לעקוב באופן קבוע אחר תאי סרטן השד מסוג 4T1 פראי (4T1-wt) ו-4T1-iRFP720 לזיהוי זיהום ויציבות ביטוי iRFP720.
2. לשמור על תאי סרטן שד משולש שליליים של עכברים במשקל 4T1 ו-4T1-iRFP720 במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%_CO2.
3. תאי מעבר בכ-80% מפגש באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA, בהתאם להליכים סטנדרטיים של תרבית תאים אספטיים.
4. השתמש במספרי מעבר זהים ותנאי תרבית לתאי 4T1-wt ו-4T1-iRFP720 לכל הניסויים ההשוואתיים.
5. הכן צפיפות זריעה של תאים הנעה בין 5 × 10⁴ עד 5 × 10⁷ תאים/מ"ל (תואם לטווח של 1 × 10⁴ עד 1 ×^{10 7} תאים ל-200 מיקרוליטר). הכינו את הריכוזים הבאים לניתוח הדמיה כדי להעריך את עוצמת האות בצפיפויות תא שונות ולקבוע את הריכוז האופטימלי: 5 × 10⁴, 3.38 × 10⁵, 6.25 × 10⁵, 1.25 × 10⁶, 2.5 × 10⁶, 3.75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1.25 × 10⁷, 2.5 × 10⁷, ו-5 × 10⁷ תאים/מ"ל.
6. הכינו תליות תואמות של תאי 4T1-wt באותו טווח ריכוז כמו תאי 4T1-iRFP720 כדי לשמש כבקרות לא פלואורסצנטיות.
7. הניחו פיגומים בודדים (שהוכנו בסעיף 2) בצלחות פטרי סטריליות ולא מטופלות.
   הערה: השתמשו בצלחות פטרי לא מטופלות כדי למזער את היצמדות התאים למשטח הפלסטיק ולעודד את החיבור לתאי המשי.
8. הסר עודף מדיום מסביב לכל פיגום ומהפיגום באמצעות פיפט, תוך זהירות לא לעוות את המבנה.
9. פיפט 200 מיקרוליטר של תליית התא המתאימה מונח ישירות על פני השטח העליון של כל פיגום, כדי להבטיח שכל הנפח ייספג לתוך הפיגום.
10. דגמו פיגומים במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%_CO2 מבלי להפריע לצלחות ולאפשר חיבור תאים.
11. לאחר 4 שעות, העבירו בזהירות כל פיגום עם זרעי תאים לבאר של צלחת בת 24 בארות המכילה 1 מ"ל מדיום שלם מחומם מראש.
12. דגמו פיגומים בלילה (16–24 שעות) בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2.

5. הרכבת פלטפורמות כיול עם פריטים

הערה: בצע את כל שלבי ההרכבה בארון בטיחות ביולוגית באמצעות כפפות סטריליות, פינצטה סטרילית וכלים סטריליים.

1. הסירו פיגומי משי עם זרעי תאים מהלוחות עם 24 בארות באמצעות פינצטה סטרילית, תוך תמיכה עדינה בכל פיגום כדי למנוע דחיסה.
2. הכנס פיגום אחד עם זרעי תאים לחלק התחתון של צינור חילוץ מוצק שקוף אופטית באמצעות מוט דחיפה סטרילי.
3. הניחו פריט פוליאתילן סטרילי אחד ישירות מעל הפיגום באמצעות מוט הדחיפה.
   הערה: יש להשתמש בפריטי פוליאתילן רק במהלך אופטימיזציה של אותות, שכן גודל הנקבוביות שלהם קטן מקוטר התא ומונע נדידת תאים או כל מגע אחר בין תאים. זה גם מאפשר הפרדה ברורה של אותות, ומאפשר זיהוי ריכוז התא המדויק המתאים לכל אות.
4. חזור על רצף הערימה, פיגום אחד ואחריו פריט אחד, עד שהוכנסו חמישה פיגומים עם זרעי תאים וחמישה פריטים.
5. סגור את תחתית צינור הסינון עם מחבר Luer-lock נשי סטרילי.
6. סגור את החלק העליון של צינור החילוץ עם מחבר Luer-lock זכרי סטרילי.

6. אופטימיזציה של אות באמצעות מכשיר הדמיה אופטית in vivo באמצעות פלטפורמות כיול עם פריטים (רק פעם אחת לאימות מערכת)

1. להעביר פלטפורמות עם זרעי תאים לכיול אל חדר ההדמיה האופטית ב-in vivo בתוך קופסה כהה אטומה לאור כדי להגן על תאים פלואורסצנטיים מפני הלבנת פוטו.
2. הכינו את ההדמיה האופטית ב-in vivo בהתאם לבטיחות המוסדית ונהלי תפעול.
3. הנח פלטפורמות מורכבות עם זרעי תאים על שלב ההדמיה.
4. לרכוש תמונות אפיפלואורסצנציה דו-ממדיות באמצעות עירור ב-675 ננומטר ופליטה ב-720 ננומטר ולייעל את פרמטרי הדמיה, כולל זמן חשיפה, מקדם קישור ומספר f, כדי להשיג עוצמת אות מקסימלית בטווח הגילוי הלינארי (ראו איור משלים 1 ואיור משלים 2).
5. כלול לפחות צינור חילוץ שקוף אופטי אחד המכיל פיגומים שזרעו בתאי 4T1-wt בצפיפויות תא תואמות כבקרה לא פלואורסצנטית.
6. רכוש תמונות לכל הדגימות באמצעות הגדרות רכישה זהות כדי לאפשר השוואה כמותית של עוצמת הפלואורסצנציה (ראו איור משלים 3 ואיור משלים 4).
7. כמת אותות פלואורסצנציה באמצעות תוכנת ניתוח דימות אופטי in vivo וקבעו את צפיפות הזריעה האופטימלית של תאים (כלומר, 5 ×-10⁶ תאים לכל פיגום) שמספקת את האות המקסימלי ללא רוויה (ראו איור משלים 5).
   הערה: ההגדרות האחרונות של מערכת ההדמיה האופטית ב-in vivo נבחרו על בסיס ניסויי אופטימיזציה כדי להבטיח רכישת אות בטווח הדינמי הליניארי של המערכת, תוך הימנעות מרוויית קיבולת פיגום ושמירה על יחס יציב בין אות לרקע בתנאי ניסוי ובקרה. בהתבסס על הגדרות אופטימליות, זרעו את כל הביוריאקטורים הניסיוניים עם 5 ×^{10 או 6} תאים/פיגום. לבצע הדמיה במצב אפיפלואורסצנציה דו-ממדי עם ההגדרות הבאות: עירור: 675 ננומטר (רוחב פס 30 ננומטר); פליטה: 720 ננומטר (רוחב פס 20 ננומטר), זמן חשיפה: 10 שניות, מקדם שידור: 8, מספר F: 8.

7. הרכבת פלטפורמה ניסיונית (ללא פריטים)

1. לאחר אופטימיזציה של אותות, פיגומים ניסיוניים לזרעים עם צפיפות תאים אופטימלית שנקבעה (כלומר, 5 ×^{10 6} תאים/200 מיקרוליטר, ראו סעיף 4).
2. הרכבת פלטפורמת ניסוי באמצעות חמישה ספוגי משי: פיגום אחד עם זרעי תאים וארבעה פיגומים ריקים ללא פריטים מפוליאתילן כדי לאפשר תקשורת תאים.
3. אטימו את החלק העליון של צינור הסינון עם מחבר Luer-lock זכרי סטרילי.
4. הגדרת מערכת התרביות לתנאי תרבות סטטיים או דינמיים
   1. תרבית סטטית: אטום את הפתח התחתון עם מחבר נקבה סטרילי מסוג Luer-lock. המערכת מונחת לאחר מכן בצינור צנטריפוגה עם מכסה רפוי.
      הערה: מכיוון שלמנעול הזכר יש פתח, תצורה זו מאפשרת החלפת גזים תוך מזעור סיכון לזיהום. בהגדרה זו, המדיה מוחלפת ידנית במכסה המנוע פעם ביום.
   2. תרבית דינמית: חבר את הפורט התחתון לצינור סטרילי וחבר את צינור הכניסה למנעול הזכר בלואר בפתח העליון כדי לאפשר תרבית פרפוזיה. אספקה והסרה רציפה של מדיה באמצעות מערכת משאבת פריסטלטית (איור משלים 6).

8. תרבות דינמית בפלטפורמה

1. התחילו חיטוי של המשאבה והצינורות הנלווים על ידי שטיפה עם 70% אתנול בזרימה מקסימלית למשך 10 דקות.
2. שטוף את המשאבה והצינור עם מדיום סטרילי מלא למשך לפחות 10 דקות כדי להסיר שאריות אתנול. החלף במדיום טרי והמשך את הפרפוזיה עוד 10 דקות כדי להבטיח איזון מלא של המערכת לפני השימוש.
   הערה: ודאו שכל הרכיבים מלאים במלואם בחומר המדיום וללא בועות אוויר לפני זריעת התאים.
3. מחברים את פתח הכניסה הזכרי (העליון) של הכור המורכב לקו היציאה של המשאבה באמצעות צינורות סטריליים ומחברי Luer-lock.
4. חבר את פתח המשאבה למאגר סטרילי המכיל מדיום שלם.
5. חבר את יציאת הכור (תחתית) למאגר המדיה כדי ליצור לולאת פרפוזיה מחזורית. תצורה זו מאפשרת פרפוזיה רציפה של מדיום דרך הפיגום תוך שמירה על מערכת לולאה סגורה.
   הערה: בפרוטוקול זה, הפרפוזיה מתבצעת באמצעות תצורת מחזור מחדש, שבה התווך מחזור ברציפות בין המאגר לכור. גישה זו ממזערת צריכה בינונית תוך שמירה על זרימה רציפה.
6. קבע את קצב הזרימה הרצוי במשאבה למאמץ גזירה נומינלי בדופן (למשל, 1 דין/^{ס"מ 2} ו-4 דיין/ס"^{מ 2}), תוך שימוש ברדיוס הפנימי של התעלה ( = 3 מ"מ) בהתבסס על הנחת זרימת פואזוי¹⁹:
   
   כאשר τ הוא מאמץ הגזירה בדופן (dyn/cm²), ו-Q הוא קצב הזרימה הנפחי (cm³/s), הוא צמיגות הנוזל של מדיום RPMI-1640 (0.958 × 10-3 N·s/m² ב-37°C)²⁰. למרות שהמערכת עצמה מכילה פיגום משי נקבובי ולכן סוטה מהגאומטריה האידיאלית הזו, הערכים המחושבים שימשו כמדדי פעולה סטנדרטיים כדי לאפשר השוואות שחזוריות בין תנאי הזרימה. קצבי הזרימה המתאימים היו 0.133 מ"ל לדקה ו-0.531 מ"ל לדקה ושימשו כתנאי פרפוזיה לתרבית.
7. התחל את הזרם ועקוב אחרי המערכת לדליפות, היווצרות בועות וזרימה יציבה.
8. התחל את הפרפוזיה עם מעכב נדידה או תרכובת בדיקה (למשל, Cucurbitacin E (CuE) ב-0.05 מיקרומול/ליטר במדיום שלם) או ללא (בקרה) ושמרו על כל ההגדרה ב-37°C באינקובטור לח עם 5%_CO2 עד חמישה ימים. לכן, חבר את פתח המשאבה למאגר סטרילי המכיל מדיום שלם כולל תרכובת הבדיקה המתאימה, והפעל את המשאבה בהגדרות דומות לאלו ששימשו קודם.
   הערה: ודאו הסרה מלאה של אתנול מהמשאבה ומהצינור על ידי ביצוע שלבי השטיפה המדיום שהוגדרו. השליכו את החלק הראשוני של המדיום לאחר השטיפה לפני החיבור לכורים שזרעו תאים, ודאגו שהמערכת מלאה לחלוטין במדיום טרי וללא בועות אוויר.

9. הדמיית פלואורסצנציה של פלטפורמת הניסוי

1. עצור את המשאבה, נתק את כל הצינורות תוך שמירה על תנאים סטריליים.
2. אטום את תחתית צינור ה-SPE באמצעות מחבר נקבה מסוג Luer-lock, הנח את כל המערכת בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל, וסגר את הצינור היטב.
3. העבר את המערכת לארון בטיחות ביולוגית כדי להמשיך את כל השלבים הבאים. בתוך מכסה המנוע, החליפו את מחבר Luer-lock הזכרי במחבר Luer-lock נקבי שנחתך כדי לסגור את המערכת לחלוטין.
4. החזירו את המערכת האטומה לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל וסגרו את הצינור היטב להובלה.
   הערה: בהתאם לתנאי המעבדה, אין צורך לעצור את הזרימה להדמיה כאשר המערכת צפופה. עם זאת, זה לא היה אפשרי במסגרת הניסויים הניתנים.
5. העבירו כורים אטומים לחדר מערכת ההדמיה האופטית ב-in vivo בתוך קופסה אטומה וחשוכה כדי להגן על תאים פלואורסצנטיים מפני הלבנת פוטו.
6. הניחו כורים על שלב מערכת ההדמיה האופטית ב-in vivo במחזיק המתאים.
7. רכוש תמונות אפיפלואורסצנציה דו-ממדיות באמצעות הפרמטרים האופטימליים מראש (למשל, עירור 675 ננומטר, פליטה 720 ננומטר, זמן חשיפה 10 שניות, בינינג 8, מספר f-מספר 8).
8. כלול 4T1-wt עם פיגום לא זרוע, ובקרות כור ריקות לכל מפגש הדמיה.
9. כמת אותות פלואורסצנציה באמצעות ניתוח דימות אופטי ב-vivo .
10. שרטט את התוצאות הכמותיות עבור קבוצות הביקורת והטיפול ויצירת גרפים השוואתיים כדי להמחיש את השפעת תרכובת הבדיקה על התוצאה הנמדדת.

10. ניתוח תמונות של פלטפורמת ניסוי

1. רכשו תמונות פלואורסצנציה ביום 0, 3 ו-5 וניתחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
2. לכל תמונה, בצע כיול מרחבי לפני הניתוח. מדדו את האורך הפיזי הידוע של פלטפורמת הניסוי בפיקסלים באמצעות כלי הקו, והזנו את המרחק המתאים בעולם האמיתי (85 מ"מ) באמצעות ניתוח > קנה מידה כדי להגדיר את ההמרה מפיקסל לאורך.
3. לאחר הכיול, כמת את שטח הפלורסנט על ידי תיעוד ידני של אזור העניין (ROI) באמצעות כלי הבחירה החופשי.
4. כדי למזער הטיית משתמשים, הגדר את ה-ROI באמצעות קריטריונים ויזואליים עקביים המבוססים על עוצמת אות הפלואורסצנציה ביחס לרקע. בצע את כל הניתוחים בהגדרות זהות, וכאשר ניתן, תן למפעיל מיומן יחיד לבצע את הניתוח.
5. זהה את אות הפלואורסצנטי כאזורים בהירים הניתנים להבחנה ברורה מהרקע הכהה בתוכנת ניתוח התמונה האופטית ב-in vivo , והשתמש באותות אלה להנחיית סגמנטציה ידנית עקבית.
6. מדדו את האזורים הנבחרים באמצעות ניתוח > מדידה, ורשמו את ערכי השטח לכל נקודת זמן. חזור על הליך זה עבור כל התמונות בכל קבוצות הניסוי.
7. נרמול מדידות שטח לערך יום 0 המתאים לכל דגימה באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני כדי להתחשב בהבדלים בגודל ההתחלתי, וביטא את התוצאות כשינוי קיפול ביחס לקו הבסיס (יום 0 = 1).

11. ניתוח סטטיסטי

1. בצע את כל הניסויים לפחות בשלושה עותקים.
2. חזור על כל הניסויים לפחות שלוש פעמים (n = 3), קבע את הערכים הממוצעים וכן את סטיות התקן (SD).
3. קבעו מובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריהם מבחן השוואה מרובה של טוקי עם α = 0.05.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה ידידותית למשתמש וזולה לתצפית מקרוסקופית על גדילה ותנועת תאים בסביבה תלת-ממדית פיזיולוגית רלוונטית. השיטה עושה שימוש בספוגי פיברואין משי כחיקוי ECM ומשלבת זרימה אינטרסטיציאלית מבוקרת למידול תנאי רקמה דינמיים. סקירה סכמטית של הליכים שלבים, מייצור ספוג משי ופיגומים ועד זריעת תאים והרכבת פלטפורמות ניסיוניות מוצגת באיור 1.

בהתחלה, היה צורך לייצר פיגומים מפיברואין משי שניתן היה לאחסן אותם לאורך זמן באתנול. משי,...

דיון

תהליך ייצור ספוגי המשי המתואר בפרוטוקול זה הוא סטנדרטי, ומבטיח ייצור פיגומים שניתן לשחזר, כפי שדווח במחקר קודם¹⁶. ייצור ספוגים בתנאים סטנדרטיים לחלוטין, כגון גובה/כמות מיטת המלח, נפח תמיסת המשי ודגירה של מתנול, הוא חיוני להשגת ספוגים אחידים ודומים. הספוגים המיוצרים צריכים לעמוד בקריטריוני פרוטוקול בקרת האיכות שפורסמו קודם^{לכן ב-16}. בקצרה, הספוג צריך לעמוד בקריטריונים כמו גובה מיטה של 12 מ"מ, גודל נקבוביות בין 500–800 מיקרון, משקל יבש של דגימ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	זהירות: מסוכן. משמש לפירוק של משי מיובש בהקפאה
24-Well plate	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	איחסון של רשתות עם תאים זרעים במהלך דגירה
4T1-iRFP720 murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	ניסויים בתרביות תאים; 4T1-iRFP720 נגזר באופן פנימי מ-4T1 הורה (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	ניסויים בתרביות תאים
Bruker Alpha Compact FTIR with Platinum-ATR Sampling Module	Bruker	A220/D-01	ניתוח FT-IR
Calcium chloride, anhydrous, ≥93% reagent grade	Sigma-Aldrich	902179	להכנת מטריצת פירוק
Cell culture flask, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	חומרים מתכלים; לתרבית תאים
Cell culture flask, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	חומרים מתכלים; לתרבית תאים
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	משמש להפרדת דגימות על ידי צנטריפוגה
Combi-stopper (female Luer-lock connector)	Braun Melsungen AG	4495101	משמש להרכבת הפלטפורמה
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	מעכב הגירת תאים
Dermal biopsy puncher, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	משמש להשגת רשתות ספוג גליליות
Dialysis tubes (3.5 kDa, cellulose)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	לדיאליזה של תמיסת משי פיברוין
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	לתחזוקת תאים
Ethanol, absolute	Merck	1.07017	להכנת מטריצת פירוק
Excel	Microsoft	v2604	ארגון נתונים, חישובים בסיסיים ושרטוט
Fetal calf serum (FCS) heat inactivated	Biowest	S181H-500	תוסף לתרבית תאים
Fiji (former ImageJ)	Open soure (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	עיבוד ניתוח תמונות
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	ניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים
HPLC pump Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	לתנאי תרבית דינמיים בפלטפורמה המורכבת
IVIS 200 Spectrum CT system	PerkinElmer	128201	מערכת הדמיה אופטית עם יכולת CT
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	תוכנה לרכישה, הדמיה וניתוח כמותי של נתוני הדמיה IVIS
JEOL JSM-6510 Scanning electron microscope	JEOL GmbH	JSM-6510	תמונות SEM
L-glutamine, 200 mM solution, suitable for cell culture (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	תוסף לתרבית תאים
Lyophilizer Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	להקפאה יבשה של פיברוין משי
Male Luer-lock connector	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	מתאם עבור מאגרי דגימות
Methanol, ≥99.9 %, HPLC Gradient Grade	Carl Roth	7342.1	זהירות: רעיל. גרימת היווצרות של גלילי בטא בחיבורים של משי
Optically transparent Solid Phase Extraction (SPE) tubes without frits	Sigma Aldrich	57240-U	משמש להרכבת הפלטפורמה
OPUS Spectroscopy software	Bruker	v7.5	ניתוח FT-IR
Orbital and Linear Shaker MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	חלוקה אחידה/ערבוב
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	לאטימה/עטיפה של צלחות ומכולות לאחסון (למשל, בקירור)
Penicillin-Streptomycin, liquid, suitable for cell culture (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	תוסף לתרבית תאים
Petri dish, 9 cm	VWR	391-0598	להטבעת ספוג במלח; להזרעה על רשתות משי
Polyethylene frits for 1 mL SPE tubes	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	משמש להרכבת הפלטפורמה
RPMI-1640 Medium, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	R0883	תרבית מתרכבת משמשת לשיווי משקל של ספוג משי, תחזוקת תרבית תאים וניסויים קשורים
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	חומרים מתכלים; לתחזוקת תאים
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	חומרים מתכלים; לתחזוקת תאים
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	חומרים מתכלים; לתחזוקת תאים
Silk cocoons of Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa