מאמר שיטה

מיקרוהזרקה של אינטרלוקין-6 לזרם הדם של זחלי דגי זברה TSC כדי לחקור התנהגויות דמויות הפרעות נוירופסיכיאטריות

170 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 ביוני 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

במאמר זה

סיכום

כדי למודל כיצד אותות דלקתיים משפיעים על התפתחות עצבית באורגניזמים רגישים גנטית, אנו מציגים פרוטוקול להזרקת IL-6 מיקרו לתעלה של הווריד הקרדינלי הנפוץ של זחלי דגי הזברה, המאפשר השראה מבוקרת של דלקת והערכת השפעתו ההתפתחותית בהקשר של קומפלקס טרשת השחפתות (TSC).

תקציר

מטופלים עם קומפלקס טרשת השחפתות (מוטציות TSC1/TSC2) מציגים ביטוי משתנה של הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), והפעלה חיסונית אימהית ידועה כמגבירה את הסיכון ל-ASD. אינטרלוקין-6 (IL-6) הוא ציטוקין פליאוטרופי עם תפקידים מבוססים היטב בוויסות מערכת החיסון, דלקת ותהליכים נוירודלקתיים. הוא מיוצר על ידי מספר סוגי תאי חיסון בתגובה לזיהום או פגיעה ברקמות, והוא מאופיין בדרך כלל כמתווך פרו-דלקתי. ראוי לציין כי IL-6 יכול לחצות את מחסום הדם-מוח והוא מעורב בדלקת עצבית ובמצבים נוירופסיכיאטריים הקשורים לדלקת, כולל הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) ולקות שכלית (ID). כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת איתות דלקתי מערכתית בדגי זברה על ידי העברת IL-6 לזרם הדם באמצעות הזרקה לתעלה של קובייה. גישה זו מאפשרת תגובות דלקתיות מבוקרות וניתנות לשחזור כדי לחקור שינויים מונעי דלקת בהתפתחות המוקדמת. הפרוטוקול מפרט את השלבים החיוניים להכנת IL-6, מיקרוהזרקה ויישומים ניסיוניים במורד הזרם במודלים של מחלות ודלקת עצבית בדגי זברה, כולל מחקרים שנועדו לבחון אינטראקציות בין גנים לסביבה. על ידי אפשרות השראה מבוקרת של איתות דלקתי מערכתית, גישה זו מספקת פלטפורמה גמישה לבחינת האופן שבו רגישות גנטית וחשיפות דלקתיות מצטלבות ומעצבות את תוצאות ההתפתחות.

מבוא

הבנת האופן שבו אותות דלקתיים מעצבים את ההתפתחות הנוירולוגית המוקדמת חיונית לניתוח המנגנונים הבסיסיים של הפרעות נוירו-התפתחותיות, במיוחד בהקשרים רגישים גנטית. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק גישה מדויקת וניתנת לשחזור להשראת איתות דלקתי מערכתית בזחלי דג זברה באמצעות הזרקה ישירה של אינטרלוקין-6 (IL-6) לתעלה של קובייה (הווריד הקרדינלי הנפוצ).

קומפלקס טרשת שחפת (TSC) מדגים אינטראקציות גנטיות-סביבה כאלה. TSC היא הפרעה גנטית נדירה הנגרמת על ידי מוטציות ב-TSC1 או TSC2, אשר מקודדות חמרטין וטוברין, בהתאמה, חלבונים היוצרים קומפלקס שמדכא בדרך כלל את איתות mTORC1. אובדן עיכוב זה מוביל להיפראקטיבציה של מסלול mTORC1, מה שמוביל לצמיחה לא תקינה של תאים ולמגוון רחב של ביטויים קליניים, כולל הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD)1,2. ההערכה היא ש-ASD משפיע על ~1.5% מהאנשים עם אבחנה ממוצעת של ~3 שניםבמדינות מפותחות. ASD מאופיין בהתנהגויות חזרתיות, פגיעה באינטראקציות חברתיות וגמישות קוגניטיבית מופחתת4, ומטופלים לעיתים קרובות מתמודדים עם אתגרים נוירו-התנהגותיים נוספים כמו חרדה, דיכאון או מוגבלות שכלית3. ראוי לציין כי 40%-60% מהאנשים עם TSC מציגים תכונות הקשורות ל-ASD2, אך חומרת התסמינים משתנה מאוד – אפילו בקרב מטופלים עם מוטציות דומות – מה שמרמז שגורמים סביבתיים מווסתים את הסיכון הגנטי.

אחד הגורמים הללו הוא דלקת. למרות שהאטיולוגיה של ASD נותרה ברובה לא ידועה, דלקת עצבית באזורים שונים במוחנחשבת מזה זמן רב. עדויות פרה-קליניות וקליניות הולכות ורבות מצביעות על כך שדלקת עצבית עוברית המופעלת על ידי הפעלת מערכת החיסון האימהי (MIA) והעלייה באיתות הציטוקינים עשויות לתרום משמעותית לפתוגנזה של ASD6. לכן, מידול חשיפה לציטוקינים דלקתיים במערכות רגישות גנטית, כמו TSC, מספק מסגרת עוצמתית לבחינת האופן שבו אותות חיסון מצטלבים עם ויסות mTORC1 מופרע כדי להשפיע על התפתחות המוח המוקדמת.

ההיגיון בפיתוח פרוטוקול זה נובע מההכרה הגוברת בכך שדלקת המתווכת על ידי ציטוקינים, כולל איתות IL-6, יכולה לקיים אינטראקציה עם פגיעויות גנטיות ולהשפיע על מסלולי נוירו-התפתחות. ציטוקינים הם גליקופרוטאינים בעלי משקל מולקולי נמוך שמתאמים תקשורת בתוך מערכת החיסון. ב-ASD, מספר מחקרים דיווחו בעקביות על רמות גבוהות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-6 בדם ההיקפי 7,8,9,10, התומכים בהשערה כי חוסר ויסות של איתות IL-6 עשוי לתרום לתכונות נוירו-התפתחותיות והתנהגותיות האופייניות להפרעה. IL-6 הוא מתווך מרכזי להפעלת מערכת החיסון הנוצרת על ידי סוגי תאי מערכת חיסון מגוונים בתגובה לזיהום או נזק לרקמות. מכיוון ש-IL-6 יכול לחצות את מחסום הדם-מוח ולהשפיע ישירות על נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה, העלאה מתמשכת של ציטוקין זה מעורבת בשינוי מסלולי נוירו-התפתחות, פלסטיות סינפטית והומאוסטזיס נוירואימוני – מנגנונים שנחקרים יותר ויותר בפתופיזיולוגיה של ASD11,12. קשרים אלו מתחזקים עוד יותר על ידי מחקרי MIA, שבהם רמות IL-6 גבוהות של האם במהלך ההריון משבשות את התפתחות המוח העוברי ומגבירה את הסיכון הקשור לאוטיזם13. עם זאת, המודלים הקיימים של החולייתנים לעיתים קרובות מסתמכים על גירוי חיסוני מערכתי דרך מולקולות הקשורות לפתוגנים או פרדיגמות חשיפה אימהיות, שיכולות להכניס שונות, להפעיל מסלולי חיסון מרובים בו-זמנית ולהגביל את היכולת לבודד את התרומה הספציפית של IL-6. הזרקת מיקרו-IL-6 ישירה בדגי זברה מתגברת על מגבלות אלו על ידי מתן מניפולציה ממוקדת של ציטוקין יחיד בתוך אורגניזם שקוף ונגיש גנטית.

לדגי זברה יש מספר יתרונות לחקר השפעות התפתחותיות מונעות ציטוקינים. השקיפות האופטית שלהם מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תגובות חיסוניות ועצביות; הפיתוח המהיר שלהם מאפשר ניסויים בקצב גבוה; ומסלולי איתות הציטוקינים השמורים שלהם הופכים אותם למודל חולייתני חזק לפירוק מנגנוני דלקת 14,15,16,17,18. במחקרים ניסיוניים, יש צורך להעביר חומרים חיצוניים (חיידקים, תאי סרטן, DNA, ננו-חלקיקים וכו') לזחלי דגי הזברה. גישה אחת כוללת חשיפת הזחלים לתמיסה המכילה את החומר הרלוונטי, מה שמאפשר ספיגה פסיבית דרך העור, הזימים או מערכת העיכול. השיטה השנייה והישירה יותר היא מיקרואינקציה, שבה חומרים חיצוניים מועברים לתאים עובריים או זחלים מסוימים באמצעות מחטים זכוכית דקות 19,20,21. חשוב לציין כי הזרקה מיקרוסקופית לתעלה של קובייה מספקת מסלול אמין להעברה מערכתית, ומבטיחה הפצה מהירה של IL-6 לאורך כל המחזור ללא ההשפעות המבלבלות של גירוי חיסוני של כל האורגניזם.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב, מהכנת מזרקי הזרקה ועד להזרקות IL-6 לזרם הדם דרך צינור הקובייה של זחלי דג הזברה ב-2 ו-3 ימים לאחר ההפריה (DPF). שיטה זו שימושית במיוחד לחוקרים החוקרים כיצד רמזים דלקתיים ספציפיים משפיעים על תהליכי התפתחות מוקדמים, אינטראקציות בין גנים לסביבה במודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות או חיסוניות, ההשלכות התאיות והמולקולריות של חשיפה לציטוקינים ב-vivo, או על האינטראקציה בין מוטציות גנטיות למסלולי איתות דלקתיים. באמצעות גישה מבוקרת, ספציפית לציטוקין ומדויקת התפתחותית, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה גמישה לחקירת המנגנונים שבאמצעותם IL-6 ואותות חיסוניים נלווים מעצבים תוצאות חיסוניות, עצביות והתנהגותיות מוקדמות.

פרוטוקול

בהליך המתואר כאן, השתמשו בקו דג זברה tsc2vu242/+ 22,23. כל הניסויים שבוצעו בוצעו בהתאם לכל החקיקה הרלוונטית, ואין צורך באישור נוסף של ועדת אתיקה משום ששלב ההתפתחות שבו נעשה שימוש (<5 DPF) אינו בתחום הביקורת האתית המחייבת. איור 1 מציג סכימה של הפרוטוקול.

1. משיכת מיקרופיפטות

  1. הכינו מחטי מיקרו-הזרקה מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרופיפטות, בהתאם לנהלים שנקבעו24.
  2. השתמש בנימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ (קוטר חיצוני של 1.0 מ"מ, עם דפנות דקות) וטען אותם למושך מיקרופיפטות.
  3. מקם בזהירות את הנימים בתוך קרון המשיכה, תוך הבטחת יישור מדויק בתוך החריץ המיועד, וקבע אותו היטב באמצעות מהדקי המכשירים כדי למנוע תנועה במהלך המשיכה.
  4. כוון את הנימים כך שיהיה ממורכז בתוך חוט החימום, כדי להבטיח חימום אחיד לאורך האזור למשיכה ליצירת מחט עקבית.
  5. התחל את תוכנית המשיכה באמצעות פרמטרים אופטימליים (למשל, עבור מכשיר סוטר השתמש בחום: 533, משיכה: 50, מהירות: 60, עיכוב: 90, ולחץ: 200) ליצירת מחטים מיקרו-הזרקה עם קצה דק.
    אזהרה: מחטים מיקרו-נמשכות מנימי זכוכית הן שבירות ועלולות בקלות להיסדק, לסתום או לפתח צורות קצה לא סדירות שמשפיעות על נפח ההזרקה. בדקו כל מחט תחת מיקרוסקופ סטריאופי לפני השימוש, הימנעו ממגעת הקצה במשטחים קשים, והחליפו את המחטים מיד אם יש התנגדות, דליפה או גודל טיפה לא אחיד.
    הערה: לאחר תהליך המשיכה, נוצרים קצות מחט מחודדים בשני קצות הנימים. לפני השימוש, יש לפתוח בזהירות את הקצה על ידי שבירה עדינה עם מלקחיים דקים תחת מיקרומיקרוסקופ כדי להגיע לגודל הצמצם הרצוי למיקרו-הזרקה.

2. הכנת בופרים ותמיסת ציר

  1. הכינו תמיסת מלאי של 60× של מדיום עובר E3 (ראו טבלה 1). חטא את התמיסה על ידי אוטוקלב ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לשימוש, דיללו את תמיסת המאגר במים אולטרה-טהורים כדי לקבל תמיסת עבודה 1×E3.
    הערה: 60× תמיסה מלאית של מדיום עובר E3 יכולה להיאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח.
  2. הכן תמיסה מלאית של 20x טריקאין (MS-222) כפי שמתואר בטבלה 1. אחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך כדי למנוע התפרקות. לפני השימוש, מדללים ל-1× ריכוז עבודה במדיום E3.
    הערה: כוונן את ה-pH של תמיסת טריקאין ל-7.5 באמצעות 1 מטריס pH 9.0. תמיסה זו ניתנת להפרידה ולשמור בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס (קפואה) לאחסון ארוך טווח או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. טריקאין מתפרק ב-RT ובאור לתרכובת רעילה.
    זהירות: יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת שימוש בטריקאין (MS-222) להרדמה, שכן חשיפה מופרזת ויתר עלולות להשפיע לרעה על פיזיולוגיית הזחל והתנהגותו. חשיפה מופרזת עלולה לדכא את תפקוד הלב ולשנות התנהגות מאוחרת יותר, בעוד שהרדמה לא מספקת מגבירה את הסיכון לפציעה במהלך ההרדמה. השתמשו בריכוז ולמשך הזמן היעילים המינימליים בלבד, ואפשרו התאוששות מלאה במדיום העובר הטרי לפני בדיקות התנהגות.
  3. הכינו תמיסה של 1% (w/v) במדיום E3 על ידי חימום עד להמסה מלאה.
    הערה: אם התמיסה מוכנה מראש, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולחמם מחדש לפני השימוש. ביום הניסוי, יש לשמור על האגרוז במצב נוזלי בטמפרטורה של 55–60 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקשות מוקדמת.
  4. הכינו תמיסת NaCl של 0.9% (ללא ציון) ואחסנו בטמפרטורת החדר עד שבוע או ב-4 מעלות צלזיוס לאחסון ממושך. לפני השימוש, יש לאזן את התמיסה לטמפרטורת החדר או לדגר בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כדי להתאים לתנאים הפיזיולוגיים של העוברים.
  5. הכן תמיסה של 2 pg/nL IL-6 ב-NaCl של 0.9%. עליכו את התמיסה כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. לפני השימוש, הפשרו והביאו את האליקו לטמפרטורת החדר.
  6. הכינו תמיסת עבודה של 0.5 מ"ג/מ"ל של פרונאז במדיום E3 מתמיסת מלאי של 20 מ"ג/מ"ל שהוכנה במים אולטרה-טהורים.

3. קבלת וגידול עוברים עד 2 DPF

  1. הגדר הופעה קבוצתית על ידי הצבת כמה דגי זברה בוגרים של tsc2vu242/vu242 באקווריום השרצה.
    הערה: ניתן להפריד בין זכרים לנקבות במהלך הלילה באמצעות מחיצה למניעת הטלה מוקדמת, כאשר המחיצה מוסרת בבוקר למחרת כדי לעודד הזדווגות מסונכרנת. לחילופין, ניתן לשמור על הדגים ללא מחיצה בסביבה הנשלטת על ידי אור, שבה המעבר מהחשכה (לילה) לאור (בוקר) משמש כרמז להשרצה.
  2. ביום הבא, הסר את המחיצה (אם השתמשו) ואפשר להטלה להמשיך למשך כשעה.
  3. לאסוף עוברים מופריים במהירות ולהעביר אותם לצלחות פטרי 100 מ"מ המכילות 40 מ"ל מדיום עובר E3, תוך שמירה על צפיפות של לא יותר מ~60 עוברים בכל צלחת כדי להבטיח התפתחות מיטבית.
  4. דגרו עוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס במחזור יום מבוקר של 14 שעות אור ו-10 שעות חושך.
  5. ב-1 DPF ו-2 DPF, בדקו עוברים תחת סטריאומיקרוסקופ והסרו עוברים מתים, ביציות לא מופריות ופסולת כדי לשמור על איכות התרבית.
  6. החלף את מדיום ה-E3 בתמיסה טרייה כדי למזער הצטברות פסולת ולתמוך בהתפתחות עוברית תקינה.

4. הכנת לוחות אגרוז להזרקות מיקרו ודכוריון

  1. הכינו תמיסת אגרוז של 1% (עם ויל) במדיום E3 וחממו עד שהאגרוז נמס לחלוטין והתמיסה מתבהרת.
  2. אפשרו לתמיסה להתקרר לזמן קצר, ואז שפכו כ-30 מ"ל לתוך צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ, כדי להבטיח שכבה אחידה על פני השטח.
  3. בעוד האגרוז עדיין נוזלי אך מתחיל להתקשות, מניחים בעדינות תבנית סיליקון על פני השטח ליצירת חריצים אחידים.
    הערה: כאן, תבניות סיליקון עם דפוסים פירמידליים (איור 2) משמשות ליצירת בארות המסוגלות לשמור עודף E3 במהלך הזרקה מיקרו. בארות אלו מתוכננות לספק יציבות זמנית במהלך טיפול והזרקה על ידי שמירה על מספיק לחות למניעת ייבוש והבטחת חיוניות העובר למספר דקות מחוץ לתנאי דגירה סטנדרטיים.
  4. הכינו צלחות פטרי מצופות אגרוז לדכוריוניזציה אנזימטית (קוטר 50 מ"מ) על ידי שפיכת כ-5 מ"ל של תמיסת אגרוז מותכת 1% (w/v) וסיבוב עדין של המנה כדי לצפות את פני השטח באופן אחיד.
  5. הסר כל אגרוז עודף.
  6. אפשר לאגרוז להתקשה בטמפרטורת החדר למשך 10–15 דקות. לאחר ההכנה, המנות מוכנות לשימוש בדקוריון אנזימטי של עוברים.

5. דקוריון אנזימטי של דגים בקצב 2 dpf

  1. העבר כ-100 עוברים בכוריון ב-2 DPF לצלחת פטרי קטנה (50 מ"מ) מצופה אגרוז.
  2. הסר כמה שיותר מדיום E3 כדי למזער את דילול התמיסה האנזימטית ולהבטיח דכוריון יעיל.
  3. הוסף 4 מ"ל של תמיסת פרונאז טרייה (ריכוז המלאי: 20 מ"ג/מ"ל [מוכנה במים אולטרה-טהורים], ריכוז עבודה: 0.5 מ"ג/מ"ל [מדולל ב-E3]) לתערה, כדי להבטיח שהעוברים יהיו טבולים לחלוטין.
    זהירות: טיפול בפרונאז חייב להיות מבוקר בקפידה, שכן עיכול יתר עלול לפגוע ברקמות הזחל, מה שמוביל לשבריריות מוגברת במהלך הטיפול ועלול להשפיע על הישרדות או התנהגות. השתמשו רק בזמן החשיפה היעיל המינימלי, ושטפו עוברים היטב לאחר מכן כדי למנוע פעילות אנזימטית מתמשכת.
  4. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 3–5 דקות, תוך ניטור שחרור הכוריון תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. סובבו או סובבו בעדינות את הצלחת לסירוגין כדי להקל על הסרת כוריון אנזימטית. המשך עד שרוב העוברים משתחררים מהכוריון שלהם.
    הערה: ודא שהעוברים העירומים תמיד טבולים בתמיסה; אחרת, שק החלמון עלול להתפוצץ ולגרום למות העוברים.
  6. לאחר השגת דקוריונציה, שטפו את העוברים היטב על ידי העברתם דרך 5–6 שינויים של מדיום E3 טרי.
    הערה: ודא שהעוברים העירומים תמיד טבולים בתמיסה; אחרת, שק החלמון עלול להתפוצץ ולגרום למות העוברים.
  7. ודאו שכל הכוריון ושאריות הפרונאז מוסרים כדי למנוע נזק לזחלים ולשמור על תנאי תרבית מיטביים.
  8. העבר ~50 זחלים מפורקים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 40 מ"ל מדיום E3 באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית.
  9. שמרו על הזחלים בתנאים אלו עד להזרקת מיקרו.

6. הזרקת עוברים לדגי זברה

  1. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ (הגדלה ≥150×), השתמשו במלקחיים עדינים כדי לשבור בזהירות את קצה נימי הזכוכית המשוכים (קטע 1), וליצור מיקרופיפטה עם פתח בקוטר של כ-3 מיקרון.
    הערה: ניתן לזהות מיקרופיפטה מתאימה על ידי הבטחת פתיחת הקצה דק, ללא השטח נראה לעין או משטח פתוח גדול בקצה. אם הקצה נשבר בצורה רחבה מדי, הוא לא יחדור את עור הדג ביעילות ועלול לגרום להזרקות לקויות או לא עקביות. לכן, יש לבצע את פתיחת הקצה בזהירות תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ בהגדלה גבוהה, כדי להבטיח שבירה מינימלית ומבוקרת בקצה הנימים.
  2. הכינו תמיסות הזרקה של 0.9% (w/v) NaCl (בקרה) או IL-6 (2 pg/nL) ב-0.9% NaCl ומוסיפים 1 מיקרוליטר של 0.1% Trypan Blue לכל 10 מיקרוליטר תמיסה כדי להקל על הוויזואליזציה במהלך ההזרקה.
  3. מילאו מחדש את המיקרופיפטה המוכנה ב~3 מיקרוליטר של תמיסת ההזרקה באמצעות קצה מיקרולודר, כדי להבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר.
  4. אבטח את המיקרופיפטה הטעונה למחזיק הקפילרי (איור 2) שמחובר למערכת המיקרו-הזריקה.
  5. הנח טיפה קטנה של שמן מינרלי על סלייד כיול.
  6. כיילון נפח ההזרקה על ידי פליטת טיפות לשמן המינרלי ומדידת קוטרן באמצעות סלייד כיול (איור 2) בקנה מידה של 0.01 מ"מ. כוונו את לחץ ההזרקה (בין 300–500 hPa) כדי להגיע לנפח טיפה של ~1 nL.
  7. מוסיפים טריקאין (MS-222) לתווך המכיל זחלים ב-E3 לריכוז סופי של 1× להרדמה. כדי למזער לחץ ולהבטיח הרדמה עקבית, השתמש בזחלים במנות קטנות.
  8. העבר זחלים בודדים במשקל 2 DPF ללוח הזרקת אגרוז מוצקה. מספר זחלים (למשל, עד 10) עשויים להיות ממוקמים בכל צלחת, בהתאם ליכולת הטיפול.
  9. הנח את הצלחת מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. באמצעות פיפטת זכוכית, מכוון בעדינות כל זחל כך שצינור קובייה יהיה גלוי ונגיש בבירור.
    הערה: בעת עבודה עם מספר זחלים, ודאו שמשטח האגרוז נשאר מיובש על ידי הוספת טיפות מדיום E3 המכילות טריקאין (1×) מדי פעם כדי למנוע ייבוש.
  10. מקמו את קצה המיקרופיפטה בנקודת הכניסה לתעלה של קובייה (כפי שמוצג באיור 3), שניתן לזהות על ידי מעקב אחר תאי הדם הנעים לעבר הלב תחת הסטריאומיקרוסקופ.
  11. הזרקו שתי טיפות רצופות (~1 ננוליטר כל אחת) של התמיסה המוכנה לתעלה של קובייה, עם מרווח של כ-20 שניות בין ההזרקות כדי לאפשר התפלגות נכונה.
  12. לאחר ההזרקה, העבר בעדינות את הזחלים מלוח האגרוז לצלחת פטרי טרייה בעובי 100 מ"מ המכילה 40 מ"ל מדיום E3. מזער את העומס המכני במהלך ההעברה.
  13. החזיר את הזחלים לאינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס לצורך התאוששות.
  14. ביום הבא (3 dpf), חזרו על הליך המיקרו-הזרקה כפי שמתואר בשלבים 6.8–6.13.
    הערה: הזרקה אחת מייצרת איתות קצר מועד בלבד ואין תגובה התנהגותית עקבית, בעוד שהזרקה השנייה מבטיחה הפעלה מתמשכת של מסלולי דלקת לאורך חלון ההתפתחות המוקדם של הזחל הרלוונטי להתפתחות הנוירולוגית ויוצרת שינויים התנהגותיים כפי שמתואר בסעיף התוצאות המייצגות.
  15. ב-5 dpf, השתמשו בזחלים ליישומים בהמשך, כולל בדיקות התנהגות, הדמיית מוח או ניתוח אימונופלואורסצנציה.

תוצאות

כדי להעריך את השפעות הזרקת המיקרו-IL-6 על הפיזיולוגיה וההתנהגות של הזחלים, השווינו זחלים שהוזרקו ל-IL-6 עם ביקורת שהוזרקו ל-NaCl לאורך כל תקופת ההישרדות ושני תצוגות התנהגותיות המשמשות בדרך כלל להערכת התנהגויות חרדה וחזרתיות בדגי זברה. הזרקת מיקרו-IL-6 לא השפיעה על חיוניות הזחלים בהשוואה להזרקות NaCl (איור 4A). שיעורי ההישרדות ב-5 dpf היו בלתי ניתנים להבחנה בין קבוצות שהוזרקו ב-IL-6 לבין קבוצות שהוזרקו ב-NaCl, מה שמעיד כי משטר המינון נסבל היטב ואינו יוצר רעילות לא ספציפית. מיקרוהזרקות עצמן הפחיתו במעט את הקיימות בהשוואה לאחים שלא הוזרקו, מה שמעיד על השפעה מתונה הקשורה לטיפול ללא תלות בחשיפה ל-IL-6. דבר זה מאשר שהפרוטוקול מתאים לניתוחי התנהגות בהמשך.

כדי לאמת שפרדיגמת המיקרוהזרקה IL-6 מעוררת תגובה דלקתית מדידה ב-5dpf, כמתנו את פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מתווך במורד הזרם של איתות דלקתי מונע ציטוקין25. המוטנטים ההומוזיגוטיים של tsc2-/- הציגו רמות PGE2 בסיסיות גבוהות גם ללא הזרקת IL-6, גבוהה משמעותית מאחיהם מסוגי הבר (WT) tsc2+/+ (איור 4B). מוטנטים הטרוזיגוטיים tsc2+/- הראו עלייה מתונה ולא משמעותית ב-PGE2 בסיסי בהשוואה לזחלי WT, אך חשוב לציין שרמות ה-PGE2 שלהם עלו בחדות לאחר הזרקת IL-6. דפוס זה תואם את מטרתנו למודל אינטראקציות בין גנים × סביבה: זחלי WT נשארים ברובם ללא השפעה מחשיפה קלה וחולפת ל-IL-6, בעוד שמוטנטים רגישים גנטית tsc2+/- מפגינים תגובה דלקתית בולטת.

בהתאם להבדלים התלויים בגנוטיפ בטון הדלקתי, בדקנו לאחר מכן האם איתות שנגרם על ידי IL-6 מתורגם לשינויים התנהגותיים מדידים במבחן השדה הפתוח. בדיקת שדה פתוח ב-5 DPF (כפי שתוארהקודם 22) גילתה שזחלי tsc2 מוטנטים הפגינו התנהגות חרדתית מוגברת בהשוואה לאחים WT (איור 4C); עם זאת, הזרקות מיקרו של IL6 לא השפיעו על התנהגות זו. בפרט, זחלי tsc2+/- ו-tsc2-/- בילו זמן רב יותר באזור החיצוני של הזירה והראו חקירת מרכז מופחתת לעומת tsc2+/+, בהתאם לפנוטיפים הקשורים לחרדה שנקבעו בזחלי דגי זברה.

הזרקות IL-6 הגבירו דפוסי שחייה חזרתיים וסטריאוטיפיים, במיוחד בזחלים מוטנטיים tsc2+/- (איור 4D–E), תכונה התנהגותית המשמשת לעיתים קרובות כקריאה רלוונטית לאוטיזם בדג זברה26. כימות מפורט של לולאות חוזרות, שהוגדרו כשלוש שחיות מעגליות או יותר רצופות, גילה עלייה משמעותית בשיעור המוטנטים שהוזרקו ב-IL-6 tsc2+/- שמפגינים התנהגות זו בהשוואה לבקרות שהוזרקו ב-NaCl. שיפור סלקטיבי זה של שחייה חוזרת בזחלים רגישים גנטית תומך עוד יותר באינטראקציה בין גנים × סביבה, שבה גירוי דלקתי קל חושף או מגביר נטיות התנהגותיות דמויות ASD במיוחד ברקע המוטנטי של tsc2+/-

figure-results-1
איור 1: סכמטי של הפרוטוקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור.

figure-results-2
איור 2: הגדרת תחנת עבודה מיקרו-אינג'קט. סכמטי של תחנת העבודה עם מיקרו-הזרקה המשמשת להזרקות דגי זברה לזחלים. (1) מיקרופיפטה מזכוכית המותקנת על מחזיק המזרק; (2) צלחת פטרי מצופה אגרוז עם בארות מעוצבות למיקום הזחלים; (3) שמן מינרלי לכיול; (4) תמיסת טרייפן בלו; (5) משכו מחטים מזכוכית; (6) סלייד כיול; (7) קצות פיפטה מורחבים; (8) פסטר פיפט; (9) תבנית סיליקון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: הזרקה לתעלה של קובייה. (א) ייצוג סכמטי של אתר ההזרקה של צינור קובייה (הווריד הקרדינלי הנפוצ) בזחל דגי זברה ומסילות מנוע פתוחות מייצגות ב-5 DPF. (B) תמונות מייצגות של הבקרה (לא מוזרקת), והזרקות עם NaCl ו-IL-6. פס קנה מידה: 250 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: תוצאות מייצגות של אינטראקציה בין גן x לסביבה באמצעות קו המוטנטי של tsc2. (א) שיעורי הישרדות (%) של זחלי tsc2vu242 במהלך הניסוי בין קבוצות ביקורת (לא מוזרקות), מוזרקות NaCl ו-IL-6. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM ב-5dpf (n = 4 שכפולים ניסיוניים עצמאיים, כאשר כל גנוטיפ × שילוב טיפול מכיל 60–70 דגים). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואה זוגית. נצפו הבדלים משמעותיים בין קבוצות הביקורת והזרקת IL-6 (p = 0.00150) ובין קבוצות הביקורת והזרקת NaCl (p = 0.00243). (B) תרשימי קופסה המייצגים רמות PGE2 במוטנטים ואחים של tsc2, שנמדדו ב-5dpf באמצעות ערכת ELISA (בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים) בהתאם לפרוטוקול היצרן (ANOVA דו-כיווני לגנוטיפ: F = 7.4503; P = 0.01234). כל דגימה מכילה 20 ראשים (זנבות שימשו לגנוטיפינג). נקודות ב-boxplot מייצגות שכפולים ביולוגיים. (ג) תרשימי קופסה של תוצאות הבדיקה בשדה פתוח לדגים מוטנטיים מסוג tsc2 המראים זמן יחסי של שהייה ליד הקירות עבור כל גנוטיפ לאחר הזרקות NaCl ו-IL-6 ועבור ביקורות לא מוזרקות (ANOVA דו-כיווני לגנוטיפ: F = 7.021; P = 0.00106). המבחן בשטח פתוח בוצע באמצעות תא ניתוח אוטומטי (טבלת החומרים) לפי הפרוטוקול שדווח קודםלכן ב-22. (D) תרשים לדוגמה המראה התנהגות חקרנית אקראית לאחר הזרקת NaCl ולולאה חוזרת לאחר הזרקות IL-6. (ה) תרשימי קופסה המייצגים את מספר בעלי החיים המראים התנהגויות לולאה תקינות וחזרתיות עבור כל גנוטיפ tsc2 לאחר הזרקת NaCl או IL-6 ועבור דגי ביקורת לא מוזרקים (ANOVA דו-כיווני לגנוטיפ: F = 5.7615; P = 0.005849). שלושה שכפולים ניסיוניים עצמאיים, כל גנוטיפ × שילוב טיפול המכיל 60–70 דגים, שימשו לכך. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פתרון 60 x E3
ריאגנטריכוז סופיסכום
NaCl297 מ"מ17.4 גרם
KCl10.7 מ"מ0.8 גרם
CaCl219.6 מ"מ2.18 גרם
MgCl2·6H2O24 מ"מ4.89 גרם
אולטרפיורH2Oלא זמיןמילוי עד 1 ליטר
סך הכללא זמין1 ליטר
תמיסת מאגר טריקאין
ריאגנטריכוז סופיסכום
טריקאין15.3 מ"מ1 גרם
1 M טריס-HCl pH 921 מ"מ5.25 מ"ל
אולטרפיורH2Oלא זמין244.75 מ"ל
סך הכללא זמין250 מ"ל

טבלה 1: הרכב תמיסות E3 וטריקאין.

דיון

כצפוי, מוטנטים הומוזיגוטיים ב-tsc2 הראו רמות בסיס גבוהות של חרדה, בהתאם לפנוטיפים שדווחובעבר 22,27. מכיוון שזחלים אלו כבר מראים חריגות התנהגותיות חמורות, הזרקת IL-6 לא החמירה עוד יותר את הפנוטיפ שלהם. לעומת זאת, הטרוזיגוטים של tsc2 הראו שינויים ברורים שנגרמו על ידי IL-6. רגישות סלקטיבית זו מדגישה את התועלת של פרוטוקול זה לחקירת אינטראקציות בין גנים × סביבה, שבהן איתות דלקתי קל אך ממושך משפיע על הפגיעות הגנטית הבסיסית ומעצב תוצאות נוירו-התנהגותיות.

חשיפה ל-LPS נותרה הפרדיגמה הנפוצה ביותר לדלקת בדגי זברה ומייצרת באופן אמין תגובה חיסונית רחבה וחזקה, המאופיינת בהשראה חזקה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, גיוס תאי חיסון מולדים ותמותה תלויה במינון. למרות עוצמתו, LPS מפעיל מספר מסלולי קולטנים דמויי Toll בו-זמנית 28,29,30, מה שמקשה לבודד את תרומתם של ציטוקינים בודדים להשפעות נוירו-התפתחותיות במורד הזרם. לעומת זאת, פרוטוקול הזרקת המיקרו-IL-6 המתואר כאן מספק גישה ממוקדת ומבוקרת על ידי הגברת ציטוקין יחיד הידוע כמרכזי בהפעלת מערכת החיסון של האימהות. חשוב לציין כי הזרקות IL-6 אינן מגבירות את התמותה ביחס לבקרות שהוזרקו ב-NaCl, ומאפשרות בדיקה של פנוטיפים התנהגותיים ומולקולריים מבלי לבלבל את הרעילות. יתרה מזאת, מיקרו-הזרקת IL-6 מייצרת איתות דלקתי ספציפי במורד הזרם, כפי שמודגם ברמות PGE2 גבוהות, וגורמת לשינויים התנהגותיים מדידים – במיוחד שחייה חוזרת מוגברת בזחלים ההטרוזיגוטיים של tsc2 – שם הרגישות הגנטית מתקשרת עם חשיפה לציטוקין. יחד, ההבדלים הללו מדגישים שבעוד ש-LPS מדמה הפעלה חיסונית גלובלית, מיקרו-הזרקת IL-6 מאפשרת ניתוח מדויק של מנגנונים ספציפיים לציטוקין הרלוונטיים לסיכון נוירו-התפתחותי.

התוצאות המייצגות המוצגות כאן ממחישות את השפעות IL-6 ברקע של tsc2-מוטנטי, אך הפרוטוקול עצמו רלוונטי באופן רחב. השיטה ניתנת ליישום בקלות בזחלים מסוג בר או במודלים גנטיים אחרים כדי לחקור כיצד רמזים דלקתיים מוגדרים מצטלבים עם הקשרים גנטיים מגוונים במהלך התפתחות נוירולוגית מוקדמת. ליישומים מעבר למודל tsc2, אנו ממליצים לקבוע אמפירית את המינון האופטימלי של IL-6, שכן רגישות הציטוקינים וספי הדלקת עשויים להשתנות בין גנוטיפים ומטרות ניסיוניות.

שיקול טכני מרכזי בפרוטוקול זה הוא עקביות נפח ההזרקה, שכן ההשפעות הביולוגיות של IL-6 תלויות באספקה מדויקת של כ-1nL לכל הזרקה. שונות בגודל הטיפה נובעת לעיתים קרובות מהבדלים בפתח המחט או בלחץ ההזרקה. אם הטיפות קטנות מדי, העלאת הלחץ בהדרגה או הרחבת קצה המחט בהגדלה גבוהה בדרך כלל מחזירה זרימה תקינה. לעומת זאת, טיפות העולות על הנפח המיועד בדרך כלל מצביעות על כך שפתח המחט רחב מדי, ובמקרה כזה יש צורך להפחית לחץ או להכין מחט חדשה עם קצה צר יותר. שמירה על נפחי הזרקה מדויקים היא חיונית, שכן סטיות עלולות לשנות את העומס הדלקתי ולפגוע בשחזוריות. לעיתים, המשתמשים עשויים להיתקל במצבים שבהם לא מוצא פתרון מהמחט. זה נובע לרוב מבועות אוויר, פסולת או חסימות בקצה המחט. בדיקת המחט תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ ובדיקת מערכת המזרקים לאיתור נזילות או חיבורים רופפים בדרך כלל פותרת את הבעיה. הבטחת קצה מחט נקי וללא חסימה היא חיונית ללידה עקבית ולמניעת הצטברות לחץ שעלולה להזיק לזחלים.

גורם חשוב נוסף הוא הסבילות הפיזיולוגית של הנפח המוזרק. הזחלים בדרך כלל סובלים ~1 ננוליטר היטב, אך נפחים גדולים יותר יכולים להגדיל את התמותה, במיוחד כאשר מבצעים מספר הזרקות בימים רצופים. בניסויים הדורשים מינון חוזר, חשוב למזער את הלחץ המכני, לאפשר זמן התאוששות מספק בין הזרקות, ולהתאים את ריכוז IL-6 במקום הנפח כדי להשיג את המינון הרצוי. שיקולים אלה מסייעים להבטיח שפנוטיפים שנצפו ישקפו חשיפה לציטוקינים ולא פגיעות הקשורות להזרקה.

לבסוף, תמותה הקשורה להזרקות יכולה להשתנות מאוד בהתאם לחוויית המשתמש. בעוד שמשתמשים מיומנים בדרך כלל מגיעים לשיעורי תמותה קרובים ל-5%, משתמשים חסרי ניסיון עשויים לצפות בשיעורים של עד 50%. רוב ההפסדים נובעים מנזק מכני במהלך ההרכבה, מיקום לא נכון של המחטים, או דקירה מקרית של שק החלמון או הרקמות הסובבות. תרגול ההליך על זחלים מסוג בר לפני תחילת הזרקות ניסיוניות משפר מאוד את העקביות ומפחית תמותה. מיקום נכון של הזחלים כדי להמחיש בבירור את צינור קובייה, בשילוב עם טיפול עדין במהלך ההרכבה וההתאוששות, מפחית עוד יותר נזק פרוצדורלי.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לקווין אס ולליאנה סולניקה-קרזל (אוניברסיטת ונדבילט) על דגי tsc2vu242/+ ול-IIMCB ZCF על הסיוע עם הדגים הבוגרים. עבודה זו נתמכה במענק SONATA BIS מס' 2023/50/E/NZ3/00252, מענק ל-JZ מהמרכז הלאומי למדע, פולין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (calcium chloride)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Capillary holder (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGריכוז מלאי: 10 µg/mL, ריכוז עבודה: 2 pg/nL (מודלל ב-0.9% NaCl)
Injector pump FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potassium chloride)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnesium chloride hexahydrate)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
Microscope Leica M165 FC 1983 magnificationLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Mineral oilSigma-AldrichM5904
NaCl (sodium chloride)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1Gריכוז מלאי: 20 mg/mL (מוכן במים טהורים במיוחד), ריכוז עבודה: 0.5 mg/mL (מודלל ב-E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Trypan BlueThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxחדר ניתוח אוטומטי

מקורות

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

232232JoVETSCTSC TANDs6 IL 6ASDDuct of CuvierMIA
מיקרוהזרקה של אינטרלוקין-6 לזרם הדם של זחלי דגי זברה TSC כדי לחקור התנהגויות דמויות הפרעות נוירופסיכיאטריות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.