הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

חתימת חיסון הקשורה למתח ברשת אנדופלזמית בפרפור פרוזדורים: למידת מכונה וטרנסקריפטומיקה חד-תאית

146 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71532

⸱

7 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Basic Medical Sciences, Harbin Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חתימות חיסוניות הקשורות ללחץ ברשתית אנדופלזמית בפרפור פרוזדורים, על ידי שילוב טרנסקריפטומיקה ציבורית בכמויות גדולות, למידת מכונה, ניתוח חדירה חיסונית וטרנסקריפטומיקה של תאים בודדים לצורך עדיפות ביומרקרים שכפולה ומיקום סוגי תאים.

תקציר

מחקר זה מתאר תהליך חישובי שניתן לשחזור לזיהוי חתימות גנים הקשורות ללחץ רשתית אנדופלזמית (ERS) בפרפור פרוזדורים (AF) על ידי שילוב טרנסקריפטומיקה גדולה, למידת מכונה, ניתוח חדירה חיסונית וטרנסקריפטומיקה חד-תאית. מאגרי נתונים ציבוריים של טרנסקריפטומיה נאספו מ-Gene Expression Omnibus (GEO), ואחריהם הרמוניזציה של פנוטיפים, נרמול, תיקון אפקט אצווה וניתוח ביטוי שונה. ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקלל (WGCNA) שולב עם קבוצות גנים הקשורות ל-ERS לזיהוי גנים מועמדים הקשורים ל-ERS. לאחר מכן נעשה שימוש במסגרת למידת מכונה רב-אלגוריתמית להשוואת אסטרטגיות בחירת תכונות והתאמת מודלים. המודל שנבחר הוערך בקבוצת אימות חיצונית עצמאית (GSE115574) והוערך עוד בקוהורט נוסף (GSE14975), עם ביצועים מובחנים שנמדדו על ידי ניתוח מאפייני תפעול מקלט (ROC) והשטח מתחת לעקומה (AUC). באמצעות תהליך עבודה זה, זוהו 22 גנים מרכזיים הקשורים ל-ERS, ומודל Elastic Net (Enet) בן 18 גנים הראה את הביצועים המפלים הגבוהים ביותר בין קבוצות ההכשרה והווימות. ניתוח SHAP Additive exPlanation (SHAP) הדגיש את התרומה המרכזית של גנים כמו RPS11, NCF2 ו-S100A4 לחיזוי המודלים. דה-קונבולוציה חיסונית וניתוח טרנסקריפטומי של תא יחיד מיפו עוד יותר את החתימה הקשורה ל-ERS בעיקר לקו המונוציטים-מקרופאג'ים, מה שמרמז על מעורבותה הפוטנציאלית בעיצוב חיסוני הקשור ל-AF. תהליך עבודה זה מספק אסטרטגיה ניתנת לשחזור לקישור חתימות טרנסקריפטומיות הקשורות למחלה לאוכלוסיות תאי חיסון ספציפיות, וניתן להתאים אותו להקשרים מחלתיים אחרים עם מאגרי נתונים מתאימים בנפח ותאי יחיד.

מבוא

פרפור פרוזדורים (AF) הוא הפרעת קצב ממושכת נפוצה ביותר בפרקטיקה קלינית, המאופיינת בפעילות חשמלית לא מסודרת בעלייה ואובדן תפקוד מכני. הוא מעלה משמעותית את הסיכון לשבץ, אי ספיקת לב ותמותה מכל הסיבה, והופך לנטל בריאותי עולמי משמעותי1. הניהול הקליני הנוכחי של פרפור פרפורים מתמודד עם אתגרים משמעותיים: תרופות אנטי-אריתמיות מסורתיות בעלות יעילות מוגבלת לטווח הארוך בשמירה על קצב הסינוסים, ותופעות הלוואי שלהן, כגון הפרעות קצב ורעילות לב, מגבילות את השימוש המתמשךשלהן 2,3. אבלציה בקטטר נותרת גם אתגר בשמירה על קצב סינוסים ארוך טווח עבור AF4 מתמשך. אסטרטגיות טיפול חדשות מוגבלות כיום בשל היעדר הבנה שיטתית של הנוף המולקולרי של מנגנוני ה-AF במעלה הזרם, מה שמקשה על זיהוי ותרגום מטרות מדויקות. מחקרים הראו כי ההתקדמות הפתולוגית של פרפור פרפור כוללת אינטראקציות מורכבות בממדים שונים, כולל עיצוב מחדש של מערכת העצבים החשמלית, המבנית והאוטונומית. ביניהם, שיקום מבני עליזות, המתמקד בפיברוזיס שריר הלב, הוא מנגנון מרכזי לשימור AF 5,6,7.

לכן, הבהרת מסלולי הלחץ במעלה הזרם שמניעים פיברוזיס היא אחד המפתחות להתמודדות עם צוואר הבקבוק הטיפולי בפרפור פרוזדורי מתמשך. מחקרים עדכניים מצביעים על כך שלחץ רשת אנדופלזמית (ERS), מרכז רגולציה מרכזי המאפשר לתאים להתמודד עם הפרעות תוך-תאיות וחוץ-תאיות, הוא תגובה אדפטיבית שמורה מאוד המופעלת כאשר הומאוסטזיס ER מופרע, מה שמוביל להצטברות יתר של חלבונים פתוחים או מקופלים בצורה שגויה בתוך לומן ER. ERS עשוי להשתתף בשיפוץ עלויות על ידי ויסות פרוטאוסטזיס, מחזור סידן, תגובות דלקתיות ואפופטוזיס 8,9. עם זאת, הטריגרים במעלה הזרם, מולקולות האפקטור המרכזיות והמסלולים במורד הזרם של ERS ב-AF טרם אופו באופן שיטתי, מה שמקשה להגדיר את הצמתים הקריטיים ונקודות ההתערבות הניתנות ליישום בשיקום פרוזדורים.

בהשוואה למחקרים טרנסקריפטומיים מסורתיים בכמויות גדולות, אינטגרציה של מולטי-אומיקס יכולה להניב אותות מחלה ברמת אוכלוסייה חזקים יותר. יתרה מזאת, שילוב טרנסקריפטומיקה חד-תאית מאפשר ניתוח של ההטרוגניות התאית וזיהוי המקורות התאיים של אותות אלו, ובכך מיפוי תוצאות האסוציאציה לסוגי תאים ספציפיים ולמסלולי האינטראקציה הפוטנציאליים שלהם. זה מספק בסיס לחקירות מכניות עתידיות ולעדיפות מטרות. במחקר הנוכחי, מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים גדולים וטרנסקריפטומיים חד-תאיים הקשורים ל-AF נאספו ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO). מודולים מרכזיים הקשורים ל-ERS זוהו באמצעות ניתוח ביטוי שונה וניתוח רשת קו-ביטוי גנטית משוקללת (WGCNA). על ידי שילוב ניתוחים חד-תאיים, מולקולות מפתח ממוקדות עוד יותר לסוגי תאים ספציפיים ולרשתות האינטראקציה שלהם. ביחד, מחקר זה שואף להגדיר רשתות מפתח הקשורות ל-ERS ב-AF ואת הקשרים שלהן לשיקום מבני, ובכך לספק הצדקה לגילוי מטרות ולאסטרטגיות טיפוליות מונעות מנגנונים ושכבתיות.

בהשוואה לניתוח ביטוי דיפרנציאלי במערך נתונים יחיד או לסריקת ביומרקרים באלגוריתם יחיד, זרימת עבודה זו משפרת את החוסן והפרשנות על ידי שילוב אימות חוצה קבוצה, בחירת תכונות ביולוגית מוגבלת, השוואת מודלים רב-אלגוריתמיים, דה-קונבולוציה חיסונית וטרנסקריפטומיקה של תא יחיד. צעדים אלו מסייעים לתת עדיפות לחתימות הקשורות ל-ERS שניתן לשחזר ולמקם אותות שמקורם בכמויות לאוכלוסיות תאי חיסון ספציפיות ולרשתות אינטראקציה. תהליך עבודה זה מתאים למחקרים המשתמשים במאגרי נתונים טרנסקריפטומיים ציבוריים או פנימיים עם קבוצות מחלה וביקורת מוגדרות היטב, מקורות רקמה דומים, גודל מדגם מספק והערות פנוטיפיות זמינות. הוא שימושי במיוחד ליצירת השערות, עדיפות ביומרקרים, ומיקום סוגי תאים של תוכניות מולקולריות הקשורות למחלות. עם זאת, ביצועיו תלויים באיכות מאגר הנתונים, עקביות פנוטיפ ותיקון אפקט אצווה אפקטיבי; לכן, חתימות מועמדות שמזוהות על ידי תהליך עבודה זה דורשות אימות בקבוצות עצמאיות ובמודלים ניסיוניים לפני תרגום קליני. תהליך העבודה הכולל של המחקר מוצג באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בהתאם לצעדים לסקירה אתית של מדעי החיים ומחקר רפואי הכולל נבדקים אנושיים שפורסמו בסין ב-18 בפברואר 2023, מחקר המבוסס על נתונים זמינים לציבור עשוי לעמוד בקריטריונים לפטור מסקירה אתית. מחקר זה השתמש רק בנתונים טרנסקריפטומיים משניים זמינים לציבור, לא מזוהים, ולא כלל גיוס משתתפים אנושיים חדשים, איסוף דגימות אנושיות או ניסויים בבעלי חיים. לכן, לא נדרשה אישור מוסדי מוסדי נוסף. לא בוצעו ניסויים בבעלי חיים במחקר זה. לכן, אישור מוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית לא היה רלוונטי.

מקורות נתונים לגנים הקשורים ללחץ ברשת אנדופלזמית בפרפור פרוזדורים
במחקר זה, מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים זמינים לציבור הקשורים ל-AF נאספו ממאגר הנתונים GEO, כולל GSE41177, GSE79768, GSE115574, GSE14975 ו-GSE165838. מידע מפורט על מאגרי הנתונים של GSE מסופק בקובץ המשלים 1—טבלה משלימה S1. GSE41177 ו-GSE79768 שימשו לבניית קבוצת ההכשרה המשולבת של טרנסקריפטומיה בכמויות גדולות, בעוד ש-GSE115574 ו-GSE14975 שימשו כשתי קבוצות אימות חיצוניות עצמאיות. GSE165838 שימש לניתוח טרנסקריפטומי חד-תא. מכיוון שמאגרי נתונים אלו נוצרו בפלטפורמות שונות ועשויים להשתנות במקור הרקמה, ברקע הקליני ובהרכב הדגימה, כל מערך נתונים עובד מראש בנפרד בהתאם למאפייני הפלטפורמה שלו לפני האינטגרציה או האימות. לאחר מכן בוצעה תיקון אפקט אצווה באמצעות חבילת sva R עבור קבוצת האימון הממוזגת. מערך הגנים הקשור ללחץ ברשת האנדופלזמית נשלף ממאגר GeneCards עם ציון רלוונטיות ≥ 3, ולאחר הסרת השכפול, יצר את רשימת הגנים היעד ששימשה במחקר זה.

ניתוח גנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי
לאחר סטנדרטיזציה ונרמול נתונים, נעשה שימוש בחבילת R לזיהוי גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) במערך האימון המשולב. DEGs הוגדרו לפי קריטריוני מובהקות הבאים: ערך P מותאם לקצב גילוי שגוי (תואר. P.Val) < 0.05 ו-|log2FC| > 0.58510. כדי להמחיש את דפוסי הביטוי של DEGs, נוצרו גרפים של הרי געש ומפות חום באמצעות חבילות ggplot2 ו-pheatmap, בהתאמה.

ניתוח WGCNA
כדי להבהיר מנגנונים פוטנציאליים של ויסות גנים מתואם, להגדיר את דפוסי הקשר בין מודולי הביטוי המשותפים למשתני תכונה קלינית, ולזהות סמנים ביולוגיים מרכזיים או מטרות טיפוליות עם פוטנציאל תרגומי, יושם WGCNA11.

רשת קו-ביטוי משוקללת נבנתה באמצעות חבילת WGCNA ב-R. עוצמת הסף הרך (β) נבחרה לפי קריטריון הטופולוגיה ללא קנה מידה; ערך ה-β המתאים נבחר לניתוחים הבאים כאשר מדד ההתאמה הטופולוגיית ללא קנה מידה (R2) הגיע ונשאר מעל 0.8512. במהלך זיהוי המודולים, פרמטרים הקשורים לכריתת עצים דינמית ורגישות לזיהוי מודול אופטימיזם לשיפור רזולוציה ויציבות גבולות המודול. לבסוף, מודולים הקשורים באופן מובהק לתכונת היעד הוצאו, וגנים תוך-מודולריים זוהו כקבוצות גנים מועמדות לניתוחים במורד הזרם.

ניתוח העשרה של DEGs הקשורים ל-AF
כדי לזהות במדויק את גני הציר, ה-DEGs נחתכו תחילה עם גנים מהמודולים המרכזיים של WGCNA כדי להגדיר קבוצת גנים המעורבים בפתוגנזה של AF. לאחר מכן, קבוצת הגנים AF הזו נחתכה עוד יותר עם גנים הקשורים ל-ERS, והגנים החופפים שנוצרו נשמרו לניתוחים הבאים.

העשרה פונקציונלית של הגנים שנבדקו הוערכה באמצעות ניתוחי אונטולוגיית גנים (GO) ואנציקלופדיה קיוטו לגנים וגנומים (KEGG). מונחי GO נותחו באמצעות clusterProfiler של חבילת R כדי לסכם העשרה בקטגוריות13 של תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). ניתוח KEGG שימש לאחר מכן לזיהוי מסלולים מועשרים הקשורים לגנים המטרה14. תוצאות העשרה עם ערך P מותאם < 0.05 נחשבו למובהקות סטטיסטית. מונחי GO המובילים ונתיבי KEGG הוצגו כגרפים של בר וגרפים בועות באמצעות ggplot2.

ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)
ניתוח PPI בוצע על ידי העלאת מערך הגנים המצטלב למאגר הנתונים STRING, כאשר האורגניזם הוגבל להומו ספיינס. צמתים מנותקים הוסרו, והאינטראקציות נאספו באמצעות סף ציון ביטחון בינוני (ציון משולב ≥ 0.4). רשת ה-PPI שנוצרה יובאה לאחר מכן לכלי ויזואליזציה וניתוח רשת לניתוח טופולוגי לזיהוי צמתים מרכזיים.

בניית מודל סיווג מועמד AF-ERS המבוסס על 12 אלגוריתמים ללמידת מכונה
במחקר זה, פותחה מסגרת סיווג אנסמבל המבוססת על שנים-עשר אלגוריתמים קונבנציונליים של למידת מכונה כדי לסינון גנים מועמדים הקשורים ל-ERS הקשורים ל-AF ולמקסם את ביצועי הסיווג. לחלוקת נתונים, לאחר תקינה ונרמול, GSE41177 ו-GSE79768 אוחדו ליצירת מטריצת ביטוי קבוצת האימון. GSE115574 שימש כקבוצת אימות חיצונית עצמאית להערכת הכללות המודל. באופן ספציפי, DEGs זוהו לראשונה בקבוצת ההכשרה (|log2FC| >0.585, מותאם p < 0.05). ה-DEGs הללו נחתכו לאחר מכן עם גנים מהמודולים המרכזיים של WGCNA וגנים הקשורים ל-ERS, ומערך הגנים שנוצר שימש כתכונות קלט לבניית המודל.

כדי לקשר גנים הקשורים ל-ERS לפנוטיפ AF, פותח מודל סיווג מועמד המשתמש ב-12 גישות למידת מכונה: Lasso, Ridge, מודל ליניארי מוכלל שלב בשלב (Stepglm), הגברת גרדיאנט קיצוני (XGBoost), יער אקראי (RF), רשת אלסטית (Enet), רגרסיה חלקית של מינימום ריבועים למודלים ליניאריים מוכללים (plsRglm), מודל רגרסיה מוגברת מוכללת (GBM), נאיב בייס, ניתוח דיסקרימיננטי ליניארי (LDA), glmBoost, ומכונת וקטור תמיכה (SVM). אומצה אסטרטגיית מידול קומבינטורי שיטתי על ידי הוספת אלגוריתם שני לראשון ואינטגרציה באמצעות α פרמטר הכיוון, מה שהוביל ל-113 שילובים של בחירת תכונות והתאמת מודלים שהוערכו באופן מקיף. הבחנה במודל הוערכה על ידי חישוב השטח מתחת לעקומת המאפיינים התפעולית של המקלט (AUC). לפי קריטריוני בחירת המודל שדווחו בעבר, מסגרת המועמד הסופית הוגדרה כמודל עם הביצועים הכוללים הטובים ביותר, כפי שהוערך על ידי ממוצע AUC בין קבוצות ההכשרה והאימות.

אסטרטגיית המידול הקומבינטורי הזו הושפעה ממחקרים קודמים בלמידת מכונהביו-רפואית 15,16,17. יחד, מחקרים אלו מצביעים על כך שאף אלגוריתם בודד לא מצליח בעקביות על אחרים במערכי נתונים ומשימות אנליטיות. בהתבסס על הנחה זו, אימוץ מסגרת למידה קבוצתית ומידולים קומבינטוריים יכול להגדיל את הסיכוי לקבל מודל מועמד בעל ביצועים גבוהים עם הכללה יציבה יותר ולשפר את עמידות בחירת המודלים.

בהמשך, ערכי SHapley Additive exPlanations (SHAP) יושמו כדי לפרש את מודל למידת המכונה על ידי המחשת המאפיינים המרכזיים שמניעים את סיווג AF, ובכך לכמת את תרומת כל תכונה לתוצאה החזויה והמחשת כיצד גני חתימה בודדים משפיעים על התוצר הסופי של המודל18.

הערכת ביצועי המודל ואימות חיצוני של המודל האופטימלי
ביצועי המודל האופטימלי הוערכו בקבוצת ההכשרה ובקבוצת האימות החיצונית העצמאית (GSE115574). ברמת המודל, נבנתה מטריצת בלבול המבוססת על תוויות המחלקה החזויות, ודווחו מדדי הסיווג המתאימים. עקומות מאפייני הפעלה של מקלט (ROC) נוצרו באמצעות חבילת R pROC, וה-AUC חושב לכימות ביצועים מבחינים.

ברמת הביומרקר, עקומות ROC חד-גני צוירו עבור כל גן מפתח במודל האופטימלי, ו-AUCs המתאימים חושבו כדי להעריך את יכולת ההבחנה האישית שלהם. בנוסף, הביטוי השונה של הגנים המרכזיים סוכם באמצעות גרף הר געש, והשתמשו בתרשימי קופסה להצגת התפלגות הביטוי שלהם במחלות לעומת דגימות בריאות. כדי להעריך עוד את ההכללה של חתימת הגן האופטימלית שהוגדרה מראש על ידי המודל, בוצעה אימות חיצוני עצמאי נוסף באמצעות GSE14975. GSE14975 מכיל נתונים טרנסקריפטומיים מדגימות של איבר עלייה שמאלית, כולל חמש דגימות פרפור עליות וחמש דגימות קצב/ביקורת סינוסים. כל הגנים הכלולים בחתימה הנעולה היו זמינים במאגר נתונים זה. כדי לשמור על עקביות עם תהליך העבודה האנליטי המקורי בין קבוצות קבוצות, קבוצת הפיתוח GSE14975 תואמת באמצעות ComBat עם מקור מערך הנתונים כמשתנה אצווה. ההרמוניזציה הזו בוצעה ללא פיקוח. חשוב לציין שתוויות מחלות/בקרה מ-GSE14975 לא שימשו לבחירת תכונות, הערכת מקדמים, קביעת סף או כיוון היפרפרמטרים.

מודל הניקוד האופטימלי שמבוסס על המודל הותאם באמצעות קבוצת הפיתוח בלבד ואז יושם על GSE14975 לאימות חיצוני. ביצועי המודל ב-GSE14975 הוערכו באמצעות ניתוח עקומת מאפייני תפעול של המקלט, שטח מתחת לעקומה, רווח סמך (CI), רגישות, ספציפיות, דיוק, ערכי חיזוי חיוביים ושליליים, וציון ברייר. בנוסף, נוצרו עקומות ROC חד-גני לכל הגנים האופטימליים שמקורם במודל ב-GSE14975 כדי להמחיש את יכולת ההבחנה האישית שלהם. כדי להעריך עוד את הפוטנציאל של התאמת יתר בקבוצת הפיתוח, בוצעו אימות צולב חוזר של 10 פעמים ותיקון אופטימיות של בוטסטרפ באמצעות חתימת הגן שמקורה במודל האופטימלי הנעול. לצורך אימות הדדי חוזר, קבוצת הפיתוח חולקה שוב ושוב ל-10 חלקיות, והבחנה בין מודלים סוכמה בכל האיטרציות. לצורך אימות בוטסטרפ, נוצרו 1,000 דגימות בוטסטרפ כדי להעריך את האופטימיות של ביצועי קבוצת הפיתוח הנראות לכאורה ולחישוב ה-AUC המתוקן באופטימיות. מכיוון שהחתימה הסופית נגזרה מהמודל האופטימלי, התרומה של כל גן פורשה בעיקר לפי הגודל והכיוון המוחלט של מקדמי המודל. בנוסף, בוצעו ניתוחי ROC חד-גנים GSE14975 כדי להמחיש את יכולת ההבחנה האישית של כל גן רכיב. לצורכי ויזואליזציה, עקומות ROC חד-גני היו מכוונות לשקף יכולת הבחנה ללא קשר לשאלה אם הביטוי הגבוה או הנמוך קשור ל-AF.

ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA)
כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של הגנים המרכזיים, בוצע GSEA באמצעות דגימות מקבוצת המחלה19. לכל גן מפתח, הדגימות חולקו לתת-קבוצות בעלות ביטוי גבוה ונמוך תוך שימוש בערך הביטוי החציוני בקבוצת המחלה כנקודת החיתוך. ההבדל הממוצע בביטוי בין שתי תת-הקבוצות לכל גן חושב, ונוצרה רשימת גנים מדורגת בסדר יורד כקלט לניתוח העשרה. GSEA בוצע באמצעות clusterProfiler של חבילת R, עם מערכי גנים שנאספו מאוסף MSigDB c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05. כיוון ההעשרה נקבע לפי סימן ציון ההעשרה המנורמל (NES), ונוצרו גרפים של העשרה עבור מסלולים מייצגים.

הערכת שפע תת-סוג תאי החיסון והביטוי המבדל
אלגוריתם הדקונבולוציה CIBERSORT יושם להערכת השפע היחסי של תת-קבוצות תאי חיסון החודרות והקשרים ביניהם בין דגמים. בהתבסס על מטריצת החתימה של LM22 לויקוציטים, הרכב תאי החיסון הוסקה כמותית מפרופילי ביטוי גנים באמצעות חבילת R CIBERSORT20. סף p < 0.05 שימש לסינון התוצאות, ורק דגימות שעמדו בקריטריון זה נשמרו לניתוחים הבאים. נוצרו תרשימי קופסה כדי להשוות את החלקים היחסיים המוערכים של תת-קבוצות תאי חיסון בין קבוצות AF לקבוצת הביקורת. בנוסף, ניתוח הקורלציה של ספירמן בוצע כדי להעריך את הקשרים בין רמות חדירת תאי מערכת החיסון לבין ביטוי הגנים של האב.

ניתוח תא יחיד
ניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי בוצע באמצעות מערך הנתונים GEO GSE165838. מטריצות ספירת תאי גן גולמיות יובאו ל-R ועובדו באמצעות Seurat v4.4.0. לכל דגימה, נוצר אובייקט Seurat באמצעות CreateSeuratObject עם min.cells = 5 ו-min.features = 300. מדדי בקרת איכות, כולל מספר הגנים שזוהו, סך כל מזהה מולקולרי ייחודי (UMI), אחוז הגנים המיטוכונדריאליים, אחוז הגנים הריבוזומליים ואחוז המוגלובין גנטי, חושבו עבור כל תא. התאים נשמרו אם היו להם יותר מ-500 גנים שזוהו, פחות מ-5,000 ספירות UMI, אחוז הגנים המיטוכונדריאלי < 25%, אחוז הגנים הריבוזומליים > 3%, ואחוז המוגלובין < 1%. גנים שזוהו בפחות משלושה תאים הוסרו. גני MALAT1 ומיטוכונדריאלים גם הם הוצאו לפני הניתוח במורד הזרם. DoubletFinder שימש לזיהוי ולהוציא דאבלטים פוטנציאליים. בקצרה, תאים חולקו לפי זהות המדגם, וזיהוי כפול בוצע בנפרד לכל מדגם באמצעות רכיבים עיקריים 1–30.

פרמטר pN הוגדר ל-0.25, והערך האופטימלי של pK נבחר לפי מדד BC מקסימלי שהושג מסריקת פרמטרים. קצב הכפול הצפוי הוערך לפי מספר התאים שנמצאו בכל דגימה, כאשר שיעורים של 2.5%, 5% ו-6.5% שימשו לדגימות עם מספר תאים נמוך יחסית, ביניים וגבוהים, בהתאמה. רק תאים שסווגו כסינגלטים נשמרו. זיהום ה-RNA הסביבתי הוערך עוד באמצעות DecontX, ותאים עם ציון זיהום ≥ 0.2 הוצאו. לאחר בקרת איכות, הסרת דאבלטים וסינון RNA סביבתי, נשמרו 40,886 תאים ו-23,947 גנים לניתוח במורד הזרם. מערך הנתונים החד-תאי המסונן ננורם בשיטת LogNormalize באמצעות גורם קנה מידה של 10,000, ואחריו זיהוי גנים משתנים מאוד. הנתונים הוגדלו לאחר מכן לפני ניתוח הרכיבים העיקריים.

כדי להפחית אפקטים ספציפיים לדגימה, הוחל Harmony באמצעות orig.ident כמשתנה אצווה. ויזואליזציה של קירוב והיטל אחיד של מניפולד (UMAP) ובניית גרף השכן הקרוב ביותר בוצעו באמצעות 15 הממדים הראשונים שתוקנו בהרמוניה21. הקיבוץ בוצע באמצעות אלגוריתם לוון, ונערכו רזולוציות אשכולות מרובות. ההערה הסופית המרכזית של סוג תא התבססה על תוצאת האשכול ברזולוציה 0.05. אשכולות תאים עברו הערות ידניות בהתאם לביטוי גנים של סמן קנוני. אסטרטגיית הסימון המבוססת על סימנים זו תואמת למחקרים קודמים בנושא פרופיל חיסון חד-תאי22. תאי T זוהו על ידי CD3D, CD3E ו-TRAC; תאי הרג טבעיים (NK) על ידי NKG7, GNLY, NCAM1 ו-KLRG1; תאי מונוציטים-מקרופאגים על ידי LYZ, CD14, FCGR3A, CD68, CD163, FCN1, TYROBP, S100A8, ו-S100A9; תאי B של MS4A1 ו-CD79A; תאי פלזמה על ידי MZB1 ו-XBP1; תאי אנדותל על ידי PECAM1, VWF ו-CDH5; תאי שריר חלק כלי דם על ידי ACTA2, TAGLN, MYH11 ו-MYL9; פיברובלסטים על ידי DCN, LUM, COL1A1, COL1A2 ו-PDGFRA; תאים דמויי נויטרופילים על ידי FCGR3B, CXCR2, S100A8 ו-MPO; תאי פיטום על ידי TPSB2; ותאים דנדריטיים על ידי LILRA4, CD1C ו-XCR1. ביטוי גן הסימון בין אשכולות הוצג באמצעות גרפים של נקודות, והתפלגות הביטוי של גני המרכז הסופיים הקשורים ל-ERS הוצגה בהטמעות UMAP.

כדי לכמת את פעילות השעתוק הקשורה ל-ERS ברמת תא יחיד, נעשה שימוש בקבוצת הגנים המרכזית הסופית לחישוב ציוני חתימה תאיים באמצעות AUCell, ניתוח העשרת קבוצות גנים בדגימה בודדת ו-Seurat AddModuleScore. ב-AUCell, דירוגי התאים נבנו מתוך מטריצת ביטוי RNA מנורמלת, וציוני AUC חושבו באמצעות קבוצת הגנים המרכזית שבה 10% הגנים המדורגים העליונים היו סף הדירוג המקסימלי. עבור ssGSEA, ציוני העשרה חושבו באמצעות חבילת GSVA. שלושת תוצרי הניקוד היו ממורכזים ומוגדרים, לאחר מכן נורמל מינימום-מקסימום, ולבסוף סוכמו ליצירת ציון משולב משולב הקשור ל-ERS לכל תא. התפלגות הציון המשולב הושוותה בין אוכלוסיות תאים עם הערות כדי להעריך את ההטרוגניות של סוגי התאים בתוכנית הקשורה ל-ERS. מכיוון ששושלת המונוציטים-מקרופאגים הציגה העשרת חתימה בולטת הקשורה ל-ERS והייתה קשורה קשר הדוק לשחזור חיסוני-דלקתי, היא נבחרה לניתוחים נוספים בתוך השושלת. תאי מונוציטים-מקרופאגים חולקו לקבוצות בעלות ציון גבוה ונמוך לפי ציון משולב חציוני הקשור ל-ERS. לאחר מכן בוצע ניתוח מסלול פסאודוטיים על תאי מונוציטים-מקרופאגים באמצעות מונוקל.

לניתוח פסאודו-זמן, נוצר אובייקט CellDataSet מתוך מטריצת הספירה הגולמית באמצעות מודל ביטוי בינומי שלילי. לאחר מכן הוערכו גורמי גודל ופיזורים. גני הסדר נבחרו באמצעות סף ביטוי ממוצע של ≥ 0.1 ופיזור אמפירי גבוה מהפיזור המותאם. הממדיות הופחתה באמצעות אלגוריתם DDRTree, והתאים סודרו לאורך המסלול המוסק. דפוסי הביטוי הדינמיים של גני המרכז הקשורים ל-ERS לאורך זמן פסאודוטיים הוצגו. ניתוח תקשורת תא-תא בוצע באמצעות CellChat כדי לחקור אינטראקציות פוטנציאליות בין ליגנד-קולטן בין תאי מונוציטים-מקרופאגים עם ציונים שונים הקשורים ל-ERS. לצורך ניתוח זה, תאי מונוציטים-מקרופאג' סומנו כבעלי ציון גבוה או נמוך לפי ציון מורכב חציוני, בעוד שתאים אחרים שמרו על תוויות סוג התאים המקוריות שלהם. מטריצת ביטוי ה-RNA המנורמל וההערות המתאימות של קבוצת תאים שימשו ליצירת אובייקט CellChat. לניתוח תקשורת תא-תא, נבחר מסד הנתונים האנושי CellChatDB, ורק אינטראקציות איתות מופרשות הוערכו. גנים מבוטאים יתר וזוגות ליגנד-קולטנים זוהו לפני חישוב הסתברויות התקשורת. קבוצות תאים שכללו פחות מ-10 תאים הוצאו מניתוח האינטראקציה. לאחר מכן הוערכו ואוגדו הסתברויות תקשורת ברמת המסלול כדי להשוות את מספר ועוצמת האינטראקציות בין אוכלוסיות תאים. כדי להקל על השכפול, מוצגת טבלת נקודות ביקורת למטה המקשרת כל שלב פרוטוקול למספר או לטבלה הצפויה המתאימה לו (קובץ משלים 1—טבלה משלימה S2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי גנים המובעים באופן שונה ב-AF
כדי לשפר את ההשוואה בין קבוצות, שולבו שני מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים הקשורים ל-AF (GSE41177 ו-GSE79768), ואפקטי אצווה תוקנו על מטריצת הביטויים הממוזגת. איור 2A,B מציג תרשימי קופסה של התפלגויות ביטוי גלובליות לפני ואחרי תיקון אפקט באצוות, ששימשו להערכת האם התפלגויות עוצמת הביטוי היו דומות בין מדגמים. איור 2C,D מציג גרפים של ניתוח רכיבים עיקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה שילב טרנסקריפטומים נפוצים וחד-תאיים כדי לחקור את תפקיד ERS בפרפורפור פרפורים. נחתמה חתימת גנים הקשורה ל-ERS עם הבחנה חיובית בין קבוצות שונות, ואותות אלו מופו בעיקר לקו המונוציטים-מקרופאג' והיו קשורים לתקשורת בין-תאית נרחבת. ביחד, הממצאים מצביעים על כך שתוכניות הקשורות ל-ERS קשורות לעיצוב מחדש ממוקד תאי חיסון ב-AF. בהשוואה לסריקת ביומרקרים בכמויות גדולות בלבד, תהליך עבודה זה מספק פרשנות רב-שכבתית של גנים הקשורים למחלות. השילוב של WGCNA וסינון גנים הקשור ל-ERS משפר את הספציפיות הבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים בעבודה זו. במהלך עדכון כתב היד הזה, ChatGPT של OpenAI שימש רק לסיוע בליטוש בשפה האנגלית. המחברים בדקו, אימתו וערכו את כל הטקסט בסיוע בינה מלאכותית ולוקחים אחריות מלאה על דיוק ושלמות כתב היד הסופי. לא נעשה שימוש בכלים בסיוע בינה מלאכותית ליצירת רעיונות מחקר, ביצוע ניתוח נתונים, פרשנות תוצאות, יצירת איורים או טבלאות, או הסקת מסקנות מדעיות. העבודה המדווחת במאמר בוצעה על ידי המחברים. F.T, PR. W: כתיבה - טיוטה מקורית, תוכנה, מתודולוגיה, ויזואליזציה, אימות ואוצרת נתונים. SY. ט: חקירה ומתודולוגיה. FF. ב: פיקוח. QR. L: פיקוח, מתודולוגיה, אוצרות נתונים. XY. J, YX. X: שליפת ספרות ופרשנות נתונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AddModuleScoreפונקצית Seuratגרסה 4.4.0לא זמין
AUCellBioconductorגרסה 1.32.0RRID:SCR_021327
caretCRANגרסה 7.0.1RRID:SCR_022524
celda / decontXBioconductorגרסה 1.24.0לא זמין
CellChatGitHub / CellChatגרסה 2.2.0RRID:SCR_021946
CIBERSORT / מטריצת חתימה LM22CIBERSORTLM22לא זמין
clusterProfilerBioconductorגרסה 4.12.6RRID:SCR_016884
CytoscapeCytoscape Consortiumגרסה 3.10RRID:SCR_003032
DoubletFinderGitHub / McGinnis Labגרסה 2.0.4לא זמין
e1071CRANגרסה 1.7.16לא זמין
gbmCRANגרסה 2.2.2לא זמין
מאגר Gene Expression Omnibus (GEO)מרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)GSE41177לא זמין
מאגר Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIGSE79768לא זמין
מאגר Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIGSE115574לא זמין
מאגר Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIGSE14975לא זמין
מאגר Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIGSE165838לא זמין
glmnetCRANגרסה 4.1.8לא זמין
HarmonyCRANגרסה 1.2.4לא זמין
limmaBioconductorגרסה 3.60.6RRID:SCR_010943
MASSCRANגרסה 7.3.61לא זמין
mboostCRANגרסה 2.9.11לא זמין
MonocleBioconductorגרסה 2.38.0RRID:SCR_016339
org.Hs.eg.dbBioconductorגרסה 3.19.1לא זמין
plsRglmCRANגרסה 1.5.1לא זמין
pROCCRANגרסה 1.18.5RRID:SCR_024286
תוכנת R סטטיסטיתR Foundation for Statistical Computingגרסה 4.4.2RRID:SCR_001905
randomForestCRANגרסה 4.7.1.2RRID:SCR_015718
RStudioPosit Software, PBCגרסה 2024.4.1.748RRID:SCR_000432
SeuratCRAN / Satija Labגרסה 4.4.0RRID:SCR_016341
shapvizCRANגרסה 0.10.2לא זמין
svaBioconductorגרסה 3.52.0לא זמין
WGCNACRANגרסה 1.73RRID:SCR_003302
xgboostCRANגרסה 1.7.8.1לא זמין

מקורות

  1. Saleh K, Haldar S. Atrial fibrillation: a contemporary update. Clin Med (Lond). 2023;23(5):437-41.
  2. Lemme M, et al. Atrial-like engineered heart tissue: an in vitro model of the human atrium. Stem Cell Reports. 2018;11(6):1378-90.
  3. van Gorp PRR, Trines SA, Pijnappels DA, de Vries AAF. Multicellular in vitro models of cardiac arrhythmias: focus on atrial fibrillation. Front Cardiovasc Med. 2020;7:43.
  4. Scherr D, et al. Five-year outcome of catheter ablation of persistent atrial fibrillation using termination of atrial fibrillation as a procedural endpoint. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2015;8(1):18-24.
  5. Staerk L, et al. Atrial fibrillation: epidemiology, pathophysiology, and clinical outcomes. Circ Res. 2017;120(9):1501-17.
  6. Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, Goette A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev. 2011;91(1):265-325.
  7. Van Wagoner DR, Chung MK. Inflammation, inflammasome activation, and atrial fibrillation. Circulation. 2018;138(20):2243-6.
  8. Yuan M, et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 2022;52:102289.
  9. Wang M, Kaufman RJ. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 2016;529(7586):326-35.
  10. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  11. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559.
  12. Hu H, et al. Dissection of metabolome and transcriptome: insights into capsaicin and flavonoid accumulation in two typical Yunnan Xiaomila fruits. Int J Mol Sci. 2024;25(14):7761.
  13. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  14. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  15. Díaz-Uriarte R, Alvarez de Andrés S. Gene selection and classification of microarray data using random forest. BMC Bioinformatics. 2006;7:3.
  16. Saeys Y, Inza I, Larrañaga P. A review of feature selection techniques in bioinformatics. Bioinformatics. 2007;23(19):2507-17.
  17. Statnikov A, Wang L, Aliferis CF. A comprehensive comparison of random forests and support vector machines for microarray-based cancer classification. BMC Bioinformatics. 2008;9:319.
  18. Liu H, et al. Unraveling diethyl phthalate-induced prostate carcinogenesis: core targets revealed by integrated network toxicology, machine learning, and structural validation. Hum Genomics. 2025;19(1):149.
  19. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-50.
  20. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12(5):453-7.
  21. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-91.
  22. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren’s syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  23. Wiersma M, et al. Endoplasmic reticulum stress is associated with autophagy and cardiomyocyte remodeling in experimental and human atrial fibrillation. J Am Heart Assoc. 2017;6(10):e006458.
  24. Hu HJ, et al. Hydrogen sulfide ameliorates angiotensin II-induced atrial fibrosis progression to atrial fibrillation through inhibition of the Warburg effect and endoplasmic reticulum stress. Front Pharmacol. 2021;12:690371.
  25. Liu Y, et al. Integrative transcriptomic, proteomic, and machine learning approach to identifying feature genes of atrial fibrillation using atrial samples from patients with valvular heart disease. BMC Cardiovasc Disord. 2021;21(1):52.
  26. Fu S, et al. Using integrative bioinformatics approaches and machine-learning strategies to identify potential signatures for atrial fibrillation. Int J Cardiol Heart Vasc. 2025;56:101592.
  27. Wu S, et al. Multiplex proteomics identifies inflammation-related plasma biomarkers for aging and cardio-metabolic disorders. Clin Proteomics. 2024;21(1):30.
  28. Xie Z, et al. Identification and verification of biomarkers and immune infiltration in obesity-related atrial fibrillation. Biology (Basel). 2023;12(1):121.
  29. Huo TM, Wang ZW. Comprehensive analysis to identify key genes involved in advanced atherosclerosis. Dis Markers. 2021;2021:4026604.
  30. Chen M, et al. Weighted gene co-expression network analysis identifies crucial genes mediating progression of carotid plaque. Front Physiol. 2021;12:601952.
  31. Wang S, et al. S100A8/A9 in inflammation. Front Immunol. 2018;9:1298.
  32. Wang Q, et al. Myeloid-specific S100A8/A9 deficiency attenuates atrial fibrillation through prevention of TLR4/NF-κB-mediated immune cell recruitment and inflammation. Front Immunol. 2025;16:1623486.
  33. Wu CL, Yin R, Wang SN, Ying R. A review of CXCL1 in cardiac fibrosis. Front Cardiovasc Med. 2021;8:674498.
  34. Zhang YF, et al. CXCR4 and TYROBP mediate the development of atrial fibrillation via inflammation. J Cell Mol Med. 2022;26(12):3557-67.
  35. Hulsmans M, et al. Recruited macrophages elicit atrial fibrillation. Science. 2023;381(6654):231-9.
  36. van der Net JB, et al. Arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein gene and coronary heart disease risk in familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2009;203(2):472-8.
  37. Ye X, et al. ALOX5AP predicts poor prognosis by enhancing M2 macrophage polarization and immunosuppression in serous ovarian cancer microenvironment. Front Oncol. 2021;11:675104.
  38. Song P, Deng H, Liu Y, Zhang M. Integrated bioinformatics analysis and experimental validation reveal the relationship between ALOX5AP and the prognosis and immune microenvironment in glioma. BMC Med Genomics. 2024;17(1):218.
  39. Chen S, Tang L, Guillot A, Liu H. Bariatric surgery associates with nonalcoholic steatohepatitis/hepatocellular carcinoma amelioration via SPP1 suppression. Metabolites. 2023;13(1):11.
  40. Ji H, et al. Integrated genomic, transcriptomic, and epigenetic analyses identify a leukotriene synthesis-related M2 macrophage gene signature that predicts prognosis and treatment vulnerability in gliomas. Front Immunol. 2022;13:970702.
  41. Sirish P, et al. The critical roles of proteostasis and endoplasmic reticulum stress in atrial fibrillation. Front Physiol. 2021;12:793171.
  42. Sun Z, et al. Cross-talk between macrophages and atrial myocytes in atrial fibrillation. Basic Res Cardiol. 2016;111(6):63.
  43. Schall TJ, Proudfoot AEI. Overcoming hurdles in developing successful drugs targeting chemokine receptors. Nat Rev Immunol. 2011;11(5):355-63.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רפואהגיליון 234גיליון 234ערך ריקגיליוןאנליזה של תא בודדאנליזת SHAP
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.