מאמר שיטה

זיהוי מהיר בנקודת הטיפול (Point-of-Care) של פתוגנים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות במטופלי טיפול נמרץ

54 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71534

⸱

19 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידי משולב למגבור איזותרמי באמצעות לולאה (LAMP), המאפשרת זיהוי בנקודת הטיפול של 15 פתוגנים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות אצל חולי טיפול נמרץ תוך שעה אחת.

תקציר

זיהומים של דרכי הנשימה התחתונות (LRTIs) הם מהגורמים המובילים להידרדרות קלינית ולמוות בקרב חולים במצב קריטי. ביחידה לטיפול נמרץ (ICU), זיהוי מהיר של הפתוגן הגורם לזיהום חיוני למתן טיפול אנטימיקרוביאלי הולם; עם זאת, שיטות תרבית קונבנציונליות דורשות 3 עד 5 ימים ובעלות שיעורי חיוביות שאינם אופטימליים, במיוחד עבור פטריות. גישות מולקולריות כגון PCR מקצרות את זמן התוצאה אך עדיין תלויות במיצוי ידני של חומצות גרעין ובמעגלי טמפרטורה (thermocycling), מה שמגביל את התאמתן לשימוש לצד מיטת החולה. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של בדיקה בנקודת הטיפול (point-of-care) המבוססת על שבב מיקרופלואידי אינטגרלי בצורת דיסק (CD chip), המשלב טיהור חומצות גרעין מבוסס חרוזי מגנט עם הגברה איזותרמית באמצעות לולאה (LAMP). לאחר שלב מפושט של הנזלה וליזיס ידנית, הדגימה המעובדת נטענת על השבב יחד עם שני מבחולי ריאגנטים ארוזים מראש. המכשיר מבצע לאחר מכן באופן אוטונומי מיצוי, הגברה ב-65 °C וקריאת פלואורסצנציה בזמן אמת, ומספק תוצאות איכותיות עבור 15 מטרות, הכוללות 11 חיידקים, 3 פטריות ופתוגן לא טיפוסי אחד, בתוך 45 min של זמן ריצת המכשיר (כ-1 h עבור זרימת העבודה המלאה מהדגימה לתשובה, כולל שלב עיבוד המדגם הידני). אנו מציגים נתוני זיהוי מ-10 דגימות מ-ICU, כולל ליחה, שאיפות סימפוניות ונוזל שטיפת סימפונית-נאשית (BAL), המקיפות הן זיהומים של פתוגן בודד והן זיהומים פולימיקרוביאליים המערבים עד 7 אורגניזמים על שבב בודד. עיצוב המחסירה הסגורה ממזער את הסיכון לזיהום באמצעות רסס (aerosol), ושלב הטעינה הבודד אינו דורש הכשרה מיוחדת, מה שממצב מערכת זו ככלי אבחון מעשי לצד מיטת החולה עבור צוותי ה-ICU.

מבוא

בקרב חולים במצב קריטי ביחידה לטיפול נמרץ (ICU), זיהומים בדרכי הנשימה התחתונות, כאשר דלקת ריאות הקשורה למסייע נשימה (VAP) היא העיקרית שבהם, נותרים גורם מתמיד לתחלואה, להארכת ההנשמה המכנית ולעלייה בתמותה1,2. המפה המיקרוביולוגית של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונות (LRTIs) שנרכשו בטיפול נמרץ שונה באופן ניכר מזו של מחלות שנרכשו בקהילה. חיידקים גרם-שליליים עמידים לריבוי תרופות (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) הם השולטים, לעיתים קרובות כחלק ממקבצים פולימיקרוביאליים המסבכים את משטרי הטיפול האמפיריים3,4. פטריות אופורטוניסטיות מוסיפות רובד נוסף של מורכבות. אספרגילוזיס ריאתי פולשני, שנחשב בעבר למאפיין של דיכוי חיסוני עמוק, מזוהה כיום בתדירות גוברת בחולי טיפול נמרץ שאינם נויטרופנים, ובמיוחד לאחר שפעת חמורה ו-COVID-195. אלגוריתמים אבחנתיים קיימים לאספרגילוזיס משלבים תרבית בעלת נבחה נמוכה עם בדיקה לנוגדן גלקטומנאן (GM), אך בדיקת ה-GM מוגבלת על ידי חלונות אבחנתיים מתועדים היטב ורגישות משתנה במארחים שאינם נויטרופנים6. כל שעת עיכוב בתחילת טיפול אנטימיקרוביאלי מתאים לאלספסיס קשורה לעלייה מדידה בתמותה7. יחד, המהירות והמורכבות של זיהומי טיפול נמרץ מחייבות כלים אבחנתיים שיכולים לעמוד בדרישה הקלינית הדחופה.

תרבית מיקרוביולוגית סטנדרטית, למרות היותה חיונית לבדיקות רגישות, מוגבלת מהותית מקצב הביצוע: זמן התוצאות נמשך 3 עד 5 ימים, מיקרואורגניזמים תובעניים (fastidious) מתפספסים, ושיעור החיוביות של תרביות פטריות נותר נמוך8. רצף דור הבא מטא-גנומי (mNGS) מציע חלופה לא מוטה, אך אימוצו הקליני מוגבל בשל עלויות, זמני עיבוד של 24 עד 48 שעות, הסתמכות על צינורות עיבוד ביו-אינפורמטיים וישימות מוגבלת בנקודת הטיפול (point-of-care)9. פאנלים מבוססי PCR צמצמו את פער הזמנים, אך הם עדיין דורשים הפקת חומצות גרעין רב-שלבית, מכשור למחזורי תרמי (thermal cycling) ובפורמטים קונבנציונליים, גםת אספורזה פוסט-אמפליפיקציה10. אף אחת מפלטפורמות אלו אינה עונה במלואה לדרישות המצטברות של מחלקת טיפול נמרץ (ICU): מהירות של פחות משעה, זמן עבודה ידני מינימלי, כיסוי פתוגנים מרובה (multiplexed) כולל פטריות, ופשטות תפעולית המספיקה עבור צוות שאינו אנשי מעבדה.

הגברה איזותרמית מתווכת לולאה (LAMP) נותנת מענה למספר מהמגבלות הללו. השיטה, שתוארה לראשונה על ידי Notomi et al., מגבירה DNA מטרה בטמפרטורה קבועה של 65 °C באמצעות סט של ארבעה עד שישה פריימרים המזהים שישה אזורים מובחנים, המונעת על ידי פולימרזה בעלת יכולת החלפת גדיל11. התגובה מייצרת מבני אמפליקון אופייניים מסוג לולאה-גבעול (stem-loop) ומבנים דמויי כרובית, הניתנים לזיהוי באמצעות פלואורסצנציה בזמן אמת, המניבים עקומות בצורת S תוך דקות ספורות מחציית הסף. הרגישות בריכוזי תבנית נמוכים היא גבוהה, ותכנון הרב-פריימר מעניק סלקטיביות המגבילה תוצאות חיוביות שגויות12,13. כאשר היא משולבת עם פלטפורמות של שבבי מיקרופלואידיקה, ניתן להריץ LAMP במקביל עבור מספר מטרות מדגימה בודדת14. עבודות קודמות הראו כי מערכות שבבי LAMP מזהות פתוגנים נשימתיים עם זמן תגובה קצר בהרבה משלוש שעות15. עם זאת, מגבלה מרכזית של מערכות אלה היא התלות בתהליך נפרד וידני של מיצוי DNA, המוסיף זמן, מורכבות תפעולית וסיכון לזיהום.

המערכת המתוארת כאן מבטלת צוואר בקבוק זה. המערכת, הבנויה סביב שבב מיקרופלואידי חד-פעמי בצורת דיסק (בקוטר 86 mm), משלבת טעינת דגימה, טיהור חומצות גרעין מבוסס חרוזיים מגנטיים והגברה מסוג 16-plex LAMP בתוך מחסנית אטומה אחת (איור 1). המפעיל מבצע רק שלב קצר של הנזלה-ליזיס ידני באמצעות צינור עיבוד שתוכנן למטרה זו, ולאחר מכן טוען את הליזט ושני מבחלי ריאגנטים אל השבב (איור 2). מנקודה זו ואילך, המכשיר מבצע באופן אוטונומי את המיצוי, הגברה איזותרמית ב-65 °C ורכישת פלואורסצנציה, ומספק תוצאות איכותיות עבור 15 מטרות בעלות רלוונטיות קלינית: 11 חיידקים, 3 פטריות (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii), ופתוגן שאינו טיפוסי אחד (Mycoplasma pneumoniae), בתוך 45 min. גן ממשפחת neuroblastoma breakpoint family (NBPF) המשמש כבקר פנימי מהליך תיקוף את הלימות הדגימה ואת שלמות התגובה בכל בדיקה. פרוטוקול זה מספק הוראות שלב-אחר-שלב לכל זרימת העבודה, החל מאיסוף דגימות ביחידה לטיפול נמרצים (ICU), דרך עיבוד מקדמי, טעינת שבב, זיהוי אוטומטי ופירוש התוצאות, והוא מיועד הן לצוותי מעבדה קלינית והן לצוותים לצד מיטת החולה ביחידה לטיפול נמרצים.

פרוטוקול

כל הדגימות נאספו תחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הבקרת האתיקה של בית החולים של Peking Union Medical College, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (מספר אישור I-24PJ1778). הסכמה מודעת בכתב התקבלה מכל משתתף או מנציגו המורשה על פי חוק לפני איסוף הדגימות. פאנל הפתוגנים המטרה והקצאות בארי בארי התגובה מפורטים ב- טבלה 1, והחומרים המתכלים ששימשו במהלך עיבוד המדגמים מפורטים ב- טבלה 2.

1. איסוף דגימות קליניות מהדרכים הנשימיות התחתונות ביחידה לטיפול נמרץ (ICU)

  1. איסוף ליחה
    1. שטפו את חלל הפה במים נקיים או בתמיסת סליין פיזיולוגית סטרילית שלוש פעמים כדי להסיר שאריות מזון ופלורה פהית קומנסלית.
    2. הנחו את המטופל לנשום שלוש עד שתי נשימות עמוקות, ולאחר מכן להשתעל בעוצמה כדי להוציא ליחה מדרכי הנשימה העמוקות ישירות לכלי איסוף סטרילי.
      הערה: דגימה קבילה מורכבת מחומר צמיגי, מוגלתי או עם פסי דם המגיע מאזור מתחת לקנה הנשימה; רוק צלול או נזלת המטפטפת מהאף לגרון אינם מספיקים ועשויים לפגוע בזיהוי בהמשך התהליך.
  2. איסוף שאיבות ברונכיאליות (BAS)
    1. עבור מטופלים שאינם מחוברים למנשם, הכניסו קטטר שאיבה סטרילי (קטטר 10–12 Fr, כאשר מקור השאיבה מוגדר ללחץ של −0.0267 MPa, שווה ערך ל-−200 mmHg) דרך הנתיב הנזאלי או האורלי לעומק של כ-30 cm.
    2. הפעילו שאיבה תוך כדי סיבוב הקטטר והוציאו את הקטטר באיטיות. אספו את ההפרשות שנשאבו למלכודת דגימות סטרילית.
      הערה: אם ההפרשות דלילות, הכניסו כ-5 mL של סליין סטרילי דרך הקטטר לפני השאיבה.
    3. עבור מטופלים במנשם מכני, בחרו את קטטר השאיבה בהתאם לגודל התוכן האנדוטראכאלי: השתמשו בקטטר 10 Fr עבור צינור של 7.0–7.5 mm ובקטטר 12 Fr עבור צינור של 8.0 mm.
    4. בצעו חמצנון מקדים למטופל עם 100% חמצן למשך 30–60 s לפני השאיבה. נתקו את מעגל המנשם והכניסו את הקטטר הנבחר דרך נתיב הנשימה המלאכותי עד למפגש עם התנגדות.
    5. הפעילו לחץ שלילי של −0.0267 MPa (שווה ערך ל-−200 mmHg), תוך הגבלת כל שלב שאיבה, ובכך גם את זמן ניתוק המנשם, למשך לא יותר מ-15 s כדי למזער דה-רקרוטמנט (derecruitment) והיפוקסמיה, וחמצנו שוב את המטופל ב-100% חמצן למשך 30–60 s לאחר השאיבה.
    6. הכניסו 1–2 mL סליין סטרילי דרך הקטטר והמתינו 3 s.
    7. הפעילו שאיבה והוציאו את הקטטר. אספו את ההפרשות שנשאבו למלכודת דגימות סטרילית. חברו מחדש את מעגל המנשם מיד לאחר איסוף הדגימה.
      הערה: טכניקת אספטיקה קפדנית חיונית לאורך כל התהליך כדי למנוע זיהום נשגב (נוזוקומיאלי) של הדגימה.
  3. איסוף נוזל שטיפה ברונכואלוולארית (BALF)
    1. זהו את הסגמנט המטרה בדימות חזה. הלהיקו את הברונכוסקופ והנחיתו אותו בתוך הברונכוס הסגמנטלי או הסוב-סגמנטלי המתאים.
    2. הזריקו במהירות מנות של 20–50 mL סליין סטרילי, במשך 3–5 מנות (סה"כ 60–120 mL). הפעילו שאיבה עדינה לאחר כל מנה, ולאחר מכן אספו את הנוזל שהוחזר למכל סטרילי ואטום.
      זהירות: ניטור המודינמי ונשמתי רציף הוא חובה במהלך BAL במטופלי טיפול נמרץ. התאימו את הגדרות המנשם לפי הצורך עבור נבדקים במנשם מכני.
      הערה: החזרה טיפוסית היא 40–60% מהנפח שהוזרק. החזרה דלה עשויה להצריך מיקום מחדש של קצה הברונכוסקופ.

2. הנזלה וליזיס של פתוגנים

  1. באמצעות פיפטה חד-פעמית מס' 2, שאבו את הדגימה עד לקו המסומן (בערך 1 mL) והעבירו אותה למבחורת ההנזלה. לחצו על בלב הפיפטה מספר פעמים כדי להעביר את כל החומר הצמיגי, ולאחר מכן סגרו את המבחורה במכסה.
    הערה: עבור BALF או ליחה מימית, העבירו שני נפחי פיפטה כדי להבטיח כמות מספקת של פתוגנים.
  2. נערה את מבחורת ההנזלה בעוצמה ביד למשך 1 דקה. בחנו את הדגימה חזותית והמשיכו לנער עד שלא יישארו גושי ריר נראים והדגימה תזרום בחופשיות דרך פיפטה חד-פעמית מס' 1 ללא התנגדות (סמיכות אחידה דמוית מים). נערה למשך 1 דקה לפחות, והאריכו את הזמן לפי הצורך עבור דגימות בעלות צמיגות גבוהה עד להשגת קריטריונים אלו.
  3. פתחו את מכסה האיטום של מבחורת הליזיס.
  4. שאבו בערך 0.5 mL מהדגימה ההומוגנית באמצעות פיפטה חד-פעמית מס' 1 והעבירו את הדגימה למבחורת הליזיס.
  5. סגרו את מכסה האיטום וודאו שראש המכסה מהודק היטב.
  6. הניחו את מבחורת הליזיס במכשיר עיבוד הדגימות המקדים (SP device), תוך לחיצה כלפי מטה עד לקיבועה. לחצו על Start.
  7. המתינו לסיום מחזור ההנזלה-ליזיס האוטומטי של מכשיר ה-SP (הפרמטרים מופיעים ב-Table 3), הנמשך כ-15 דקות.
    הערה: אין לפתוח או להוציא את המבחורה במהלך העיבוד.

3. טעינת השבב וגילוי אוטומטי

  1. טעינת ריאגנטים ודגימות
    1. הוציאו את שבב ה-CD מהאחסון בטמפטורה של 4 °C והמתינו להגעה לשיווי משקל בטמפרטורת החדר (בערך 25 °C) במשך 10 דקות.
      ​הערה: מבחנות הריאגנטים O ו-B והליזאט שעבר עיבוד מקדים משמשים בטמפרטורת החדר; הגברת ה-LAMP על השבב מבוצעת בטמפרטורה של 65 °C (ראו שלב 3.2.3 ו-טבלה 3).
    2. פתחו את נרתיק הרבדי והניחו את השבב על משטח שטוח.
    3. סובבו את המכסה נגד כיוון השעון כדי לפתוח את השבב.
    4. נערה קלות את מבחנה O כדי לרכז את הנוזל בתחתית המבחנה.
    5. פתחו את מכסה מבחנה O, הכניסו את הדיזה לתוך יציאה O, והעבירו את כל התוכן לתוך היציאה.
    6. השליכו את מבחנה O. חזרו על הפרוצדורה באמצעות מבחנה B ויציאה B.
    7. הוציאו את מבחנת הליזיס המעובדת ממכשיר ה-SP והסירו את מכסה הקצה.
    8. יישרו את קצה המבחנה עם יציאה S והעבירו את כל נפח הליזאט לתוך השבב.
    9. השליכו את מבחנת הליזיס המשומשת.
    10. סובבו את מכסה השבב עם כיוון השעון עד ששני נקישים נשמעים ומאשרים אטימה מלאה.
      הערה: טעינה חלקית של אחת היציאות עלולה לגרום לכשלים בערוצים בודדים. ודאו ריקון מלא לפני האיטום. כדי למנוע איטום חלקי וסיכוני זיהום, אין להשתמש בכפפות PE בעת איטום המכסה; מומלץ להשתמש בכפפות לטקס או ניטריל במקום זאת.
  2. הפעלת המכשיר
    1. הפעילו את המנתח האוטומטי לחומצות גרעין. הקישו על Detect, סרקו את הברקוד שעל נרתיק הרבדי של השבב, והזינו את הפרטים הדמוגרפיים של המטופל ואת מזהה הדגימה.
    2. הרכיבו את השבב על הציר המסתובב ולחצו למטה עד שנקיש מאשר את החיבור.
    3. הקישו על Start. המכשיר מבצע באופן אוטונומי חלוקת ריאגנטים צנטריפוגלית, מיצוי באמצעות חרוזיים מגנטיים, הגברת LAMP בטמפרטורה של 65 °C ורכישת פלואורסנציה. זמן ההרצה הוא בערך 45 דקות (סיכום של טעינת הריאגנטים/דגימות וזרימת העבודה של המכשיר מופיע ב-איור 3).
      הערה: אין לפתוח את המכסה במהלך ההרצה.
  3. פירוש התוצאות
    1. התוכנה מזהה את נקודת ההשen (inflection point) של כל עקומת הגברה בצורת S באמצעות ניתוח מקסימום נגזרת שנייה ומדווחת על ערך ה-TP התואם (זמן עד לחיוביות).
    2. השוו כל ערך TP לסף התואם הרשום ב-טבלה 4. סווגו ערוצים עם ערכי TP השווים לסף או נמוכים ממנו כחיוביים, וערוצים עם ערכי TP מעל הסף כשליליים.
    3. וודאו שערוץ הבקרה הפנימי (באר 16) מראה עקומת הגברה בצורת S עם ערך TP נמוך מ-12 דקות.
    4. פסלו את ההרצה אם הבקרה הפנימית נכשלה. חזרו על הבדיקה באמצעות שבב חדש או אספו מחדש את הדגימה.

תוצאות

עם השלמת הרצה תקפה, המכשיר הציג עקומות פלואורסצנציה בזמן אמת עבור כל 16 הערוצים. ערוצים חיוביים הראו קינטיקת הגברה בצורת S הצפויה, עם ערכי TP מסומנים אוטומטית, בעוד שערוצים שליליים נשארים בקו הבסיס. ערוץ ה-IC (באר 16) הניב עקומה בצורת S עם TP < 12 min בכל ההרצות התקפות.

כהדגמה ראשונית להוכחת ההיתכנות (proof-of-concept) של הפרוטוקול, נבחרו 10 דגימות מייצגות כדי להדגים את מגוון התרחישים הקליניים הנפוצים בפרקטיקה של יחידה לטיפול נמרץ (ICU), כולל 6 שאיבות סימפוניאליות (BAS), 2 דגימות של נוזל שטיפת ברונכ׳י-אלבולה (BALF), ו-2 דגימות של ליחה עמוקה (Spt). דגימות אלו נבחרו במכוון כך שיכסו מקרים של זיהום מונו-מיקרוביאלי ומקרים פולי-מיקרוביאליים מורכבים, ולא כדי להעריך את שכיחות הפתוגנים; 8 מתוך 10 היו פולי-מיקרוביאליים (2 עד 7 מטרות בכל דגימה), ו-2 היו מונו-מיקרוביאליים. נתוני TP מלאים מוצגים ב-טבלה 5, ועקומות הגברה מייצגות מוצגות ב-איור 4.

בקצה אחד של ספקטרום המורכבות, דגימה S1 (BAS) הפיקה אות חיובי יחיד עבור .Aspergillus spp (TP = 8 min), בעוד שכל הערוצים הבקטריאליים נותרו שליליים. תבנית זו תאמה לאספרגילוזיס פולשני מבודד, אבחנה ששיטות תרבית קונבנציונליות לרוב אינן מצליחות לזהות במהירות. דגימה S10 (Spt) הפיקה באופן דומה תוצאה חיובית יחידה עבור Streptococcus pneumoniae (TP = 5.5 min). ממצאים אלו הדגימו את יכולתה של הבדיקה לזהות זיהומים מונו-מיקרוביאליים על רקע של 15 יעדי פתוגנים.

זיהומים פולימיקרוביאליים נצפו בשאר הדגימות, דבר העולה בקנה אחד עם האפידמיולוגיה של זיהומים נשימתיים בחולים ביחידות טיפול נמרץ (ICU). דגימות S2–S5 הכילו כל אחת Aspergillus spp. יחד עם פתוגנים בקטריאליים אחד או יותר, ובשתי דגימות נמצאה גם Candida albicans. הדגימה המורכבת ביותר, S5 (BALF), הניבה שבעה אותים חיוביים בו-זמנית, כולל Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, ו-Stenotrophomonas maltophilia. תוצאות אלו הדגימו את יכולת הגילוי הרב-ערוצית (multiplex) של השבב מיקרופלואידי בעל 16 הבארים תחת תנאי בדיקה קליניים.

דגימות S6–S9, שהכילו זיהומים חיידקיים משולבים ללא מעורבות פטרייתית, נעו בין זיהוי של שני פתוגנים (S6: B. cepacia ו-E. coli) לבין זיהוי של ארבעה פתוגנים (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae, ו-S. maltophilia). בכל 10 הדגימות, ערכי ה-TP עבור הערוצים החיוביים נעו בין 3.5–9 min, וכל ערוצי הבקרה הפנימית עמדו בקריטריון התקינות שהוגדר מראש של TP < 12 min.

עבור סט פיילוט זה, תוצאות השבב הושוו לשתי שיטות ייחוס שבוצעו במקביל על אותם 10 דגימות: רצף דור הבא מטגנומי ממוקד (tNGS) ותרבית ליחה קונבנציונלית. ההסכמה לכל מטרה עבור 15 ערוצי הפתוגנים מסוכמת ב-טבלה 6. ביחס ל-tNGS, הבדיקה הראתה 100% הסכמה חיובית (PPA) ו-100% הסכמה שלילית (NPA) בכל המטרות בדגימות אלו. ביחס לתרבית ליחה, ה-PPA היה 100% עבור כל מטרה חיובית בתרבית, בעוד שה-NPA נע בין 44.4% ל-100%; ערכי ה-NPA הנמוכים יותר שיקפו מטרות שזוהו על ידי השבב (ועל ידי tNGS) אך לא הופקו בתרבית, דבר העולה בקנה אחד עם הרגישות האנליטית הגבוהה יותר של הגברה של חומצות גרעין ביחס לתרבית, ולא עם חיוביות שגויה. בהתחשב במדגם הקטן שנבחר במכוון, נתונים אלו הם הערכות הסכמה תיאוריות עבור קהל הפיילוט ואינם נועדו לשמש כ measures פורמליים של דיוק אבחנתי. מכיוון ש-tNGS היא בעצמה שיטה מבוססת חומצה גרעינית, ההסכמה עם tNGS מאשרת התאמה ברמת החומצה הגרעינית ולא קובעת את הסטטוס הקליני של כל אורגניזם; אף אחת מהשיטות, כשלעצמה, אינה מבדילה בין זיהום אמיתי לקולוניזציה.

figure-results-1
איור 1: ארכיטקטורת השבב המיקרופלואידי וחומרים נלווים. (A) סקירה כללית של שבב הדיסק בעל קוטר 86 mm, המציג שלושה אזורים קונצנטריים: אזור טעינה, אזור ביניים לטיהור באמצעות חרוזי מגנט, ואזור חיצוני להגברה וזיהוי. (B) טבעת הגברה חיצונית המכילה 16 בארי תגובה (מיקומים 1, 4, 8, 12 ו-16 מצוינים). (C) רכיבי מבחנת הליזה (מכסה קצה, מכסה איטום וגוף המבחנה). (D) בקבוקוני ריאגנטים למנה אחת "O" ו- "B." (E) אזור הטעינה המציג את באר הדגימה "S" ואת בארי הריאגנטים "O" ו- "B." קיצורים: O = ריאגנט O; B = ריאגנט B; S = דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ערכת עיבוד מקדמי ותהליך העיבוד המקדמי של הדגימה. (A) הדגימה מועברת לתוך מבחורת ההנשיה והומוגניזציה על ידי ניעור ידני. (B) הדגימה ההומוגנית מועברת ממבחורת ההנשיה למבחורת הליזיס. (C) מבחורת הליזיס מונחת במכשיר העיבוד המקדמי של הדגימה (SP) למחזור הנשיה-ליזיס אוטומטי. (D) מתכלים לעיבוד מקדמי: פיפטות חד-פעמיות מס' 1 ו-2 (חיצים אדומים מצביעים על סימוני טעינת הדגימה), מבחורת הליזיס ומבחורת ההנשיה. קיצור: SP = Sample preprocessing. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זרימת העבודה של טעינת השבב והגילוי האוטומטי. (A) מבחנת ריאגנט O, מבחנת ריאגנט B והדגימה המעובדת נטענות לפתחי השבב המתאימים (O, B ו-S). (B) השבב מורכב ונאטם. (C) השבב מורכב על מנתח חומצות הגרעין האוטומטי, וברקוד הסריקה נסרק. (D) ההרצה מופעלת דרך מסך המגע, ולאחריה ביצוע אוטומטי של מיצוי חומצות גרעין, הגברה וגילוי פלואורסצנציה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4עקומות הגברה מייצגות שהתקבלו מ-10 דגימות ממסלכת הנשימה התחתונה שנאספו מחולי ביחידה לטיפול נמרץ (ICU). כל פאנל מייצג דגימה בודדת (S1–S10). עקומות הגברה בצורת S מעידות על יעדים חיוביים עם ערכי TP מצוינים, בעוד שקוים שטוחים מעידים על יעדים שליליים. דגימה S1 הכילה רק Aspergillus .spp.; דגימות S2–S5 הכילו Aspergillus .spp יחד עם פתוגנים חיידקיים ו/או Candida albicans; דגימות S6–S9 הכילו זיהומים חיידקיים פולימיקרוביאליים; ודגימה S10 הכילה רק Streptococcus pneumoniaeערכי ה-TP המתאימים מופיעים ב- טבלה 5קיצורים: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus .spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; כיול = Candida albicans; Cst = *Corynebacterium striatum*; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = בקרה פנימית; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = *Mycoplasma pneumoniae*; Pae = *Pseudomonas aeruginosa*; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. נא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בארמטרהקיצורקטגוריהסוג
1Acinetobacter baumanniiAbaחיידקיםחיידק
2Aspergillus spp.Aspפטריותפטרייה
3Burkholderia cepaciaBccחיידקיםחיידק
4Candida albicansCalפטריותפטרייה
5Corynebacterium striatumCstחיידקיםחיידק
6Escherichia coliEcoחיידקיםחיידק
7Haemophilus influenzaeHinחיידקיםחיידק
8Klebsiella pneumoniaeKpnחיידקיםחיידק
9Legionella pneumophilaLpnחיידקיםחיידק
10Mycoplasma pneumoniaeMpnאטיפייםחיידק אטיפי
11Pseudomonas aeruginosaPaeחיידקיםחיידק
12Pneumocystis jiroveciiPjiפטריותפטרייה
13Staphylococcus aureusSauחיידקיםחיידק
14Stenotrophomonas maltophiliaSmaחיידקיםחיידק
15Streptococcus pneumoniaeSpnחיידקיםחיידק
16NBPF (בקרה פנימית)ICבקרה פנימיתבקרה פנימית

טבלה 1: פאנל פתוגנים מטרה והקצאות בארי הבדיקה.

מתכלהמפרט / נפחתפקוד
מבחנה להנזלה2 מ"ל/מבחנהקבלת דגימה; הומוגניזציה ידנית
מבחנה לליזיס0.5 מ"ל/מבחנהגוף סיליקון דחיס עם 200 µm ממברנת סינון; ריאגנטים לליזיס טעונים מראש
#1 פיפטה חד-פעמית0.5 מ"להעברת הדגימה ההומוגניזית למבחור ליזיס
#2 פיפטה חד-פעמית2 מ"לשאיבת הדגימה עד לקו המסומן לתוך מבחנה להנזלה

טבלה 2: מפרטים של חומרים מתכלים ששימשו במהלך עיבוד מקדים של הדגימות.

שלבטמפרטורהמשך זמן
הנשייה50 °C10 min
ליזיס של פתוגנים95 °C5 min
סך כל המחזור—~15 min

טבלה 3: פרמטרי ההפעלה של מחזור מכשיר עיבוד הדגימות המקדים (SP).

מטרהסף TP (דקות)כלל סיווג
Acinetobacter baumannii13TP ≤ סף = חיובי
.Aspergillus spp15.5TP ≤ סף = חיובי
Burkholderia cepacia12.5TP ≤ סף = חיובי
Candida albicans13.5TP ≤ סף = חיובי
Corynebacterium striatum13TP ≤ סף = חיובי
Escherichia coli12TP ≤ סף = חיובי
Haemophilus influenzae13.5TP ≤ סף = חיובי
Klebsiella pneumoniae15.5TP ≤ סף = חיובי
Legionella pneumophila14.5TP ≤ סף = חיובי
Mycoplasma pneumoniae14TP ≤ סף = חיובי
Pseudomonas aeruginosa12TP ≤ סף = חיובי
Pneumocystis jirovecii14.5TP ≤ סף = חיובי
Staphylococcus aureus15.5TP ≤ סף = חיובי
Stenotrophomonas maltophilia12TP ≤ סף = חיובי
Streptococcus pneumoniae14.5TP ≤ סף = חיובי
NBPF (בקרת פנימית)12הרצה תקפה אם TP < 12 דק׳

טבלה 4: ערכי סף TP ששימשו לסיווג המטרה.

SpecimenTypeDetected targetTP (min)Culture / tNGS (reads)
S1BASAspergillus spp.8+ / 1,253
S2BASAspergillus spp.7.5– / 3,877
Pseudomonas aeruginosa4+ / 55,039
Stenotrophomonas maltophilia6.5– / 3,087
S3BASAspergillus spp.5.5+ / 6,145
Burkholderia cepacia6– / 3,221
Candida albicans7.5– / 3,280
Stenotrophomonas maltophilia6+ / 13,189
S4BALFAcinetobacter baumannii6.5+ / 10,485
Aspergillus spp.7.5– / 4,432
Burkholderia cepacia5.5– / 1,676
Candida albicans8.5– / 576
S5BALFAspergillus spp.7.5+ / 2,869
Burkholderia cepacia4– / 6,532
Corynebacterium striatum5.5– / 71,839
Escherichia coli7– / 1,891
Pseudomonas aeruginosa4+ / 31,386
Staphylococcus aureus6.5– / 26,683
Stenotrophomonas maltophilia4+ / 21,467
S6BASBurkholderia cepacia5.5– / 1,984
Escherichia coli5.5+ / 8,005
S7BASAcinetobacter baumannii5.5+ / 28,007
Burkholderia cepacia4+ / 3,585
Haemophilus influenzae6.5– / 8,912
Stenotrophomonas maltophilia6– / 8,865
S8BASAcinetobacter baumannii5.5– / 43,721
Burkholderia cepacia4– / 53,796
Klebsiella pneumoniae3.5+ / 23,757
Stenotrophomonas maltophilia4– / 26,898
S9SptHaemophilus influenzae9– / 3,636
Staphylococcus aureus8.5+ / 1,918
Stenotrophomonas maltophilia8.5– / 872
S10SptStreptococcus pneumoniae5.5– / 29,893

טבלה 5: תוצאות זיהוי וערכי TP עבור 10 דגימות מייצגות ממסכת הנשימה התחתונה שנאספו מחולי ICU.

TargettNGS +POCT +tNGS −POCT −PPANPA(SC) PPA/NPA
Acinetobacter baumannii3377100%100%100% / 87.5%
Aspergillus spp.5555100%100%100% / 71.4%
Burkholderia cepacia6644100%100%100% / 44.4%
Candida albicans2288100%100%– / 80.0%
Corynebacterium striatum1199100%100%100% / 100%
Escherichia coli2288100%100%100% / 88.9%
Haemophilus influenzae2288100%100%– / 80.0%
Klebsiella pneumoniae1199100%100%100% / 100%
Legionella pneumophila001010–100%– / 100%
Mycoplasma pneumoniae001010–100%– / 100%
Pseudomonas aeruginosa2288100%100%100% / 100%
Pneumocystis jirovecii001010–100%– / 100%
Staphylococcus aureus2288100%100%100% / 88.9%
Stenotrophomonas maltophilia6644100%100%100% / 50.0%
Streptococcus pneumoniae1199100%100%– / 90.0%

טבלה 6: התאמה של הבדיקה לכל מטרה מול ריצוף מטגנומי ממוקד מהדור הבא (tNGS) ותרבית ליחה קונבנציונלית עבור 10 דגימות מייצגות. עבור כל אחת מ-15 מטרות הפתוגנים, מוצגים מספר התוצאות החיוביות והשליליות בכל שיטה, ואחוזי ההסכמה החיובית (PPA) והשלילית (NPA) הנובעים מכך. קיצורים: PPA = positive percent agreement; NPA = negative percent agreement; tNGS = targeted metagenomic next-generation sequencing; PPA/NPA מוצגים כ-"/" כאשר לא היו זמינות תוצאות ייחוס חיוביות (או שליליות).

No.PathogenLoD (copies/mL)
1Acinetobacter baumannii1,000
2Aspergillus spp.2,000
3Burkholderia cepacia2,000
4Candida albicans1,000
5Corynebacterium striatum1,000
6Escherichia coli4,000
7Haemophilus influenzae2,000
8Klebsiella pneumoniae4,000
9Legionella pneumophila2,000
10Mycoplasma pneumoniae1,000
11Pseudomonas aeruginosa2,000
12Pneumocystis jirovecii1,000
13Staphylococcus aureus2,000
14Stenotrophomonas maltophilia2,000
15Streptococcus pneumoniae4,000
16Internal control (NBPF)Not applicable (internal control)

טבלה 7: גבול גילוי (LoD) אנליטי עבור כל יעד בלוח. ה-LoD נקבע באמצעות חומצה גרעינית גנומית שכוומתה ב-digital-PCR והוחדרה למטריקס שלילית של נוזל שטיפת סימפונות (bronchoalveolar lavage fluid), דוללה בסדרה ונבדקה בשלוש חזרות, והוגדר כריכוז הנמוך ביותר שזוהה בלפחות 95% מהחזרות. הערכים מבוטאים ב-copies/mL. קיצור: LoD = גבול גילוי.

ממדPOCT (בדיקה זו)תרבית ליחהPCR קונבנציונליmNGS (ריצוף דור הבא מטאגנומי)
זמן סבב~ 1 שעה2–5 ימים4–8 שעות> 24 שעות
נדרשת מיומנות של המפעילנמוךגבוהגבוהגבוה
דרישות מעבדהנמוך; לצד המיטהגבוה; מעבדת בקטריולוגיהגבוה; מעבדת PCRגבוה; מתקן ייעודי
השקעה בציודנמוך–בינונינמוךבינוניגבוה
עלות לבדיקהבינונינמוךבינוניגבוה
רגישות אנליטיתגבוהנמוךגבוהגבוה
היתרון העיקרימשולב במלואו, הכנסת דגימה/קבלת תוצאה, ללא צורך בהפעלה מומחיתסטנדרט ייחוס; מספק רגישותרגישות גבוהה; כמותיבלתי מוטה; מזהה פתוגנים נדירים/בלתי צפויים; פותר מקרים קשים

טבלה 8: השוואה איכותית של בדיקת ה-point-of-care הנוכחית מול תרבית ליחה, PCR קונבנציונלי וריצוף מטאגנומי. השיטות מושוות לפי זמן סבב, דרישות מיומנות מהמפעיל, דרישות תשתית מעבדתית, השקעה בציוד, עלות לבדיקה, רגישות אנליטית ויתרונות עיקריים. קיצורים: POCT = בדיקות point-of-care; PCR = polymerase chain reaction; mNGS = ריצוף מטאגנומי מדור הבא.

דיון

זיהוי מהיר של פתוגנים הוא קריטי לניהול זיהומים ביחידה לטיפול נמרץ (ICU). המערכת המתוארת כאן מקצרת את הזמן עד לזיהוי הפתוגן מ-3 עד 5 הימים הדרושים בדרך כלל לתרבית לפחות משעה אחת, מסגרת זמן שבה מתקבלות לעיתים קרובות החלטות לגבי טיפול אנטימיקרוביאלי בקו ראשון7. על ידי שילוב של מיצוי חומצות גרעין, טהרה והגברה של 16-plex LAMP בתוך שבב אטום אחד, זרימת עבודה זו מבטלת את שלב מיצוי ה-DNA הידני, שהיה צוואר הבקבוק התפעולי העיקרי של פלטפורמות שבבי LAMP מוקדמות יותר15. התוצאה היא הליך טעינה יחיד שניתן לבצע על ידי כוח אדם ללא הכשרה מיוחדת בביולוגיה מולקולרית.

מספר היבטים פרוצדורליים דורשים תשומת לב מיוחדת. איכות הדגימה היא חיונית. דגימות נשימתיות עמוקות, כגון שאיבה ברונכיאלית או נוזל שטיפה ברונכואלוולולרי, עדיפות על פני ליחה שיירקה בחולים המאווררים, שבהם זיהום אורו-פארינגיאלי עלול להסוות את אות הפתוגן האמיתי. פירוק (ליקוויפקציה) לא מלא הוא הגורם השכיח ביותר לליזיס שאינו אופטימלי, ולכן יש להמשיך בניעור ידני עד שהדגימה תגיע בבירור לעקביות מימית. במהלך טעינת השבב, ריקון חלקי של בקבוק הריאגנט או של מבחורת הליזיס עלול למנוע מהבארות הבאות אחריו את חומר הקלט הנדרש, מה שיוביל לכשלים ספציפיים בערוצים שעלולים להתפרש בטעות כתוצאות שליליות. בנוסף, סגירת מכסה השבב באמצעות שני לחיצות אינה רק מאפיין מכני; היא נחוצה כדי לשמור על חלל הראש האטום הנדרש להגברה איזותרמית וכדי למנוע אובדן עקב אידוי.

פתרון בעיות הוא פשוט יחסית. ליחה צמיגה מאוד מה-ICU עשויה לדרוש ניעור ידני למשך זמן ארוך יותר מהדקה המומלצת. דגימות מדוללות, ובמיוחד נוזל שטיפה ברונכו-אלבולהרי (BAL), עשויות לדרוש העמסה בכפול מנפח הפספוס הסטנדרטי כדי לפצות על צפיפות נמוכה יותר של פתוגנים. כישלון של הבקרה הפנימית, המוגדר כהיעדר עקומת הגברה בצורת S או ערך TP הגבוה מ-12 min, מעיד על תאיות לא מספקת של הדגימה או על כשל זרימתי בתוך השבב. במקרים אלו, התגובה המתאימה היא איסוף דגימה חדשה או חזרה על הבדיקה באמצעות שבב חדש, במקום לפרש מחדש את הערוצים הבודדים.

לשיטה זו יש גם מגבלות חשובות. הפאנל מוגבל ל-15 מטרות שהוגדרו מראש, ולא ניתן לזהות אורגניזמים שאינם מופיעים ברשימה זו, כולל דטרמיננטים רבים של עמידות לאנטימיקרוביאליים. כל סט פריימרים מכוון לאזור שמור וספציפי למין של האורגניזם המיועד, למעט הבדיקה של הסוג Aspergillus; לפיכך, מינים או זנים שאינם מיוצגים בפאנל אינם מזוהים, והפאנל אינו קולט שונות ברמת הזן בתוך אותו מין. מכיוון שכל אחת מ-16 הבארות מכילה סט פריימרים ליפופיליזציה ייעודי, הפאנל הוא מודולרי וניתן להגדרתו מחדש בגרסאות עתידיות כדי להוסיף מטרות.

פלט הבדיקה הוא איכותני. למרות שערכי TP עשויים להראות קשר רפוי לעומס הפתוגנים, הם אינם יכולים להחליף תוצאות תרבית כמותיות או הערכות מבוססות PCR הנגזרות מערכי סף מחזור (cycle threshold). כבכל בדיקה להגברת חומצות גרעין המבוצעת על דגימות נשימה, הבדיקה אינה יכולה להבחין בעצמה בין קולוניזציה לזיהום ממשי. לפיכך, הפרשנות הקלינית חייבת לשלב את תוצאות השבב עם סממנים דלקתיים כגון C-reactive protein ופרוקלקצטונין, ממצאי הדמיה, סממנים ביולוגיים פטרייתיים הכוללים galactomannan ו- (1,3)-β-D-glucan, והמהלך הקליני הכללי. בנוסף, המערכת אינה מספקת נתונים על רגישות לאנטימיקרוביאליים, ותרבית קונבנציונלית נותרת חיונית למטרה זו.

לבסוף, כל הדגימות שנכללו במחקר זה הגיעו מיחידה אחת לטיפול נמרץ רמה שלישית, וייתכן ששכיחות הפתוגנים ודפוסי זיהומים משולבים יהיו שונים בין מוסדות שונים ואוכלוסיות חולים שונות. על כן, יש להתייחס לעבודה הנוכחית כאל פיילוט, הדגמה של הוכחת היתכנות (proof-of-concept) של הפרוטוקול על קבוצה קטנה ונבחרת במכוון של דגימות מייצגות; היא לא תוכננה להערכת דיוק אבחנתי. רגישות וסגוליות קליניות לכל מטרה, כמו כן התאמה שיטתית לתרבית קונבנציונלית ולריצוף דור הבא מטגנומי (mNGS), יקבעו במחקר פרוספקטיבי מתוכנן, עם גיוס רציף של נבדקים במספר מרכזים.

כמדד ראשוני לביצועים אנליטיים, הערך של גבול הגילוי (LoD) עבור כל מטרה נאמד באמצעות חומצות גרעין גנומיות שכווננו לריכוזים ידועים ב-digital-PCR והוספו למטריצה של נוזל שטיפה ברונכואלוולארית שלילית. הדגימות דוללו בסדרה ונבדקו בשלוש חזרות. ה-LoD הוגדר כריכוז הנמוך ביותר שזוהה בלפחות 95% מהחזרות. ערכי ה-LoD שהתקבלו נעו בין 1,000 ל-4,000 copies/mL עבור הפאנל (טבלה 7). מכיוון שכימות של כל אורגניזם המבוססת על ספירת מושבות לא הייתה זמינה במחקר פיילוט זה, הערכות LoD אלו יעודכנו באמצעות זני ייחוס שנספרו באופן פורמלי בעבודה עתידית.

השוואה עם גישות אבחוניות קיימות מבהירה עוד יותר את מעמדה של פלטפורמה זו. תרבית קונבנציונלית, למרות היותה איטית, נותרת תקן הייחוס ומספקת מידע על רגישות לאנטיביוטיקה. רצף גנומי מטגנומי מדור הבא (Next-generation sequencing) מציע כיסוי רחב בהרבה של אורגניזמים, אך זאת בעלות גבוהה משמעותית, זמני תגובה ארוכים יותר (בדרך כלל 24–48 h), ובדרישות ביו-אינפורמטיקה שפלטפורמות רבות ביחידות לטיפול נמרץ (ICU) אינן יכולות לתמוך בהן באתר9. פאנלים סטנדרטיים של multiplex PCR מקצרים את הזמן לקבלת תוצאה, אך הם עדיין דורשים בדרך כלל מיצוי נפרד של חומצות גרעין, ובהתאם לפלטפורמה, עיבוד במנות (batch processing) שעלול להוסיף עיכוב נוסף10.

מנקודת מבט של עלות, אף שניתוח רשמי של יעילות מול עלות חרג מהיקף מחקר פיילוט זה, הפלטפורמה נותנת מענה למניעי העלות המרכזיים בעולם האמיתי ביחידה לטיפול נמרץ (ICU), כולל הן תרביות והן בדיקות PCR קונבנציונליות או מולטיפלקס (השוואה איכותית בין השיטות מוצגת ב-טבלה 8). היא מחזירה תוצאות תוך כ-1 h, בהשוואה ל-2–5 ימים עבור תרבית ליחה, 4–8 h עבור PCR קונבנציונלי (הדורש בדרך כלל עיבוד במנות), ו->24 h עבור ריצוף מטאגנומי. מכיוון שזרימת העבודה משולבת במלואה (הכנסת דגימה, קבלת תוצאה), היא דורשת רק שלב טעינה ידני יחיד ללא מיצוי נפרד של חומצות גרעין, ניתנת לביצוע לצד מיטת החולה ללא מעבדה ייעודית לבקטריולוגיה או מולקולרית או צוות מומחה לביולוגיה מולקולרית, ומשתמשת במחסנית סגורה לשימוש חד-פעמי המפחיתה בדיקות חוזרות הקשורות לזיהומים. עלויות הציוד הן גם צנועות, ובכך נמנעת הצורך במכשיר PCR כמותי בזמן אמת או בפלטפורמת ריצוף. עבור חולי ICU במצב קריטי, זמן תגובה מהיר זה עשוי לקצר את משך הטיפול האמפירי הבלתי הולם ולהפחית את משך האשפוז, ובכך לספק תועלת כלכלית עקיפה אך פוטנציאלית משמעותית.

המערכת הנוכחית תופסת נישה מובחנת המוגדרת על ידי זמן תגובה מהיר, פשטות תפעולית ובטיחות ביולוגית של מח interchangeable-cartridge, מאפיינים אשר יחד הופכים את היישום לצד המיטה לאפשרי. הכללת שלושה יעדים פטרייתיים היא מאפיין חשוב במיוחד. Aspergillus spp. זוהה ב-5 מתוך 10 דגימות (טווח TP: 5.5–8 min). בהינתן המגבלות הידועות של תרביות והחלון האבחנתי המצומצם של בדיקות galactomannan עבור Aspergillus5,6, אות מולקולרי הזמין בתוך 45 min עשוי לאפשר שקילה מוקדמת יותר של טיפול אנטי-פטרייתי ממוקד, אם כי הערך הקליני של אות מוקדם זה יצטרך להיקבע במחקרים פרוספקטיביים.

מספר כיווני מחקר עתידיים ניכרים. הרחבת הפאנל כך שיכלול דטרמיננטים מרכזיים של עמידות, לכל הפחות גנים של carbapenemase ו-mecA, תסייע בגישור על הפער שבין זיהוי הפתוגן לבין בחירה אמפירית של טיפול אנטימיקרוביאלי. בנוסף, ככל שמערכי הנתונים של TP יגדלו, מודלים של למידת מכונה שאומנו על פרופילי הגברה מצומדים ומטא-נתונים קליניים עשויים לסייע בסופו של דבר בהבחנה בין קולוניזציה לזיהום ממשי, אם כי יישומים כאלה ידרשו תיקוף פרוספקטיבי קפדני. באופן רחב יותר, תהיה נחוצה הערכה רב-מרכזית באוכלוסיות ICU מגוונות גאוגרפית בטרם ניתן יהיה לראות בביצועים האבחנתיים של פלטפורמה זו ככאלה שניתן להכלילם.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

פרויקט מדע וטכנולוגיה לאומי מרכזי למחלות כרוניות לא מדבקות (מס' 2023ZD0516500), מימון למחקר קליני בבית חולים ברמה גבוהה לאומית (2026-PUMCH-A-103), תוכנית תחרות פתוחה של CMB (24-561) ותוכנית לטיפוח כישרונות של בית החולים של המכללה הרפואית של בקינג יוניון (מס' UGG11571).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מנתח חומצות גרעיניות אוטומטיBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-T80-01TurboFlow T; מבצע חלוקת ריאגנטים בצנטריפוגה, מיצוי באמצעות חרוזי מגנט, LAMP ב-65 °C, וגילוי פלואורסצנציה בזמן אמת (זמן ריצה של כ-45 min)
פיפטת פסטור חד-פעמית מס' 1Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeמתכלה חד-פעמית; 0.5 mL; להעברת דגימה הומוגנית לשפופרת ליזיס
פיפטת פסטור חד-פעמית מס' 2Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeמתכלה חד-פעמית; 2 mL; לשאיבת דגימה עד לקו הסימון לתוך שפופרת הנזלה
דיסקית CD chipBeijing Hongyang Chensheng Technology Co., LtdCustom-madeמתכלה חד-פעמית; דיסקית בקוטר 86 mm עם אזור טעינה מרכזי (נמלי O, B, S), אזור טיהור בחרוזי מגנט, וטבעת חיצונית עם 16 בארי תגובה (15 מטרות פתוגנים + בקרת פנימית NBPF)
ריאגנטים לתגובת LAMPYeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd16730ES80ריאגנטים לתגובת LAMP המאוחסנים מראש בדיסקית ה-CD chip כחרוזים ליופילים
שפופרת הנזלהBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeמתכלה חד-פעמית; 2 mL/tube; לקליטת דגימה לצורך הומוגניזציה ידנית
שפופרת ליזיסBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeמתכלה חד-פעמית; 0.5 mL/tube; גוף סיליקון דחיס עם ממברנת סינון של 200 µm; מכילה ריאגנטים לליזיס המטוענים מראש
פריימריםSangon Biotech (Shanghai) Co., LtdCustom-madeתערובת פריימרים המוטמעת בתא התגובה של ה-CD chip
מכשיר להכנה מקדימה של דגימותBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-R10-02TS-2000; מחזור הנזלה–ליזיס אוטומטי (כ-15 min)
בקבוקון למינון בודד “B”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeמתכלה חד-פעמית; ריאגנט ארוז מראש על השבב; אחד לכל בדיקה; מאוחסן ב-4 °C ומובא לטמפרטורת החדר (כ-25 °C) לפני הטעינה
בקבוקון למינון בודד “O”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeמתכלה חד-פעמית; ריאגנט ארוז מראש על השבב; אחד לכל בדיקה; מאוחסן ב-4 °C ומובא לטמפרטורת החדר (כ-25 °C) לפני הטעינה

מקורות

  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
  2. Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
  3. Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
  4. Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
  5. Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
  6. Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
  7. Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
  8. Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
  9. Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
  10. Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
  11. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  12. Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
  13. Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
  14. Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
  15. Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהומים בדרכי הנשימה התחתונותזיהוי פתוגניםשבב מיקרופלואידיטיהור חומצות גרעיןהגברה איזותרמיתמיצוי באמצעות חרוזי מגנטאבחון לצד המיטהפתוגנים בדרכי הנשימה

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.