הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול אופטימלי לטרנספקציה הפוכה להחדרת mRNA של טלומראז למפיבלובלסטים אנושיים בשלבי סנסקנס מוקדמים

126 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 באוגוסט 2026

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לטרנספקציה הפוכה למסירה יעילה של mRNA של טלומראז רברס טרנסקריפטאז אנושי (hTERT mRNA) בעל מודיפיקציית נוקליאוזיד, אל תוך פיברובלסטים אנושיים מזדקנים (senescent). ציפוי מוקדם של משטחי התרבית בקומפלקסים של hTERT mRNA-ליפיד משפר את הספיגה, ומאפשר הפעלת טלומראז, הארכת טלומרים והשבה חלקית של נעורי התאים. בסופו של דבר, התרביות חוזרות למצב של זקנה תאית או משבר (crisis) ללא הגעה לאימורטליזציה.

תקציר

הזקנה התאית (Cellular senescence) קשורה לשינויים עמוקים בפיזיולוגיה התאית, הכוללים ירידה בנזילות הממברנה, פגיעה בתעתוק אנדוזומלי, ירידה ביכולת האנדוציטוזה ועלייה בפעילות RNase חוץ-תאית, אשר כולם מעכבים מסירה יעילה של mRNA. חסמים אלו הגבילו את היישום של גישות מבוססות RNA בתאים מזדקנים, ובמיוחד עבור מסירה של תמלילי טיפוליות גדולים. פרוטוקול זה מתאר שיטת טרנספקציה הפוכה (reverse-transfection) מותאמת למסירה יעילה של RNA שליח (mRNA) מושנה לתוך פיברובלסטים אנושיים מזדקנים. למרות ש-mRNA של human telomerase reverse transcriptase (hTERT) שימש כתמליל המודל, סבב העבודהו רחב וניתן להחלה על סוגי mRNA אחרים. בניגוד לשיטות טרנספקציה קונבנציונליות, שבהן קומפלקסים של RNA-ליפיד מתווספים למצע התרבית לאחר היצמדות התאים, טרנספקציה הפוכה מניחה את הקומפלקסים על פני השטח של התרבית לפני זריעת התאים, מה שמאפשר אינטראקציה ישירה בין התאים הנצמדים לבין קומפלקסי הטרנספקציה. כדי למקסם את יעילות הטרנספקציה, הפרוטוקול משלב mRNA עם מודיפיקציות של נוקלאוזידים המכילים pseudouridine ו-5-methylcytidine, זנבות poly(A) מוארכים, תזמון מותאם ליצירת הקומפלקס, עיכוב RNase, העלאה זמנית של ה-pH האנדוזומלי באמצעות chloroquine, הגדלה של צפיפות זריעת התאים ותקופות אינקובציה מוארכות. באמצעות גישה זו, הושגה יעילות טרנספקציה של כ-50%–80% בפיברובלסטים מזדקנים בעקבות מסירה של תמליל hTERT mRNA באורך 5 kb. שיא פעילות הטלומרז נצפה 24–48 h לאחר הטרנספקציה. מחזור טרנספקציה בודד הניב הארכה מדידה של הטלומרים, בעוד ששלוש טרנספקציות רצופות הובילו להארכה משמעותית אך מוגבלת של הטלומרים. היפוך חלקי של פנוטיפים הקשורים להזדקנה היה ניתן לזיהוי בתוך 72–96 h, כולל ירידה בפעילות β-galactosidase הקשורה להזדקנה, ירידה בביטוי של p16 ו-p21, שיקום המורפולוגיה התאית והארכה של ת गृह lifespan רפליקטיבי. ה-hTERT mRNA שנמסר התפרק בתוך 72–96 h, ולא נצפתה אלמוות (immortalization). פרוטוקול זה מספק גישה מעשית למסירה זמנית של mRNA לתוך תאים מזדקנים ועשוי להיות ניתן להתאמה למגוון רחב של סוגי תאים ומינים.

מבוא

גישת הטרנספקציה ההפוכה (reverse transfection) מהווה התאמה מתודולוגית קריטית עבור תאים מזדקנים (senescent cells), אשר מתגברת על המחסומים הבסיסיים שתאים אלו מציבים בפני שיטות טרנספקציה סטנדרטיות. בניגוד לטרנספקציה רגילה (forward transfection), שבה התאים נזרעים מראש ומורשים להיקשר לפני הוספת קומפלקסי הטרנספקציה, טרנספקציה הפוכה כוללת הוספה של תאים בתליה ישירות על קומפלקסי mRNA-ליפיד של hTERT שהוכנו מראש. טכניקה זו מגבירה באופן דרמטי את יעילות הטרנספקציה בתאים מזדקנים על ידי מקסום החשיפה לקומפלקסי הטרנספקציה במהלך שלב ההיחבסות הקריטי, כאשר עיצוב הממברנה מחדש הוא בשיאו.

השינוי המושגי המרכזי בפרוטוקול הוא התייחסות לתאים מזדקנים (senescent cells) כאל בעיית הובלה ייחודית, ולא רק כגרסאות של תאים צעירים שקשה להעביר בהם טרנספקציה. בזקנה תאית, שינויים גלובליים בהרכב הליפידים של הממברנה, כולל פוספוליפידים, ספינגוליפידים וכולסטרול, משנים את נזילות הממברנה, את קימורה ואת האינטראקציות בין חלבונים לליפידים, ובמקביל תורמים לפנוטיפ הפרשתי הקשור לזקנה (SASP)1,2,3. תאים מזדקנים מראים גם הפחתה באנדוציטוזה של רצפטורים המתווכת על ידי קלתירין וקאוולאולין (caveolae) ושינוי בניתוב האנדוציטוטית, המונעים בחלקם על ידי דאון-רגולציה של amphiphysin-1 ושינויים פיצויים בביטוי של caveolin, אשר מעכבים את הספיגה והאות המתווכות על ידי רצפטורים4,5,6. במקביל, ציר האנדוזום המאוחר-ליזוזום המוסדר על ידי Rab7 והרשת האנדוזומלית-אוטופגית-ליזוזומלית (EAL) הרחבה יותר הופכות לבלתי מאוזנות, כאשר Rab7 פועל כבקר מרכזי של הבשלת האנדוליזוזום ושל היתוך אוטופגוזום-ליזוזום, תהליכים המופרעים בהזדקנות ובניוון עצבי7.

תאים מזדקנים (Senescent cells) נוטים להעלות את הביטוי של רכיבים מרובים במערכת העיבוד וההסתגלות הליזוזומלית (LYPAS), כולל ביוגנזה ליזוזומלית המונחית על ידי TFEB/TFE3 ואוטופגיה מתווכת-צ'פרון, ובכך הם מגדילים את המסה הליזוזומלית. עם זאת, ליזוזומים בודדים מראים לעיתים קרובות pH לומינלי גבוה, נזק לממברנה ויכולת פרוטאלולית משובשת, מה שתורם לתפקוד ליזוזומלי לקוי למרות השפע הגובר שלהם8,9,10,11. יחד, שינויים אלו עשויים לנתב חומרים שהופנמו ביעילות רבה יותר למסלולי פירוק אנדוליזוזומליים, ובכך להגדיל את הסבירות ש-RNA או חלבון שהגיעו לתא יפורקו לפני שיושפעו לשחרור ציטוזולי יעיל9,10,11. טרנספקציה הפוכה (Reverse transfection) מכוונת ישירות לחלון הזמן המוקדם ביותר שבו הממברנות עוברות עיצוב מחדש, במהלך ההיצמדות, ובכך היא כופה מגע מתמשך ובעל זיקה גבוהה בין התאים לבין קומפלקסים של mRNA-ליפידים, ובכך עוקפת, לפחות חלקית, אנדוציטוזה לקויה במצב יציב בתאים מזדקנים ההיצמדו באופן מלא4,5,6,12.

מבחינת תכנון ה-RNA, הפרוטוקול מניח כי בהקשר של הזדקנות, בסיס פשוט של cap + tail אינו מספיק: שינוי מלא של הנוקליאוזידים (לדוגמה, pseudouridine או N1‑methylpseudouridine בתוספת 5‑methylcytidine) נחשב למבצע הכרחי כדי לנתק את התרגום מהזיהוי על ידי קולטני Toll-like אנדוזומליים ומשרה של interferon מסוג I. עבודות יסוד הראו כי שילוב של נוקליאוזידים שעברו שינוי ב-RNA מדכא את הפעלת TLR3, TLR7 ו-TLR8 ומפחית באופן משמעותי את ייצור הציטוקינים בתאי דנדריטיים, מה שמספק בסיס מכניסטי לתגובתיות החיסונית המולדת המופחתת של פלטפורמות mRNA נוכחיות בעלות נוקליאוזידים שעברו שינוי13. סקירות עדכניות יותר של חיסוני mRNA–LNP ותרופות mRNA מדגישות הנדסה מתואמת של ה-5′ cap, ה-UTRs, הרצף המקודד וזנב ה-poly(A) כדי להגביר את היציבות והתרגום in vivo תוך מזעור הפעלת מערכת החיסון המולדת14. בפרט, אורך ומבנה זנב ה-poly(A) התגלו כגורמים מרכזיים ליציבות של mRNA המשוכתב in vitro ולתפוקת התרגום, מה שמוביל לתכנוני poly(A) מוארכים או מהונדסים ב-mRNA טיפולי15.

בנוסף לכך, הפרוטוקול כולל הגנה מפורשת מפני RNases חוץ-תאיים ואנדוזומליים במהלך היווצרות הקומפלקס והספיגה, יחד עם חלון בריחה אנדוזומלי מוגדר באמצעות סוכן ליסוזומוטרופי זמני כגון chloroquine16,17. Chloroquine משמש מזה זמן רב כגשש תפקודי של מחסומים אנדוזומליים ויכול להגביר באופן משמעותי את המעורבות עם המטרה ואת ההשתקה על ידי siRNA או אוליגנוקלאוטידים אנטיסנס, על ידי קידום הפרעה של ממברנה אנדוזומלית ובריחה של מטען חומצות הגרעין אל הציטוזול18. במקביל, דימיון של תאים חיים ודימיון ברזולוציה גבוהה (super-resolution) של mRNA המסומך על LNP הדגימו כי מסירה יעילה מוגבלת באופן חריף על ידי אירועי בריחה נדירים מאנדוזומים מוקדמים/ממחזרים, ולא על ידי הספיגה הראשונית כשלעצמה, מה שמדגיש את החשיבות של הנדסה מכוונת של שלב הבריחה האנדוזומלית עבור תרפיה מבוססת mRNA19.

בסך הכל, שינויים אלו הקשורים להזדקנות התאים (senescence) בדינמיקה של הממברנה, בתעתוק אנדוציטי, בעיבוד ליסוזומלי ובפעילות המערכת החיסונית המולדת, יוצרים מחסומים משמעותיים למסירה יעילה של mRNA. אסטרטגיית התעתוק ההפוך (reverse-transfection) המתוארת כאן פותחה כדי להתגבר על מגבלות אלו על ידי שילוב של הנדסת mRNA מותאמת, הגנה מפני RNase, שיפור הבריחה מהאנדוזומים וחשיפה ישירה של תאים נצמדים לקומפלקסים מוכנים מראש של mRNA-ליפידים. למרות ש-hTERT mRNA משמש כמטען המודלי, זרימת העבודה ישימה באופן רחב למסירה של טרנסקריפטים תרפויטיים גדולים אחרים של mRNA לאוכלוסיות של תאים מזדקנים ותאים שקשה להעביר בהם טרנספקציה20,21,22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תעתוק In vitro של hTERT mRNA

  1. transcription In vitro (IVT) באמצעות ARCA ו-ΨUTP
    1. הכינו תגובת IVT בנפח 20 µL בהתאם ל-טבלה 1. הגדילו את כמות הרכיבים באופן ליניארי אם נדרשת תנובה גבוהה יותר.
    2. שלבו את כל רכיבי התגובה, למעט T7 RNA polymerase, במבחנה נקייה מ-RNase. הוסיפו את ה-T7 RNA polymerase אחרון, ערבבו בעדינות וסובבו את המבחנה קצרה בצנטריפוגה.
    3. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 0.5–4 שעות.
      הערה: התאימו את זמן הדגירה לאורך התבנית. דגרו תגובות המכילות תבניות קצרות (כ-500 bp) למשך כ-30 דקות ותגובות המכילות תבניות ארוכות יותר (כ-4 kb) למשך 3–4 שעות.
  2. טיפול ב-DNase
    1. הוסיפו 1 µL של DNase I נקי מ-RNase ישירות לתערובת תגובת ה-IVT.
    2. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.
      הערה: יש לבצע את הטיפול ב-DNase ישירות בתגובת ה-IVT ללא טהרה מוקדמת של ה-mRNA המסנתז.
  3. טהרת mRNA
    1. הוסיפו 115 µL של H₂O נקי מנוקלאז כדי לדלל את תערובת התגובה.
    2. טהרו את ה-mRNA באמצעות ערכה לניקוי RNA בהתאם להוראות היצרן.
    3. בצעו אלוטציה (elution) ל-mRNA המטוהר ב-20–30 µL של H₂O נקי מנוקלאז.
    4. מדדו את טוהר ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטריה ואמתו את שלמות ה-RNA באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז דנטורטיבי בריכוז 1.0–1.5% או ג'ל פוליאקרילאמיד בריכוז נמוך.
  4. הוספת זנב Poly(A)
    1. הכינו תגובת poly(A)-tailing בנפח 50 µL בהתאם ל-טבלה 2. ערבבו בעדינות את רכיבי התגובה ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30–60 דקות.
      הערה: התאימו את זמן הדגירה לכמות ה-RNA המוכנס.
    2. סיימו את התגובה על ידי הוספה של 2 µL של EDTA בריכוז 0.5 M (pH 8.0).
  5. טהרה סופית ובקרת איכות
    1. טהרו את ה-mRNA עם זנב ה-poly(A) באמצעות ערכה לניקוי RNA בהתאם להוראות היצרן.
    2. בצעו אלוטציה ל-mRNA המטוהר ב-20–30 µL של H₂O נקי מנוקלאז.
    3. העריכו את איכות ה-mRNA לפני המעבר לטרנספקציה
      1. מדדו את ריכוז ה-mRNA באורך גל של 260 nm וקבעו את הטוהר באמצעות היחסים A260/A280 ו-A260/A230. השתמשו בתכונות mRNA עם ערכי A260/A280 של כ-2.0 וערכי A260/A230 הגבוהים מ-2.0.
      2. העריכו את שלמות ה-mRNA באמצעות אלקטרופורזה בג'ל או מערכת ניתוח RNA בהתאם להוראות היצרן.
      3. אמתו את אורך זנב ה-poly(A) באמצעות RT-PCR או ניתוח ב-Bioanalyzer. ודאו שאורך זנב ה-poly(A) הוא בין 120 ל-200 נוקליאוטידים.
      4. חלקו את ה-mRNA המטוהר לאליקוואוטים (aliquots) ואחסנו אותם בטמפרטורה של −80 °C כדי לצמצם מחזורי הקפאה-הפשרה.

2. טרנספקציה הפוכה

  1. יום 1-: הכנה לפני טרנספקציה
    1. אימות הפנוטיפ הסנסנטי (senescent phenotype)
      1. בצעו צביעת β-galactosidase המשויכת לסנסנציה (SA-β-gal) על דגימת תאים מייצגת. ודאו כי יותר מ-70% מהתאים חיוביים.
      2. אשרו את הביטוי של סמני סנסנציה (p16 ו-p21) באמצעות qRT-PCR או אימונופלואורסצנציה.
      3. קבעו את חיוניות התאים וודאו שהחיוניות עולה על 90%.
    2. הכנת ריאגנטים
      1. חממו מראש מצע גידול מלא ל-37 °C.
      2. חממו מראש סליין בבופר פוספט (PBS) ל-37 °C.
      3. הכינו מצע Opti-MEM I טרי.
        הערה: אין להוסיף מעכב RNase למצע Opti-MEM I לפני השימוש.
  2. יום 0: יום הטרנספקציה
    הערה: הקצילו כ-3 שעות מהכנת הריאגנטים ועד לדגירה של התאים שעברו טרנספקציה.
    1. הכנת hTERT mRNA
      1. המיסו את ה-hTERT mRNA על קרח. מדדו את ריכוז ה-mRNA והשתמשו בהכנות בעלות ריכוזים שבין 0.5 ל-1.0 µg/µL.
      2. דללו את הכמות הרצויה של hTERT mRNA במצע Opti-MEM I בהתאם לפורמט התרבית שבו נעשה שימוש (טבלה 3). הוסיפו מעכב RNase לריכוז סופי של 0.5–1.0 U/µL וערבבו בעדינות.
      3. שמרו את ה-mRNA המדולל על קרח עד ליצירת הקומפלקס.
        הערה: הוסיפו מעכב RNase רגע לפני השימוש. אין לאחסן mRNA עם מעכב RNase, מכיוון שפעילותו יורדת לאחר הקפאה.
    2. הכנת ריאגנט הטרנספקציה
      1. שלבו 6.0 µL של ריאגנט טרנספקציה עם 100 µL של Opti-MEM I במבחנה סטרילית נקייה מ-RNase. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטור.
      2. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
        הערה: עבור מבני hTERT mRNA גדולים (~5 kb), אופטימיזו את יחסי הריאגנט ל-mRNA לטווח שבין 0.4 ל-0.6 µL ריאגנט לכל 100 ng mRNA.
    3. יצירת קומפלקס mRNA-ליפיד
      1. הוסיפו את תמיסת hTERT mRNA המדוללת (100 µL) לתמיסת ריאגנט הטרנספקציה המדוללת (106 µL). ערבבו בעדינות על ידי פיפטור 5–6 פעמים.
      2. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות.
      3. אין לחרוג מ-30 דקות של יצירת קומפלקסים.
      4. אשרו את הצלחת יצירת הקומפלקס על ידי הופעת תמיסה עכורה קלות.
        הערה: בצעו את הכנת התאים במהלך תקופת יצירת הקומפלקס.
    4. הכנת תאים לטרנספקציה הפוכה (reverse transfection)
      1. שאבו את מצע הגידול מתרביות תאים סנסנטיות.
      2. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש (2 mL לכל באר בלוח של 6 בארות).
      3. הוסיפו 500 µL של 0.05% trypsin-EDTA לכל באר.
      4. דגרו את התאים ב-37 °C למשך 3–5 דקות.
      5. נטרלו את הטריפסין עם 3 mL של מצע מלא המכיל סרום.
      6. בצעו טריטורציה עדינה לתאים כדי לקבל תמיחת תאים בודדים.
      7. קבעו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי.
      8. הכינו תמיחה המכילה 2.0–2.5 × 105 תאים לבאר במצע מלא.
        הערה: הימנעו מטריפסינציה ממושכת מכיוון שתאים סנסנטיים רגישים מאוד למעמקה מכני. שמרו את התאים בתמיחה; אין לזרוע אותם לפני הטרנספקציה ההפוכה.
    5. טרנספקציה הפוכה
      1. הכנת לוח התרבית
        1. הוסיפו 500 µL של 0.01% poly-L-lysine לכל באר בלוח של 6 בארות ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        2. שאבו את תמיסą הציפוי רגע לפני השימוש.
        3. הוסיפו 200 µL של קומפלקס hTERT mRNA-ליפיד למרכז כל באר.
        4. דגרו את הלוח ב-37 °C וב-5% CO₂ למשך 30 דקות.
          הערה: בצעו את ציפוי הלוח במקביל ליצירת הקומפלקס ולהכנת התאים.
      2. הכנת תמיחת התאים
        1. השעו 2.0–2.5 × 105 תאים ב-1800 µL של מצע מלא ללא אנטיביוטיקה.
        2. השעו את התאים בעדינות כדי לקבל תמיחת תאים בודדים אחידה.
          הערה: השתמשו במצע ללא אנטיביוטיקה במהלך הטרנספקציה.
      3. זריעת תאים על הקומפלקסים
        1. הוסיפו 1800 µL של תמיחת התאים ישירות על קומפלקסי ה-hTERT mRNA-ליפיד שהוכנו מראש.
        2. הטו בעדינות את הלוח 2–3 פעמים לכל כיוון כדי לפזר את התאים באופן שווה.
          הערה: אין להשתמש בפיפטור לתמיחה לאחר הוספת התאים, שכן הדבר עלול לשבש את קומפלקסי ה-mRNA-ליפיד.
      4. דגירת תאים
        1. דגרו את התאים ב-37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ למשך 6–8 שעות.
        2. עקבו אחר היצמדות התאים באמצעות מיקרוסקופ אור 2–3 שעות לאחר הטרנספקציה.
        3. וודאו שהתאים מפוזרים באופן שווה ומתחילים להיצמד למשטח התרבית.
          הערה: מספר מופרז של תאים צפים או שיירי תאים עשוי להעיד על ציטוטוקסיות הקשורה לטרנספקציה.

3. הפחתת ציטוטוקסיות

  1. קצרו את תקופת החשיפה לטרנספקציה ל-48 h אם אובדן התאים עולה על 20%.
  2. הוסיפו לתרביות 10 µM של מעכב ROCK Y-27632 במהלך תקופת הטרנספקציה כדי לשפר את הישרדות התאים.
  3. לאחר 6–8 h של טרנספקציה, שאבו בזהירות את מצע הטרנספקציה תוך מזעור הפרעת התאים המחוברים חלקית. השאירו כ-100 µL של מצע שארי בכל באר.
  4. הוסיפו לכל באר 1 mL של מצע גידול מלא טרי שחומם מראש ותומlyה ב-15% FBS.
  5. הוסיפו כלורוכין (chloroquine) לריכוז סופי של 10–20 µM מיד לאחר החלפת המצע.
  6. דגרו את התרביות למשך 2 h נוספות ב-37 °C באינקובטור לח המכיל 5% CO₂.
  7. החליפו את המצע המכיל כלורוכין במצע גידול מלא טרי.
  8. החזירו את התרביות לאינקובטור להמשך גידול.
    הערה: עקבו אחר מורפולוגיית התאים וחיוניותם לאורך תקופת ההתאוששות. התנתקות מוגברת של תאים או נוכחות שיירי תאים עשויות להעיד על ציטוטוקסיות הקשורה לטרנספקציה.

4. ניתוח לאחר טרנספקציה

  1. הערך את ביטוי חלבון TERT כ-24–48 שעות לאחר הטרנספקציה.
  2. מדוד את רמות חלבון TERT באמצעות western blotting או צביעת immunofluorescence בהתאם לנהלי מעבדה סטנדרטיים.
  3. מדוד את פעילות הטלומרז במהלך אותו פרק זמן באמצעות בדיקת פעילות טלומרז מתאימה.
    הערה: פעילות הטלומרז יורדת בדרך כלל לאחר 48 שעות עקב פירוק של mRNA של hTERT שהועבר באופן זמני.
  4. הערך את אורך הטלומרים 48–72 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות monochrome multiplex quantitative PCR (MMqPCR) או שיטה מקבילה לניתוח אורך טלומרים.
    הערה: ניתן להבחין בהארכה של הטלומרים בעקבות העברה מוצלחת של mRNA של hTERT.
  5. הערך פנוטיפים הקשורים להזדקנות (senescence) ולהצהרה מחדש (rejuvenation) 7 ימים לאחר הטרנספקציה
    1. מדוד את פעילות β-galactosidase הקשורה להזדקנות (SA-β-gal).
    2. מדוד את רמות הביטוי של p16 ו-p21.
    3. הערך את ביטוי Ki67.
    4. בחן את המורפולוגיה התאית באמצעות מיקרוסקופיה של אור.
      הערה: השווה בין תרבויות שעברו טיפול לבין בקרים מזדקנים שלא טופלו או שעברו טרנספקציה דמה (mock-transfected), כדי להעריך שינויים בפנוטיפים הקשורים להזדקנות ובמאפיינים פרוליפרטיביים.

5. פרוטוקול למתן מינונים חוזרים (אופציונלי)

  1. בצעו את הטרנספקציה הראשונית כפי שמתואר בסעיפים 2–4.
  2. חזרו על הטרנספקציות לפי לוח הזמנים הבא: יום 0: טרנספקציה ראשונה; יום 5: טרנספקציה שנייה; ימים 10–12: טרנספקציה שלישית.
  3. שמרו על התאים כתרביות צמיחה צמודות (adherent) ואל תבצעו טריפסיניזציה לפני טרנספקציות עוקבות.
  4. הכינו קומפלקסים טריים של hTERT mRNA–ליפיד כפי שמתואר בסעיפים 2.2.1–2.2.3.
  5. שאבו את מצע התרבית מכל באער.
  6. הוסיפו 200 µL של קומפלקסים של hTERT mRNA–ליפיד ישירות לכל באער.
  7. הוסיפו 800 µL של מצע F-10 מלא וטרי מיד לאחר הוספת הקומפלקסים.
  8. דגרו את התאים למשך 4–6 h בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂.
  9. החליפו את מצע הטרנספקציה במצע מלא וטרי.
    הערה: הגבילו את הטיפול למקסימום שלושה מחזורי טרנספקציה כדי למזער ציטוטוקסיות מצטברת הקשורה לטרנספקציה.

6. פרוטוקול טרנספקציה קדימה (2 µg/mL, פורמט של 6 באריים)

  1. יום 1-: זריעת תאים
    1. נתקו פיברובלסטים מזדקנים או בשלב התחלה של הזדקנות באמצעות 0.05% trypsin-EDTA.
    2. נטרלו את ה-trypsin באמצעות מצע תרבית מלא.
    3. קבעו את מספר התאים ואת חיוניותם.
    4. זַרְעו את התאים בלוחיות 6-well בצפיפות של 2.0–2.5 × 105 תאים לבאר.
    5. דגרו את התאים למשך לילה ב-37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂ עד שיגיעו לכ-60–80% התמזגות (confluence).
  2. יום 0: הכנת קומפלקסים של hTERT mRNA–reagent
    1. הפשירו מנה של hTERT mRNA עם מודיפיקציית נוקליאוזידים על קרח.
    2. דללו hTERT mRNA ב-Opti-MEM לריכוז סופי של 2 µg/mL במבחנה סטרילית נטולת RNase (מבחנה A).
    3. הוסיפו למבחנה A מעכב RNase לריכוז סופי של 0.5–1.0 U/µL וערבבו בעדינות.
    4. דללו את ריאגנט הטרנספקציה ב-Opti-MEM במבחנה שנייה נטולת RNase (מבחנה B), תוך שימוש ב-0.4–0.6 µL ריאגנט לכל 100 ng mRNA.
    5. הוסיפו את תכולת מבחנה B בטיפות למבחנה A תוך ערבוב עדין.
    6. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15–20 דקות.
  3. יום 0: טרנספקציה קדמית (Forward transfection)
    1. וודאו כי התאים נמצאים ב-60–80% התמזגות ומראים מורפולוגיה בריאה.
    2. שאבו את מצע התרבית.
    3. שטפו את התאים פעם אחת עם 1–2 mL של PBS שחומם מראש.
    4. הוסיפו 0.5 mL של מצע מלא או מצע עם ריכוז סרום מופחת, שחומם מראש, לכל באר.
    5. ניתן להוסיף באופן רשות chloroquine לריכוז סופי של 10–20 µM.
    6. הוסיפו 0.5 mL של קומפלקסי hTERT mRNA–reagent שהוכנו בשלב 6.2.6 לכל באר.
    7. נערו בעדינות את הלוחית כדי להפיץ את הקומפלקסים באופן שווה.
    8. דגרו את התאים למשך 4–6 שעות ב-37 °C באינקובטור לחה המכיל 5% CO₂.
      ​הערה: במידת הצורך, האריכו את תקופת הדגירה ל-6–8 שעות עבור תאים מזדקנים.
    9. שאבו את מצע הטרנספקציה.
    10. הוסיפו 2.0 mL של מצע מלא טרי לכל באר.
    11. בצעו אנליזות לאחר הטרנספקציה כמתואר בסעיף 4.
      הערה: השתמשו באותה סדרת hTERT mRNA, באותו ריאגנט טרנספקציה ובאותו מינון נומינלי בעת השוואת תנאי טרנספקציה קדמית לעומת טרנספקציה הפוכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ה-modRNA מסוג d2EGFP-T2A-hTERT הונדס כמסגרת קריאה פתוחה (ORF) היברידית, שבה רפורטר EGFP לא יציב (d2EGFP) קושר ל-TERT אנושי באמצעות פפטיד T2A בעל יכולת פיצול עצמי. הרצפים המלאים של הנוקלאוטידים והחלבונים עבור כל המבנים מופיעים ב-Supplementary File 1. רצף הקידוד הוקף על ידי אזור שאינו מתורגם (UTR) סינתטי ב-5′ ועל ידי ה-3′ UTR של β-globin אנושי כדי להגביר את יעילות התרגום ואת יציבות ה-mRNA (איור 1A). קסטת הביטוי הכילה גם רצף מייצב אנזימם סינתטי (Es) ורצף מגביר שעתוק סינתטי (TEs...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מגדיר מחדש את ההזדקנות התאית (cellular senescence) כבעיית הובלה (delivery) מובחנת, ולא כווריאציה מינורית של פיזיולוגיה פרוליפראטיבית, ומפתח אסטרטגיית טרנספקציה של mRNA של טלומראז המותאמת למגבלות הביופיזיות והאימונולוגיות של המצב הסנסנטי. תאים סנסנטיים מציגים ממברנות נוקשות ועשירות כולסטרול ופעילות אנדוציטית מופחתת, המהוות מחסום משמעותי להובלה יעילה של חומצות גרעיניות. על ידי אימוץ גישת טרנספקציה הפוכה (reverse-transfection), פרוטוקול זה מנצל את תקופת ההיצמדות החולפת שבה התאים הסנסנטיים עוברים עיצוב מחדש של הממברנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

J.M.S. הוא מייסד שותף ויו"ר ה-SAB של Transposon Therapeutics.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מספרים P01 AG051449, R01 AG016694, ו-R01 AG078925 שניתנו ל-JS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher11550043מדיה לתרבית תאים.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England BiolabS1411Lעבור רוב ה-RNAs, מבנה ה-cap מגביר את היציבות, מפחית את הרגישות לפירוק על ידי exonuclease ומקדם את היווצרותם של קומפלקסים של התחלה של mRNA.
5-Methyl-Cytidine-5´-Triphosphate (5-Methyl-CTP)New England BiolabN0432SNTPs משוכשכים משמשים בדרך כלל להפחתת אימונוגניות עבור RNA בשעתוק in vitro.
6 Well PlateCorning351146לגידול וטיפול בנפחים בינוניים עד גדולים של תאים נצמדים או תאים בתליה בתנאים ניסיוניים נפרדים.
Anti-Ki67 antibody (SP6)abcamab16667Ki67 מובע בעיקר בתאים הנמצאים בשלב התרבשות.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal Staining) cellbiolabsCBA-230 זיהוי של תאים מזדקנים (senescent) באמצעות בדיקת צביעת SA-β-gal
DNA LoBind 0.5ml TubesEppendorf 022431005להשבה יעילה של DNA ו-RNA ללא אובדן
DNA LoBind 1.5ml TubesEppendorf22431021להשבה יעילה של DNA ו-RNA ללא אובדן
DNase I, RNase-free (1 U/μL)Thermo FisherEN0521DNase I, RNase-free הוא endonuclease המעכל DNA בעלי גדילה אחת או שתיים. 
E. coli Poly(A) PolymeraseNew England BiolabM0276Sב-Escherichia coli, Poly(A) Polymerase I (PAP I) מתפקד בעיקר כזרז להוספה שאינה תלוית תבנית של שארי אדנוזין מונופוספיה (AMP) לקצה ה-3' של מולקולות RNA.
Fetal Bovine SerumThermo FisherA5256701תוסף סרום לתרבית תאים 
HiScribe T7 ARCA mRNA KitNew England BiolabE2065Sערכת HiScribe T7 ARCA mRNA (עם tailing) תוכננה לייצור מהיר של mRNA עם cap מסוג ARCA וזנב poly(A) in vitro. mRNA עם cap מסנתזים על ידי שילוב קו-טרנסקריפציונלי של Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) באמצעות T7 RNA Polymerase.
HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AGNew England BiolabE2080Sערכות HiScribe T7 mRNA עם CleanCap Reagent AG מאפשרות ייצור מהיר ויעיל של תמליל אחד או רבים, עם תפוקות טיפוסיות של ≥90 μg לריאקציה,
LongAmp Hot Start Taq DNA PolymeraseNew England BiolabM0534SLongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase מציע ביצועים יוצאי דופן עם amplicons ארוכים.
M-MuLV Reverse TranscriptaseNew England BiolabM0253LM-MuLV Reverse Transcriptase מסנתז גדיל DNA משלים המתחיל מפריימר, תוך שימוש ב-RNA (סינתזה של cDNA) או ב-DNA בעל גדיל אחד כתבנית.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)New England BiolabT2040Lהתפקיד העיקרי של ערכת Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) הוא לטהר ולרכז עד 50 μg של RNA באיכות גבוהה מתגובות אנזימטיות או מתערובות מיצוי.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabE2621LNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix מאפשר הרכבה חלקה של מספר מקטעי DNA, ללא קשר לאורך המקטעים או לתאימות הקצוות. הוא שימושי עבור קהילת הביולוגיה הסינתטית, וכן לשיクלונינג של מספר מקטעים בשלב אחד הודות לקלות השימוש, לגמישות ולפורמט ה-master-mix הפשוט. 
Opti-MEM -Reduced Serum MediumThermo Fisher31985070למקסום יעילות טרנספקציית תאים במהלך היווצרות קומפלקס ליפיד-מטען. הוא משמש כסביבה מוגדרת כימית ואופטימלית השומרת על חיוניות גבוהה של תאי יונקים תוך הפחתת הצורך בתוספת סרום סטנדרטית
PBS, pH 7.4Thermo Fisher10010023השימוש התפקודי העיקרי של Phosphate-Buffered Saline (PBS) ב-pH 7.4 הוא שמירה על pH יציב ואיזון אוסמוטי עבור תאי יונקים ומולקולות ביולוגיות.
PCR StripsThermo FisherAB0776השימוש התפקודי העיקרי של מבחנות PCR ברצועות (בדרך כלל בפורמט של 8 או 12 מבחנות) הוא החזקת תגובות נוזליות בנפחים קטנים במהלך מחזורי תרמיים בעוצמה גבוהה.
Poly-L-Lysine HydrobromideMillipore SigmaP4707-50MLהשימוש התפקודי העיקרי של Poly-L-Lysine (PLL) Hydrobromide להיספח תאים הוא ציפוי משטחים מוצקים בעלי מטען שלילי (כגון זכוכית או פלסטיק) ליצירת מצע דביק מאוד בעל מטען חיובי.
Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP- ΨUTP)New England BiolabN0433SPseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP) משמשים בדרך כלל להפחתת אימונוגניות עבור RNA בשעתוק in vitro.
Ribonucleotide Solution SetNew England BiolabN0450Lארבעה תמיסות נפרדות של ATP, GTP, CTP ו-UTP
ROCK inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)Stem cell technologies72302Y-27632 הוא מעכב חדיר-תאים, רב-עוצמה וסלקטיבי של Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Y-27632 מעכב הן את ROCK1 (Ki = 220 nM) והן את ROCK2 (Ki = 300 nM) על ידי תחרות עם ATP על קישור לאתר הקטליטי 
RT-PCR Grade WaterThermo FisherAM9935השימוש התפקודי העיקרי של RT-PCR Grade Water (המסומן לעיתים כ-Nuclease-Free Water) הוא לשמש כממס אולטרה-טהור עבור בדיקות אנזימטיות רגישות שבהן כל זיהום עלול לפרק את הדגימה או לעכב את ההגברה.
SUPERase·In RNase Inhibitor Thermo FisherAM2694SUPERase In RNase Inhibitor הוא מעכב מבוסס חלבון ממקור שאינו אנושי, הנקשר באופן לא-קוולנטי ומעכב את ה-RNases הנפוצים והבעייתיים ביותר, כולל RNase A, B, C, 1, ו-T1.
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainThermo FisherS7563השימוש התפקודי העיקרי של SYBR™ Green I Nucleic Acid Gel Stain הוא ויזואליזציה וכימות של DNA דו-גדילי (dsDNA) בג'לים של agarose או polyacrylamide.
TransIT-mRNA Transfection KitMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250ריאגנט טרנספקציה בעל יעילות גבוהה ורעילות נמוכה עבור RNA גדול
TRAPeze Telomerase Detection KitMillipore Sigma S7700 בדיקת TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) היא שיטה מבוססת PCR נפוצה ורגישה לזיהוי ומדידה של פעילות טלומראז בתאי יונקים ובדגימות רקמות. היא כוללת שלושה שלבים עיקריים: הארכה של חזרות טלומריות על ידי טלומראז, הגברה של תוצרים אלה באמצעות PCR, וזיהוי עוקב.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300054לניתוק תאי יונקים נצמדים מכלי תרבית במהלך מעבר תאים שגרתי (subculturing) ואיסוף.

מקורות

  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פיברובלסטים מזדקניםmRNA של hTERTmRNA עם מודיפיקציית נוקליאוזידיםעיכוב RNaseמודולציה של pH אנדוזומליהארכת טלומריםתוחלת חיים רפליקטיבית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.