ביטוי יתר מאולץ של miR-486-3p מדכא פעילות הקשורה לשגשוג, גדילה קלונוגנית, סגירת פצע ומעבר במטריג'ל (Matrigel) בתאי אדנוקרצינומה של הריאה מסוג A549 ו-H358. השפעות אלו נלוות להפחתה בביטוי של WNT5B, DVL1, β-catenin ו-BCL-2, דבר המצביע על קשר in vitro לשינויים הקשורים למסלול Wnt, ללא ביסוס של מטרה ישירה או סיבתיות של המסלול.
מאמר מחקר
miR-486-3p מדכא פנוטיפים ממאירים ומקושר להפחתה בביטוי של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin בתאי אדנוקרצינומה של הריאה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) היא הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים, והיא נותרת קשורה לתחלואה ותמותה משמעותיות. מחקרים קודמים זיהו תפקודים מדכאי-גידול של miR-486-3p ב-LUAD, אך הקשר שלו לשינויים בביטוי של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin לא הוגדר באופן ברור. כאן, נבדקה שפעות הבסיס של miR-486-3p בתאי LUAD מסוג A549 ו-H358, והיא הושוותה לזו של תאי אפיתל ברונכיאליים מסוג Beas-2b שנשמרו בתנאי השגרה שלהם. מודלים עם ביטוי-יתר יציב של miR-486-3p נוצרו באמצעות טרנסדוקציה לנטיויריאלית. פעילות הקשורה לצמיחת תאים, צמיחה קלונוגנית, סגירת פצע ומעבר דרך ממברנות מצופות ב-Matrigel הוערכו באמצעות Cell Counting Kit-8, בדיקת יצירת מושבות, בדיקת ריפוי פצעים ובדיקות Transwell. שפעות החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin ו-BCL-2 נמדדה באמצעות Western blotting, ורמות mRNA של WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2 נבחנו בנוסף באמצעות RT-qPCR. תחת תנאי התרבית ששימשו במחקר, שפעות ה-miR-486-3p הייתה נמוכה יותר בתאי A549 ו-H358 מאשר בתאי Beas-2b, וטרנסדוקציה לנטיויריאלית הניבה ביטוי-יתר יציב בשני קווי תאי ה-LUAD. ביטוי-יתר כפוי של miR-486-3p הפחית את אות ה-CCK-8, את יצירת המושבות, את סגירת הפצע ואת המעבר דרך ממברנות מצופות ב-Matrigel, ולווה בשפעות נמוכה יותר של החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin כולל ו-BCL-2. RT-qPCR הראה בנוסף שפעות נמוכה יותר של תמלילי WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2 בשני קווי תאי ה-LUAD לאחר ביטוי-יתר של miR-486-3p. ממצאים אלו תומכים בקשר in vitro בין ביטוי כפוי של miR-486-3p, החלשה של מספר מדדי תאים ממאירים ושינוי בביטוי הקשור ל-Wnt; עם זאת, הם אינם מבססים קישור ישיר בין miRNA למטרה, פעילות של מסלול או מנגנון איתות ליניארי סיבתי.
מבוא
אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) היא תת-הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC), והיא תורמת באופן משמעותי לתחלואה ולתמותה הקשורות לסרטן הריאה ברחבי העולם1,2,3,4,5. סיווג מולקולרי וטיפולים ממוקדים שיפרו את התוצאות עבור קבוצות נבחרות של חולים, אך LUAD בשלבים מתקדמים נותר קשה לטיפול והוא הטרוגני מבחינה ביולוגית1,2,3,4,5. לפיכך, הגדרת תהליכים רגולטוריים התורמים להתנהגות של תאים ממאירים נותרת רלוונטית לפיתוח היפותזות טיפוליות הניתנות לבחינה.
סיגנליזציית Wnt כוללת ענפים תלויים ב-β-catenin וענפים בלתי תלויים ב-β-catenin המווסתים proliferace, הישרדות, פולריות וניידות6,7,8,9. WNT5B מקושר לרוב לסיגנליזציה לא קנונית, אם כי השפעותיו הביולוגיות משתנות בהתאם לקולטן ולהקשר התאי10,11. DVL1 הוא חלבון העברת אותות ציטופלזמי המשותף למספר ענפי Wnt, והוא נקשר להתנהגות הקשורה ל-β-catenin בסרטן הריאה12. בהתאם לכך, אין לפרש שינויים מקבילים ב-WNT5B, DVL1 ו-β-catenin כראיה למסלול ליניארי יחיד כשלעצמם.
מיקרו-RNAs (miRNAs) הם RNAs קצרים שאינם מקודדים המווסתים ביטוי גנים באמצעות אינטראקציות תלויות-רצף עם תמלילי מטרה13,14,15. מכיוון ש-miRNA אחד עשוי להשפיע על מספר RNAs, שפעות משתנות של miRNA יכולות להשפיע על פנוטיפים מגוונים הקשורים לגידולים סרטניים13,14,15,16,17,18. מספר miRNAs נקשרו לצמיחה, ניידות ואיתות של סרטן ריאה, וקשרי גומלין (crosstalk) בין miRNAs לרשתות הקשורות ל-Wnt תוארו במספר הקשרי סרטן16,17,18,19,20.
הלוקוס MIR486 יוצר את הגדילים הבשלים miR-486-3p ו-miR-486-5p. miR-486-3p הפגין פעילות של דיכוי גידולים בסרטן הפה ובגליובלסטומה, בעוד שהשפעה מעודדת גידולים דווחה בקרצינומה של תאי קשקשת בעור21,22,23,24,25. miR-486-3p נבחר למחקר הנוכחי באמצעות אסטרטגיה מונחית-היפותזה, המבוססת על שפעו המופחת בנתוני LUAD ציבוריים, על פעילותו של דיכוי גידולים שדווחה בעבר ב-LUAD, ועל תחזיות ביואינפורמטיות הקושרות אותו לטרנסקריפטים מועמדים הקשורים ל-WNT. Tomioka וחב' הדגימו השפעות של דיכוי גידולים של שני גדילי miR-486 ב-LUAD וזיהו את GINS4 באמצעות סריקת מטרות גנומית רחבה26. לפיכך, המחקר הנוכחי אינו טוען להדגמה הראשונה של פנוטיפ אנטי-גידולי. במקום זאת, הוא בוחן האם ביטוי מאולץ של miR-486-3p מלווה בשינויים בשפע של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin ובשינויים פנוטיפיים ניתנים לשחזור בשתי שורות תאים של LUAD. ניתוחים אלו מעריכים קשרים ואינם מבססים מיקוד ישיר, פעילות של מסלול, או מנגנון ליניארי של WNT5B/DVL1/β-catenin.
פרוטוקול
הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
תרבית תאים
במחקר נעשה שימוש בשורות תאי אדנוקרצינומה של הריאה האנושית (LUAD) A549 ו-H358, ובשורה של תאי אפיתל ברונכיאליים מונצחים Beas-2b. תאי A549 (KRAS G12S) ו-H358 (KRAS G12C; חסרי STK11) נבחרו כמודלים נפוצים של LUAD בעלי רקעים שונים של מוטציות ב-KRAS, בעוד ש-Beas-2b נכלל כביקורת של תאי אפיתל ברונכיאליים שאינם ממאירים. תאי A549 ו-H358 גודלו במצע RPMI-1640, ותאי Beas-2b גודלו במצע DMEM; כל מצע הכיל 10% fetal bovine serum ו-1% penicillin-streptomycin. התאים תורגלו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. כיוון ששורות התאים של הגידול ותאי הביקורת האפיתליאליים גודלו במצעי שגרה שונים, השוואות של ביטוי בסיס בין שורות התאים השונות פורשו בזהירות.
טרנסדוקציה לנטיבית ובחירת תאים יציבים
וקטורים לנטיביריאליים הנושאים את רצף הקדם של hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) או רצף בקרה שלילי מקומבנ (LV-NC) שימשו בתכנון של הגברה יציבה של תפקוד (stable gain-of-function). תאי A549 ו-H358 נזרעו בלוחות של 6 בארות בריכוז של 5 × 104 תאים/בארת וגודלו למשך לילה. למחרת, התאים נחשפו ללנטיבירוס בריבוי זיהום (MOI) של 10 בנוכחות של 8 µg/mL polybrene. לאחר 24 h, הוחלף התחליל הוויראלי במצע גידול מלא וטרי. תאים שעברו טרנסדוקציה נבחרו באמצעות 2 µg/mL puromycin למשך 7 ימים. לאחר הבחירה, התאים ששרדו הושארו להתאושש והורחבו לצורך הבדיקות המולקולריות והתפקודיות העוקבות. לא נכלל זרוע של מעכב miR-486-3p מכיוון שהמחקר הנוכחי תוכנן ספציפית כדי להעריך את ההשפעות של ביטוי יתר מאולץ ויציב.
הערה: יש לשמור על MOI, זמן החשיפה לפוליברן (polybrene) ותנאי הסלקציה בפיורומיצין (puromycin) זהים בין קבוצות ה-LV-NC וה-LV-miR-486-3p, כדי לצמצם הבדלים בחיוניות התאים הקשורים לטיפול.
RT-qPCR
ביצוע RT-qPCR נועד לקבוע את רמות הביטוי של miR-486-3p ולאשר את יעילות הביטוי העודף (overexpression) באמצעות לנטי-וירוס בתאי A549 ו-H358. RNA כולל בודד באמצעות ריאגנט TRIzol בהתאם להוראות היצרן. ריכוז ה-RNA וטוהרו הוערכו באופן ספקטרופוטומטרי, כאשר יחס A260/A280 של 1.8–2.1 נחשב לקביל. לצורך ניתוח mRNA, 1 µg של RNA כולל עבר שעתוק הפוך ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית לסינתזת cDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. לצורך ניתוח microRNA, סינתזת ה-cDNA בוצעה באמצעות פריימר לשעתוק הפוך מסוג stem-loop הספציפי ל-miRNA. ה-Quantitative PCR בוצע בנפח תגובה כולל של 20 µL המכיל 10 µL של 2× SYBR Green Master Mix, 0.4 µM מכל פריימר ו-2 µL של תבנית cDNA. פרוטוקול ההגברה כלל שלב דנטורציה ראשוני ב-95 °C למשך 5 min, ולאחריו 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 10 s ואנילינג/הארכה ב-60 °C למשך 30 s. לאחר מכן בוצע ניתוח עקומת התכה (melting curve analysis) כדי לאמת את סגוליות ההגברה. RNA גרעיני קטן מסוג U6 שימש כביקורת פנימית לכימות ה-miRNA, בעוד ש-GAPDH שימש כגן ייחוס לנרמול ה-mRNA. רמות ביטוי יחסיות נקבעו באמצעות שיטת 2−ΔΔCq.
רצפי הפריימרים של ה-miRNA היו כדלקמן: פריימר לשיעתוק הפוך במבנה לולאה-גבעול (stem-loop), 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; פריימר קדימה (forward) ל-miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; פריימר אחורה (reverse) אוניברסלי, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; פריימר קדימה ל-U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; ופריימר אחורה ל-U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. רצפי הפריימרים עבור WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2, ו-GAPDH, יחד עם אורכי האמפליקונים ויעילות ההגברה, מופיעים ב-טבלה 1. ביטוי ה-mRNA ננרמל ל-GAPDH, בעוד שביטוי miR-486-3p ננרמל ל-U6. כל ניסוי כלל שלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות, עם שלוש חזרות טכניות לכל חזרה ביולוגית.
וסטן בלוטינג (Western blotting)
לאחר השלמת סלקציית הפומייסין (puromycin) שנמשכה 7 ימים ותקופת התאוששות, התאים לויסו בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חלבון BCA. כמויות שוות של חלבון (20 µg לכל נתיב) הופרדו על ג'לי SDS-PAGE בריכוז 10% והועברו לממברנות PVDF באמצעות העברה רטובה בזרם של 300 mA למשך 120 min. הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה שהוכן בבופר Tris-buffered saline המכיל 0.1% Tween-20 (TBST) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. הממברנות דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL), או β-actin (1:5,000). שמות היצרנים ומספרי הקטלוג של כל הנוגדנים מופיעים בטבלת החומרים. לאחר שלושה שטיפות של 10 min ב-TBST, הממברנות דגרו עם נוגדן משני של עיזים נגד IgG של ארנב המצומד ל-HRP, בדילול של 1:5,000, למשך 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נשטפו הממברנות שלוש פעמים ב-TBST, ופסי החלבון הודגמו באמצעות סבסטרט כימילומניסנטי וצולמו במערכת לדוקומנטציה והדמיה של ג'לים. עוצמות הפסים כוונתו באמצעות ImageJ. שכיחותו של כל חלבון מטרה נורמלה לאות ה-β-actin התואם מאותה דגימה ביולוגית. לצורך ניתוח דנסיטומטרי נעשה שימוש אך ורק בחשיפות שנמצאות בטווח הגילוי הליניארי והלא-רווי. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.
בדיקת Cell Counting Kit-8
תאי A549 ו-H358 שעברו טרנסדוקציה יציבה עם LV-NC או LV-miR-486-3p נזרעו בלוחות של 96 בארות בריכוז של 1.5 × 104 תאים/באר ב-100 µL של מצע מלא. לאחר היצמדות למשך לילה, המצע הוחלף, ובליעת האור (absorbance) בנקודת הזמן 0-h נמדדה מיד לאחר הוספת ריאגנט Cell Counting Kit-8. בנקודות הזמן 0 h, 24 h, 48 h, 72 h ו-96 h, הוספו 10 µL של ריאגנט לכל בארה והם דגרו למשך 1 h ב-37 °C לפני קריאת הבליעה ב-450 nm. עבור ניתוח מהלך הזמן המעודכן, כל קבוצה נורמלה לערך ה-0-h שלה לפני השרטוט. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים, והערכים של בארות טכניות בתוך כל ניסוי חושבו כממוצע לפני הניתוח הסטטיסטי.
בדיקת יצירת מושבות
תאי A549 ו-H358 שנבחרו באופן יציב הוכנו כתליות של תאים בודדים בריכוז של 5 × 102 cells/mL. מיליליטר אחד של תליית תאים נזרע לכל באער בלוח של 6 באערים, ולאחר מכן נוספו 3 mL של מצע גידול מלא. התאים תורבעו למשך 14 ימים, עם החלפת המצע בכל 5 ימים. המושבות נשטפו ב-PBS, קובעו עם 4% paraformaldehyde למשך 20 min, נצבעו ב-crystal violet למשך 20 min, נשטפו ויובשו באוויר. מושבות המכילות לפחות 50 תאים נספרו באמצעות ImageJ. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.
הערה: נדרשים תגשוש תאים בודדים אחיד והפרעה מינימלית לפלטה במהלך ביסוס המושבות כדי למנוע התקבצות מלאכותית של תאים.
בדיקת נדידת תאים
תאי A549 ו-H358 שעברו טרנסדוקציה יציבה נזרעו בלוחות 6-בארים ותורבתו עד להיווצרות שכבה חד-שכבתית רצופה (confluent monolayer). שריטה ישרה נוצרה באמצעות טיפ פטה סטרילי של 10 µL, תאים שהסתרו הוסרו, והשדות המסומנים צולמו בנקודות זמן של 0 h, 24 h, 48 h ו-72 h. שטח הפצע נמדד בתוכנת ImageJ, וסגירת הפצע חושבה כ-(שטח ב-0 h − שטח בנקודת הזמן המצוינת) / שטח ב-0 h × 100%. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. לא נעשה שימוש בחוסם פרולפרציה פרמקולוגי; לפיכך, בדיקה זו פורשה כמדידה של סגירת פצע ולא כתוצאה הספציפית לנדידה.
הערה: יש ליצור את השריטות ברוחב ובלחץ עקביים, ויש לעקוב אחר שדות זהים לאורך כל מהלך הזמן.
בדיקת פלישת תאים
בדיקות פלישה בשיטת Transwell בוצעו באמצעות סבבי הכנסה (inserts) של ממברנת פוליקרבונט ב-24 בארות עם גודל נקבים של 8 µm. את פני השטח העליונים של כל סבב הכנסה ציפו ב-100 µL של מטריצת ממברנה בסיסית מסוג Matrigel, המדוללת ביחס של 1:8 ב-DMEM נטול סרום לריכוז חלבון סופי מקורב של 1 mg/mL, והדגימות דגרו ב-37 °C למשך 4 h. תאי A549 ותאי H358 הותחו בתוך תוכה של RPMI-1640 נטול סרום בצפיפויות של 8 × 105 cells/mL ו-4 × 105 cells/mL, בהתאמה. מנה של 200 µL מתלי התאים הוספה לתא העליון, דבר שהתאים ל-1.6 × 105 תאי A549 או 8 × 104 תאי H358 לכל סבב הכנסה. את התא התחתון מילאו ב-500 µL של תוכה מסוג RPMI-1640 המכילה 20% fetal bovine serum כחומר מושך כימי (chemoattractant). לאחר דגירה ב-37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ למשך 48 h, תאים שאינם פולשים שנותרו על פני השטח העליונים של הממברנה הוסרו בעדינות באמצעות מקל צמר גפן. תאים שפלשו דרך הממברנה קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 20 min ונצבעו ב-0.1% crystal violet למשך 20 min בטמפרטורת החדר. חמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי צולמו עבור כל סבב הכנסה, ומספר התאים הפולשים נספר באמצעות ImageJ. ממוצע מספר התאים מחמשת השדות נחשב כערך אחד עבור כל סבב הכנסה, וסבב ההכנסה, ולא שדה מיקרוסקופי בודד, נחשב ליחידה הניסויית. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.
הערה: יש להסיר את התאים שאינם פולשים בעדינות ובעקביות כדי למנוע פגיעה בממברנה או ניתוק של תאים שנדדו אל פני השטח התחתונים שלה.
ניתוח סטטיסטי
הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-n מציין ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים, אלא אם צוין אחרת. חזרות טכניות או שדות מיקרוסקופיים מרובים מאותה יחידה ניסויית חושבו כממוצע לפני ביצוע בדיקות הסקה סטטיסטית. עבור השוואה בין שלושה קווי תאים, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו השוואות זוגיות מותאמות לפי Tukey. עבור סדרות זמן של CCK-8 וסגירת פצע, נעשה שימוש בניתוח שונות דו-כיווני למדידות חוזרות (two-way repeated-measures analysis of variance) להערכת השפעות הטיפול, הזמן והאינטראקציה בין הטיפול לזמן, ולאחריו השוואות מותאמות לפי Šídák בנקודות זמן בודדות. השוואות בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחני t-tests של Student דו-צדדיים למדגמים בלתי זוגיים. ניתוחים סטטיסטיים והדמיית נתונים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי ולגרפיקה. ערכי p מדויקים מדווחים בלוחות האיורים או בטבלאות נתוני המקור. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ו-****p < 0.0001.
תוצאות
ניתוח TCGA/starBase מראה שפע מופחת של miR-486-3p ב-LUAD, ו-TargetScan מזהה אתרי קישור פוטנציאליים
נתוני ביטוי המופקים מ-TCGA ואשר נגישו באמצעות starBase v3.0 הראו כי שפעו של miR-486-3p היה נמוך באופן מובהק ב-512 דגימות של אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) לעומת 20 דגימות ריאה שאינן גידולים (מבחן Wilcoxon rank-sum, p = 3.2 × 10⁻5; איור 1). TargetScanHuman זיהה אתר מועמד 7mer-m8 בעל שימור נמוך עבור miR-486-3p בעמדות 468–474 של האזור ה-3′ שאינו מתורגם (3′ UTR) של DVL1, עם context++ score של −0.23 ו-context++ score percentile של 80. אתר מועמד 8mer בעל שימור נמוך זוהה בעמדות 913–920 של ה-3′ UTR של WNT5B, עם context++ score של −0.46 ו-context++ score percentile של 97 (איור 2). אתרים אלו, שנחזו באופן חישובי, שימשו ליצירת ההיפותזה הניסוית ולא נחשבו כראיה לקישור ישיר בין miRNA למטרה. כתובות URL של המקורות מופיעות ב-טבלה 2.
שכיחות miR-486-3p מופחתת בשורות תאים של LUAD ועולה באופן ניכר לאחר טרנסדוקציה לנטיווירלית
תחת תנאי תרבית שגרתיים בהתאמה, ניתוח RT-qPCR הראה כי השפעות של miR-486-3p הייתה נמוכה יותר בתאי A549 ו-H358 מאשר בתאי אפיתל ברונכיאליים מסוג Beas-2b. השוואות עם תיקון Tukey לאחר ניתוח שונות חד-כיווני (one-way ANOVA) הראו הבדלים מובהקים בין תאי A549 לתאי Beas-2b (p < 0.01) ובין תאי H358 לתאי Beas-2b (p < 0.001; איור 3A).
טרנסדוקציה יציבה עם LV-miR-486-3p הגבירה באופן ניכר את שפע ה-miR-486-3p ביחס לקבוצות ה-LV-NC המקבילות. הביטוי עלה בערך פי 1,470 בתאי A549 ובפי 220 בתאי H358, כאשר שתי ההשוואות הגיעו למשמעות סטטיסטית (p < 0.001; איור 3B,C). תוצאות אלו אישרו את ההקמה המוצלחת של מודלים תאיים עם ביטוי יתר יציב של miR-486-3p.
ביטוי מאולץ של miR-486-3p קשור להפחתה בביטוי של WNT5B, DVL1, β-catenin ו-BCL-2
בדיקת Western blotting הראתה שפע של חלבונים נמוך יותר של WNT5B, DVL1, total β-catenin ו-BCL-2 בתאים שעברו טרנסדוקציה של LV-miR-486-3p בהשוואה לבקרה המתאימה של LV-NC (איור 4A–E). בתאי A549, ביטוי מאולץ של miR-486-3p היה קשור להפחתה בשפע החלבונים של β-catenin (p = 0.022), WNT5B (p = 0.0008), DVL1 (p = 0.019) ו-BCL-2 (p = 0.0017). הפחתות מקבילות נצפו גם בתאי H358 עבור β-catenin (p = 0.001), WNT5B (p = 0.0002), DVL1 (p = 0.0003) ו-BCL-2 (p = 0.0018).
לאחר מכן בוצע RT-qPCR כדי לקבוע האם שינויים ברמת התמלול ליוו את הממצאים ברמת החלבון (איור 4F–I). בתאי A549, ביטוי מאולץ של miR-486-3p הפחית את ה-mRNA של CTNNB1 למכפלה של 0.226 ביחס לקבוצת LV-NC (p = 0.004), את ה-mRNA של WNT5B למכפלה של 0.180 (p = 0.004), את ה-mRNA של DVL1 למכפלה של 0.278 (p = 0.006), ואת ה-mRNA של BCL2 למכפלה של 0.259 (p = 0.003).
שינויים דומים ברמת התעתוק זוהו בתאי H358. רמות ה-mRNA של CTNNB1 פחתו ל-0.288-fold ביחס לקבוצת ה-LV-NC (p = 0.028), mRNA של WNT5B ל-0.250-fold (p = 0.019), mRNA של DVL1 ל-0.271-fold (p = 0.020), ו-mRNA של BCL2 ל-0.534-fold (p = 0.003). לפיכך, כיוון השינויים ברמת התעתוק היה עקבי עם הממצאים התואמים ברמת החלבון בשני סוגי התאים. תוצאות אלו מדגימות שינויי ביטוי מתואמים, אך אינן מבססות תקיפה ישירה או את הפעילות של מנגנון איתות ליניארי של WNT5B/DVL1/β-catenin.
ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית את אות ה-CCK-8 הקשור לצמיחה
מדידות CCK-8 נורמלו לערך של 0-h המתאים עבור כל קבוצת ניסוי. אות ה-CCK-8 המנורמל עלה עם הזמן הן בתאים שעברו טרנסדוקציה של LV-NC והן בתאים שעברו טרנסדוקציה של LV-miR-486-3p, אך באופן כללי נצפו ערכים נמוכים יותר בעקבות ביטוי מאולץ של miR-486-3p (איור 5).
בתאי A549, השוואות עם תיקון Šídák לאחר ניתוח שונות (ANOVA) דו-כיווני עם מדידות חוזרות הראו אותות CCK-8 נמוכים באופן מובהק בקבוצת LV-miR-486-3p בנקודות הזמן 24, 48 ו-96 h בהשוואה לקבוצת LV-NC (p < 0.05), בעוד שההבדל ב-72 h לא היה מובהק סטטיסטית (איור 5A). בתאי H358, אות ה-CCK-8 היה נמוך באופן מובהק בקבוצת LV-miR-486-3p ב-24, 48, 72 ו-96 h (p < 0.05; איור 5B). ממצאים אלו מעידים כי ביטוי מאולץ של miR-486-3p הפחית את הפעילות המטבולית הקשורה לצמיחה, עם השפעה עקבית יותר לאורך ציר הזמן של תאי H358.
ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית צמיחה קלונוגנית
בדיקות להערכת יכולת יצירת מושבות בוצעו כדי לבחון צמיחה קלונוגנית לטווח ארוך. תאי A549 שעברו טרנסדוקציה עם LV-miR-486-3p יצרו מספר מושבות קטן משמעותית בהשוואה לתאי LV-NC המקבילים (p = 0.013; איור 6A). הפחתה משמעותית במספר המושבות נצפתה גם בתאי H358 (p = 0.006; איור 6B). ההפחתה הייתה בולטת יותר בתאי H358 מאשר בתאי A549, מה שמעיד על כך שעוצמת האפקט הקלונוגני השתנתה בין שני דגמי ה-LUAD.
ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית את סגירת הפצע
סגירת הפצע נמדדה כמותית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר השריטה (איור 7). בתרביתי A549, קבוצת ה-LV-miR-486-3p הראתה סגירת פצע נמוכה באופן מובהק מאשר קבוצת ה-LV-NC ב-24, 48 ו-72 שעות (p < 0.05 לכל השוואה; איור 7A,C).
באופן דומה, סגירת הפצע פחתה בתרביות H358 שעברו טרנסדוקציה של LV-miR-486-3p ב-24 שעות וב-48 שעות (p < 0.05) וב-72 שעות (p < 0.01; איור 7B,D). מכיוון שהבדיקה בוצעה ללא מעכב פרוליפרציה פרמקולוגי, תוצאות אלו פורשו כסגירת פצע מופחתת ולא כראיה לאפקט ספציפי של נדידה בלבד.
ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית את המעבר דרך ממברנות מצופות ב-Matrigel
יכולתן של התאים לחצות ממברנות Transwell מצופות Matrigel נבדקה לאחר 48 h. מספר תאים מעט יותר של תאים שצבעו בצבע גביש-סגול (crystal-violet) זוהו על פני השטח התחתון של הממברנה בקבוצת A549 LV-miR-486-3p מאשר בקבוצת A549 LV-NC (p = 0.0001; איור 8A). הפחתה דומה נצפתה בתאי H358 (p = 0.0007; איור 8B).
חמישה שדות מיקרוסקופיים שוררו עבור כל השתלה, וההשתלה שימשה כיחידה הניסיונית. ממצאים אלו מדגימים מעבר מופחת של ממבטנים מצופים ב-Matrigel בעקבות ביטוי מאולץ של miR-486-3p תחת התנאים ששימשו בבדיקה זו.
זמינות נתונים:
כל נתוני המקור העומדים בבסיס האיורים כלולים בSupplementary File 1, כולל קבצי מקור של מסד הנתונים, נתוני RT-qPCR, תמונות Western blots ללא חיתוך, ערכי דנסיתומטריה, תמונות מיקרוסקופיה, רישומי ספירה, מדידות CCK-8 וקבצי ניתוח סטטיסטי.
איור 1: שפע של miR-486-3p בדגימות LUAD ודגימות ריאה נורמליות מ-TCGA/starBase. נתוני ביטוי ממקור TCGA נשלו באמצעות starBase v3.0 במאי 2026 וכללו 512 דגימות של אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) ו-20 דגימות ריאה נורמליות. הקבוצות הושוו באמצעות מבחן Wilcoxon rank-sum (p = 3.2 × 10⁻5). LUAD, אדנוקרצינומה של הריאה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2אתרי קישור מועמדים ל-miR-486-3p ב- אשר נחזו על ידי TargetScan ב- DVL1 ו- WNT5B אזורי 3′ UTR. TargetScanHuman זיהה אתר מועמד מסוג 7mer-m8 בעמדות 468–474 של ה- DVL1 האזור הבלתי מתורגם 3' (3' UTR) ואתר 8mer פוטנציאלי בעמדות 913–920 של ה- WNT5B 3′ UTR. כתובות URL של המקור מסופקות ב- טבלה 2חיזויים חישוביים אלו שימשו להגדרת היפותזות ואינם מהווים ראיה ניסונית לקשירה ישירה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שפע בסיסי של miR-486-3p ואימות ביטוי-יתר לנטיבירילי. (A) ניתוח RT-qPCR של שפע miR-486-3p בתאי A549, H358 ו-Beas-2b שגודלו במצעי התרבית השגרתיים שלהם. (B,C) אימות RT-qPCR של ביטוי-יתר של miR-486-3p בתאי A549 (B) ו-H358 (C) שעברו טרנסדוקציה עם LV-NC או LV-miR-486-3p. הביטוי נורמל ל-U6. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. (A) נותח באמצעות one-way ANOVA ולאחריו השוואות מרובות מתוקננות לפי Tukey. (B,C) נותחו באמצעות מבחני Student’s t-tests דו-זנביים ללא צימוד. *p < 0.01; **p < 0.001. LV-NC, לנטיבירוס ביקורת שלילית; RT-qPCR, PCR כמותי עם שעתוק הפוך; SD, סטיית תקן. נא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי מאולץ של miR-486-3p קשור להפחתה בביטוי של הגנים המועמדים. (A) Western blots מייצגים המראים את השפעות של β-catenin, WNT5B, DVL1, BCL-2 ו-β-actin בתאי A549 ו-H358 שעברו טרנסדוקציה עם LV-NC או LV-miR-486-3p. מסות מולקולריות מסומנות ב-kilodaltons. (B–E) כימות דנסיטומטרי של β-catenin (B), WNT5B (C), DVL1 (D) ו-BCL-2 (E), מנורמלים ל-β-actin. (F–I) ניתוח RT-qPCR של שפעות התמלילים של CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H) ו-BCL2 (I), מנורמלים ל-GAPDH. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים; נקודות בודדות מייצגות חזרות ביולוגיות עצמאיות. הקבוצות הושוו באמצעות מבחני Student's t-tests דו-צדדיים ללא צימוד. ערכי p מדויקים ושינויי קיפול (fold changes) מופיעים בפאנלים המתאימים. kDa, kilodaltons; LV-NC, לנטי-וירוס של בקרה שלילית; RT-qPCR, PCR כמותי עם שעתוק הפוך; SD, סטיית תקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 5: ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית אותות CCK-8 הקשורים לצמיחה לאורך זמן. תאי A549 (A) ו-H358 (B) שעברו טרנסדוקציה עם LV-NC או LV-miR-486-3p נותחו בנקודות הזמן 0 h, 24 h, 48 h, 72 h ו-96 h. ערכי OD450 נורמלו לערך ה-0-h המתאים בכל קבוצה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. השפעות הטיפול, הזמן והאינטראקציה בין הטיפול לזמן נותחו באמצעות two-way repeated-measures ANOVA, ולאחריו השוואות עם תיקון Šídák בין הקבוצות בכל נקודת זמן. *p < 0.05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, לנטי-וירוס ביקורת שלילית; OD450, צפיפות אופטית ב-450 nm; SD, סטיית תקן. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית צמיחה קלונוגנית. תמונות מייצגות של באריים שלמים וספירות כמותיות של מושבות מוצגים עבור תאי A549 (A) ו-H358 (B) שעברו טרנסדוקציה עם LV-NC או LV-miR-486-3p. המושבות נספרו באמצעות ImageJ עם הגדרות ניתוח זהות עבור כל הקבוצות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים ונותחו באמצעות מבחני Student’s t דו-צדדיים למדגמים בלתי זוגיים. ערכי p מדויקים מופיעים בפאנלים המתאימים. LV-NC, לנטיווירוס ביקורת שלילית; SD, סטיית תקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית את סגירת הפצע. תמונות מייצגות ומדידות כמותיות של סגירת פצעים מוצגות עבור תאי A549 (A,C) ותאי H358 (B,D) בנקודות זמן של 0 h, 24 h, 48 h ו-72 h לאחר שריטה. סגירת הפצע חושבה באופן הבא: (שטח הפצע ב-0 h − שטח הפצע בנקודת הזמן המצוינת) / שטח הפצע ב-0 h × 100%. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים. השפעות הטיפול, הזמן והאינטראקציה בין הטיפול לזמן נותחו באמצעות two-way repeated-measures ANOVA, ולאחריו השוואות עם תיקון Šídák בין הקבוצות בכל נקודת זמן. סרגי קנה מידה, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. LV-NC, לנטי-וירוס של בקרה שלילית; SD, סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: ביטוי מאולץ של miR-486-3p מפחית את המעבר דרך ממברנות Transwell מצופות Matrigel. מוצגים שדות מיקרוסקופיים נבחרים שנצבעו ב-crystal-violet וספירה כמותית של תאים ברמת ה-insert עבור תאי A549 (A) ותאי H358 (B) שעברו טרנסדוקציה עם LV-NC או LV-miR-486-3p. נעשה שימוש ב-Transwell inserts עם גודל נקבים של 8-µm. חומש של חמישה שדות מיקרוסקופיים עבור כל insert, וכל insert נחשב כיחידה ניסויית אחת. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים ונותחו באמצעות מבחני Student's t דו-זנביים למדגמים בלתי זוגיים. סרגלי קנה מידה, 200 µm. ערכי p מדויקים מופיעים בפאנלים המתאימים. LV-NC, לנטי-וירוס של ביקורת שלילית; SD, סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
| גן | רצפי פריימרים | אורכי אמפליקונים | יעילויות הגברה | |
| WNT5B | קדמי: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| הפוך: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | קדמי: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| הפוך: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | קדימה: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| הפוך: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | קדמי: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| המשלים: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | קדימה: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| היפוך: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
טבלה 1: רצפי הפריימרים ששימשו עבור RT-qPCR.
| מטרה | מידע לניבוי | אנא ספק את הטקסט המקור באנגלית כדי שאוכל לתרגם אותו לעברית בהתאם להנחיות המקצועיות שצוינו. | ||
| DVL1 | 7mer-m8, פוזיציות 468–474 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&חברים=miR-486-3p&הצגcnc=1& הצג nc=1&הצג_ביקורת_שלילית=1&הצג cf1=1&הצג cf2=1&תת-קבוצה=1) | ||
| WNT5B | 8mer, עמדות 913–920 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&חברים=miR-486-3p&הצגcnc=1& הצגת תוכן=1&הצג_בקרת_שלילית=1&הצג cf1=1&הצג cf2=1&תת-קבוצה=1) | ||
טבלה 2: מאגר הנתונים TargetScan וכתובת ה-URL המתאימה.
קובץ משלים 1: נתונים התומכים בממצאי מחקר זה.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
מחקר תפקוד-מוסף (gain-of-function) זה בחן את ההשפעות של ביטוי יציב ומאולץ של miR-486-3p בתאי אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) מסוג A549 ו-H358. בשני המודלים, ביטוי יתר של miR-486-3p היה קשור להפחתה באותות CCK-8 הקשורים לצמיחה, לירידה בצמיחה קלונוגנית, לסגירה איטית יותר של פצעים ולמספר קטן יותר של תאים שעברו דרך ממברנות Transwell מצופות Matrigel. שינויים פנוטיפיים אלו לוו בירידה בשפע החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin כולל ו-BCL-2, יחד עם רמות נמוכות יותר של תמלילי WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2. באופן קולקטיבי, ממצאים אלו תומכים בקשר בין ביטוי מאולץ של miR-486-3p, הנחתה של מספר פנוטיפים של תאים ממאירים ושינויים מתואמים במולקולות נבחרות הקשורות למסלול Wnt. עם זאת, הם אינם מבססים קישור ישיר בין miRNA למטרה, פעילות של מסלול או רצף סיגנלינג סיבתי.
הפנוטיפ הכללי של דיכוי גידולים שנצפה במחקר זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים ואין לפרש אותו כממצא החידוש העיקרי. Tomioka et al. הדגימו בעבר שגם miR-486-3p וגם miR-486-5p מדכאים פנוטיפים ממאירים בתאי LUAD, וזיהו את GINS4 באמצעות אסטרטגיית סריקת מטרות לא מוטה26. תרומתו של המחקר הנוכחי היא ספציפית יותר: ביטוי כפוי של miR-486-3p לווה בירידה ברמות ה-WNT5B, DVL1 ו-β-catenin בשני מודלים של תאי LUAD. בנוסף, המחקר מספק זרימת עבודה ניסויית משולבת המשלבת טרנסדוקציה לנטיווירלית יציבה, RT-qPCR, Western blotting, ניתוח CCK-8, יצירת מושבות (colony formation), סגירת פצע (wound closure) ובדיקות Transwell מצופות Matrigel. הבחנה זו חשובה מכיוון שהעבודה הנוכחית מרחיבה את התצפיות המולקולריות הקשורות לביטוי יתר של miR-486-3p, מבלי לטעון כי זוהי ההדגמה הראשונה של פעילותו נגד גידולים ב-LUAD.
המרמזים הקשורים ל-Wnt דורשים פרשנות זהירה. WNT5B מתואר בדרך כלל כליגנד Wnt לא-קנוני ועשוי להפעיל סיגנלינג של planar-cell-polarity או Wnt/Ca2⁺ באופן התלוי בקולטן ובהקשר. בחלק מהסביבות התאיות, סיגנלינג Wnt לא-קנוני עשוי גם לעכב סיגנלינג תלוי β-catenin10,11. DVL1 הוא מתווך תוך-תאי משותף שיכול להשתתף הן בסיגנלינג Wnt קנוני והן בסיגנלינג לא-קנוני, והוא נקשר לפנוטיפים הקשורים ל-β-catenin בסרטן ריאה מסוג non-small cell12. לכן, הפחתה סימולטנית של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin כולל אינה מעידה על מסלול ליניארי של WNT5B→DVL1→β-catenin. הנתונים הנוכחיים מצביעים במקום זאת על הפחתות נלוות בביטוי של WNT5B ובשפע של DVL1 ו-β-catenin לאחר ביטוי מאולץ של miR-486-3p.
התוצאות ברמת התעתוק היו עקביות מבחינת הכיוון עם ממצאי ה-Western blot. ביטוי מאולץ של miR-486-3p הפחית את שפע התעתוקי של WNT5B, DVL1, ו-CTNNB1 הן בתאי A549 והן בתאי H358. התאמה זו מרמזת כי השינויים הנצפים בחלבונים עשויים להיות מלווים בשינוי בשפע התעתוקי, ולא לנבוע אך ורק משינויים ביציבות החלבון. עם זאת, רמות מופחתות של תעתוק וחלבון אינן מוכיחות קישור ישיר של miR-486-3p לאזורי ה-3′ untranslated regions החזויים. בדיקות Dual-luciferase reporter באמצעות אתרי קישור מסוג wild-type ומוטנטים, יחד עם ניסויי rescue, יהיו נחוצות כדי לקבוע האם WNT5B או DVL1 מווסתים באופן ישיר על ידי miR-486-3p. באופן דומה, ההפחתה בשפע של BCL-2 מעידה על שינוי בחלבון הקשור להישרדות, אך בהיעדר בדיקות מוכחות של מוות תאי, לא ניתן לפרש זאת כראיה לאפופטוזיס מוגברת.
לבדיקות התפקודיות ישנן גם מגבלות ספציפיות לבדיקה. CCK-8 מודד פעילות מטבולית תאית במקום לקבוע באופן ישיר את מספר התאים, ושינויים בבליעה (absorbance) עשויים לשקף שינויים בשגשוג, במטבוליזם או בהישרדות התאים. בדיקת יצירת מושבות מספקת מדד ארוך-טווח יותר ליכולת קלונוגנית, אך עוצמת ההשפעה הייתה שונה בין שני קווי התאים, עם הפחתה צנועה בתאי A549 והפחתה גדולה יותר בתאי H358. הבדל זה מרמז כי התגובה לביטוי כפוי של miR-486-3p עשויה להיות תלויה בהקשר המולקולרי והתאי.
נצפתה סגירה מופחתת של הפצע בשני שורות התאים, אך לא נעשה שימוש במעכב פרוליפרציה במהלך הבדיקה. מכיוון שביטוי מאולץ של miR-486-3p השפיע גם על מדדים הקשורים לגדילה, ייתכן שפרוליפרציה מופחתת תרמה לפנוטיפ של סגירת הפצע. לפיכך, יש לפרש את הממצאים כסגירה מופחתת של הפצע ולא כהשפעה ספציפית על נדידה. באופן דומה, בדיקת Transwell מצופה Matrigel למשך 48-h עשויה להיות מושפעת מהבדלים במעבר דרך הממברנה, פרוליפרציה, הישרדות או היצמדות. כתוצאה מכך, ההפחתה שנצפתה במספר התאים על פני השטח התחתון של הממברנה תומכת במעבר לקוי תחת התנאים שנבדקו, אך אינה מבודדת מנגנון פלישה ספציפי.
שיקול נוסף הוא עוצמת ביטוי העודף של miR-486-3p. טרנסדוקציה לנטיווירלית העלתה את שפע ה-miR-486-3p בערך פי 1,470 בתאי A549 ופי 220 בתאי H358 ביחס לקבוצות הביקורת המתאימות. ביטוי על-פיזיולוגי שכזה עלול להגביר דיכוי של מטרות שאינן רצויות (off-target) התלוי ברצף ה-seed, להשפיע על זמינותם של מרכיבי קומפלקס השתיקה המושרה על ידי RNA, או להוביל למעקה תאי לא ספציפי. מכיוון שלא בוצעה סדרת מנות-תגובה, לא ניתן היה להגדיר את הקשר בין שפע ה-miR-486-3p לבין הפנוטיפים שנצפו. יתרה מכך, היעדרם של ניסויי אובדן תפקוד (loss-of-function) מבוססי מעכבים מונע הסקת מסקנות לגבי התפקיד הפיזיולוגי האנדוגני של miR-486-3p בתאי LUAD. לפיכך, יש לפרש את התוצאות הנוכחיות ספציפית כהשלכות של ביטוי עודף מאולץ ויציב.
יש להביא בחשבון מספר מגבלות. נבדקו רק שני קווי תאי LUAD עם מוטציה ב-KRAS, והשימוש במדיי מ routine שונים מגביל את פרשנות ההשוואות מול תאי Beas-2b. לא בוצעו אימות של קווי התאים ובדיקות למיקופלסמה במהלך המחקר, ו-U6 שימש כרפרנס יחיד לכימות של miR-486-3p. במחקר חסרו בנוסף בדיקות loss-of-function, בדיקות תגובה למנה (dose-response), בדיקות reporter, בדיקות rescue ובדיקות תפקודיות של מסלול ה-Wnt. יתרה מכך, תוצאות סגירת הפצע (wound-closure) ו-Transwell עשויות היו להיות מושפעות מהבדלים בקצב השגשוג, החיוניות או ההיצמדות. לבסוף, לא נכללו מודלים של בעלי חיים, דגימות חולים או קבוצות תיקוף קליניות. לפיכך, הממצאים מוגבלים למערכת in vitro זו של ביטוי מאולץ ואינם מבססים תקיפה ישירה, סיבתיות של המסלול או תועלת קלינית.
לסיכום, ביטוי יציב ומאולץ של miR-486-3p הפחית מספר מדדים הקשורים לצמיחה וניידות בתאי LUAD מסוג A549 ו-H358, ולווה בביטוי נמוך יותר של WNT5B, DVL1, total β-catenin ו-BCL-2. ממצאים אלו מהווים בסיס לחקירה מכניסטית נוספת, אך אינם מבססים את WNT5B או DVL1 כמטרות ישירות, מסלול ליניארי של WNT5B/DVL1/β-catenin, או את הערך הקליני של miR-486-3p.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
תוכנית המדע והטכנולוגיה הרפואית והבריאותית של מחוז Zhejiang (2025KY349) ותוכנית התמיכה בדיסציפלינות מרכזיות של העיר Jiaxing (2023-zc-014) סיפקו תמיכה כספית למחקר זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | הכנת ג'ל ריכוז (stacking gel) ל-SDS-PAGE |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | הכנת ג'ל הפרדה (resolving gel) ל-SDS-PAGE |
| בופר TBS בריכוז 20× | Solarbio | 71080 | בופר מלאי לשטיפת western blot ולדילול נוגדנים |
| תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד 30% (29:1) | Solarbio | A1010 | הכנת ג'לים ל-SDS-PAGE |
| מקבע פאראפורמאלדהיד 4% | Servicebio | G1101 | קיבוע לבדיקות יצירת מושבות ובדיקות Transwell |
| בופר טעינת חלבונים 5× | Beyotime | P0015 | הכנת דגימות חלבון ל-SDS-PAGE |
| אמוניום פרסולפט | Solarbio | 427A038 | יוזם פולימריזציה של ג'ל SDS-PAGE |
| ערכה למדידת ריכוז חלבון BCA | Beyotime | P0009-1 | קביעת ריכוז חלבון |
| נוגדן BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | נוגדן פוליקלונלי משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000 |
| ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | בדיקה של פעילות מטבולית הקשורה לצמיחת תאים; 10 μL לכל 100 μL של מצע גידול |
| מערכת דימוי כימילומניסנציה | Bio-Rad | ChemiDoc MP | דימוי western blot |
| כלורופורם | Servicebio | G3005 | הפרדת פאזות במהלך מיצוי RNA מבוסס TRIzol |
| תמיסת צביעה בויולט קריסטל | Servicebio | G1014 | צביעת מושבות וממברנת Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | מצע גידול שגרתי לתאי Beas-2b |
| נוגדן DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000 |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Biosharp | BL203B | תוסף של 10% (v/v) לתרבית תאים שגרתית; 20% (v/v) בתא התחתון של ה-Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | הכנת גרפים וניתוח סטטיסטי |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | quantitative PCR מבוסס SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | שעתוק הפוך עבור mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | ניתוח סטטיסטי |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | דנסitומטריה של western blot, מדידת שטח פצע, ספירת מושבות וספירת תאי Transwell |
| מיקרוסקופ הפוך | Olympus | CKX53 | דימוי של בדיקות ריפוי פצעים ובדיקות Transwell |
| איזופרופנול | Servicebio | G3006 | שקיעת RNA במהלך מיצוי מבוסס TRIzol |
| תכשירי לנטי-וירוס LV-miR-486-3p ו-LV-NC | GenePharma | Custom synthesis | וקטור לביטוי יתר יציב של miR-486-3p ווקטור ביקורת שלילית (scrambled) |
| מטריצת קרום בסיס Matrigel | Corning | 354234 | מדולל 1:8 ב-DMEM נטול סרום; ריכוז חלבון סופי של כ-1 mg/mL |
| מתנול | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | הפעלת ממברנת PVDF |
| קורא מיקרופלטה | BioTek | ELx800 | מדידת בליעה ב-450 nm |
| ספקטרופוטומטר UV-Vis למיקרו-נפחים | Allsheng | Nano-600 | הערכת ריכוז RNA וטוהר A260/A280 |
| פניצילין-סטרפטומייצין | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | תוסף של 1% (v/v) לתרבית תאים שגרתית |
| סליין מתוחנן פוספאט (PBS) | Servicebio | G0002 | שטיפת תאים וממברנות |
| תערובת מעכבי פרוטאז | APExBIO | K1007 | נוסף לבופר ליזיס RIPA |
| סולם חלבונים (protein ladder) | Biosharp | BL712A | נקודת ייחוס למשקל מולקולרי עבור western blotting |
| ממברנת PVDF | Millipore | K2MA8350E | ממברנת העברה של חלבונים עבור western blotting |
| מערכת QuantStudio 5 Real-Time PCR | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | איסוף נתונים של RT-qPCR |
| בופר ליזיס RIPA | Beyotime | P0013B | מיצוי חלבון תאי כולל |
| ריאגנט למיצוי RNA (מסוג TRIzol) | Servicebio | G3013 | מיצוי RNA כולל |
| מצע RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | מצע גידול שגרתי לתאי A549 ו-H358, ומתלה תאים נטול סרום ל-Transwell |
| SDS | Solarbio | S8010 | ריאגנט ל-SDS-PAGE |
| אבקת חלב רזה | BD | 2271470 | תמיסת חסימה של 5% עבור western blotting |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | ניתוח ביטוי של miR-486-3p מבוסס TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | חיזוי אתרי קישור מועמדים של miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | זרז פולימריזציה של ג'ל SDS-PAGE |
| הכנסות Transwell, 24 בארות, גודל נקבים 8 μm | Corning | 3428 | בדיקת מעבר דרך ממברנה מצופה ב-Matrigel |
| טריפסין | Servicebio | G4000 | הפרדת תאים |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | הכנת בופר שטיפה ל-western blot |
| מערכת אלקטרופורזה אנכית | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | הפרדת חלבונים ב-SDS-PAGE |
| ריאגנט לומינול עבור סובסטרט HRP ל-Western | Affinity Biosciences | KF001 | גילוי כימילומניסצנטי ב-western blot |
| מערכת העברה רטובה (wet transfer system) | Bio-Rad | 1703930 | העברת חלבונים לממברנת PVDF |
| נוגדן WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000 |
| נוגדן β-actin | Abcam | ab8227 | בקרת טעינה; western blotting בדילול של 1:5,000 |
| נוגדן β-catenin | Signalway Antibody | 21725 | נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000 |
מקורות
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.