הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

miR-486-3p מדכא פנוטיפים ממאירים ומקושר להפחתה בביטוי של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin בתאי אדנוקרצינומה של הריאה

44 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71545

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ביטוי יתר מאולץ של miR-486-3p מדכא פעילות הקשורה לשגשוג, גדילה קלונוגנית, סגירת פצע ומעבר במטריג'ל (Matrigel) בתאי אדנוקרצינומה של הריאה מסוג A549 ו-H358. השפעות אלו נלוות להפחתה בביטוי של WNT5B, DVL1, β-catenin ו-BCL-2, דבר המצביע על קשר in vitro לשינויים הקשורים למסלול Wnt, ללא ביסוס של מטרה ישירה או סיבתיות של המסלול.

תקציר

אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) היא הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים, והיא נותרת קשורה לתחלואה ותמותה משמעותיות. מחקרים קודמים זיהו תפקודים מדכאי-גידול של miR-486-3p ב-LUAD, אך הקשר שלו לשינויים בביטוי של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin לא הוגדר באופן ברור. כאן, נבדקה שפעות הבסיס של miR-486-3p בתאי LUAD מסוג A549 ו-H358, והיא הושוותה לזו של תאי אפיתל ברונכיאליים מסוג Beas-2b שנשמרו בתנאי השגרה שלהם. מודלים עם ביטוי-יתר יציב של miR-486-3p נוצרו באמצעות טרנסדוקציה לנטיויריאלית. פעילות הקשורה לצמיחת תאים, צמיחה קלונוגנית, סגירת פצע ומעבר דרך ממברנות מצופות ב-Matrigel הוערכו באמצעות Cell Counting Kit-8, בדיקת יצירת מושבות, בדיקת ריפוי פצעים ובדיקות Transwell. שפעות החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin ו-BCL-2 נמדדה באמצעות Western blotting, ורמות mRNA של WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2 נבחנו בנוסף באמצעות RT-qPCR. תחת תנאי התרבית ששימשו במחקר, שפעות ה-miR-486-3p הייתה נמוכה יותר בתאי A549 ו-H358 מאשר בתאי Beas-2b, וטרנסדוקציה לנטיויריאלית הניבה ביטוי-יתר יציב בשני קווי תאי ה-LUAD. ביטוי-יתר כפוי של miR-486-3p הפחית את אות ה-CCK-8, את יצירת המושבות, את סגירת הפצע ואת המעבר דרך ממברנות מצופות ב-Matrigel, ולווה בשפעות נמוכה יותר של החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin כולל ו-BCL-2. RT-qPCR הראה בנוסף שפעות נמוכה יותר של תמלילי WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2 בשני קווי תאי ה-LUAD לאחר ביטוי-יתר של miR-486-3p. ממצאים אלו תומכים בקשר in vitro בין ביטוי כפוי של miR-486-3p, החלשה של מספר מדדי תאים ממאירים ושינוי בביטוי הקשור ל-Wnt; עם זאת, הם אינם מבססים קישור ישיר בין miRNA למטרה, פעילות של מסלול או מנגנון איתות ליניארי סיבתי.

מבוא

אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) היא תת-הסוג ההיסטולוגי השכיח ביותר של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC), והיא תורמת באופן משמעותי לתחלואה ולתמותה הקשורות לסרטן הריאה ברחבי העולם1,2,3,4,5. סיווג מולקולרי וטיפולים ממוקדים שיפרו את התוצאות עבור קבוצות נבחרות של חולים, אך LUAD בשלבים מתקדמים נותר קשה לטיפול והוא הטרוגני מבחינה ביולוגית1,2,3,4,5. לפיכך, הגדרת תהליכים רגולטוריים התורמים להתנהגות של תאים ממאירים נותרת רלוונטית לפיתוח היפותזות טיפוליות הניתנות לבחינה.

סיגנליזציית Wnt כוללת ענפים תלויים ב-β-catenin וענפים בלתי תלויים ב-β-catenin המווסתים proliferace, הישרדות, פולריות וניידות6,7,8,9. WNT5B מקושר לרוב לסיגנליזציה לא קנונית, אם כי השפעותיו הביולוגיות משתנות בהתאם לקולטן ולהקשר התאי10,11. DVL1 הוא חלבון העברת אותות ציטופלזמי המשותף למספר ענפי Wnt, והוא נקשר להתנהגות הקשורה ל-β-catenin בסרטן הריאה12. בהתאם לכך, אין לפרש שינויים מקבילים ב-WNT5B, DVL1 ו-β-catenin כראיה למסלול ליניארי יחיד כשלעצמם.

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם RNAs קצרים שאינם מקודדים המווסתים ביטוי גנים באמצעות אינטראקציות תלויות-רצף עם תמלילי מטרה13,14,15. מכיוון ש-miRNA אחד עשוי להשפיע על מספר RNAs, שפעות משתנות של miRNA יכולות להשפיע על פנוטיפים מגוונים הקשורים לגידולים סרטניים13,14,15,16,17,18. מספר miRNAs נקשרו לצמיחה, ניידות ואיתות של סרטן ריאה, וקשרי גומלין (crosstalk) בין miRNAs לרשתות הקשורות ל-Wnt תוארו במספר הקשרי סרטן16,17,18,19,20.

הלוקוס MIR486 יוצר את הגדילים הבשלים miR-486-3p ו-miR-486-5p. miR-486-3p הפגין פעילות של דיכוי גידולים בסרטן הפה ובגליובלסטומה, בעוד שהשפעה מעודדת גידולים דווחה בקרצינומה של תאי קשקשת בעור21,22,23,24,25. miR-486-3p נבחר למחקר הנוכחי באמצעות אסטרטגיה מונחית-היפותזה, המבוססת על שפעו המופחת בנתוני LUAD ציבוריים, על פעילותו של דיכוי גידולים שדווחה בעבר ב-LUAD, ועל תחזיות ביואינפורמטיות הקושרות אותו לטרנסקריפטים מועמדים הקשורים ל-WNT. Tomioka וחב' הדגימו השפעות של דיכוי גידולים של שני גדילי miR-486 ב-LUAD וזיהו את GINS4 באמצעות סריקת מטרות גנומית רחבה26. לפיכך, המחקר הנוכחי אינו טוען להדגמה הראשונה של פנוטיפ אנטי-גידולי. במקום זאת, הוא בוחן האם ביטוי מאולץ של miR-486-3p מלווה בשינויים בשפע של WNT5B, DVL1 ו-β-catenin ובשינויים פנוטיפיים ניתנים לשחזור בשתי שורות תאים של LUAD. ניתוחים אלו מעריכים קשרים ואינם מבססים מיקוד ישיר, פעילות של מסלול, או מנגנון ליניארי של WNT5B/DVL1/β-catenin.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

תרבית תאים

במחקר נעשה שימוש בשורות תאי אדנוקרצינומה של הריאה האנושית (LUAD) A549 ו-H358, ובשורה של תאי אפיתל ברונכיאליים מונצחים Beas-2b. תאי A549 (KRAS G12S) ו-H358 (KRAS G12C; חסרי STK11) נבחרו כמודלים נפוצים של LUAD בעלי רקעים שונים של מוטציות ב-KRAS, בעוד ש-Beas-2b נכלל כביקורת של תאי אפיתל ברונכיאליים שאינם ממאירים. תאי A549 ו-H358 גודלו במצע RPMI-1640, ותאי Beas-2b גודלו במצע DMEM; כל מצע הכיל 10% fetal bovine serum ו-1% penicillin-streptomycin. התאים תורגלו בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂. כיוון ששורות התאים של הגידול ותאי הביקורת האפיתליאליים גודלו במצעי שגרה שונים, השוואות של ביטוי בסיס בין שורות התאים השונות פורשו בזהירות.

טרנסדוקציה לנטיבית ובחירת תאים יציבים

וקטורים לנטיביריאליים הנושאים את רצף הקדם של hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) או רצף בקרה שלילי מקומבנ (LV-NC) שימשו בתכנון של הגברה יציבה של תפקוד (stable gain-of-function). תאי A549 ו-H358 נזרעו בלוחות של 6 בארות בריכוז של 5 × 104 תאים/בארת וגודלו למשך לילה. למחרת, התאים נחשפו ללנטיבירוס בריבוי זיהום (MOI) של 10 בנוכחות של 8 µg/mL polybrene. לאחר 24 h, הוחלף התחליל הוויראלי במצע גידול מלא וטרי. תאים שעברו טרנסדוקציה נבחרו באמצעות 2 µg/mL puromycin למשך 7 ימים. לאחר הבחירה, התאים ששרדו הושארו להתאושש והורחבו לצורך הבדיקות המולקולריות והתפקודיות העוקבות. לא נכלל זרוע של מעכב miR-486-3p מכיוון שהמחקר הנוכחי תוכנן ספציפית כדי להעריך את ההשפעות של ביטוי יתר מאולץ ויציב.

הערה: יש לשמור על MOI, זמן החשיפה לפוליברן (polybrene) ותנאי הסלקציה בפיורומיצין (puromycin) זהים בין קבוצות ה-LV-NC וה-LV-miR-486-3p, כדי לצמצם הבדלים בחיוניות התאים הקשורים לטיפול.

RT-qPCR

ביצוע RT-qPCR נועד לקבוע את רמות הביטוי של miR-486-3p ולאשר את יעילות הביטוי העודף (overexpression) באמצעות לנטי-וירוס בתאי A549 ו-H358. RNA כולל בודד באמצעות ריאגנט TRIzol בהתאם להוראות היצרן. ריכוז ה-RNA וטוהרו הוערכו באופן ספקטרופוטומטרי, כאשר יחס A260/A280 של 1.8–2.1 נחשב לקביל. לצורך ניתוח mRNA, 1 µg של RNA כולל עבר שעתוק הפוך ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית לסינתזת cDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. לצורך ניתוח microRNA, סינתזת ה-cDNA בוצעה באמצעות פריימר לשעתוק הפוך מסוג stem-loop הספציפי ל-miRNA. ה-Quantitative PCR בוצע בנפח תגובה כולל של 20 µL המכיל 10 µL של 2× SYBR Green Master Mix, 0.4 µM מכל פריימר ו-2 µL של תבנית cDNA. פרוטוקול ההגברה כלל שלב דנטורציה ראשוני ב-95 °C למשך 5 min, ולאחריו 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 °C למשך 10 s ואנילינג/הארכה ב-60 °C למשך 30 s. לאחר מכן בוצע ניתוח עקומת התכה (melting curve analysis) כדי לאמת את סגוליות ההגברה. RNA גרעיני קטן מסוג U6 שימש כביקורת פנימית לכימות ה-miRNA, בעוד ש-GAPDH שימש כגן ייחוס לנרמול ה-mRNA. רמות ביטוי יחסיות נקבעו באמצעות שיטת 2−ΔΔCq.

רצפי הפריימרים של ה-miRNA היו כדלקמן: פריימר לשיעתוק הפוך במבנה לולאה-גבעול (stem-loop), 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; פריימר קדימה (forward) ל-miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; פריימר אחורה (reverse) אוניברסלי, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; פריימר קדימה ל-U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; ופריימר אחורה ל-U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. רצפי הפריימרים עבור WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2, ו-GAPDH, יחד עם אורכי האמפליקונים ויעילות ההגברה, מופיעים ב-טבלה 1. ביטוי ה-mRNA ננרמל ל-GAPDH, בעוד שביטוי miR-486-3p ננרמל ל-U6. כל ניסוי כלל שלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות, עם שלוש חזרות טכניות לכל חזרה ביולוגית.

וסטן בלוטינג (Western blotting)

לאחר השלמת סלקציית הפומייסין (puromycin) שנמשכה 7 ימים ותקופת התאוששות, התאים לויסו בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חלבון BCA. כמויות שוות של חלבון (20 µg לכל נתיב) הופרדו על ג'לי SDS-PAGE בריכוז 10% והועברו לממברנות PVDF באמצעות העברה רטובה בזרם של 300 mA למשך 120 min. הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה שהוכן בבופר Tris-buffered saline המכיל 0.1% Tween-20 (TBST) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. הממברנות דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL), או β-actin (1:5,000). שמות היצרנים ומספרי הקטלוג של כל הנוגדנים מופיעים בטבלת החומרים. לאחר שלושה שטיפות של 10 min ב-TBST, הממברנות דגרו עם נוגדן משני של עיזים נגד IgG של ארנב המצומד ל-HRP, בדילול של 1:5,000, למשך 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נשטפו הממברנות שלוש פעמים ב-TBST, ופסי החלבון הודגמו באמצעות סבסטרט כימילומניסנטי וצולמו במערכת לדוקומנטציה והדמיה של ג'לים. עוצמות הפסים כוונתו באמצעות ImageJ. שכיחותו של כל חלבון מטרה נורמלה לאות ה-β-actin התואם מאותה דגימה ביולוגית. לצורך ניתוח דנסיטומטרי נעשה שימוש אך ורק בחשיפות שנמצאות בטווח הגילוי הליניארי והלא-רווי. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.

בדיקת Cell Counting Kit-8

תאי A549 ו-H358 שעברו טרנסדוקציה יציבה עם LV-NC או LV-miR-486-3p נזרעו בלוחות של 96 בארות בריכוז של 1.5 × 104 תאים/באר ב-100 µL של מצע מלא. לאחר היצמדות למשך לילה, המצע הוחלף, ובליעת האור (absorbance) בנקודת הזמן 0-h נמדדה מיד לאחר הוספת ריאגנט Cell Counting Kit-8. בנקודות הזמן 0 h, 24 h, 48 h, 72 h ו-96 h, הוספו 10 µL של ריאגנט לכל בארה והם דגרו למשך 1 h ב-37 °C לפני קריאת הבליעה ב-450 nm. עבור ניתוח מהלך הזמן המעודכן, כל קבוצה נורמלה לערך ה-0-h שלה לפני השרטוט. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים, והערכים של בארות טכניות בתוך כל ניסוי חושבו כממוצע לפני הניתוח הסטטיסטי.

בדיקת יצירת מושבות

תאי A549 ו-H358 שנבחרו באופן יציב הוכנו כתליות של תאים בודדים בריכוז של 5 × 102 cells/mL. מיליליטר אחד של תליית תאים נזרע לכל באער בלוח של 6 באערים, ולאחר מכן נוספו 3 mL של מצע גידול מלא. התאים תורבעו למשך 14 ימים, עם החלפת המצע בכל 5 ימים. המושבות נשטפו ב-PBS, קובעו עם 4% paraformaldehyde למשך 20 min, נצבעו ב-crystal violet למשך 20 min, נשטפו ויובשו באוויר. מושבות המכילות לפחות 50 תאים נספרו באמצעות ImageJ. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.

הערה: נדרשים תגשוש תאים בודדים אחיד והפרעה מינימלית לפלטה במהלך ביסוס המושבות כדי למנוע התקבצות מלאכותית של תאים.

בדיקת נדידת תאים

תאי A549 ו-H358 שעברו טרנסדוקציה יציבה נזרעו בלוחות 6-בארים ותורבתו עד להיווצרות שכבה חד-שכבתית רצופה (confluent monolayer). שריטה ישרה נוצרה באמצעות טיפ פטה סטרילי של 10 µL, תאים שהסתרו הוסרו, והשדות המסומנים צולמו בנקודות זמן של 0 h, 24 h, 48 h ו-72 h. שטח הפצע נמדד בתוכנת ImageJ, וסגירת הפצע חושבה כ-(שטח ב-0 h − שטח בנקודת הזמן המצוינת) / שטח ב-0 h × 100%. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים. לא נעשה שימוש בחוסם פרולפרציה פרמקולוגי; לפיכך, בדיקה זו פורשה כמדידה של סגירת פצע ולא כתוצאה הספציפית לנדידה.

הערה: יש ליצור את השריטות ברוחב ובלחץ עקביים, ויש לעקוב אחר שדות זהים לאורך כל מהלך הזמן.

בדיקת פלישת תאים

בדיקות פלישה בשיטת Transwell בוצעו באמצעות סבבי הכנסה (inserts) של ממברנת פוליקרבונט ב-24 בארות עם גודל נקבים של 8 µm. את פני השטח העליונים של כל סבב הכנסה ציפו ב-100 µL של מטריצת ממברנה בסיסית מסוג Matrigel, המדוללת ביחס של 1:8 ב-DMEM נטול סרום לריכוז חלבון סופי מקורב של 1 mg/mL, והדגימות דגרו ב-37 °C למשך 4 h. תאי A549 ותאי H358 הותחו בתוך תוכה של RPMI-1640 נטול סרום בצפיפויות של 8 × 105 cells/mL ו-4 × 105 cells/mL, בהתאמה. מנה של 200 µL מתלי התאים הוספה לתא העליון, דבר שהתאים ל-1.6 × 105 תאי A549 או 8 × 104 תאי H358 לכל סבב הכנסה. את התא התחתון מילאו ב-500 µL של תוכה מסוג RPMI-1640 המכילה 20% fetal bovine serum כחומר מושך כימי (chemoattractant). לאחר דגירה ב-37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ למשך 48 h, תאים שאינם פולשים שנותרו על פני השטח העליונים של הממברנה הוסרו בעדינות באמצעות מקל צמר גפן. תאים שפלשו דרך הממברנה קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 20 min ונצבעו ב-0.1% crystal violet למשך 20 min בטמפרטורת החדר. חמישה שדות מיקרוסקופיים שנבחרו באופן אקראי צולמו עבור כל סבב הכנסה, ומספר התאים הפולשים נספר באמצעות ImageJ. ממוצע מספר התאים מחמשת השדות נחשב כערך אחד עבור כל סבב הכנסה, וסבב ההכנסה, ולא שדה מיקרוסקופי בודד, נחשב ליחידה הניסויית. בוצעו שלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.

הערה: יש להסיר את התאים שאינם פולשים בעדינות ובעקביות כדי למנוע פגיעה בממברנה או ניתוק של תאים שנדדו אל פני השטח התחתונים שלה.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, ו-n מציין ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים, אלא אם צוין אחרת. חזרות טכניות או שדות מיקרוסקופיים מרובים מאותה יחידה ניסויית חושבו כממוצע לפני ביצוע בדיקות הסקה סטטיסטית. עבור השוואה בין שלושה קווי תאים, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (one-way analysis of variance) ולאחריו השוואות זוגיות מותאמות לפי Tukey. עבור סדרות זמן של CCK-8 וסגירת פצע, נעשה שימוש בניתוח שונות דו-כיווני למדידות חוזרות (two-way repeated-measures analysis of variance) להערכת השפעות הטיפול, הזמן והאינטראקציה בין הטיפול לזמן, ולאחריו השוואות מותאמות לפי Šídák בנקודות זמן בודדות. השוואות בין שתי קבוצות נותחו באמצעות מבחני t-tests של Student דו-צדדיים למדגמים בלתי זוגיים. ניתוחים סטטיסטיים והדמיית נתונים בוצעו באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי ולגרפיקה. ערכי p מדויקים מדווחים בלוחות האיורים או בטבלאות נתוני המקור. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ו-****p < 0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח TCGA/starBase מראה שפע מופחת של miR-486-3p ב-LUAD, ו-TargetScan מזהה אתרי קישור פוטנציאליים

נתוני ביטוי המופקים מ-TCGA ואשר נגישו באמצעות starBase v3.0 הראו כי שפעו של miR-486-3p היה נמוך באופן מובהק ב-512 דגימות של אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) לעומת 20 דגימות ריאה שאינן גידולים (מבחן Wilcoxon rank-sum, p = 3.2 × 10⁻5; איור 1). TargetScanHuman זיהה אתר מועמד 7mer-m8 בעל שימור נמוך עבור miR-486-3p בעמדות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר תפקוד-מוסף (gain-of-function) זה בחן את ההשפעות של ביטוי יציב ומאולץ של miR-486-3p בתאי אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD) מסוג A549 ו-H358. בשני המודלים, ביטוי יתר של miR-486-3p היה קשור להפחתה באותות CCK-8 הקשורים לצמיחה, לירידה בצמיחה קלונוגנית, לסגירה איטית יותר של פצעים ולמספר קטן יותר של תאים שעברו דרך ממברנות Transwell מצופות Matrigel. שינויים פנוטיפיים אלו לוו בירידה בשפע החלבונים WNT5B, DVL1, β-catenin כולל ו-BCL-2, יחד עם רמות נמוכות יותר של תמלילי WNT5B, DVL1, CTNNB1 ו-BCL2. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

תוכנית המדע והטכנולוגיה הרפואית והבריאותית של מחוז Zhejiang ‏(2025KY349) ותוכנית התמיכה בדיסציפלינות מרכזיות של העיר Jiaxing ‏(2023-zc-014) סיפקו תמיכה כספית למחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020הכנת ג'ל ריכוז (stacking gel) ל-SDS-PAGE
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010הכנת ג'ל הפרדה (resolving gel) ל-SDS-PAGE
בופר TBS בריכוז 20×Solarbio71080בופר מלאי לשטיפת western blot ולדילול נוגדנים
תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד 30% (29:1)SolarbioA1010הכנת ג'לים ל-SDS-PAGE
מקבע פאראפורמאלדהיד 4%ServicebioG1101קיבוע לבדיקות יצירת מושבות ובדיקות Transwell
בופר טעינת חלבונים 5×BeyotimeP0015הכנת דגימות חלבון ל-SDS-PAGE
אמוניום פרסולפטSolarbio427A038יוזם פולימריזציה של ג'ל SDS-PAGE
ערכה למדידת ריכוז חלבון BCABeyotimeP0009-1קביעת ריכוז חלבון
נוגדן BCL-2Boster Biological TechnologyA00040-2נוגדן פוליקלונלי משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000
ערכה לספירת תאים-8 (CCK-8)TargetMolC0005בדיקה של פעילות מטבולית הקשורה לצמיחת תאים; 10 μL לכל 100 μL של מצע גידול
מערכת דימוי כימילומניסנציהBio-RadChemiDoc MPדימוי western blot
כלורופורםServicebioG3005הפרדת פאזות במהלך מיצוי RNA מבוסס TRIzol
תמיסת צביעה בויולט קריסטלServicebioG1014צביעת מושבות וממברנת Transwell
DMEMServicebioG4511מצע גידול שגרתי לתאי Beas-2b
נוגדן DVL1Signalway Antibody53180נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000
סרום עגל עוברי (FBS)BiosharpBL203Bתוסף של 10% (v/v) לתרבית תאים שגרתית; 20% (v/v) בתא התחתון של ה-Transwell
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareVersion 8הכנת גרפים וניתוח סטטיסטי
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)Yeasen Biotechnology11201ES08quantitative PCR מבוסס SYBR Green
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)Yeasen Biotechnology11141ES60שעתוק הפוך עבור mRNA RT-qPCR
IBM SPSS StatisticsIBMVersion 22.0ניתוח סטטיסטי
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.53דנסitומטריה של western blot, מדידת שטח פצע, ספירת מושבות וספירת תאי Transwell
מיקרוסקופ הפוךOlympusCKX53דימוי של בדיקות ריפוי פצעים ובדיקות Transwell
איזופרופנולServicebioG3006שקיעת RNA במהלך מיצוי מבוסס TRIzol
תכשירי לנטי-וירוס LV-miR-486-3p ו-LV-NCGenePharmaCustom synthesisוקטור לביטוי יתר יציב של miR-486-3p ווקטור ביקורת שלילית (scrambled)
מטריצת קרום בסיס MatrigelCorning354234מדולל 1:8 ב-DMEM נטול סרום; ריכוז חלבון סופי של כ-1 mg/mL
מתנולXilong ScientificGB/T 683-2006הפעלת ממברנת PVDF
קורא מיקרופלטהBioTekELx800מדידת בליעה ב-450 nm
ספקטרופוטומטר UV-Vis למיקרו-נפחיםAllshengNano-600הערכת ריכוז RNA וטוהר A260/A280
פניצילין-סטרפטומייציןGibco, Thermo Fisher Scientific15240062תוסף של 1% (v/v) לתרבית תאים שגרתית
סליין מתוחנן פוספאט (PBS)ServicebioG0002שטיפת תאים וממברנות
תערובת מעכבי פרוטאזAPExBIOK1007נוסף לבופר ליזיס RIPA
סולם חלבונים (protein ladder)BiosharpBL712Aנקודת ייחוס למשקל מולקולרי עבור western blotting
ממברנת PVDFMilliporeK2MA8350Eממברנת העברה של חלבונים עבור western blotting
מערכת QuantStudio 5 Real-Time PCRThermo Fisher ScientificQuantStudio 5איסוף נתונים של RT-qPCR
בופר ליזיס RIPABeyotimeP0013Bמיצוי חלבון תאי כולל
ריאגנט למיצוי RNA (מסוג TRIzol)ServicebioG3013מיצוי RNA כולל
מצע RPMI 1640ServicebioG4510מצע גידול שגרתי לתאי A549 ו-H358, ומתלה תאים נטול סרום ל-Transwell
SDSSolarbioS8010ריאגנט ל-SDS-PAGE
אבקת חלב רזהBD2271470תמיסת חסימה של 5% עבור western blotting
StarBase v3.0Sun Yat-sen Universityhttps://rnasysu.com/encori/ניתוח ביטוי של miR-486-3p מבוסס TCGA
TargetScanHumanWhitehead Institute for Biomedical Researchhttps://www.targetscan.org/vert_80/חיזוי אתרי קישור מועמדים של miR-486-3p
TEMEDSigma-AldrichT8090זרז פולימריזציה של ג'ל SDS-PAGE
הכנסות Transwell, 24 בארות, גודל נקבים 8 μmCorning3428בדיקת מעבר דרך ממברנה מצופה ב-Matrigel
טריפסיןServicebioG4000הפרדת תאים
Tween-20Solarbio815A043הכנת בופר שטיפה ל-western blot
מערכת אלקטרופורזה אנכיתLiuyi BiotechnologyDYCZ-24DNהפרדת חלבונים ב-SDS-PAGE
ריאגנט לומינול עבור סובסטרט HRP ל-WesternAffinity BiosciencesKF001גילוי כימילומניסצנטי ב-western blot
מערכת העברה רטובה (wet transfer system)Bio-Rad1703930העברת חלבונים לממברנת PVDF
נוגדן WNT5BSignalway Antibody56808נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000
נוגדן β-actinAbcamab8227בקרת טעינה; western blotting בדילול של 1:5,000
נוגדן β-cateninSignalway Antibody21725נוגדן ראשוני משפנפן; western blotting בדילול של 1:5,000

מקורות

  1. Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
  2. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
  3. Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
  4. Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
  5. She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
  6. Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
  7. Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
  8. Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
  9. Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
  10. Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
  11. Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
  12. Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
  13. Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
  14. Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
  15. Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
  16. Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
  17. Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
  18. Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
  19. Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
  20. Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
  21. Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
  22. Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
  23. Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
  24. Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
  25. Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
  26. Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי WNT5Bביטוי DVL1בטא-קטניןטרנסדוקציה לנטיווירליתיצירת מושבותמבחן ריפוי פצעיםWestern BlotRT-qPCR
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.