בידוד, טיהור ואפיון של מיטוכונדריה פונקציונלית שמקורן בשריר השלד של העכבר להשתלת מיטוכונדריה

Summary

הוקם פרוטוקול סטנדרטי המשלב עיכול טריפסין וצנטריפוגציה דיפרנציאלית לבידוד, טיהור ואפיון תפקודי של מיטוכונדריה משריר השלד של העכברים, וכן להערכת יישומם בהשתלת מיטוכונדריה.

Abstract

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים המווסתים את חילוף החומרים של האנרגיה, העברת אותות והומאוסטזיס התאים בתאים אאוקריוטיים. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה תורם לפתוגנזה של מחלות רבות והוביל לפיתוח השתלות מיטוכונדריאלית כאסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית. יישום מוצלח של השתלת מיטוכונדריה תלוי בזמינות של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ושלמה מבחינה פונקציונלית. שריר השלד הוא מקור תורם מתאים בזכות תכולת המטוכונדריה הגבוהה שלו, פעילותו המטבולית והנגישות שלו. מחקר זה קבע פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור לבידוד, טיהור ואפיון של מיטוכונדריה פונקציונלית משרירי שלד של העכברים והעריך את השימוש בהם בהשתלות מיטוכונדריה. ההליך כלל שני שלבים עיקריים. ראשית, המיטוכונדריה בודדה משריר השלד של עכברי C57BL/6 באמצעות עיכול טריפסין ואחריו צנטריפוגציה שונה. שנית, המיטוכונדריות המבודדות אופיינו להערכת טוהר, מבנה על-טבעי ופעילות פונקציונלית. טוהר המיטוכונדריה הוערך באמצעות כימות חלבון בחומצה ביסינכונינית (BCA) וניתוח ווסטרן בלוט. שלמות אולטרה-מבנית נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר. הפעילות התפקודית הוערכה באמצעות JC-1 ותיוג פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי יחד עם מדידות צריכת חמצן, קיבולת ייצור ATP ויחס בקרה נשימתית באמצעות מערכת רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. המיטוכונדריה המבודדת הפגינה פוטנציאל ממברנה משומר, מבנה על-טבעי שלם ופעילות נשימתית יציבה, מה שמעיד על התאמה למחקרים פונקציונליים במורד הזרם וליישומי השתלת מיטוכונדריה.

Introduction

מיטוכונדריה היא האתרים העיקריים לייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) ומשחקת תפקידים מרכזיים באפופטוזיס, הומאוסטזיס סידן והמטבוליזם של מיני חמצן פעילים (ROS). לכן, שלמות המיטוכונדריה חיונית לשמירה על הומאוסטזיס תאי ולקביעת גורל התא ^1,2. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל מוטציות ב-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) וחריגות בשרשרת העברת אלקטרונים (ETC), מובילה לפגיעה במטבוליזם האנרגיה, לחץ חמצוני ואפופטוזיס לא מאוזן ^3,4. חריגות אלו קשורות למגוון רחב של מחלות, כולל הפרעות מיטוכונדריאליות תורשתיות, מחלות ניווניות עצבית^ומחלות לב וכלי ^דם. אסטרטגיות טיפוליות קונבנציונליות לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה, כגון נוגדי חמצון וגורמים מטבוליים, בדרך כלל מספקות יעילות מוגבלת משום שהן מקלות על התסמינים מבלי להחזיר ישירות את תפקוד המיטוכונדריה ^7,8. כתוצאה מכך, השתלות מיטוכונדריה הפכו לגישה טיפולית מבטיחה ברפואה רגנרטיבית. אסטרטגיה זו כוללת העברת מיטוכונדריה חיצונית שלמה לתאים פגומים או דיספונקציונליים כדי לשקם פעילות מיטוכונדרית ומטבוליזם אנרגיה ^תאית. מחקרים קודמים הראו כי מיטוכונדריה אקסוגנית יכולה להיות מופנמת על ידי תאי המקבל ולהיות משולבת ברשת המיטוכונדריה האנדוגנית, מה שמוביל לשיפור התפקוד הביואנרגטי ולשיפור הישרדות התאים 11,12,13.

שריר השלד נחשב לתורם מתאים לבידוד מיטוכונדריאלי בשל תכולתו הגבוהה במיטוכונדריה, פעילות מטבולית ונגישות 14,15,16. השתלת מיטוכונדריה דורשת מספר שלבים קריטיים, כולל בידוד מיטוכונדריה, טיהור, אפיון תפקודי והעברה יעילה לתאי המקבל. עם זאת, נותרה שונות מתודולוגית משמעותית בין הפרוטוקולים שדווחו עד כה, במיוחד בהליכים הכוללים הומוגניזציה של רקמות, עיכול אנזימטי, בקרת טמפרטורה וטיהור. שונות כזו יכולה להשפיע על תפוקת מיטוכונדריה, טוהר ושלמות פונקציונלית, ובכך להגביל את השחזוריות הניסויית.

כדי לשפר עקביות מתודולוגית ויכולת שכפול, מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ואפיון מיטוכונדריה פונקציונלית משריר השלד של העכברים באמצעות עיכול טריפסין וצנטריפוגציה דיפרנציאלית. המיטוכונדריה המבודדת הוערכה לטוהר, שלמות אולטרה-מבנית ופעילות פונקציונלית באמצעות כימות חלבון בחומצה ביצינכונינית (BCA), ווסטרן בלוטינג, מיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית, בדיקות פוטנציאל ממברנה מבוססות פלואורסצנציה ורספירומטריה ברזולוציה גבוהה. בנוסף, הוערכה קליטת מיטוכונדריה מבודדת על ידי תאי המקבל כדי להעריך את התאמתם ליישומים של השתלת מיטוכונדריה. פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה שניתן לשחזור לקבלת מיטוכונדריה שמקורם בשרירי שלד פונקציונליים למחקרים ניסיוניים במורד הזרם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו במתקן ספציפי ללא פתוגנים (SPF) ואושרו על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של בית החולים השלישי המסונף של אוניברסיטת חיל האוויר הרפואית (מס' אישור: IACUC-2024kq-065).

עכברים זכרים מסוג C57BL/6 (בני 6-8 שבועות, 18-20 גרם) נרכשו ממרכז בעלי החיים המעבדתיים של אוניברסיטת חיל האוויר לרפואה (רישיון ייצור: SCXK (שאנשי) 2024-002). העכברים אוחסנו בכלובים מאווררים (IVCs) בלחץ חיובי ובתנאים נקיים, עם טמפרטורה של 20-26 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 40%-70%, מחזור אור-חושך של 12 שעות, ולפחות 15 החלפות אוויר בשעה. סופקו תזונה מעוטאת, מי שתייה והעשרה סביבתית.

המגבים, הכימיקלים והכלים הניסיוניים ששימשו בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. הקרבת בעלי חיים ואיסוף רקמות

1. הניחו את העכבר בתא המתת חסד אטום לאוויר והפכו להמתים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני (CO₂) הדרגתית, נפח תא של 30%-70% לדקה.
2. אישור מוות על ידי הפסקת נשימה ודופק ספונטניים, אובדן רפלקסים אישונים וחוסר תגובה לגירוי מכני.
3. טבלו את עכברי C57BL/6 שהושמתו ב-75% אתנול למשך 5 דקות לחיטוי.
   הערה: כדי למנוע קיבוע רקמתי ונזק תאי כתוצאה מאלכוהול, הגביל את זמן הטבילה ל-10 דקות. השתמש ברקמה טרייה לאורך כל הפרוטוקול כי הקפאה פוגעת בחיוניות ובשלמות התפקודית של המיטוכונדריה.
4. הנח את העכבר בצלחת פטרי סטרילית בתוך קפוצ'ון זרימה למינרי, כאשר הבטן פונה כלפי מעלה, כדי לחשוף במלואו את אזורי הבטן והגפיים האחוריות.
5. הרם את עור הבטן התחתונה ליד אזור המין באמצעות מלקחיים ובצע חתך קטן. בצע ניתוח קהה כדי להפריד את העור מהרקמה שמתחת. הארכי את החתך כלפי מעלה לאורך קו האמצע עד הקרסול ולרוחב לכיוון שתי הגפיים האחוריות כדי לחשוף לחלוטין את שרירי הגפיים האחוריות.
6. זהה את שריר הארבע ראשי הירך בצד הקדמי של הירך והפרד בזהירות את השריר בכיוון סיבי השריר באמצעות דיסקציה קהה. חתכו את הרצועה הפיקה הרחוקה ואת הגיד הפרוקסימלי כדי לבודד לחלוטין את רקמת השריר.
   הערה: שטפו את הרקמה שלוש פעמים בסליין מופעל פוספט מקורר מראש (PBS) עם תוספת של 2% פניצילין-סטרפטומיצין באמצעות צלחת פטרי טרייה בכל שטיפה כדי למזער זיהום.
7. הניחו את רקמת השריר המבודדת מיד ב-PBS מקורר מראש ושטפו היטב כדי להסיר שיער ודם מפני הרקמה.
8. נגב בעדינות לחות עודפת מהרקמה באמצעות גזה סטרילית. חלק את הרקמה לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ושקול את הדגימות. השתמש בכ-100 מ"ג רקמה לכל דגימה כדי לשמור על עקביות בין ההכנות.

2. טחינת רקמות והומוגניזציה

1. הנח את צינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את הרקמה משלב 1.8 על הקרח. חתוך את הרקמה לחתיכות קטנות בגודל של כ-1-2 מ"^{מ 3} באמצעות מספריים סטריליים.
2. הוסף 8 נפחים של טריפסין מקורר מראש ב-0.25% ועכל את שברי הרקמה על קרח למשך 15 דקות.
   הערה: חשב את נפח הטריפסין הנדרש לפי מסת הרקמה (1 מ"ג ≈ 1 מיקרוליטר). לדוגמה, הוסף 640 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ל-80 מ"ג רקמה.
3. צנטריפוגה את התערובת ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליך את הסופרנטנט ושמור את כדור הרקמה. החזירו את הכדור ל-1 מ"ל בופר בידוד מיטוכונדריאלי מקורר מראש המכיל D-מניטול (215 מ"מ), סוכרוז (75 מ"מ), HEPES (20 מ"מ), EGTA (1 מ"מ) ואלבמין בקר ללא חומצות שומן (0.5% עם חומצות שומן).
4. העבר את המתלים למכשיר זכוכית שהומוגני על הקרח. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות 10-12 תנועות עדינות למעלה ולמטה עד שהתלייה הופכת לעכורה.
   הערה: הימנעו מסיבוב העלי הזכוכית לרוחב בתחתית ההומוגניזר כי כוח מכני מופרז עלול לפגוע בממברנות המיטוכונדריה ולפגוע בתפקוד המיטוכונדריאה.

3. צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. העבר את ההומוגנט לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לקבל את הכדור המיטוכונדריאלי הגולמי.
   הערה: אספו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות מזרק בנפח 1 מ"ל תוך הימנעות מהפרעה לכדור ולשאריות רקמה.

4. טיהור ואחסון מיטוכונדריאלי

1. החזירו בעדינות את הכדור המטוכונדריאלי הגס בבופר שטיפה מקורר מראש המכיל סוכרוז (250 מ"מ), HEPES (10 מ"מ, pH 7.4), EGTA (1 מ"מ) ואלבמין סרום בקר (0.15% w/v). צנטריפוגה את המתלים בעוצמה של 1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. העבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה טרי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לקבל את הכדור המטוהר של המיטוכונדריה.
   הערה: השתמש במיטוכונדריה מבודדת טרית מיד כשאפשר. אחסון קצר טווח בטמפרטורה של 4°C או אחסון ארוך טווח ב-−80°C בבופר אחסון מיטוכונדריאלי המכיל סוכרוז (0.25 מ'), Tris-MOPS (10 מ"מ, pH 7.4) ו-EGTA (0.1 מ"מ) אפשרי. עם זאת, הקפאה עלולה לפגוע בפעילות האנזימטית של המיטוכונדריה ובתפקוד הנשימה. השתמש בדגימות קפואות בעיקר לניתוח חלבונים.

5. הפקת חלבונים מיטוכונדריאלית וציטוזולית וכימות BCA

1. הפקת חלבון מיטוכונדריאלי
   1. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי המטוהר ב-50 מיקרוליטר של בופר ליזיס RIPA לכל 100 מ"ג של רקמת התחלה ודחפו את הכדור על קרח למשך 15 דקות.
   2. צנטריפוגה את הליזאט בכ-14,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל כדי לקבל את שבר החלבון המיטוכונדריאלי.
2. הפקת חלבון ציטוזולי
   1. בצנטריפוגה הסופרנטנט הציטוזולי שהושג בשלב 4.2 ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על הכדור כחלק הציטוזולי המועשר.
   2. החזירו את הכדור הציטוזולי ל-50 מיקרוליטר של בופר ליזיס RIPA ועבדו את הדגימה כפי שמתואר בשלבים 5.1.1-5.1.2.
      הערה: הכינו את בופר הליזיס טרי עם מעכבי פרוטאז ובצעו את כל ההליכים על קרח כדי למזער את פירוק החלבון. המיטוכונדריה בשלב זה יכולה להיות טרייה או קפואה.
3. כימות חלבון BCA
   1. הכינו את תמיסת העבודה של BCA על ידי ערבוב תגובת A וריגנט B ביחס של 50:1 (v/v). הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לכל באר של לוח עם 96 בארות.
      הערה: הכינו את תמיסת ה-BCA הפועלת מיד לפני השימוש והשתמשו בה תוך שעה בטמפרטורת החדר.
   2. מדלל את תמיסת המאגר של אלבומין הסרום (BSA) (2 מ"ג/מ"ל) ל-0.5 מ"ג/מ"ל והשאיר את התמיסה על הקרח עד השימוש.
   3. הכינו את העקומה הסטנדרטית על ידי הוספת 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 או 0 מיקרוליטר של פתרון BSA לבארות נפרדות. כוון את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר באמצעות תמיסת NaCl.
   4. הוסף 4 מיקרוליטר חלבון מיטוכונדריאלי ו-16 מיקרוליטר תמיסת NaCl לקבוצת בארות אחת. הוסיפו 4 מיקרוליטר חלבון ציטוזולי ו-16 מיקרוליטר תמיסת NaCl לקבוצת בארות אחרת.
   5. הוסיפו 200 מיקרולטר של תמיסת BCA לכל באר ודגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות. מדדו את הספיגה ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
   6. בנו עקומת תקן חלבון עם מקדם קורלציה (R²) ≥ 0.999. חשב ריכוזי חלבונים (μg/μL) על ידי אינטרפולציה של ערכי הספיגה מהעקומה הסטנדרטית.

6. הערכת טוהר של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי השלד

1. לדלל דגימות חלבון מיטוכונדריאלי וציטוזולי לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר. הכין תערובות תגובה של 20 מיקרוליטר המכילות 30 מיקרוגרם חלבון ו-4 בופר עומס ×. כוון את הווליום שנותר עם תמיסת NaCl. הרתיחו את הדגימות במשך 10 דקות ואחסנו אותן בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש.
2. הפרדו דגימות חלבון באמצעות ג'לים מוכנים עם 4%-20% גרדיאנט. בצע אלקטרופורזה ב-140-150 וולט למשך 50 דקות.
3. הפעל את ממברנת ה-PVDF (0.22 מיקרון) במתנול למשך דקה. חלבוני העברה משתמשים בבופר ההעברה המהירה ב-400 mA למשך 30 דקות.
4. הסר את ממברנת ה-PVDF מסנדוויץ' ההעברה ושוטף אותו ב-TBST למשך 5 דקות. חסום את הממברנה עם חלב רזה של 5% בטמפרטורת החדר למשך שעה עם ניעור עדין.
5. דילול נוגדנים ראשוניים (COX IV, ציטוכרום c, β-אקטין) 1:1,000 בבופר דילול נוגדנים. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות בכל כביסה.
7. דגרו את הממברנה עם נוגדנים משניים מדוללים ב-1:10,000 בטמפרטורת החדר למשך שעה.
8. שטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות כל אחת. פתח את הכתם ותצלום את התמונות.

7. צביעת MitoTracker של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי שלד

1. מדלל את תמיסת הצביעה לריכוז סופי של 200 ננומטר במדיום מחומם מראש מיד לפני השימוש.
2. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי ל-100 מיקרו-ליטר של תמיסת העבודה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות.
3. הוסיפו חמישה נפחים של בופר אחסון מקורר מראש לאחר הדגירה. צנטריפוגה את המתלה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט המכיל צבע לא קשור.
4. העבר אליקווט של המתלה המיטוכונדריאלי המוצבע למחסנית זכוכית וכסה את הדגימה בכיסוי.
5. צלם תמונות פלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם הגדרות עירור ופליטה מתאימות לזיהוי צבע מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי אדום.

8. הערכת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית באמצעות צביעת JC-1

1. קבוצת הטיפול CCCP (ציאניד קרבוניל m-chlorophenyl hydrazone)
   1. לטפל בהשעיה המיטוכונדריאלית עם CCCP בריכוז סופי של 10 מיקרומולר ולדוגר במשך 20 דקות כדי לפזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.
   2. דגרו את הטיפול המיטוכונדרי המטופל ב-CCCP עם 250 מיקרוליטר של תמיסת צביעת JC-1 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם ערבוב עדין.
2. קבוצת הטיפול JC-1
   1. החזירו את הכדור המיטוכונדריאלי ל-100 מיקרוליטר של תמיסת JC-1 ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות מוגן מאור.
   2. הכינו 1× בופר צביעה JC-1 על ידי דילול תמיסת המלאי 5× במים מזוקקים ביחס של 2:8 (v/v) ושמרו על הבופר על קרח.
   3. הסר את תמיסת הצביעה ושוטף את הפלט המיטוכונדריאלי פעמיים עם בופר צביעה 1× JC-1 מקורר מראש.
   4. החזירו את המיטוכונדריה המוכתמת ל-PBS וצילמו אותן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. השתמש בהגדרות עירור ופליטה מתאימות לזיהוי מונומרים ירוקים של JC-1 פלואורסצנטי ואגרגטים אדומים פלואורסצנטיים של JC-1.

9. ניתוח אולטרה-מבני של מיטוכונדריה מבודדת של שרירי השלד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר

1. מקבע מיטוכונדריה מבודדת טרייה ב-2.5% גלוטראלדהיד שהוכן בבופר פוספט של 0.2 מ' (pH 7.4) ודגור את הדגימות ללילה בטמפרטורה של 4°C.
2. שטפו את הדגימות ב-0.1 מיליון מלח עם בופר פוספט (PBS, pH 7.4) וקיבעו את הדגימות לאחר מכן בטטרוקסיד אוסמיום 1% למשך שעה בטמפרטורת החדר.
3. ייבוש הדגימות באמצעות סדרת אתנול מדורגת, ואחריה חדירה, הטמעה ופולימריזציה בשרף אפוקסי.
4. חתך את הדגימות המשובצות בעובי של 50-70 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום.
5. צבע כפול את החלקים עם אורניל אצטט ועופרת ציטראט. התבונן וצלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר.

10. קליטה תאית של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי השלד

1. שיבוט תרבות NCTC 929 (L929; RRID: CVCL_0462) תאים שהתקבלו מספק מסחרי במדיום מלא המכיל MEM Alpha, בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. כאשר התאים מגיעים ל-80%-90% מפגש (מפגש בין 80%), שאיפת המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS מחומם מראש. הוסף טריפסין-EDTA ודוגר עד שהתאים מתנתקים.
3. הוסיפו מדיום מלא לסיום העיכול ויוצרים תלייה חד-תאית באמצעות פיפטינג עדין. צנטריפוגה את המתלים ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות וזרקו את הסופרנטנט.
4. החזירו את כדור התא למדיום טרי ומלא וזרעו את התאים לכלי תרבית חדשים בצפיפות מתאימה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
5. זרעים מעבירים תאי 5 (P5) לכלים עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ ומגדלים את התאים במהלך הלילה.
6. סומנו את המיטוכונדריה המבודדת עם צבע אדום פלואורסצנטי ייחודי למיטוכונדריה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות ושטפו את המיטוכונדריה עם PBS להסרת צבע לא קשור.
7. הוסיפו מיטוכונדריה מסומנת בצבע פלואורסצנטי אדום (20 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי לכל צלחת) לתאים ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
8. צבעו את התאים עם גלאי אקטין פלואורסצנטי למשך 30 דקות כדי להמחיש את שלד האקטין ולצבוע גרעיני נגד צבע גרעיני פלואורסצנטי.
   הערה: יש לשלוט בזהירות בריכוז הסרום במהלך הדגירה המשותפת, מכיוון שסרום מופרז עלול להפחית את יעילות קליטת המיטוכונדריה. המיטוכונדריה שבשלב זה היא טרייה.

11. מדידת תפקוד נשימתי מיטוכונדריאלי באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

1. הכנת כלי נגינה
   1. נקה את תאי הנשימה, תא האלקטרודות והפקקים.
   2. הניחו מוט ערבוב מגנטי בכל תא ווודאו את שלמות ממברנת אלקטרודת החמצן.
2. כיול מכשירים
   1. הוסיפו 2.1 מ"ל של בופר נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05, pH 7.10) לכל תא נשימה וודאו שאין בועות אוויר.
   2. איזון את מערכת הספירומטריה ברזולוציה גבוהה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וביצוע כיול אוויר יומי לאחר ייצוב קו הבסיס של החמצן.
      הערה: הימנעו מהחדרת בועות אוויר לתא הנשימה, שכן הן מפריעות לאותות אלקטרודות החמצן ופוגעות באיכות הנתונים. המיטוכונדריה שבשלב זה היא טרייה.
3. עומס דגימות ואיזון
   1. הוסיפו מיטוכונדריה מבודדת טרייה המכילה כ-30 מיקרוגרם חלבון לתוך תא הנשימה ואוטם את החדר.
   2. לאזן את התא למשך 5-8 דקות ולרשום צריכת חמצן בסיסית.
      הערה: שמרו על המיטוכונדריה על קרח ובצעו מדידות נשימה מיד לאחר הבידוד כדי לשמור על פעילות.
4. פרוטוקול SUIT
   1. הוסיפו 5 מיקרוליטר פירובט (2 מ'), 10 מיקרוליטר גלוטמט (2 מ'), ו-10 מיקרוליטר מאלט (400 מ״מ) ברצף. ייצוב את התגובה למשך 5 דקות ותעדים נשימה של דליפת CI.
   2. הוסף 10 מיקרוליטר ADP (500 מ"מ) כדי לגרום לזרחון חמצוני ולרשום נשימת CI OXPHOS. הוסף 10 מיקרוליטר מגנזיום כלוריד (0.3 מ').
   3. הוסף 20 מיקרוליטר סוקסינאט (1 מ') ורשום את נשימת CI+CII OXPHOS לאחר הייצוב.
   4. הוסף 2 מיקרוליטר מעכב ATP סינתאז (0.01 מ״מ) ורשם את דליפת הפרוטון.
   5. הוסיפו CCCP (1 מ״מ) בהדרגה בשלוש הוספות של 2 מיקרוליטר במרווחים של 2 דקות עד שצריכת החמצן מגיעה לפלטו. רשם קיבולת מקסימלית של מערכת העברת אלקטרונים.
   6. הוסף 1 מיקרוליטר רוטנון (1 מ״מ) כדי לעכב פעילות מורכבת I.
   7. הוסף 1 מיקרוליטר אנטימיצין A (5 מ"מ) כדי לעכב פעילות קומפלקס III ולתעד צריכת חמצן שאריתית.
   8. הוסף 5 מיקרוליטר אסקורבט (800 מ"מ) ו-5 מיקרוליטר n,n,n',n'-טטרמתיל-p-פנילנדיאמין (200 מ"מ). תיעד פעילות הנשימה המורכבת המקסימלית של ה-IV לאחר הייצוב.
      הערה: יש לבצע Aliquot את כל החומרים לפני ההקפאה כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים. הוסף CCCP בהדרגה, שכן ניתוק יתר מעכב את נשימת המיטוכונדריה.
5. ניתוח נתונים
   1. השגת פרמטרי נשימה מיטוכונדריאליים, כולל CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET ו-CIV, באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.
   2. חשב את יחס הבקרה הנשימתית (RCR; נשימה במצב 3/במצב 4) ויכולת ייצור ATP. שמור את כל הערכים לשלושה מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. התוכנה ששימשה לניתוח נתונים הייתה Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

סקירה סכמטית של תהליך הבידוד והטיהור של המיטוכונדריאלים מוצגת באיור 1. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורה של 4°C לשמירה על שלמות המיטוכונדריה ופעילותה התפקודית. רקמת שריר שלד מבודדת טרייה טוחנה ועוכלה עם טריפסין כדי להקל על פירוק הרקמות, ולאחר מכן הומוגנית בבופר בידוד איזוטוני באמצעות הומוגניזר זכוכית. לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה דיפרנציאלית להפרדת מיטוכונדריה מפסולת רקמה ומזהמים ציטוזוליים. הצנטריפוגה הראשונית ב-1,000 × גרם הסירה גרעינים ופסולת גדולה, בעוד שהצנטריפוגה הבאה ב-12,000 × גרם הניבה כדור מיטוכונדריה גס. שלבי שטיפה וצנטריפוגציה נוספים הפחיתו עוד יותר את הזיהום הציטוזולי, והניבו מיטוכונדריה מטוהרת המתאימה לניתוחים מבניים ופונקציונליים במורד הזרם (איור 1).

איור 1: דיאגרמה סכמטית של בידוד וטיהור המיטוכונדריאלים. מיטוכונדריה בעלות טוהר גבוה בודדו באמצעות גישה משולבת של עיכול טריפסין מבוקר וצנטריפוגציה דיפרנציאלית. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשמירה על שלמות מבנית ותפקודית של המיטוכונדריה. רקמת שריר שלדית מבודדת זה עתה עברה עיכול אנזימטי, הומוגניזציה ושלבי צנטריפוגה עוקבים כדי להשיג מיטוכונדריה מטוהרת המתאימה לניתוחים פונקציונליים ומבניים במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הפעילות התפקודית של מיטוכונדריה מבודדת הוערכה באמצעות צביעת JC-1 וסימון מיטוכונדריה פלואורסצנטי (איור 2). צביעת JC-1 הראתה פלואורסצנציה אדומה חזקה במיטוכונדריה מבודדת טרייה בתנאי בסיס, מה שמעיד על שימור פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית. לאחר טיפול ב-carbonyl ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), הפלואורסצנציה האדומה ירדה, והפלואורסצנציה הירוקה עלתה, בהתאם לדפולריזציה של ממברנת המיטוכונדריאל. ממצאים אלו אישרו שהמיטוכונדריה המבודדת שמרה על תגובתיות פוטנציאלית לממברנה ונשארה פעילה תפקודית לאחר הבידוד. תיוג פלואורסצנטי הראה עוד יותר שהמיטוכונדריה מופיעה כמבנים מנוקדים נפרדים ומפוזרים באופן אחיד ברחבי השדה, ללא הצטברות או משקע צבע ברור. הפלואורסצנציה הנמוכה של הרקע ודפוס הצביעה האחיד הצביעו על שימור שלמות המיטוכונדריה ופוטנציאל הממברנה לאחר הבידוד.

איור 2: אפיון פעילות פונקציונלית של מיטוכונדריה מבודדת. (א) הערכת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית באמצעות צביעת JC-1. מיטוכונדריה מטוהרת צובעה ב-JC-1 ונצפתה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. נצפו מצטברות פלואורסצנטיות אדומות מובחנות בקבוצת המיטוכונדריה הביקורתית, מה שמעיד על פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית משומר. לאחר טיפול במפריד CCCP, הפלואורסצנציה עברה בעיקר למונומרים ירוקים מסוג JC-1, מה שמעיד על דה-פולריזציה של הממברנה וקריסת פוטנציאל הממברנה (פס סקאלה = 50 מיקרון). (B) תיוג פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי של מיטוכונדריה מטוהרת. מיטוכונדריה מסומנת פלואורסצנטית הופיעו כמבנים מפוזרים ומנוקדים ללא הצטברות ברורה ועם פלואורסצנציה רקע מינימלית, מה שמעיד על שלמות מיטוכונדרית נשמרת ופוטנציאל ממברנה יציב (פס סקאלה = 100 מיקרון). (ג) ניתוח כמותי של יחסי עוצמת הפלואורסצנציה של JC-1 בקבוצות שונות לאחר צביעת JC-1. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחן t לא מזווג (****P < 0.0001). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

השלמות האולטרה-מבנית של מיטוכונדריה מבודדת נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר (איור 3). הדמיה בהגדלה נמוכה חשפה מיטוכונדריה מטוהרת עם מורפולוגיה אליפטית ברובה, בעוד שהדמיה בהגדלה גבוהה הראתה ממברנות חיצוניות שלמות ומבני קריסטה מוגדרים בבירור. לא נצפה נפיחות, קרע או הפרעה מבנית ברורה. להערכה כמותית, נותחו חמישה שדות שנבחרו באקראי המכילים כ-40-60 מיטוכונדריות לכל שדה. תצפיות אלו הראו כי הליך הבידוד שימר ביעילות על מבנה העל-יסודי של המיטוכונדריה ויצר מיטוכונדריה המתאימה למחקרים פונקציונליים במורד הזרם.

איור 3: שלמות אולטרה-מבנית של מיטוכונדריה מבודדת של שרירי השלד שנבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר. (משמאל) תמונת TEM מייצגת בהגדלה נמוכה (4,000×; פס סקאלה = 2 מיקרון) המציגה מיטוכונדריה מטוהרת עם מורפולוגיה אליפטית ברובה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

(מימין) תמונת TEM בהגדלה גבוהה (40,000×; פס סקאלה = 200 ננומטר) המדגימה ממברנות מיטוכונדריאליות חיצוניות חלקות ורציפות ומבני קריסטה מוגדרים בבירור. חצים צהובים מצביעים על ממברנות מיטוכונדריה חיצוניות שלמות, בעוד שחצים לבנים מצביעים על קריסטה מיטוכונדריאלית מאורגנת היטב. לא נצפו עדות לנפיחות, קרע או הפרעה מבנית. חמישה שדות שנבחרו באקראי המכילים כ-40-60 מיטוכונדריות לכל שדה נותחו. ממצאים אלו מראים כי פרוטוקול הבידוד שמר על שלמות אולטרה-מבנית של המיטוכונדריה וסיפק בסיס מבני אמין לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם.

התפוקה והטוהר המיטוכונדריאלי הוערכו לאחר מכן באמצעות כימות חלבון וניתוח אימונובלוט (איור 4). השוואה בין שיטות עיכול הטריפסין (TD) לשיטת החילוץ התקינה (NE) הראתה כי שיטת TD הניבה כ-2.3-2.4 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי לרקמת מ"ג, בעוד ששיטת NE הניבה כ-1.7-1.8 מיקרוגרם לרקמה. ניתוח אימונובלוט הראה העשרה חזקה של סמנים מיטוכונדריאליים, ציטוכרום c אוקסידאז ו-COX IV, בשברים מיטוכונדריאליים, עם גילוי מינימלי בשברים ציטוזוליים. לעומת זאת, הסמן הציטוזולי β-אקטין הראה רק אותות חלשים בשברים המיטוכונדריאליים, מה שמעיד על זיהום ציטוזולי מוגבל. השוואה בין קבוצות TD ל-NE הצביעה כי עיכול טריפסין שיפר את תפוקת המיטוכונדריה וטוהרו. ביחד, ממצאים אלו הראו כי הפרוטוקול יצר מיטוכונדריה המתאימה לניתוחים מולקולריים ותפקודיים במורד הזרם.

איור 4: השוואת תפוקה וטוהר של מיטוכונדריה מטוהרת. (א) השוואת תפוקת החלבון המיטוכונדריאלי ליחידת מסת רקמה שהושגה באמצעות שיטות עיכול טריפסין (TD) והפקה תקינה (NE). קבוצת ה-TD הניבה כ-2.3-2.4 מיקרוגרם/מ"ג רקמה, בעוד שקבוצת NE הניבה כ-1.7-1.8 מיקרוגרם/מ"ג רקמה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחן t לא מזווג (*P < 0.05). (B) ניתוח אימונובלוט של חלבוני סמן מיטוכונדריאליים וסיטוזוליים בחלקים מיטוכונדריאליים המבודדים באמצעות שיטות TD ו-NE. (C-D) ניתוח כמותי של חלבוני סמן מיטוכונדריאלי ציטוכרום C אוקסידאז ו-COX IV. סמנים מיטוכונדריאליים הועשרו מאוד בחלקי מיטוכונדריה אך הראו ביטוי מינימלי בשברים ציטוזוליים. הסמן הציטוזולי β-אקטין הראה ביטוי חלש בלבד בשברים המיטוכונדריאליים, מה שמעיד על הסרה יעילה של מזהמים ציטוזוליים. בהשוואה לקבוצת ה-NE, קבוצת TD הראתה שיפור בטוהר המיטוכונדריה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המובהקות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחן t לא מזווג (*P < 0.05; **P < 0.01). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

להערכת תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלית לעומק, נמדדה צריכת חמצן באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (איור 5). מיטוכונדריה שבודדה בשיטת TD הציגה ערכי יחס בקרה נשימתיים (RCR) של כ-9-10, בעוד שמיטוכונדריה שבודדה בשיטת NE הציגה ערכי RCR של כ-8-9. מכיוון שערכי RCR הגבוהים מ-4 נחשבים בדרך כלל למצביעים על פעילות נשימתית מיטוכונדרית משומרת, תוצאות אלו הראו כי מיטוכונדריה שבודדה בשתי השיטות שמרה על שלמות פונקציונלית. ערכי ה-RCR הגבוהים שנצפו בקבוצת TD הצביעו על שימור טוב יותר של תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי מאשר בקבוצת NE. יעילות הקישור הביוכימי הוערכה גם באמצעות המשוואה 1 − (קצב נשימת דליפה/קצב נשימת העברת אלקטרונים), כאשר ערכים המתקרבים ל-1 מצביעים על חיבור נשמתי הדוק יותר וייצור ATP יעיל יותר. שתי הקבוצות הראו יעילות קישור בסביבות 1, מה שמעיד כי פונקציונליות ביואנרגטית של מיטוכונדריה נשמרה לאחר הבידוד.

איור 5: בדיקת תפקוד נשימתי במיטוכונדריה מטוהרת. (א) השוואה בין יחס הבקרה הנשימתית המיטוכונדריאלית (RCR) בין קבוצות עיכול הטריפסין (TD) והחילוץ התקין (NE). ערכי RCR בשתי הקבוצות היו גבוהים מ-4, מה שמעיד על שימור פעילות הנשימה המיטוכונדריאלית לאחר בידוד. קבוצת ה-TD הציגה ערכי RCR מעט גבוהים יותר מקבוצת NE, מה שמרמז על שימור טוב יותר של תפקוד הנשימה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחן t לא מזווג (**P < 0.01). (ב) השוואה בין יעילות הקישור הביוכימי של המיטוכונדריה לבין יכולת הסינתזה של ATP בין קבוצות TD ו-NE. ערכי יעילות הצימוד התקרבו ל-1 בשתי הקבוצות, מה שמעיד על נשמה מקושרת מאוד וייצור ATP יעיל. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות מבחן t לא מזווג (*P < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קליטת מיטוכונדריה מבודדת על ידי תאי המקבל הוערכה באמצעות תאי L929 (איור 6). התאים הוגדרו יחד עם מיטוכונדריה שמקורם בשריר השלד המסומן בצבע פלואורסצנטי אדום, ושלד האקטין הוצג באמצעות גלאי אקטין פלואורסצנטי. מיקרוסקופיה קונפוקלית חשפה מבנים פלואורסצנטיים אדומים מנוקדים המפוזרים ברחבי הציטופלזמה, מה שמעיד שתאי L929 אימצו מיטוכונדריה אקסוגנית. ניתוח כמותי הראה עלייה תלויה בזמן בספיגת המיטוכונדריה ב-12, 24 ו-48 שעות. עם זאת, נצפה עלייה מתונה בלבד בין 24 שעות ל-48 שעות, מה שמרמז שיעילות הקליטה מתקרבת לרוויה לאחר 24 שעות. בנוסף, תאי L929 שנקלטו הראו עלייה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לאחר קליטת המיטוכונדריה, מה שמעיד על שיפור בתפקוד המיטוכונדריאה. ממצאים אלו הראו כי מיטוכונדריה שמקורם בשרירי שלד המבודדים באמצעות פרוטוקול זה יכולים להיות מופנמים ביעילות על ידי תאי המקבל תוך שמירה על פעילות תפקודית.

איור 6: קליטה תאית של מיטוכונדריה שמקורם בשרירי השלד על ידי תאי L929. (א) קליטת מיטוכונדריה מטוהרת על ידי תאי L929 בזמנים שונים של דגירה (12 שעות, 24 שעות ו-48 שעות). זוהו מיטוכונדריה מסומנת בצבע פלואורסצנטי (אדום) בתוך הציטופלזמה של תאי המקבל, בעוד שצביעת פאלואידין (ירוקה) שימשה להצגת שלד האקטין. צביעה גרעינית בוצעה באמצעות DAPI (כחול). מיקרוסקופיה קונפוקלית אישרה את האינטרנליזציה של מיטוכונדריה אקסוגנית על ידי תאי L929 (סרגל קנה מידה = 50 מיקרון). (ב) ניתוח כמותי של יעילות קליטת המיטוכונדריה על ידי תאי L929 בנקודות זמן שונות. (ג) ניתוח צביעת JC-1 של פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית בתאי L929 לאחר קליטת מיטוכונדריה שמקורם בשריר השלד. (ד) ניתוח כמותי של יחסי פלואורסצנציה מצטברים למונומרים של JC-1 בתאי L929 של המקבל לאחר קליטת מיטוכונדריה. פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית עלה משמעותית לאחר הפנמת מיטוכונדריה פעילה שמקורם בשרירי השלד. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נותחה באמצעות ANOVA חד-כיווני (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

השתלת מיטוכונדריה היא אסטרטגיה מתפתחת בטיפול תאים ורפואה רגנרטיבית, המשחזרת את התפקוד הפיזיולוגי בתאים עם מטבוליזם אנרגיה פגוע באמצעות אספקת מיטוכונדריה שלמה תפקודית. בנוסף לוויסות חילוף החומרים של אנרגיה תאית, טכניקה זו יכולה לווסת תהליכים ביולוגיים מרכזיים כגון אפופטוזיס ולחץ חמצוני, ובכך לספק הזדמנויות טיפוליות חדשות למגוון מחלות 4,17,18,19. עם זאת, התרגום הקליני של השתלת מיטוכונדריה עדיין מתמודד עם מספר אתגרים, ביניהם היעדר פרוטוקולי בידוד מיטוכונדריאלי סטנדרטיים, יעילים וניתנים לשחזור, שעדיין מהווה צוואר בקבוק מרכזי.

כדי להתמודד עם סוגיה זו, המחקר הנוכחי הקים פרוטוקול ניסויי סטנדרטי ומוצג המבוסס על צנטריפוגציה דיפרנציאלית לבידוד יעיל של מיטוכונדריה חופשית פונקציונלית משרירי השלד של עכברים C57BL/6. על ידי אופטימיזציה של תהליך הטיהור ושילוב שלבי עיכול טריפסיני, שטיפה וטיהור, שיטה זו משפרת ביעילות את התנתקות הרקמות, שומרת על שלמות המבנה המיטוכונדריאלי ומפחיתה זיהום מרכיבים תאיים שאינם ממוקדים.

הפרוטוקול המוצע משיג איזון נוח בין טוהר המיטוכונדריה לתפוקה. בהשוואה לשיטות חילוץ מסורתיות המבוססות על טחינה, השיטה הנוכחית מהירה יותר, מעשית יותר וחסכונית יותר, מה שהופך אותה למתאימה ליישומים שגרתיים במעבדה ולהכנת מיטוכונדריה מתורמים. גישות הבידוד המיטוכונדריאלי הקיימות כוללות מגבלות מסוימות. לדוגמה, צנטריפוגציה עם גרדיאנט צפיפות וטיהור אימונואפיניות יכולים להגיע לטוהר גבוה יותר אך הם גוזלים זמן ויקרים, בעוד שגישות מבוססות גשושיות בקנה מידה ננומטרי אינן מפותחות מספיק לשימוש שגרתי^20,21. לרקמות צפופות כמו שריר שלד, שלב העיכול המוקדם האופטימלי של טריפסין (0.25% טריפסין ב-37°C למשך 10-15 דקות), בשילוב עם הומוגניזציה עדינה, שומר טוב יותר על שלמות המיטוכונדריה מאשר צנטריפוגה דיפרנציאלית קונבנציונלית בלבד.

במחקר זה, ערכת צנטריפוגה דיפרנציאלית זמינה מסחרית בתנאי טמפרטורה נמוכה לאורך כל ההליך ובעקבות זרימת עבודה סטנדרטית, שאפשרה רכישה מהירה של מיטוכונדריה שלמה מבנית. כדי להתמודד עם בעיות פוטנציאליות בתהליך החילוץ, כולל תפוקה נמוכה, זיהום חלבונים ופוטנציאל ממברנה חריג, מוצעות מספר אסטרטגיות לפתרון תקלות.

תפוקה מיטוכונדריאלית נמוכה נגרמת לרוב מהומוגניזציה לא מספקת, כמות רקמה לא מספקת או אובדן צנטריפוגלי. בעיות אלו ניתנות למזעור על ידי הבטחת עיכול מקדים מספק, ביצוע הומוגניזציה עדינה (10-15 מעברים באמצעות הומוגנייזר הדוק), שימוש בלפחות 100-150 מ"ג של רקמת שריר שלד טרייה, שליטה קפדנית בתנאי צנטריפוגציה (1,000 × גרם להסרת פסולת ו-10,000-12,000 גרם × לפלט מיטוכונדריה), והשעיית דגימות באמצעות קצות פיפטה רחבי קידוח. זיהום חלבונים נובע בעיקר מהסרת פסולת לא שלמה או מהפרעות ליפידיות; לכן, מומלץ לחזור על שלב הצנטריפוגציה של 1,000 × גרם , לשלב שני שלבי שטיפה נוספים של 12,000 × גרם , ולהסיר בזהירות רקמת שומן. פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית חריג קשור לעיתים קרובות לנזק מכני או לתנודות טמפרטורה. לכן יש להימנע מהומוגניזציה מופרזת, לבצע את כל ההליך על קרח ולהשלים תוך 60-90 דקות, ויש להוסיף בופרי בידוד ב-EGTA ו-0.5% BSA. ניתן לשפר את ההומוגניזציה הלא שלמה על ידי הבטחת עיכול אנזימטי מספק, בחירת הומוגניזר מתאים, וביצוע סינון לאחר ההומוגניזציה.

למרות שהפרוטוקול הנוכחי משפר משמעותית את היעילות והטוהר של בידוד מיטוכונדריה, קיימות מספר מגבלות. ראשית, ההליך תלוי מאוד בטריות הרקמות; באופן אידיאלי, דגימות רקמה צריכות לעבור עיבוד תוך שעה לאחר המוות. שנית, טריפסין שנותר עלול לפרק חלבוני משטח מיטוכונדריאליים, כולל חלבונים הקשורים לטרנסלוקאז, אם לא יוסר כראוי במהלך הכביסה, מה שעלול להשפיע על יעילות הקליטה התאית בהמשך. שלישית, זמן האחסון המיטוכונדריאלי מוגבל, שכן אחסון ממושך בטמפרטורה של 4°C או הקפאה מפחיתים משמעותית את פעילות המיטוכונדריה.

ברמה התרגומית, נותרו אתגרים נוספים, כולל שיפור יעילות ההפצה בתוך החיים , הבנת המנגנונים ארוכי הטווח של אינטגרציה מיטוכונדרית, והבהרת אינטראקציות אפשריות בין מיטוכונדריה מושתלת לגנום המארח. עם ההתקדמות המתמשכת בטכנולוגיות בידוד וטיהור מיטוכונדריאלים, צפויים חידושים מתודולוגיים נוספים להאיץ את התרגום הקליני של טיפול בהשתלת מיטוכונדריה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	אפיון מיטוכונדריה
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	הפחתת דהייה של צבעים פלואורסצנטיים
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	מבחן ריכוז חלבון
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	נוגדן Beta-actin שימש לגילוי טוהר המיטוכונדריה המבודדת
BSA	Sigma	A6003	במהלך הבידוד, הוא קושר חומצות שומן חופשיות כדי להגן על פעילות המיטוכונדריה.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	צנטריפוגה ב-4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	להוציא חיבור חמצוני של הפוספורילציה המיטוכונדריאלית ולגרום לדליפת פרוטונים מירבית
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	תצפית על צביעת אימונופלואורסצנטית
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	אפיון מיטוכונדריה
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	לצביעת נגדית גרעינית
D-mannitol	Solarbio	IM00402	לשמירה על איזון אוסמוטי ולמניעת נפיחות מיטוכונדריאלית במהלך הבידוד
EGTA	Sigma	E4378	נמצא בשימוש נפוץ במאגרי בידוד מיטוכונדריאליים כדי להגן על תפקוד המיטוכונדריה על ידי קישור ספציפי ל-Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	גידול תאים L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	משמש לאחיזה, החזקה והרמת רקמות
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	משמש להומוגניזציה של רקמות ולבידוד מיטוכונדריה
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	זה קובע במהירות ומייצב את המבנה האולטרה-סלולרי של התא על ידי צלב חלבונים, ומונע אוטוליזה כדי לשמר את המורפולוגיה הטבעית של האורגנלים.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	מספק סביבת pH יציבה.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	גידול תאים L929
JC-1	Solarbio	M8650	גילוי שינויים בפוטנציאל הממברנה של מיטוכונדריה מטוהרים.
L929 cell line	Procell	CL-0137	לבדיקת סוף-פאגוציטוזה מיטוכונדרית
Lead citrate	Sigma	15326	כדי לצבוע חתכים דקים לתצפית מבנה תת-סלולרי דק.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	גידול תאים L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	כמרכיב של מאגר העברה, הוא משמש להסרת SDS ולהקלת העברת חלבונים מהג'ל לממברנה מוצקה.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	מדידת ספיגת JC-1-סטייני מיטוכונדריה
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	גילוי פוטנציאל קרום מיטוכונדריה בשרירים שלד
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	ערכות להפקה על בסיס צנטריפוגציה דיפרנציאלית
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	לשימור מיטוכונדריה
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	אפיון מיטוכונדריה
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	כמאגר בהכנת תמיסה
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 מכוון ל-IgG עכבר (H+L) ב-Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 מכוון ל-IgG ארנב (H+L) ב-ELISA ו-Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	הוא משמש בעיקר כחומר חסימה כדי להפחית את אות הרקע על ידי כיבוש אתרי קישור לא ספציפיים על הממברנה.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	קביעת תפקוד נשימתי מיטוכונדריאלי ומטבוליזם חמצן.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	או פוסט-פיקסציה לשמירת שומנים ושיפור ניגודיות הממברנה בדגימות TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	ניקוי רקמת שריר
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	גידול תאים L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	תיוג ציטו-שלד F-actin לתמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות
Polyvinyl