כימות שיעור המוות העוברי ב-Caenorhabditis elegans

סיכום

פרוטוקול זה מספק הליך פשוט וזול לכימות שיעור המוות העוברי ב-Caenorhabditis elegans. הוא מאפשר זיהוי פשוט של חריגות עובריות באוכלוסיות שונות ללא ציוד מיוחד או מומחיות באיסוף תולעים. הפרוטוקול יכול לשמש לכימות השפעות של מוטציות גנטיות, הפלות גנים בתיווך RNA ותזונה.

תקציר

קטלניות עוברית היא פנוטיפ יסוד המשמש במחקר Caenorhabditis elegans לאפיון ליקויים התפתחותיים הנובעים מגורמים כמו חשיפות רעילות ומוטציות גנטיות. לכן, כימות מדויק של חדירת קטלניות עוברית הוא קריטי להבנת המנגנונים וההשפעה של הפרעות אלו על התפתחות בעלי החיים. למרות שקיימות פלטפורמות ניקוד אוטומטיות, גישות אלו דורשות לעיתים השקעה כספית משמעותית וחומרה או תוכנה מיוחדת. מאמר זה מתאר מבחן טכנולוגי נמוך וזול שמכמת את קטלניות העובר על ידי מדידת אחוז העוברים שלא הצליחו לבקוע. ראוי לציין שגרסה זו של הבדיקה מבטלת את הצורך במכשיר תולעת, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד למתחילים. יתרון נוסף של גישה זו הוא שכל בדיקה טכנית משכפלת צאצאים ממספר בעלי חיים, וכך נמנעת מהטיות האפשריות של בדיקות תולעת אחת. פרוטוקול זה כולל דיון בפרמטרים קריטיים, כגון מספר הצאצאים המינימלי הנדרש כדי ללכוד במדויק את חדירת הפנוטיפ וההיגיון של המתודולוגיה. לבסוף, אנו מספקים הנחיות כיצד להתאים את הבדיקה להערכת השפעות הפלת גנים באמצעות התערבות RNA, טיפולים פרמקולוגיים או תוספי תזונה, ומוסיפים כלי גמיש ונגיש לכלי הכלים של חוקרי C. elegans .

מבוא

קטלניות עוברית היא פנוטיפ קריטי להערכת תפקידי גנים וגורמים סביבתיים בהתפתחות המוקדמת. C. elegans הוא מודל עוצמתי לחקר תהליכי התפתחות בשל שושלת התאים הבלתי משתנה שלו, גופו השקוף ומחזור החיים המהיר¹. ניתן להשתמש בקטלניות עוברית של C. elegans להערכת שלמות התפתחותית תחת הפרעות כימיות, פרמקולוגיות, תזונתיות וגנטיות 2,3,4,5. לכן, שיטות נגישות ורב-שימושיות לכימות מדויק של שיעור המוות העוברי יועילו לקהילת המחקר.

שיטות מתקדמות בעלות תפוקה גבוהה ותוכן גבוה החוקרות אמבריוגנזה מסתמכות על מערכות הדמיה ותוכנות ייעודיות, שדורשות לעיתים השקעה כספית ^{משמעותית 4,6,7}, בעוד ששיטות פשוטות וגבוהות יותר מספקות בעיקר קריאות איכותיות ^8,9. לעומת זאת, שיטות קלאסיות משתמשות בגישה ידנית וזולה, שכוללת בדרך כלל העברה חוזרת של הרמפרודיטים בודדים באמצעות פיק תולעת כדי להעריך את הקטלניות העוברית של כל הגוזל ^2,10. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מאתגרת טכנית למתחילים ויש לה יכולת הרחבה מוגבלת. בנוסף, בדיקות מסורתיות המבוססות על גודל גידול מכימות את החיוניות העוברית בצאצאי אם חד-הורית, מה שעלול לגרום להטיה לא מכוונת.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק גישה אלטרנטיבית, פשוטה, חסכונית ורב-תכלית לכימות כדאיות עוברית בקצב ביניים. שיטה זו מודדת את שיעורי הקטלניות העוברית בצאצאי בעלי חיים מרובים בכל שכפול, אינה דורשת שימוש בפיק תולעת, ומונעת ציוד מיוחד או יקר. המחקר גם מראה כיצד ניתן ליישם את השיטה על הפרעות נפוצות, כגון התערבות RNA ובדיקות תרופות או חומרים מזינים.

פרוטוקול

1. תחזוקת C. elegans

הערה: הנחיות מפורטות על גידול C. elegans ניתן למצוא בספר תולעת¹¹.

1. הכינו לוחות תחזוקה למדיום גידול נמטודה (NGM).
   1. כדי לייצר 1 ליטר NGM, יש לשלב 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון בקטריולוגי ו-17 גרם אגר בבקבוק של 2 ליטר. הוסיפו 975 מ"ל מים מזוקקים ומוט ערבוב, ואז אוטוקלאב למשך 20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
   2. תנו למדיום להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס באמבט מים. מניחים את הבקבוק על צלחת ערבוב, ובטכניקה אספטית מוסיפים 25 מ"ל של 1 מ' בופר פספט אשלגן ו-1 מ"ל כל אחד מהבאים: 1 מיליון MgSO₄, 1 מיליון CaCl₂, ו-5 מ"ג/מ"ל כולסטרול. שפכו כ-25 מ"ל לכל פלטה של 100 מ"מ.
2. הכינו תרביות E. coli OP50 ללילה.
   1. באמצעות טכניקה אספטית, מלא בקבוק Erlenmeyer בנפח 1 ליטר עד חמישית מנפחו (200 מ"ל) במדיום LB. החסן את המדיום במושבה אחת של E. coli OP50 באמצעות לולאת חיסון סטרילית. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-200 סל"ד.
3. לוחות תחזוקה של NGM זרעים עם E. coli OP50 (איור 1A).
   1. העבר את תרבית E. coli OP50 לבקבוקי צנטריפוגה עם אוטוקלב ולצנטריפוגה למשך 30 דקות בעוצמה של 3,500 x גרם בטמפרטורת החדר. החזירו את הכדור החיידקי בעשרים מהנפח המקורי. השתמשו ב-1–1.5 מ"ל של תרבית מרוכזת לזריעה של כל צלחת 100 מ"מ NGM.
   2. דגרו את הצלחות ללילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לחיידקים לגדול.
      הערה: לוחות תחזוקה אלו מכילים צפיפות חיידקים גבוהה לתמוך בעד 4,000 תולעים בכל צלחת, דבר רצוי בעת ביצוע מספר רב של בדיקות או עבודה עם זן שגדל לאט של C. elegans. צלחות תחזוקה עם זרעים יכולות להישמר במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
4. הקמת תרבות ראשונית של C. elegans (איור 1A).
   1. השתמש בקצה פיפטה סטרילית כדי לחתוך חתיכה קטנה של אגר עם ~1,000 תולעים מלוח תחזוקה רעב. הנח את חתיכת האגר על צלחת NGM עם זרעים.
   2. הניחו את הצלחת החדשה במיכל פלסטיק ודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים, עד שהתולעים נכנסות להריון ומטילות ביצים. ודאו שהדשא החיידקי מספיק, ושאוכלוסיית התולעים לא תמות מרעב. בשלב זה, אוכלוסיית התולעים מוכנה לניסוי.

2. הכנת מדיה ניסיונית ותרביות חיידקים

הערה: בשלב זה, יש להמשיך בשיטה 1 לבדיקת השפעת הפלת גנים בתיווך RNAi או בשיטה 2 לבדיקת תוספי תזונה.

1. שיטה 1: הכנת לוחות NGM ניסיוניים ל-RNAi על ידי הזנה.
   1. הכינו 1 ליטר של NGM כפי שמתואר בשלב 1.1, ואז, באמצעות טכניקה אספטית, מוסיפים 1 מ"ל של 1 מ"ג IPTG ו-1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל אמפיצילין. שפכו כ-5 מ"ל לכל פלטה בקוטר 35 מ"מ.
   2. החסנו את מספר השיבוטים הרצויים של שיבוטי תזונה של E. coli HT115 RNAi הנושאים פלסמידים של L4440 המכוונים לגנים של C. elegans , יחד עם בקרת הווקטור הריק. בחר מושבה אחת עם לולאת חיסון והעבר אותה ל-1.5 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. דגרו ל-18 שעות ב-37 מעלות צלזיוס על רועיד מסלול ב-200 סל"ד.
   3. זרעו לוחות NGM בקוטר 35 מ"מ המכילות אמפיצילין ו-IPTG עם 100 מיקרוליטר של תרבית E. coli HT115 ללילה, תוך הכנת שני שכפולים טכניים לכל תנאי. דגרו את הלוחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר צמיחת חיידקים ולעודד ייצור RNA דו-גדילי. אחסן מספר שווה של צלחות לא זרעיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר בהעברת ביצים.
2. שיטה 2: הכינו צלחות NGM ניסיוניות עם תוסף תזונתי או תרופתי.
   1. הכינו 1.5 מ"ל מים מזוקקים מרוכז על ידי ביצוע ההוראות בשלב 1.1, אך הוסיפו 642 מ"ל מים מזוקקים במקום 975 מ"ל. שמור את המדיום המוכן באמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
   2. הכינו מלאי מבוסס מים של התוסף הרלוונטי בריכוז פי 3 מהיעד (לדוגמה, להכנת לוחות המכילות פורמט נתרן של 40 מ"מ, להכין מלאי של 120 מ"מ). חשב את נפח המלאי הנדרש על ידי הכפלת מספר הלוחות הניסיוניים ב-1.666 מ"ל (שליש מנפח הלוח). השתמש במסנן מזרק כדי לסנן את הציר, ואז לחמם אותו ל-55 מעלות צלזיוס באמבט מים.
   3. בצינור קוני בנפח 50 מ"ל, מערבבים 2 חלקים 1.5x NGM עם תוסף 1 חלק. ללא שליטה בתוספים, ערבב 2 חלקים 1.5x NGM עם חלק אחד מים חמים סטריליים. ערבבו בעדינות על ידי הפיכת הצינור 10 פעמים, ואז, בטכניקה אספטית, שפכו במהירות כ-5 מ"ל מדיום לכל פלטה בקוטר 35 מ"מ.
      הערה: 1.5x NGM משמש לפיצוי על דילול בינוני כאשר מוסיפים כמויות גדולות של תוסף. עם זאת, אם התרופה או המאגר המטבוליטי מרוכזים ל-100× או יותר מהריכוז הסופי, ניתן להשתמש ב-NGM רגיל במקום 1.5× NGM. כאשר מוסיפים חומצה אורגנית, שימוש בצורת מלח הנתרן שלה יעזור למנוע ירידה ב-pH בינוני.
   4. באמצעות טכניקת אספטית, מלא בקבוק ארלנמאייר בנפח 50 מ"ל עד חמישית מהנפח שלו (10 מ"ל) במדיום LB. החסן במושבה של E. coli OP50 ודוגר לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על מנער אורביטלי ב-200 סל"ד.
   5. זרעו לוחות NGM בקוטר 35 מ"מ עם 100 מיקרוליטר של תרבית E. coli OP50 ללילה, והכינו שני שכפולים טכניים לכל תנאי. דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אחסן מספר שווה של צלחות לא זרעיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר בהעברת ביצים.

3. השגת אוכלוסייה מסונכרנת של זחלים L1

1. הכינו תמיסת אקונומיקה אלקלינית על ידי שילוב של 7 מ"ל מים סטריליים, 2 מ"ל תמיסת נתרן היפוכלוריט 5%, ו-1 מ"ל של 5 N NaOH.
2. הכינו בופר M9 על ידי המסה של 3 גרם KH₂PO₄, 6 גרם Na₂HPO₄, ו-5 גרם NaCl ב-1 ליטר מים מזוקקים, ואז כוונו את ה-pH ל-6.5. אוטוקלב למשך 20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, מאפשר לתמיסה להתקרר, ואז מוסיפים באופן אספטי 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4.
3. שטוף תולעים בוגרות ברות (שלב 1.4.2) מהפלטה עם בופר M9 והעבר אותן לצינור קונוסי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-350 x g למשך 2 דקות, שואף את הסופרנטנט, ומלא את הצינור בבופר M9 טרי. חזור על השטיפה פעמיים.
4. הוסף 2 מ"ל של בופר M9 ו-2 מ"ל תמיסת אקונומיקה אלקלינית לגלגלת התולעת. מערבולת ונענע בעוצמה, תוך בדיקה מעת לעת תחת המיקרוסקופ עד שכמעט כל התולעים נמסות.
5. מלא את הצינור בבופר M9 וצנטריפוגה ב-350 x g למשך 2 דקות. הסר את הסופרנטנט על ידי היפוך הצינור, ואז שטוף ארבע פעמים עם בופר M9. ודא שהשטיפה הראשונה מתבצעת מיד לאחר התלוש של התולעים כדי למנוע הלבנה מופרזת. לאחר השטיפה האחרונה, מלאו את הצינור ב-8 מ"ל של בופר M9 ודגרו על נדנדה במשך 18–20 שעות, עד שהביצים בוקעות.

4. גידול אוכלוסיות אימהיות

1. הניחו חמש טיפות של 3 מיקרוליטר של תלעת תולעת על מחסנית זכוכית וספרו את מספר הזחלים שבקעו ב-L1 תחת מיקרוסקופ. חלק את הספירה הכוללת ב-15 כדי לקבל את הריכוז למיקרוליטר.
2. הניחו 30 זחלים באורך L1 על כל צלחת באורך 35 מ"מ ודגרו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. אם תנאי הניסוי גורמים לעיכוב התפתחותי, יש להאריך את זמן הדגירה עד שהתולעים יהפכו להריון ויתחילו להטיל ביצים (איור 1B).

5. העברת עוברים לצלחות הבקיעה

1. הסר את הצלחות הלא זרעיות באורך 35 מ"מ מהמקרר ותן להן להגיע לטמפרטורת החדר.
2. בדקו את לוחות התולעת תחת מיקרוסקופ ואשרו שהן מכילות יותר מ-100 עוברים, ללא זחלים L1 שבקעו.
3. מלא בזהירות את הצלחת בבופר M9. השתמשו בקו ואקום כדי לשאוב את הנוזל ולהוציא את אוכלוסיית האימהות. ודא שאין תולעים בוגרות שנשארות על הצלחת.
4. מלאו קצה מיקרופיפטה ב-200 מיקרוליטר של בופר M9 ופיפטה למעלה ולמטה בכוח כדי לנתק עוברים מהדשא החיידקי. בעת הצפייה דרך המיקרוסקופ, הכוון את קצה הפיפטה לעבר אזורים צפופים בעוברים.
5. קח צלחת לא זרעה ופיפטה טיפה של תליית עובר למרכז. בדוק את הטיפה תחת המיקרוסקופ. אם אין בו 100–300 עוברים, יש להוסיף עוד השענת עוברים עד לטווח זה. ודאו שאף תולעים מאוכלוסיית ההורים לא מועברות עם העוברים.
6. תן לנוזל להתייבש, ואז דגר את לוחות ההעברה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 24 שעות.
   הערה: אם זחלי L1 כבר קיימים על לוח הניסוי, השתמשו בקו ואקום במקום שטיפת M9 כדי להסיר את כל אוכלוסיית האימהות אחת אחת. זה מונע שטיפת גוזלים מסוג L1, שאינם נדבקים לדשא החיידקי כמו עוברים. המשיכו בהעברת הצאצאים, שתכלול כעת גם עוברים וגם זחלים מסוג L1. ודא שאותה גישה מיושמת על כל המצבים.

איור 1: ציר זמן ניסיוני וסכמטי של השלבים המרכזיים במבחן קטלניות עוברית. (א) ציר זמן של תרשים זרימה המייצג את משך הפרוטוקול הניסיוני המלא, מהכנת מדיה לתחזוקה ועד לניקוד לוחות הבקיעה. הנהלים המרכזיים מצוינים לימים המתאימים לניסוי. (ב) סכמטי של מבחן הקטלניות העוברית (שלבים 4–6). ביום הרביעי, לרוות L1 מסונכרנות מתווספות ל-RNAi הניסיוני או לצלחות התוספים כדי לקבוע אוכלוסייה אימהית. לאחר 72 שעות, ביום השביעי, לאחר שהתולעים הטילו ביצים, אוכלוסיית האם נשטפת והעוברים נשארים מחוברים לדשא החיידקים. העוברים נשטפים מהדשא באמצעות פיפטה ומועברים לפלטת בקיעה, עם לפחות 100 עוברים בכל צלחת. לאחר 24 שעות של דגירה נספרים זחלים ועוברים שלא בקעו. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. לוחות דירוג

1. השתמש בטוש קבוע כדי לצייר רשת בגודל של כ-4 מ"מ × 4 מ"מ על מכסה צלחת פטרי 35 מ"מ, ואז מניח את המכסה מתחת לפלטה. השתמשו ברשת כמדריך, ותחת מיקרוסקופ ספרו את מספר הזחלים L1 והעוברים שלא בקעו באמצעות מונה קליקים ידני.
2. קומביין ספירות משכפולים טכניים כדי להבטיח משקל מתאים לכל שכפול בהתבסס על ספירת הצאצאים שלו. בפרט, מסכם את מספר העוברים והזחלים שטרם בקעו בין שכפולים טכניים.
3. חשב שיעור קטלניות עוברי אחד לכל שכפול ביולוגי על ידי חלוקת מספר העוברים (תולעים שלא בקעו) במספר התולעים והעוברים הכולל, ואז הכפלת 100 כדי לבטא את הערך כאחוז.
   הערה: אם צלחת מכילה רק זחלים בקעו או רק עוברים, ניתן לדלג על שלב הספירה הזה, שכן שיעור הקטלנות העוברית הוא 0 (0%) או 1 (100%), בהתאמה.

7. ניתוח סטטיסטי

1. חזור על כל הניסוי לפחות שלוש פעמים כדי לקבל שכפולים ביולוגיים עצמאיים. לכל שכפול ביולוגי, יש להשתמש בשני לוחות שכפול טכניים לכל תנאי, עם מינימום של 100 עוברים לכל שכפול טכני.
2. קבעו האם שיעורי הקטלנות העוברית שונים משמעותית בין מצבים המשתמשים ב-ANOVA חד-כיווני, ואחריהם מבחני t-סטודנט לאחר הוק עם תיקון במספר מבחנים, כמו שיטת בנג'מיני-הוכברג.
   הערה: שילוב של שני שכפולים טכניים מניב מינימום של 200 עוברים לכל שכפול ביולוגי. זה עונה על דרישת גודל המדגם (~184 עוברים למצב) שהוערכה על ידי מבחן power.prop.פונקציית בסיס R כדי לזהות הבדל של 15 אחוזים בקטלניות (למשל, 20% לעומת 35%) עם 90% הספק ורמת מובהקות של α = 0.05.

תוצאות

בדיקת הקטלניות העוברית בוצעה בשני זנים: סוג פראי N2 וזן רגיש ל-RNAi rrf-3 (pk1426). באמצעות RNAi על ידי האכלה, הפלנו גנים שדווחו בעבר כגורמים לקטלניות עוברית במסכים בעלי תפוקה^{גבוהה 9,12}. איור 2 מציג הדגמה מייצגת של ביצועי הבדיקה. הפלת T04G9.4 יצרה קטלניות עוברית כמעט חדירה במלואה הן בבעלי חיים rrf-3(pk1426) והן בבעלי חיים של N2 (איור 2A,B) ולכן עשויה לשמש כבקרה חיובית א...

דיון

מספר שלבים קריטיים לשחזור ולדיוק הבדיקה. ראשית, שלב ההלבנה חייב להיות מתוזמן בקפידה כדי להמיס תולעים בוגרות מבלי לפגוע בעוברים. נקודה חשובה נוספת היא העברת מספר מספיק עוברים לספירה: מעט מדי יפחיתו את הדיוק, בעוד שיותר מדי יהפכו את הספירה למייגעת מיותרת. לאחר מכן, יש לבצע העברת עוברים לפני שהעוברים מתחילים לבקוע. אחרת, הגוזלים יישטפו יחד עם הבוגרים, מה שעלול להטות את שיעור הבקיעה לכיוון קטלניות עוברית גבוהה יותר. לבסוף, כדי לשמור על עקביות בספירות עוברים ו-L1, יש להכשיר ניסויים מתחילים לז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח נתרן אמפיצילין	Sigma-Aldrich	A9518
פפטון בקטריולוגי	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	מרכז הגנטיקה של Caenorhabditis	N2	סוג פראי
C. elegans NL2099	מרכז הגנטיקה של Caenorhabditis	NL2099	rrf-3(pk1426) II. רגישות יתר ל- RNAi
סידן כלוריד, ללא מים	Sigma-Aldrich	746495
כולסטרול	Sigma-Aldrich	C3045
צינורות חרוטיים, 15 מ"ל	VWR	60818-725
צינורות תרבית, 14 מ"ל	VWR	470150-966
משאבת ואקום דיאפרגמה	Amazon	TC-100
מיקרוסקופ ניתוח	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	מרכז הגנטיקה של Caenorhabditis		חסר RNAse III, המשמש לניסויי RNAi על ידי הזנה
Escherichia coli OP50	מרכז הגנטיקה של Caenorhabditis
אגר מגורען	Fischer Scientific	BP97445
מונה מניין ידני	LabDepot	HTCP01
IPTG, ללא דיוקסאן (איזופרופיל-b-D-תיאוגלקטוזיד)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	להכנת מדיום LB יש להמיס 25 גרם של אבקת LB ב- 1 ליטר מים מזוקקים. לחטא באוטולב למשך 20 דקות ב- 121.1 °C.
מזרק Luer Lok חד פעמי	BH Supplies	BH20LL
מגנזיום סולפט	Sigma-Aldrich	M2643
שקופיות מיקרוסקופ	Sail Brand	7101
צלחות פטרי, 100 מ"מ	Tritech Research	T3371
צלחות פטרי, 35 מ"מ	Tritech Research	T3501
מאגר פוספט אשלגן (PPB)			להכנת מאגר פוספט אשלגן (1 M), יש להמיס 98 גרם של פוספט אשלגן מונו-בסיסי ו- 48 גרם של פוספט אשלגן דו-בסיסי ב- 1 ליטר מים מזוקקים. להתאים את ה- pH ל- 6. לחטא באוטולב למשך 20 דקות ב- 121 °C.
פוספט אשלגן דו-בסיסי	Sigma-Aldrich	795496
פוספט אשלגן מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	529568
נענע (מנער מתנודד)	Corning LSE	6720
פיפטות סרולוגיות, 25 מ"ל	Corning	4489
פיפטות סרולוגיות, 5 מ"ל	Celltreat	229235
חממה רועדת Infors Multitron	INFORS HT	NA
נתרן כלוריד	Sigma-Aldrich	S9888
תמיסת נתרן הידרוקסיד, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
נתרן היפוכלוריט, 5%	LabDepot	LC246302
נתרן פוספט דו-בסיסי	Sigma-Aldrich	S9763
צנטריפוגה Sorvall ST1 Plus	Thermo Scientific	75016030
לוח ערבוב	ONilab	ONi28-S
פילטרים למזרק	Semmerfeld	JQP033022QE1
אמבט מים	FOUR E's Scientific	WB401