תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליאליים (MMPS): כלי קוד פתוח וידידותי למשתמש לניתוח כמותי של מורפולוגיית מיקרוגליה

סיכום

תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליאליים (MMPS) היא צינור ניתוח ידידותי למשתמש שאינו דורש מומחיות בקידוד ומבצע ניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית חד-תאית מתמונות אימונופלואורסנציה. מאומת במודל דלקת עצבית המושרה על ידי ליפופוליסכרידים, MMPS מזהה באופן שכפולי שינויים מורפולוגיים הקשורים להפעלה ומאפשר פנוטיפינג מיקרוגליאלי סטנדרטי וניתן להרחבה.

תקציר

מיקרוגליות הן תאי חיסון שמקורם במיאלואידים של מערכת העצבים המרכזית, המתווכים את התדרדרות הרקמה ושינוי הרקמות בעקבות פגיעה נוירולוגית, והפכו למטרות טיפוליות מבטיחות במספר מחלות ניווניות נוירולוגיות. ניתוח כמותי של מורפולוגיה מיקרוגליאלית יכול לחשוף הבדלים עדינים בין תת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות תוך שמירה על מידע חשוב במקום . עם זאת, פלטפורמות רבות הזמינות כיום לניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית אינן נגישות לציבור או דורשות מומחיות חישובית מיוחדת, מה שמגביל את השימוש הנרחב שלהן. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותחה פלטפורמת ניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית בקוד פתוח, בשם Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), באמצעות Python 3.11. MMPS תואם לתהליכי עבודה מבוססי אימונופלואורסצנציה ואינו דורש מומחיות קידוד להתקנה או להפעלה. התוכנה מאוטומטית חלקית את ניתוח המורפולוגיה של מיקרוגליה חד-תאית באמצעות ממשק גרפי נגיש ומשלבת תהליכי עבודה מותאמים אישית של עיבוד תמונה ויצירת מסכות. המחקר עוסק באימות MMPS באמצעות מודל דלקת עצבית המושרה על ידי ליפופוליסכריד מכרסמים (LPS). ניתוח כמותי ברמת בעלי חיים הראה כי מיקרוגליה מבעלי חיים שטופלו ב-LPS הציגה עלייה משמעותית באזור הסומה (p < 0.01) והיקף התא המופחת (p < 0.05) בהשוואה לביקורת שטופלו ברכב, בהתאם לתכונות מורפולוגיות הקשורות להפעלה מיקרוגליאלית ודלקת עצבית. בסך הכל, MMPS מספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור לניתוח כמותי של מורפולוגיה מיקרוגליאלית בין מעבדות.

מבוא

מיקרוגליות הן תאי חיסון מולדים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הסוקרים באופן רציף את סביבתם לאיתור פתוגנים ונזק לרקמות¹. עם ההפעלה, המיקרוגליות מושכות את תהליכיה ועוברות ממורפולוגיה הומאוסטטית ומסועפת לפנוטיפ אמאבואידי ^2,3. במחלות נוירודגנרטיביות כמו שבץ איסכמי ^4,5 ומחלת אלצהיימר ^6,7. מיקרוגליה לעיתים קרובות מנציחה דלקת עצבית באמצעות ייצור ציטוקינים מתמשך, התדרדרות רקמה נרחבת ופגוציטוזה². תהליכים אלו תורמים להפרעה ביחידת העצבים העצבית, ומחמירים עוד יותר את הפעלת המיקרוגליאלים ואת פגיעת מערכת העצבים^{המרכזית 8}, ובכך הופכים את המיקרוגליה ליעדים טיפוליים מבטיחים ^9,10.

גישה אחת לזיהוי הבדלים עדינים בין תת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות במחלות נוירודגנרטיביות היא באמצעות ניתוח מורפולוגי. פעולה זו מתבצעת בדרך כלל באמצעות בעלי חיים מסוג Cx3CR1-GFP עם מיקרוסקופ דו-פוטוני¹¹ ב-vivo או באמצעות תיוג אימונופלואורסצנציה (IF) של סמנים מיקרוגליאליים מוכרים כגון מולקולת אדפטור קישור סידן מיוננת-1 (Iba1) או קולטן פורינוצפטור P2Y¹². למרות שמיקרוגליה עוברת לעיתים קרובות בין מורפולוגיות הומאוסטטיות לאמבואידים לאחר פציעה, מחקרים קודמים הראו שמיקרוגליה יכולה גם לאמץ פנוטיפים נוספים, כולל מיקרוגליה היפר-מסועפת ^3,13, מיקרוגליה חלת^{דבש 3,14}, מיקרוגליה תגובתית¹⁵, ומיקרוגליה מוטית ^3,16. עם זאת, מחקרי מורפולוגיה מיקרוגליאלית לעיתים קרובות מסתמכים על סיווג ידני של פנוטיפים הומאוסטטיים ואמבואידים. גישות אלו דורשות צינורות ניתוח מיוחדים שלעיתים קרובות חסרים סטנדרטיזציה בין מעבדות, ומקשים על ההבחנה בין מורפולוגיות דומות, כמו הפנוטיפים הומיאוסטטיים לעומת פנוטיפים היפר-מסועפים, אפילו עבור אנשי מקצוע מיומנים¹⁷. יתרה מזאת, ניתוח מבוסס IF של שינויים מורפולוגיים עדינים דורש הדמיה ברזולוציה גבוהה, מה שעלול להוות אתגרים טכניים נוספים.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותחו מספר פלטפורמות אנליטיות שמזהות מיקרוגליה באופן חצי-אוטומטי¹¹ או¹⁸ ומייצרות ייצוגים בינאריים מרובים של התאים, הנקראים "מסכות", באזורים מוגדרים על ידי המשתמש (למשל, 200–800 מיקרון²). גישות אלו מפחיתות הטיית משתמש, משפרות את השחזוריות ומגבירות את היעילות האנליטית. למרות ההתקדמות הזו, פלטפורמות תוכנה רבות הזמינות כיום סובלות ממגבלות שמגבלות את האימוץ הנרחב, כולל חוסר נגישות בקוד פתוח¹⁷, דרישות למומחיות בתכנות 11,19,20, תלות במערכות מיקרוסקופיה דו-פוטונית ב-vivo ^11,19, היעדר ממשקי משתמש גרפיים אינטואיטיביים 11,21,22, איטי מהירויות עיבוד¹¹, או הסתמכות על פלטפורמות תוכנה מסחריות 12,19,21. למרות שמחקרים עדכניים החלו לטפל בכמה מהנושאים הללו, פלטפורמות רבות קיימות עדיין אינן מתאימות במיוחד לתהליכי עבודה מבוססי IF, שעדיין בשימוש נרחב לחקר מורפולוגיה מיקרוגליאלית.

כאן מוצגת פלטפורמת ניתוח מורפולוגיית מיקרוגליאליים ממוקדת משתמש בשם Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS אינו דורש מומחיות קידוד, משתלב עם זרימות עבודה מבוססות ImageJ מבוססות, ומעוצב במיוחד לשימוש עם תמונות IF. התוכנה פותחה ב-Python 3.11 ומשלבת מושגים מפלטפורמות מורפולוגיה בקוד פתוח^{שפורסמו בעבר 11}. ל-MMPS יש ממשק משתמש גרפי אינטואיטיבי המאפשר למשתמשים לייבא ולעבד כמויות גדולות של תמונות IF באמצעות אפשרויות עיבוד תמונה מותאמות אישית מרובות. הפלטפורמה כוללת גם בחירת תאים ידנית למזעור ארטיפקטים מדגימת יתר שנוצרו במהלך הדמיית IF, וכן תכנון סומה ידני למניעת הכללת תהליכים תאיים במדידות סומה. בנוסף, MMPS כולל פרמטרים מותאמים אישית של יצירת מסכות ומספר תכונות הבטחת איכות לשיפור דיוק המסכה. התוכנה מחשבת מספר פרמטרים מורפולוגיים נפוצים, כולל פרימטר, מרחק מרכז ממוצע, שטח מסכה, אקסצנטריות, עיגול ושטח סומה. למחקרים מתקדמים יותר, פלטים שנוצרים על ידי MMPS תואמים למספר תוספים של ImageJ וניתן לנתח אותם עוד יותר באמצעות תוספים נלווים לניתוחים פרקטליים, שלדיים וגוף ספינה.

MMPS אומת באמצעות מודל דלקת עצבית המושרה על ידי ליפופוליסכריד מכרסמים (LPS) על ידי בחינת שינויים מיקרוגליאליים בשכבת הקורטקס IV. ניתוח כמותי הראה כי מתן LPS הגדיל משמעותית את שטח הסומה המיקרוגליאלית תוך הקטנת היקף התא בהשוואה לביקורת שטופלו ברכב, מה שמעיד ש-MMPS מזהה במדויק שינויים מורפולוגיים עדינים הקשורים להפעלת מיקרוגליאל.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מערב וירג'יניה (פרוטוקול #2109047180) ולמדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, הנתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות. הציוד, החומרים והתוכנה המשמשים בשיטה זו מופיעים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים ניסיוניים

1. רכש 10 עכברי ספרג-דולי זכרים (2-3 חודשים). כאשר העכברים מגיעים למתקן החיות, יש לאחסן אותם בקבוצה במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ולמים. עם ההגעה, העכברים מתרגלים במשך 3 ימים לפני השימוש.
2. הקצו חולדות באקראי לקבוצות רכב או קבוצות שטופלו ב-LPS (n = 5 חולדות לקבוצה).
   הערה: בשל מספר העכברים הקטן לשימוש, ניתן להשתמש באסטרטגיית אקראיות פשוטה, עם מספרים אקראיים שנוצרו במחשב כדי לשייך את העכברים לקבוצת טיפול.
3. עקבו אחר חולדות לאחר טיפול ב"התנהגות מחלה": ירידה במשקל (>15%), הפרשת פורפירין, הפרעות נשימתיות או ירידה בפעילות.
   הערה: תסמיני התנהגות מחלה מופיעים לעיתים קרובות בתוך 12 השעות הראשונות לאחר ההעברה, לכן מזריקים חומרים מוקדם בבוקר (6-8 בבוקר), עוקבים אחרי התנהגות לאורך כל היום, ומחזירים חולדות למתקן מאוחר ביום (17:00-19:00).

2. מודל דלקת עצבית

1. הכינו את תמיסת המלאי LPS (O111:B4) (10 מ"ג/מ"ל) על ידי המסה של 50 מ"ג LPS במלח 5 מ"ל עם בופר פוספט.
   הערה: LPS הוא אנדוטוקסין. חוקרים צריכים לפעול לפי נהלי הפעולה של המוסד שלהם לטיפול ולסילוק.
2. שקלו חולדות ואז מזריקים תוך-פריטונית עם LPS (10 מ"ג/ק"ג) או PBS (רכב).
3. בהתבסס על משקל העכברים, צפוי נפח הזרקה בין 150–300 מיקרוליטר.
4. המית חולדות 24 שעות לאחר הזרקה באמצעות פרפוזיה לבבית ואחריה עריפת ראש.
5. הרדימו חולדות עם איזופלוראן שנשאף (5% בחמצן₂) למשך 5–10 דקות. אשר הרדמה בהיעדר רפלקס גמילה מהפדל.
6. בזמן ההרדמה, יש ליצור חתך חזה בקו אמצע כדי לחשוף את הסרעפת והעצם. מהדק את תהליך הזקפואיד באמצעות המוסטטים כדי לחשוף את חלל החזה.
7. חתוך את הסרעפת וכלוב הצלעות לכיוון הגפיים הקדמיות כדי לחשוף את הלב.
8. מהדק את האאורטה היורדת ואת הווריד הנוב התחתון עם המוסטטים. הכנס מחט כנפיים בקוטר 25 לתוך החדר השמאלי.
9. פרפיוז חולדות עם PBS קר (25 מ"ל ב-30 מ"ל לדקה) באמצעות משאבה פריסטלטית. חתך את העלייה השמאלית תוך מספר שניות מתחילת הפרפוזיה כדי לאפשר ניקוז פרפוזט.
10. חולדות פרפיוז עם 4% פאראפורמלדהיד (25 מ"ל ב-30 מ"ל לדקה).
    אזהרה: לטפל בפארפורמלדהיד באמצעות ציוד מגן אישי מתאים בסביבה מאווררת היטב. סילוק פסולת פאראפורמלדהיד בהתאם לתקנות מוסדיות ומקומיות.
11. ערפו את ראשם של חולדות עם גיליוטינה לאחר פרפוזיה.
    הערה: עקבו אחרי הנחיות המוסד שלכם בנוגע לתיעוד עריפות ראש והשחזת להבים.
12. חשפו את הגולגולת על ידי משיכת הקרקפת לכיוון הפינה.
13. שברו את עצם המצח באמצעות המוסטטים או רונג'ורים המוכנסים לשקעים האורביטליים.
14. הכניסו מלקחיים לפורמן מגנום וקילפו את עצמות הפריאטל.
15. הסר את המוח באמצעות מלקחיים דקים ודגר לילה ב-4% פאראפורמלדהיד.
16. העבר את המוח ברצף ל-20% סוכרוז ו-30% סוכרוז בלילה להגנה קריוקריוטמית.

3. אימונופלואורסצנציה

1. הקפיאו מוחות מוגנים בקריו ב-Tissue Tek O.C.T. תרכובת על קרח יבש.
2. חותכים מוח ב-30 מיקרון באמצעות קריוסטט.
3. לאסוף חתכים ב-PBS ולהעביר אותם לבארות רשת שהוכנסו לפלטת 12 בארות.
4. בחרו לפחות שני חלקים לכל עכבר המכילים את ההיפוקמפוס הגבי הקדמי.
5. שטוף חלקים ב-PBS במשך 5 דקות פעמיים בזמן הנדנוד.
6. חדיר קטעים ב-0.3% Triton X-100/PBS למשך 45 דקות בזמן הנדנוד.
   הערה: השתמש בתמיסה של 3 מ"ל לכל שלב שטיפה או דגירה אלא אם צוין אחרת.
7. שטוף חלקים ב-PBS במשך 5 דקות פעמיים.
8. מדלל את תמיסת שאיבת האנטיגן ל-1x ב-PBS והוסף 2 מ"ל לכל באר.
9. דגרו קטעים בטמפרטורה של 80°C למשך 20 דקות באמצעות אמבט מים.
10. תן לחלקים להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים.
11. שטוף חלקים ב-PBS במשך 5 דקות פעמיים.
12. מקטעי בלוק ב-10% סרום חמור/0.05% טריטון X-100/PBS ל-2 שעות ב-37°C עם רעידות ב-75 סל"ד.
13. שטפו חלקים בסרום חמור 1% ו-0.05% טריטון X-100/PBS למשך 5 דקות שלוש פעמים.
14. העבר חתכים ללוח חדש של 12 בארות ללא בארות הרשת המכילות 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית נגד Iba1 שהוכנה בסרום חמור 1% ו-0.05% טריטון X-100/PBS.
15. הכינו ביקורת שלילית על ידי השמטת הנוגדן הראשי מתמיסת הדגירה.
16. דגרו את כל החלקים בלילה בטמפרטורה של 4°C על נדנדה מסלולית.
17. החזר את החלקים לבארות הרשת.
18. שטפו חלקים בסרום חמור 1% ו-0.05% טריטון X-100/PBS למשך 10 דקות שלוש פעמים.
19. דגרו חתכים עם נוגדן משני נגד ארנבים (דילול של 1:1000) בסרום חמור 1% ו-0.05% טריטון X-100/PBS למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
    הערה: מזער את החשיפה לאור בכל ההליכים הבאים ועטוף לוחות בנייר אלומיניום כדי למנוע התדרדרות פלואורופור.
20. שטוף חלקים ב-PBS במשך 5 דקות פעמיים.
21. התקן חלקים על שקופיות מיקרוסקופ.
22. החלקות לייבוש באוויר בחושך למשך >2 שעות.
23. מקטעי כיסוי באמצעות תרכובות מסיסות במים.
24. הכינו שקופיות שליטה שלילית באמצעות מדיום התקנה.
25. אחסנו את הסליידס בקופסת שקופיות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה.

4. דימות

1. זהה את גודל הפיקסלים של מערכת הדמיה בהגדלה של פי 40. אם לא נמצא קנה המידה, הוסף פס קנה מידה לכל תמונה.
2. השתמש בצביעה DAPI לזיהוי רצועה צפופה של גרעיני קורטיקה בהגדלה נמוכה התואמת לשכבת הקורטקס IV.
3. למקד את התמונה באזור הקורטקס שזוהה.
4. עבור להגדלה של 40x.
5. כוון את הגדרות החשיפה לערוץ כדי למקסם את ההפרדה בין אות DAPI ו-Iba1 לפלואורסצנציה ברקע.
6. רכוש תמונות Z-stack (> 30 שלבים) המשתרעות על כל עומק המיקרוגליה.
7. יצר ושמור תמונת הקרנה בעוצמה מרבית מרוכבת מתוך ערימת ה-Z שנרכשה של שני הצבעים.
   הערה: אופטימיזציה של חשיפה והגדרות Z-stack לכל תמונה כדי למקסם את הפרדת האות בין DAPI/Iba1 לפלואורסצנציה ברקע. הפרדה לקויה של אותות מפחיתה את דיוק יצירת המסכות.

5. תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליאליים (MMPS)

1. אחסן את כל התמונות המורכבות בתיקיית תמונות אחת.
2. צור תיקיית פלט נפרדת לתוצאות שנוצרות על ידי MMPS.
3. הורידו את חבילת ה-MMPS העצמאית או סקריפט MMPS.py ממאגר GitHub.
4. התקן את כל התלויות שמופיעות בקובץ requirements.txt אם מפעילים MMPS דרך MMPS.py.
5. פתח את חבילת MMPS או הרץ MMPS.py סקריפיט.
6. בחר "בחר את תיקיית התמונה" ובחר בתיקיית התמונות.
7. בחר "בחר תיקיית פלט" ובחר את תיקיית הפלט.
8. הענק הרשאות גישה לתיקיות אם מערכת ההפעלה מתבקשת.
   הערה: הוראות התקנה נוספות, הנחיות לפתרון תקלות ודוגמאות שימוש מסופקות בתיעוד המשלים ובמאגר GitHub.
9. בחר "תיוג תמונה" והקצה לכל תמונה מזהי בעלי חיים וקבוצות טיפול.
   הערה: אם מדלגים על תיוג תמונה, MMPS מבקש מזהי קבוצות טיפול ובעלי חיים לפני ייצוא הנתונים.
10. הזן את גודל הפיקסל תחת לשונית "פרמטרים".
11. בחר "כיול מסרגל הסקאלה" אם גודל הפיקסל אינו ידוע. בחר את נקודות ההתחלה והסיום של פס הסולם כאשר מתבקשים. הנה את מרחק סקאל-בר הידוע במיקרומטרים.
12. בחר את ערוץ הפלואורסצנציה המכיל את אות המיקרוגליאל.
13. בחר תמונות לעיבוד על ידי סימון התיבה ליד שם כל תמונה. מעבדים תמונות בנפרד כאשר פלואורסצנציה ברקע שונה באופן מהותי בין התמונות.
14. עיין בלשוניות "מקורי", "תצוגה מקדימה", "מעובד" ו"מסכות" כדי להשוות בין שלבי עיבוד התמונה.
15. בחר "תצוגה מקדימה של תמונה נוכחית" כדי להעריך את הגדרות עיבוד התמונה.
16. כוון את הגדרות החיסור, הדנואיזציה והחדדה של רקע בכדור גלגול לפי הצורך.
17. השתמש בערכי כדור גלגול בין 5–150 פיקסלים לחיסור ברקע.
18. השתמש בערכים של הסרת רעש בין 3–7 פיקסלים כדי להפחית ארטיפקטים של תאורה לא אחידה.
19. השתמשו בערכי חידוד בין 1–2 לשיפור הגדרת הקצוות.
20. בחר "עיבוד תמונות נבחרות" לאחר אופטימיזציה של הגדרות עיבוד התמונה.
    הערה: זמן עיבוד התמונה משתנה בהתאם למספר התמונה ולפרמטרים הנבחרים.
21. בחר "בחר סומאס (כל התמונות)."
22. בחר "הצג צבע (C)" כדי להציג תמונות RGB מורכבות. בחר "ערוצים..." והסרת בחירת ערוצים לא בשימוש אם צבעי התמונה נראים מעוותים.
23. בחר סומות מיקרוגליאליות המציגות DAPI וקולוקליזציה של Iba1. הימנע מבחירת תאים שנוגעים בגבולות התמונה. הסר סימני SOMA שנבחרו לא נכון באמצעות מקשי "Backspace" או "Delete".
24. לחץ על "Enter" או "Return" כדי להמשיך לתמונה הבאה.
25. בחר "מתווה סומאס (כל)" לאחר סיום בחירת הסומה.
26. שרטט את היקף הסומה של כל תא מיקרוגליאלי נבחר. החריגו תהליכים תאיים ממתאר הסומה והשתמשו לפחות בשמונה נקודות מתאר לכל סומה. הסר נקודות מתאר שמונחות לא נכון באמצעות "ביטול נקודה אחרונה", "מחיקה" או "Backspace".
27. ללחוץ "הזן", "החזר", לחיצה כפולה או קליק ימני כדי לסיים כל מתווה של סומה.
28. בחר ב"Redo Last Outline" כדי לחזור על מתווה הסומה הקודם במידת הצורך.
29. בחר ב"יצירת כל המסכות" לאחר סיום תכנון ה-soma.
30. הפעילו ערך סף מינימלי כדי להגביל את שילוב פיקסלי רקע בעוצמה נמוכה במסכות.
    הערה: ערכים גבוהים יותר שומרים על דיוק הסומה על חשבון הסתעפות, בעוד ערכים נמוכים שומרים על דיוק ההסתעפות על חשבון ה-soma. ערכי סף בין 10–30% בדרך כלל מספקים דיכוי רקע מאוזן ושימור ענפים.
    הערה: זמן יצירת המסכה משתנה בהתאם למספר התאים הנבחרים.
31. בחרו ב"QA All Masks" כדי להתחיל בבדיקת איכות המסכה.
32. מסכות סקירה הוצגו מהגדולה ביותר (800 מיקרון²) ועד הקטנה ביותר (200 מיקרון²).
33. השווה כל מסכה למיקרוגליה המתאימה באמצעות הלשוניות "מעובד" ו"מסכה".
34. קבל מסכות באמצעות קיצור המקלדת "A". דחו מסכות באמצעות קיצור מקלדת "R". לחץ על "B" כדי לבטל קבלה או דחייה. נווט בין גדלי המסכות באמצעות מקשי החצים של המקלדת.
35. בחר את המסכה הגדולה ביותר שמקובלת שתופס במדויק הסתעפות מיקרוגליאלית מבלי לכלול תאים שכנים, רקע מופרז, גבולות תמונה או פסי קנה מידה.
    הערה: דחו מסכות אם יש אי-ודאות לגבי דיוקן.
    הערה: בחר "נקה את כל המסכות", ואז יצר מחדש את המסכות עם ערך סף שונה אם רובן לא מדויקות.
36. בחר "לחשב מאפיינים פשוטים" לאחר השלמת בדיקת איכות המסכה
    חשב מרחק מרכזי ממוצע, שטח מסכה, היקף, אקסצנטריות, עיגול וגודל SOMA באמצעות מסכות מקובלות וקווי מתאר של SOMA.
37. עיין בטבלה 1 להגדרות פרמטרים ומגמות מיקרוגליאליות בדלקת עצבית.
38. הורדה "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" ו"SkeletonAnalysisImageJ.py" לביצוע ניתוחים נוספים.
39. פתח "FractalAnalysis_ImageJ.py" כתוסף פיג'י לניתוח פרקטלי וגוף ספינה.
40. הזן את מיקום תיקיית הפלט וגודל הפיקסל כאשר מתבקשים. בחר באפשרות "המסכה הגדולה ביותר בלבד" אם רצוי ניתוח של המסכה הגדולה ביותר שהתקבלה.
41. פתח "Sholl.py" כתוסף פיג'י לניתוח של Sholl.
42. הזן את מיקום תיקיית הפלט וגודל הפיקסל כאשר מתבקשים.
43. הכירו את גודל שלב ניתוח השול הרצוי. בחר "השתמש ברדיוס סומה כרדיוס התחלה" כדי להשתמש ברדיוסים הסומה שמקורם ב-MMPS כרדיוס ההתחלה בניתוח שול. הזן ערך רדיוס סומה קבוע אם לא משתמשים ברדיוסים הסומה שמקורם ב-MMPS.
44. פתח את "SkeletonAnalysisImageJ.py" כתוסף פיג'י לניתוח שלד.
45. הזן את מיקום תיקיית הפלט, גודל הפיקסלים, ומיקום תיקיית המסכות כאשר מתבקשים.
46. יייצא את כל התוצאות שנוצרו על ידי תוספים כקבצי CSV לתיקיית הפלט לאחר סיומם.

6. נוסחאות המשמשות ב-MMPS לחישובי מורפולוגיה של מיקרוגליה

הערה: כל החישובים מתבצעים אוטומטית על ידי MMPS כאשר לוחצים על "Calculate Simple Properties". חישובי פרמטרים מוצגים להלן.

1. היקף
   1. חשב את ההיקף באמצעות המשוואה הבאה:
      
   2. הגדר כפרימטר, כמספר פיקסלי הקצה, וכגודל פיקסל במיקרומטר.
2. מרחק מרכזי ממוצע
   הערה: מרחק מרכזי ממוצע נקרא גם פיזור תאים¹¹.
   1. זהה ארבע נקודות קצה של ענף בהתבסס על קואורדינטות התא:
      ענף עליון: קואורדינטת Y מינימלית,
      ענף תחתון: קואורדינטת y מקסימלית,
      ענף שמאל: קואורדינטת x מינימלית,
      ענף ימין: קואורדינטת x מקסימלית.
   2. חשב את קואורדינטות המרכזים באמצעות המשוואות הבאות:
      
      
   3. הגדר c_{x ו-c y} כקואורדינטות מרכזיות, x_i ו-y_i כקואורדינטות פיקסלים, וכמספר הפיקסלים הכולל.
   4. חשב מרחק ענף באמצעות המשוואה הבאה:
      
   5. הגדר d כמרחק ענף, x_i ו-y_i כקואורדינטות קצה הענף, ו-c_{x ו-c y} כקואורדינטות מרכזיות.
   6. חישבו את המרחק הממוצע של המרכז באמצעות המשוואה הבאה:
      
   7. הגדר כמרחק מרכז ממוצע, כמרחק ענף, d_i וכגודל פיקסל במיקרון.
3. אזור המסכה
   1. חשב את שטח המסכה באמצעות המשוואה הבאה:
      
   2. הגדר כשטח המסכה במיקרומטר², כמספר הפיקסלים בתוך המסכה, וכגודל הפיקסל במיקרומטר.
4. אקסצנטריות
   1. חשב את המומנטים המרכזיים השניים באמצעות המשוואות הבאות:
      
      
      
   2. הגדר μ₂₀,_{μ 02} ו-μ₁₁ כרגעים מרכזיים שניים, x_i ו-y_i כקואורדינטות פיקסלים, c_x ו-c_y כקואורדינטות מרכזיות, ו-N כמספר הפיקסלים הכולל.
   3. חשב ערכי עצמי של מטריצת קו-וריאנס באמצעות המשוואה הבאה:
      
   4. הגדר λ₁ ≥ λ₂.
   5. חישבו אורכי צירים ראשיים ומינוריים באמצעות המשוואות הבאות:
      
   6. הגדר a כאורך ציר ראשי ו-b כאורך ציר קטן.
   7. חשב אקסצנטריות באמצעות המשוואה הבאה:
      
   8. הגדר כאקסצנטריות.
5. עגלגלות
   1. חשב עיגוליות באמצעות המשוואה הבאה:
      
   2. מגדירים כעיגול, כאורך הציר הראשי, וכאורך ציר קטן.
6. גודל סומה
   1. חשב את שטח הסומה באמצעות המשוואה הבאה:
      
   2. הגדר את Sa כשטח סומה במיקרומטר², כמספר הפיקסלים בתוך מסכת הסומה, ו-S כגודל פיקסל במיקרומטר.

7. ניתוח סטטיסטי

1. בצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות גרסה 4.3.2 של R.
2. סנן מערכי נתונים באמצעות המסכה הגדולה ביותר שהתקבלה לכל תא.
3. פרמטרים תאיים ממוצעים ברמת בעלי החיים לפני ניתוח סטטיסטי.
4. הערכו נורמליות ושונות באמצעות מבחני שפירו–וילק ולבן.
5. בצע מבחני t של סטודנט או ANOVA עם ממוצעים חוזרים עם מבחני t זוגיים מתוקנים על ידי הולם כאשר מערכי הנתונים עומדים בהנחות פרמטריות.
6. בצע בדיקות סכום דירוג וילקוקסון או מבחני פרידמן עם מבחני דירוג וילקוקסון חתומים מתוקנים על ידי הולם כאשר מערכי הנתונים אינם עומדים בהנחות פרמטריות.
7. הגדר מובהקות סטטיסטית כ-p < 0.05 .

תוצאות

פלטפורמת ניתוח מורפולוגיית מיקרוגליאלי עצמאית בקוד פתוח, בשם Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), פותחה כדי לספק זרימת עבודה נגישה וסטנדרטית לניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית מבוססת IF. הפלטפורמה בונה על שיטות קודמות של ניתוח מורפולוגיה, אינה דורשת מומחיות בקידוד, ומשלבת ממשק משתמש גרפי נגיש. MMPS תוכנן לשפר את זיהוי הסתעפויות מיקרוגליאליות עדינות תוך שילוב מספר אמצעי הגנה כדי לצמצם הערכה מופרזת של מסכות מיקרוגליאליות.

MMPS אומת באמצעות מודל דלקת עצבית של מכרסמים שנגרם על ידי LPS. לאחר עיבוד רקמות ורכישת תמונה (איור 1), אושרה ספציפיות ל-IF באמצעות קטעי ביקורת שליליים ללא צביעת נוגדנים ראשונית (איור משלים 1). עיבוד MMPS מתחיל בייבוא תמונות IF לממשק התוכנה (איור 2A). התוכנה מספקת אפשרויות עיבוד תמונה רבות לשיפור זיהוי אותות מיקרוגליים והפרדת רקע. חיסור רקע חובה מתבצע באמצעות אלגוריתם כדור גלגול שמיושם בחבילת התמונה של Scikit, בעוד שזמינים פילטרים אופציונליים להסרת רעש וחיזוק באמצעות סינון גאוסיאני מבוסס SciPy. לאחר עיבוד תמונה, סומות מיקרוגליאליות נבחרות ידנית ומזוהות באמצעות סמני בחירה אדומים (איור 2B). גבולות הסומה מתארים ידנית לאחר מכן לחישובים מורפולוגיים במורד הזרם (איור 2C).

איור 1: סקירה גרפית של מודל ועיבוד דלקת עצבית. העכברים הוזרקו ב-LPS או PBS ונאספו במשך 24 שעות עם פרפוזיה לבבית ואחריה כריתת ראש. המוחות הופקו ונחתכו לחלקים של 30 מיקרומטר לשימוש ב-IF לסמן מיקרוגליאלי Iba1, אשר לאחר מכן עובדו באמצעות MMPS. נוצר עם Biorender. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: סקירה של השימוש ב-MMPS. (א) דוגמה לתמונה של מיקרוגליה קורטיקלית (אדום, Iba1) עם גרעיני תאים (כחול, DAPI) שיש להתייחס אליו ב-MMPS (פס סולם = 75 מיקרון, 40x). לאחר עיבוד תמונה באמצעות MMPS, הרקע יוקטן ויבחן מורפולוגיות מדויקות (B) לאחר עיבוד התמונה ב-MMPS, סומות נבחרות ידנית עם עיגול אדום לשימוש בשלבים הבאים המפורטים בשיטות (פס קנה מידה = 75 מיקרון, 40x). (ג) שני מיקרוגליות מייצגות סומנו ידנית, ותמונות המתאר של הסומה שנשמרו מוצגות למטה. (D) יצירת מסכות של תאים נבחרים עוקבת אוטומטית אחרי ענפי מיקרוגליה עד 800 מיקרו^מ"ר, אך הדבר דורש בקרת איכות ידנית. כאן אנו מציגים את המסכה הלא מדויקת של 800 מיקרון² ואחריה המסכה המדויקת יותר של 700 מיקרון² . אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לאחר תכנון SOMA, MMPS מייצר מסכות באופן איטרטיבי בטווח גודל של 200–800 מיקרון^מעורבע באמצעות סף אדפטיבי המוגבל על ידי ספי מינימום עוצמה שהוגדרו על ידי המשתמש. מסכות קטנות יותר עוקבות יותר אחרי הסף שמוגדר על ידי המשתמש, בעוד שמסכות גדולות יותר מקלות בהדרגה את מגבלות הסף כדי למקסם את שילוב הסניף. מסכות שנוצרו עוברות בדיקת איכות ידנית כדי למנוע הכללת תאים שכנים, שילוב מופרז של רקע, או קיצור על ידי גבולות תמונה או פסי קנה מידה. כפי שמוצג באיור 2D, מסכת 800^{מיקרו-מטר 2} עבור תא מיקרוגליאלי מייצג התרחבה לתא סמוך. דחיית מסכת 800 מיקרון² ובחירת מסכת 700 מיקרון² תיקנו את שגיאת הסגמנטציה תוך שמירה על ההגדרה המדויקת של מיקרוגליה היעד.

לאחר עיבוד MMPS, הוערכה הפעלה מיקרוגליאלית באמצעות המסכה הגדולה ביותר המקובלת לכל תא, שכן מסכות אלו תפסו בצורה המדויקת ביותר את ההסתעפות הדיסטלית תוך צמצום הטמעת רקע. פרמטרים מורפולוגיים מחושבים מסוכמים בטבלה 1 ומיוצגים באיור 3. מתן LPS הפחית משמעותית את מרחק הצנטרואידים הממוצע והיקף התא בהשוואה לביקורת שטופלו ברכב (p < 0.05; איור 3A,B), תואם למשיכת תהליכים מיקרוגליאליים במהלך ההפעלה. לא נצפו הבדלים משמעותיים באזור המסכה, בעיגוליות או באקסצנטריות בין קבוצות הטיפול (איור 3C–E), למרות שדיווחים קודמים קישרו פרמטרים אלו לפנוטיפים מיקרוגליאליים מופעלים ^3,23. המחקר הנוכחי לא קיבל כוח סטטיסטי לזהות הבדלים עדינים בצורת הסומה או באזור המסכה, ותת-אוכלוסיות מיקרוגליאליות יכולות לאמץ מורפולוגיות דלקתיות הטרוגניות שאינן עוקבות באופן אחיד אחרי מגמות אלו³. לעומת זאת, אזור הסומה גדל משמעותית בבעלי חיים שטופלו ב-LPS בהשוואה לבקרת הרכב (p < 0.01; איור 3F), התומך עוד יותר בשדרוג מורפולוגי הקשור להפעלה²².

איור 3: השוואת פרמטרים מורפולוגיים מיקרוגליאליים. לכל הפאנלים נערכו בדיקות לנורמליות (שפירו-וילק ולבן) עם ערכים לא מובהקים שנמצאו בכל המקרים (עמ' >0.05), מה שהוביל לשימוש במבחני t לסטודנטים. הנקודות מייצגות בעלי חיים בודדים (n=5 לכל טיפול) (א) המרחק הממוצע של המרכז היה גדול משמעותית בקבוצת הרכב בהשוואה לקבוצת הטיפול ב-LPS. (ב) היקף תאי המיקרוגליה היה גדול משמעותית בקבוצת הרכב בהשוואה לקבוצת הטיפול ב-LPS. (ג) לא היה הבדל מובהק באזור המסכה בין קבוצות הטיפול. (ד) לא היה הבדל מובהק באקסצנטריות הסומה בין הקבוצות. (ה) אין הבדל משמעותי בעיגוליות הסומה בין קבוצות הטיפול. (F) נרשמה עלייה משמעותית בשטח הסומה בקבוצת LPS * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרמטר	הגדרה	קשר להפעלה מיקרוגליאלית
מרחק מרכז ממוצע	המרחק הממוצע של הענף הרחוק ביותר במיקומים העליונים, הימניים, התחתונים והשמאליים	ירידות
היקף	מדידת היקף התא	ירידות
אזור המסכות	האזור האמיתי של התא, לא אזור המסכה המטרה	ירידות
אקסצנטריות	מדידה של ההארכה המשוערת של סומה התא (0: מעגלי, 1: מוארכת מאוד)	ירידות
עגלגלות	מדידה של המעגליות המשוערת של סומה התא (0: מוארכת, 1: מעגלית)	העלאות
גודל סומה	שטח הסומה של התא	העלאות

טבלה 1: פרמטרים מחושבים מ-MMPS ושינוי צפוי בתגובה להפעלת מיקרוגליה. הטבלה מסכמת פרמטרים מורפולוגיים שחושבים על ידי תוכנת מיפוי פרמטרים מיקרוגליים (MMPS), כולל היקף, מרחק ממוצע של מרכז הגלריה (CENTROID), שטח המסכה, אקסצנטריות, עיגול ושטח סומה.

השכפול בין המשתמשים הוערך לאחר מכן על ידי מתן אותו סט תמונה למשתמשים עיוורים ולא מאומנים קודם לכן לניתוח עצמאי (איור משלים 2). לא זוהו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין המשתמשים, וכל המשתמשים שיחזרו מגמות מורפולוגיות התואמות את הפעלת המיקרוגליאלים בבעלי חיים שטופלו ב-LPS.

MMPS תומך גם בניתוחים מורפולוגיים מתקדמים במורד הזרם. ניתוח קורלציה של פרמטרים שנוצרו מאיור 3 הראה קשרים בין תכונות מורפולוגיות מובחנות. חולדות שטופלו ברכב הראו רק קורלציה חלשה בין עגלגליות המיקרוגליה להיקף (R² = 0.17), בעוד שחולדות שטופלו ב-LPS הראו קורלציה חזקה יותר (R² = 0.64), מה שמרמז כי הפעלה מוגברת של המיקרוגליה הייתה קשורה לירידה סימולטנית בעיגול ובהיקף (איור 4A). בנוסף, אזור המסכה הראה מתאמים חיוביים חזקים עם המרחק הממוצע של מרכז הרכבים והקבוצות שטופלו ב-LPS (R² = 0.71 ו-0.88, בהתאמה), בהתאם לשינויים במורכבות ההסתעפות הקשורה למצב הפעלה מיקרוגליאלי (איור 4B).

איור 4: ניתוח מתקדם של פרמטרים מיקרוגליאליים. כל הפאנלים הם קווים ברמת בעלי חיים של התאמה מיטבית, המחושבים בשיטת הריבועים המינימליים הרגילים, המוצגים עם מקדם הקביעה שלהם (R²) ומוצללים עם מרווח הביטחון של 95%. (א) עגלות הסומה המיקרוגליאלית ומגמת אורך ההיקף הכוללת חלשה במיקרוגליה מהווים את קבוצת הרכב (R² = 0.17) אך יש מתאם חזק יותר לאחר חשיפה ל-LPS (R² = 0.64). (B) המרחק הממוצע של הצנטרואידים מתאם עם שטח המיקרוגליה בקבוצות הרכב (R² = 0.71) ו-LPS (R² = 0.88). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: אימות פרוטוקול IF באמצעות בקרה שלילית. פרוסת מוח אחת מאותו אזור עבור כל חולדה עברה פרוטוקול IF ללא הוספת נוגדנים ראשוניים לאישור חוסר אוטופלואורסצנציה (פס סולם = 75 מיקרון) (A) תמונה מייצגת של רקמה מוכתמת ברכב עבור DAPI (כחול). (B) תמונה מייצגת של רקמה מוכתמת ברכב עבור Iba1 (אדום). (ג) תמונה מייצגת של רקמה מוכתמת ברכב עבור DAPI (כחול) ו-Iba1 (אדום). (D) תמונה מייצגת של רקמה מוצבעת ב-LPS עבור DAPI (כחול). (ה) תמונה מייצגת של רקמה מוכתמת ב-LPS עבור Iba1 (אדום). (ו) תמונה מייצגת של רקמה מוצבעת ב-LPS עבור DAPI (כחול) ו-Iba1 (אדום). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: הערכת שונות בין-משתמשית ב-MMPS. מספר משתמשים עיוורים השתמשו ב-MMPS על אותן דגימות מהאיור 3 והתוצאות ברמת בעלי החיים הושוו. לכולם, מבחני נורמליות (שפירו-וילק ולבן) היו לא מובהקים (p>0.05), מה שהוביל לשימוש ב-ANOVA עם ממוצעים חוזרים עם מבחן t זוגי מתוקן לאחר הוק הולם (p>0.05). (א) לא היה הבדל מובהק בין כל קבוצה בין משתמשים למרחק מרכז ממוצע (p>0.05). (ב) לא היה הבדל מובהק בכל קבוצה בין משתמשים להיקף (p>0.05). (ג) לא היה הבדל מובהק בכל קבוצה בין משתמשים מבחינת אזור המסכה (p>0.05). (ד) לא היה הבדל מובהק בין כל קבוצה בין משתמשים לאקסצנטריות (p>0.05). (ה) לא היה הבדל מובהק בכל קבוצה בין משתמשים מבחינת עגלגלות (p>0.05). (F) לא היה הבדל מובהק בכל קבוצה בין משתמשים באזור הסומה (p>0.05). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

המטרה העיקרית של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הנגישות לניתוח מורפולוגיה מיקרוגליאלית על ידי הפחתת חסמים טכניים נפוצים, תוך שמירה על חוזקות הגישות להערכה מורפולוגית מבוססות. MMPS מאפשר גילוי שינויים מורפולוגיים מיקרוגליאליים עדינים תוך שמירה על תאימות לניתוחים מתקדמים, כולל ניתוחי פרקטל, שלד, גוף ושול. בהשוואה לגישות שפורסמו בעבר, MMPS מספק ממשק משתמש גרפי נגיש, חישובים משולבים לפרמטרים מורפולוגיים נפוצים, וביטול דרישות קידוד תוך שמירה על תאימות לניתוחים מתקדמים יותר במורד הזרם.

מספר שלבים מתודולוגיים קריטיים משפיעים רבות על דיוק אנליטי ויכולת שחזור. הדמיית אימונופלואורסצנציה (IF) באיכות גבוהה חיונית ליצירת מסכות וחישובי מורפולוגיה אמינים. ספציפיות הנוגדנים מהווה גורם מרכזי לאיכות התמונה, שכן סימון לא ספציפי מעלה את הפלואורסצנציה ברקע ומפחית את הפרדת האותות בין המיקרוגליה לרקמה הסובבת. באופן דומה, ריכוזי נוגדנים תת-אופטימליים יכולים להפחית את עוצמת הפלואורסצנציה ולהפחית את רזולוציית התמונה. רכישת תמונות ערימת Z היא גם קריטית, שכן השמטת הדמיית Z-stack עלולה לשנות באופן מלאכותי את מורכבות ההסתעפות המיקרוגליאלית והתפשטות התהליך, ובכך להטות את החישובים המורפולוגיים.

מספר שיקולים נוספים חשובים במהלך עיבוד MMPS. למרות ש-MMPS תומך בעיבוד תמונה באצווה, אופטימיזציה אישית של תמונה לעיתים מועדפת מכיוון שמאפייני הרקע ואיכות הצביעה יכולים להשתנות משמעותית בין התמונות. איכות התמונה משפיעה ישירות על דיוק יצירת המסכה; לכן, אופטימיזציה במהלך עיבוד מוקדם של תמונה משפרת משמעותית את השחזוריות והעמידות של ניתוחים במורד הזרם. בחירה זהירה של סומות מיקרוגליאליות חשובה גם היא, במיוחד הימנעות ממגע תאים בגבולות התמונה, שכן סלקציה חלקית של תאים יכולה להפחית באופן מלאכותי את מדידות הסומה ולעוות את יצירת המסכה. במהלך בדיקת אבטחת האיכות של מסכות, יש לדחות מסכות שמכללות תאים סמוכים, רקע מופרז או גבולות תמונה. לעומת זאת, מסכות קטנות יותר לא צריכות להידחות רק בגלל שהן לא מצליחות ללכוד את כל התהליכים הדיסטליים, שכן אלגוריתם יצירת המסכות האיטרטיבי מכוון בכוונה את פרמטרי הסף המקומיים בהתאם לגודל המסכה ולעוצמת הפיקסל האזורית.

מתודולוגיה זו גמישה מאוד וניתן להתאים אותה לדרישות ניסוי ספציפיות. מכיוון ש-MMPS הוא קוד פתוח, ניתן להרחיב את הפלטפורמה לניתוח מסגרות Z-stack בודדות או לשלב אלגוריתמים אוטומטיים לזיהוי תאים ליצירת צינור ניתוח מורפולוגיה אוטומטי מלא. בנוסף, מסכות וקווי מתאר של סומה שנוצרו נשארים תואמים לזרימות עבודה מבוססות ImageJ לניתוחי פרקטלים, גוף, שלד ו-Sholl. מכיוון ש-MMPS פותח בפייתון 3.11, ניתן גם לשלב ניתוחים נוספים ישירות בתוכנה באמצעות חבילות מדעיות נפוצות בפייתון, מבלי לדרוש פלטפורמות תוכנה חיצוניות.

למרות היתרונות הללו, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. MMPS אומת באמצעות מודל דלקת עצבית באזור מוחי מסוים של זכרי חולדות ספרג-דולי, ואזורים שונים במוח, מודלים של מחלה, מינים או מין ביולוגי עשויים להשפיע על תוצאות מורפולוגיות. לכן, יש לאמת את היישום של MMPS לפרדיגמות ניסיוניות חלופיות באמצעות מחקרי פיילוט או לתמוך בהשוואות ספרות קודמות. בנוסף, הדמיה מבוססת IF לא מצליחה ללכוד באופן מלא מבני הסתעפות תלת-ממדיים, משום שתהליכים המתרחבים ישירות מעל או מתחת למישור המוקד עשויים שלא להתגלות בתמונות עם הקרנה מקסימלית. הגדלת מספר התאים שנבדקו עשויה לסייע בהפחתת מגבלה זו. MMPS גם נשאר תלוי באיכות רכישת התמונה ולכן דורש אופטימיזציה למערכות הדמיה בודדות, פרוטוקולי צביעה והכנות נוגדנים. תמונות ברזולוציה נמוכה יכולות להגדיל באופן מלאכותי את גודל המסכה בגלל גבולות מטושטשים סביב הסומות וענפים דחוסים היטב. מסיבה זו, הפרוטוקול הנוכחי משלב שיטות IF צפות ואפשרויות עיבוד תמונה מרובות כדי למקסם את איכות התמונה.

MMPS שומר גם על פוטנציאל לשונות תלויה במשתמש, שכן המשתמשים בוחרים תאים ומסמנים סומות באופן ידני. עם זאת, השימוש בקולוקליזציה של DAPI ו-Iba1 מפחית משמעותית את העמימות במהלך בחירת התא. יתרה מזאת, ניתוח בין-משתמש עיוור הראה שונות מינימלית בין משתמשים שלא היו מיומנים קודם, מה שתומך בשחזור תהליך העבודה האנליטי.

בניגוד למספר פלטפורמות מורפולוגיה מיקרוגליאלית שפורסמו בעבר, MMPS אינו אוטומטי לחלוטין. עם זאת, עיצוב זה נבחר כדי לתת עדיפות לדיוק סגמנטציה ולבטחת איכות המסכה. ניתן היה לשלב זרימות עבודה אוטומטיות באמצעות שינוי קוד המקור של פייתון כדי לאפשר זיהוי קולוקליזציה אוטומטית של DAPI/Iba1, תכנון סומה מבוסס קונטור, וקבלת או דחיית מסכות מבוססות למידת מכונה. בנוסף, MMPS דורש קיבולת אחסון דיסק משמעותית משום שמסכות וקווי מתאר SOMA שנוצרים נשמרים אוטומטית כקבצי .tiff לניתוחים בהמשך ולבקרת איכות. דרישות האחסון יכלו להיות מופחתות על ידי שינוי התוכנה ליצירת מסכות ברצף על בסיס תא-תא, ולאחר מכן הערכת איכות מיידית וחילוץ פרמטרים.

לסיכום, MMPS מרחיב את הגישה לניתוח כמותי של מורפולוגיה מיקרוגליאלית על ידי מתן פלטפורמה סטנדרטית וקוד פתוח שאינה דורשת מומחיות קידוד או יכולות דימות בחיים (in vivo ). הפלטפורמה מאפשרת ניתוח שכפול של מורפולוגיה מיקרוגליאלית מבוססת IF תוך שמירה על תאימות לגישות אנליטיות מתקדמות במורד הזרם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	פלטה המשמשת לגידול ולשטיפת חלקי רקמות.
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101	משמשת להגנה על דגימות פלואורסצנטיות מפני חשיפה לאור.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	משמש לשיפור הנגישות של האנטיגן במהלך צביעה פלואורסצנטית.
Anti-Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	נוגדן ראשוני המשמש לתיוג פלואורסצנטי של מיקרוגליה.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	מכשיר המשמש לחיתוך רקמות מוח קפואות בעובי מוגדר.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	נוגדן משני פלואורסצנטי המשמש לחזות נוגדנים ראשוניים של ארנבים.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	חומר חוסם המשמש להפחתת קישור נוגדנים לא ספציפי.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמש לרכישת תמונות.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	פלטפורמת עיבוד תמונות המשמשת לניתוח מורפולוגיה ותוספות.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	מדיום הרכבה המשמש לשימור פלואורסצנציה ואבטחת זכוכית מכסה.
Isoflurane	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	הרדמה לשאיפה המשמשת במהלך הליכים על בעלי חיים.
Lipopolysaccharide	Millipore Sigma	L2630	משמש לגירוי דלקת עצבית מערכתית והפעלת מיקרוגליה במכרסמים.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		ספריית שרטוט פייתון המשמשת לויזואליזציה של נתונים ויצירת דמויות.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	פלטפורמת תוכנה קוד פתוח שפותחה לניתוח מורפולוגיה של מיקרוגליה.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	תוספות המשמשות להחזקת חלקי רקמות צפים חופשיים במהלך נהלי צביעה.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		ספריית פייתון המשמשת לחישובים מספריים בתוך MMPS.
Objective lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	עדשה בעלת הגדלה נמוכה המשמשת לזיהוי כיוון אנטומי וזיהוי אזורים.
Objective lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	עדשה בעלת הגדלה גבוהה המשמשת לצילום מורפולוגיה של מיקרוגליה.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		ספריית ראייה ממוחשבת המשמשת לפונקציות עיבוד תמונה בתוך MMPS.
Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	169650025	חומר קיבוע המשמש לחדירה והשמרה של רקמות לפני חיתוך.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	מדיום הרכבה קבוע המשמש לשימור שקופיות.
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP3991	פתרון חיץ המשמש לשטיפת רקמות והכנת ריאגנטים.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		ספריית הדמיה של פייתון המשמשת לפעולות עיבוד תמונה.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		מסגרת GUI של פייתון המשמשת ליצירת ממשק משתמש גרפי של MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	סביבת שפת תכנות המשמשת לפיתוח והפעלת MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	תוכנת סטטיסטיקה המשמשת לניתוח נתונים ויצירת גרפים.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		ספריית ניתוח תמונות פייתון המשמשת לעיבוד תמונה ופילוח.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		חבילת מדעי חישוב פייתון המשמשת לפעולות סינון ועיבוד תמונה.
Sprague-Dawley Rats	Evingo	002	חיות ניסוי המשמשות לאימות מודל הדלקת העצבית.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	חומר קריופרוטקטיב המשמש לפני הקפאה של רקמת מוח.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		חבילת פייתון המשמשת לקריאה וכתיבה של קבצי תמונה TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	מדיום הטמעה המשמש לקריו-חתכים של דגימות רקמה קפואות.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	חומר גורף המשמש לחדירת