מאמר שיטה

הכנת שתלי עצב פריפריאלי אנושיים דה-צלולריים באמצעות נתרן הידרוקסיד ונתרן דאוקסיכולאט

22 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

1 בספטמבר 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לדה-צלולריזציה בסיוע בסיס, המשלבת טיפול בנתרן הידרוקסיד עם מערכת להחלפת תמיסות המונעת על ידי משאבה פריסטלטית, כדי להפיק שתלי עצב פריפריאלי אנושיים דה-צלולריים עם הסרה יעילה של תאים ושימור של מבנה המטריצה החוץ-תאית הטבעית.

תקציר

פגיעות בעצבים פריפריים דורשות לעיתים קרובות חומרי השתלה המספקים הדרכה מבנית לצמיחה מחדש של אקסונים. למרות שהשתלת עצב אוטולוגית נותרה תקן הזהב הקליני, השימוש בה מוגבל עקב תחלואה באתר התרומה וזמינות רקמה מוגבלת. מגבלות אלו הובילו לעניין גובר בשטלי עצב פריפריים אנושיים דה-צלולים (decellularized) כביומטריאל חלופי לרגנרציה של עצבים. עם זאת, פרוטוקולים נפוצים של דה-צלולציה מבוססי דטרגנטים עלולים לשבש את ארכיטקטורת המטריצה החוץ-תאית (ECM) ולהשאיר שאריות ציטוטוקסיות שעלולות לפגוע באיכות השתל. במאמר זה, מתואר פרוטוקול סטנדרטי להכנת שטלי עצב פריפריים אנושיים דה-צלולים באמצעות גישה של דה-צלולציה מסייעת בבסיס (alkaline-assisted). ההליך מתחיל בטיפול בנתרן הידרוקסיד (NaOH) כדי לקדם פירוק תאי יעיל, ולאחריו שלב עדין של נתרן דאוקסיכולאט (SDC) המסיר רכיבים תאיים ואימונוגניים שנותרו תוך שימור ארגון ה-ECM הטבעי. אסטרטגיה זו מגבילה את החשיפה לדטרגנטים תוך תמיכה בשימור ארכיטקטורת ה-ECM הטבעית. זרימת העבודה כוללת הכנה של עצב התורם, טיפול מבוקר ב-NaOH, טיפול עדין ב-SDC לאחר מכן, ושטיפה נרחבת תחת החלפת תמיסה רציפה באמצעות מערכת המונעת על ידי משאבה פריסטלטית כדי להקל על הסרת סוכני עיבוד שנותרו. שלבי עיבוד נוספים מיושמים כדי לשמור על השלמות המבנית ולהכין את השתלים לאריזה סופית וסטריליזציה. יעילות הדה-צלולציה מוערכת באמצעות ניתוח היסטולוגי וכימות של DNA שנותר, ושימור מבנה ה-ECM נבדק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. היעדר שאריות SDC והביואקומפטביליות של השתלים המעובדים אושרו באמצעות בדיקות ציטוטוקסיות. פרוטוקול זה מספק גישה מעשית לייצור שטלי עצב פריפריים אנושיים דה-צלולים לצורך מחקר רגנרציה של עצבים פריפריים ויישומים טרנסלציונליים.

מבוא

פגיעות בעצבים פריפריאליים עלולות להוביל לליקוי תפקודי חמור ומהוות אתגר קליני משמעותי ברפואה רגנרטיבית ובכירורגיה רקונסטרוקטיבית. התחדשות של פגמים עצביים סגמנטליים דורשת חומרי השתלה שאינם רק מגשרים על פער הפגיעה, אלא גם מספקים הכוונה מבנית ורמזים ביוכימיים לתמיכה ברגנרציה אקסונלית ובאינרווציה מחדש. השתלת עצב אוטולוגית נחשבת נרחבית כסטנדרט הזהב הקליני מכיוון שהיא משמרת את ארכיטקטורת המטריקס החוץ-תאי (ECM) הטבעית ומספקת מיקרו-סביבה תומכת להתחדשות העצב1,2. עם זאת, השימוש הקליני בה מוגבל בשל הזמינות המצומצמת של רקמת תורם, הצורך בפרוצדורות כירורגיות נוספות ותחלואה באתר התורם3,4. מגבלות אלו הובילו לפיתוח חומרי השתלה חלופיים, ובמיוחד השתלות של עצבים פריפריאליים דצלוולריים (נטולי תאים), השומרים על ארכיטקטורת ה-ECM הטבעית תוך מזעור רכיבים תאיים אימונוגניים5,6,7,8.

הביצועים של השתלי עצב שעברו דצולולריזציה תלויים במידה רבה בתהליך הדצולולריזציה. שיטות קונבנציונליות מסתמכות בדרך כלל על ריאגנטים מבוססי דטרגנטים כגון Triton X-100 וסודיום דאוקסיכולאת (SDC), המסירים רכיבים תאיים על ידי המסה של ממברנות ליפידיות9,10,11. עם זאת, חשיפה ממושכת לדטרגנטים אלו עלולה לפגוע במיקרו-מבנה של ה-ECM ולהשאיר חומרים ציטוטוקסיים שיריים המשפיעים לרעה על חיות התאים ועל תוצאות ההתחדשות12,13. כתוצאה מכך, נבדקות באופן פעיל אסטרטגיות דצולולריזציה חלופיות המאפשרות הסרה יעילה של תאים תוך שימור של שלמות ה-ECM14. דצולולריזציה בסיסית באמצעות נתרן הידרוקסיד (NaOH) עלתה כגישה חלופית פוטנציאלית, מכיוון שתנאי pH קיצוניים יכולים לפרק ביעילות רכיבים תאיים, חומצות גרעיניות וליפידים15,16,17. למרות זאת, חשיפה בלתי מבוקרת לתנאים בסיסיים חזקים עלולה לפגוע בשלמות ה-ECM, מה שמדגיש את החשיבות של תנאי עיבוד מבוקרים במדויק16,18.

כאן מוצג פרוטוקול סטנדרטי להסרת תאים (דסלולריזציה) של שתלי עצב פריפריאלי אנושי בסיוע בסיס, המשלב מערכת להחלפה רציפה של תמיסות המופעלת על ידי משאבה פריסטלטית. בהשוואה לשיטות טבילה סטטיות קונבנציונליות, תהליך דינמי זה מאפשר החלפה רציפה של התמיסה, ובכך מקל על הסרת פסולת תאית וחומרי עיבוד שביעות. מאמר זה מספק הדגמה חזותית שלב-אחר-שלב של זרימת העבודה המלאה, כולל הכנת העצב מהתורם, דסלולריזציה מבוקרת בסיוע בסיס, והחלפה רציפה של תמיסות באמצעות מערכת המופעלת על ידי משאבה פריסטלטית. השתלים שהתקבלו הוערכו באמצעות אנליזה היסטולוגית, כימות של DNA שרידי, ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) כדי לאשר דסלולריזציה יעילה ושימור של אולטרה-מבנה ה-ECM. על ידי מתן ויזואליזציה ברורה של שלבים טכניים קריטיים, מאמר זה מספק מסגרת מוגדרת בבירור להכנת שתלי עצב דסלולריים ולעתיד לצורך הגדלת קנה המידה של התהליך.

פרוטוקול

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. הכנת התמיסות (יום 1)

  1. הכינו תמיסת נתרן הידרוקסיד (NaOH) בריכוז 0.25 N על ידי המסה של 10 g של NaOH ב-1 L של מים מזוקקים תחת ערבוב מגנטי.
  2. הכינו תמיסת נתרן דאוקסיכולאט (SDC) בריכוז 4% על ידי המסה של 40 g של SDC ב-1 L של מים מזוקקים תחת ערבוב מגנטי.
  3. העבירו כל אחת מהתמיסות שהוכנו לבקבוקי זכוכית סטריליים.
    זהירות: יש לטפל בנתרן דאוקסיכולאט (SDC) בתוך מנדף כימיים. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה והגנה על העיניים, כדי למנוע שאיפה ומגע עם העור.

2. הכנת מקטעי העצב הפריפריאלי להסרת תאים (Decellularization)

  1. חטא את המשטח החיצוני של אריזת העצב הפריפריאלי הגולמי ופתח את האריזה באופן אספטי.
  2. שטוף את העצב הפריפריאלי מספר פעמים במים מזוקקים סטריליים.
  3. הסר רקמת שומן שרידית, רקמת חיבור, ענפים מיותרים ורקמת עצב פגועה באמצעות מספריים ופינצטה סטריליים. שטוף שוב את העצב הפריפריאלי במים מזוקקים סטריליים.
  4. חתוך את העצב הפריפריאלי למקטעים באורך 2–5 cm. סווג את המקטעים שהוכנו לשלוש קבוצות אורך: 2–3 cm, >3–4 cm, ו->4–5 cm.
    הערה: עבד כל קבוצת אורך בנפרד, כיוון שמשכי הטיפול ב-IPA, NaOH ו-SDC משתנים בהתאם לאורך מקטע העצב, כפי שמרכז ב-טבלה 1.

3. הגדרת מערכת משאבת הפריסטלטיקה

  1. חברו צינור סיליקון עמיד כימית באורך מספיק לשני קצותיה של עמודת הכרומטוגרפיה.
  2. חברו קצה אחד של הצינור למשאבה הפריסטלטית.
  3. חברו את הקצוות החופשיים של הצינור לבקבוק זכוכית של 1 L המכיל isopropyl alcohol (IPA) באמצעות צינור משאבה כדי ליצור מערכת סירקולציה במעגל סגור.
    הערה: הדקו היטב את כל חיבורי הצינורות, שכן לחץ ורטט מהמשאבה הפריסטלטית עלולים לגרום לניתוק הצינור מהעמודה או מהבקבוק.

4. הסרת ליפידים מהעצב ההיקפי

הערה: אלא אם צוין אחרת, בצע את כל שלבי החלפת התמיסות בטמפרטורת החדר (20–25 °C) באמצעות משאבה פריסטלטית המכוונת ל-90–186 mL/min, בהתאם לתצורת הצינורות. שמור על קצב זרימה קבוע לאורך כל סבב עיבוד.

  1. פתחו קצה אחד של עמודת הכרומטוגרפיה ומלאו את העמודה חלקית בתמיסת IPA כדי להבטיח שרקמת העצב תישאר טבולה מיד לאחר ההחדרה.
  2. באמצעות פינצטה סטרילית, אחזו בעדינות ברקמה החיצונית בקצה אחד של מקטע עצב פריפרי נגבוי בודד. הימנעו מדחיסה ישירה או מאחיזה של גוף העצב המרכזי. הורידו בזהירות את מקטע העצב אל תוך התמיסה בתוך העמודה.
  3. באמצעות הפינצטה, יישרו בעדינות את מקטע העצב ומקמו אותו לאורכו, במקביל לכיוון זרימת הנוזל. ודאו שהמקטע אינו מקופל, מלופף או לחוץ כנגד הדופן הפנימית של העמודה או כנגד מסנן היציאה.
  4. סגרו את העמודה ומקמו אותה בשיפוע קל כלפי מעלה לכיוון היציאה, כאשר היציאה ממוקמת מעט גבוה יותר מהכניסה. אוריינטציה זו מסייעת למנוע ממקטע העצב לשקוע כנגד מסנני הקצוות, ובמיוחד כנגד מסנן היציאה.
    הערה: עיבדו מקטע עצב פריפרי אחד לכל עמודה בכל פרוצדורה. אין צורך בהתקן קיבוע פיזי נוסף. הציפה הטבעית של רקמת העצב וזרימת הנוזלים העדינה יחסית מסייעות לשמור את המקטע במצב תלוי ומתוח. בדקו את מיקום הרקמה במהלך העיבוד ומקמו אותה מחדש בעדינות באמצעות פינצטה סטרילית אם היא נדבקת לדופן העמודה, למסנן או לעצמה.
  5. חברו את תמיסת ה-IPA למערכת משאבת הפריסטלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמודה למשך 1.5 h עבור מקטעי עצב באורך 2–3 cm, למשך 2 h עבור מקטעים באורך >3–4 cm, או למשך 2.5 h עבור מקטעים באורך >4–5 cm.
  6. רוקנו את התמיסה מהעמודה.
  7. הוסיפו 40 mL של מים מזוקקים סטריליים לעמודה. הפכו או נערו בעדינות את העמודה חמש פעמים כדי לשטוף את העצב הפריפרי.
  8. חזרו על שלבים 4.6 ו-4.7 למשך חמישה שטיפות בסך הכל.
  9. חברו מאגר המכיל 5 L של מים מזוקקים סטריליים למערכת משאבת הפריסטלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמודה במהלך הלילה.
    נקודת עצירה: לאחר השלמת השטיפה הלילית, ניתן להשהות את הפרוצדורה. עצרו את משאבת הפריסטלטיקה ואחסנו את העצב הפריפרי כשהוא טבול לחלוטין במים מזוקקים סטריליים בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 24 h לפני המעבר לשלב 5.1.
    הערה: צמצמו את כמות בועות האוויר בתוך העמודה כדי לקדם החלפה יעילה של התמיסה. התאימו את מיקום מקטע העצב הפריפרי לפי הצורך כדי לשמור עליו תלוי בתמיסה ולמנוע ממנו להידבק לדופן הפנימית של העמודה או למסנן.

5. ביצוע דה-צלולריזציה ראשונה (יום 2)

  1. חברו את תמיסת ה-0.25 N NaOH למערכת משאבת הפריסטאלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמודה במשך 6 h עבור מקטעי עצב באורך 2–3 cm, במשך 8 h עבור מקטעים באורך >3–4 cm, או במשך 10 h עבור מקטעים באורך >4–5 cm.
  2. רוקנו את התמיסה מהעמודה.
  3. שטפו את העצב הפריפרי כפי שמתואר בשלבים 4.6–4.8.
  4. חברו מיכל המכיל 5 L של מים מזוקקים סטריליים למערכת משאבת הפריסטאלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמודה במהלך הלילה.
    נקודת עצירה: לאחר השלמת השטיפה הלילית, ניתן להשהות את הפרוצדורה. עצרו את משאבת הפריסטאלטיקה ואחסנו את העצב הפריפרי כשהוא טבול לחלוטין במים מזוקקים סטריליים בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 24 h לפני המעבר לשלב 6.1.

6. ביצוע דה-צלולריזציה שנייה (יום 3)

  1. חברו את תמיסת ה-SDC בריכוז 4% (w/v) למערכת משאבת הפריסטלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמוד למשך 6 שעות עבור מקטעי עצב באורך 2–3 cm, 8 שעות עבור מקטעים באורך >3–4 cm, או 10 שעות עבור מקטעים באורך >4–5 cm.
  2. רוקנו את התמיסה מהעמוד.
  3. שטפו את העצב הפריפרי כך כפי שמתואר בשלבים 4.6–4.8.
  4. חברו מיכל המכיל 5 L של מים מזוקקים סטריליים למערכת משאבת הפריסטלטיקה. בצעו החלפה רציפה של התמיסה דרך העמוד למשך הלילה.
    נקודת עצירה: לאחר השלמת השטיפה הלילית, ניתן להשהות את הפרוצדורה. עצרו את משאבת הפריסטלטיקה ואחסנו את העצב הפריפרי טבול לחלוטין במים מזוקקים סטריליים בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 24 שעות לפני המעבר לשלב 7.1.

7. עיקור של העצב ההיקפי לאחר הסרת תאים (יום 4)

  1. הסיר נפח קטן של מים מזוקקים מהעמודה. הוצא בזהירות את העצב ההיקפי שעבר דה-צלולריזציה (decellularized) תוך שמירתו תלוי בנוזל שנותר.
  2. ארוז את העצב ההיקפי יחד עם מים מזוקקים סטריליים.
  3. עקר את העצב ההיקפי הארוז באמצעות הקרנת גמא במינון של 25 kGy.
    הערה: אין לרוקן את המים המזוקקים מהעמודה באופן מלא. השאר את מקטע העצב תלוי בנפח מספיק של הנוזל שנותר כדי למנוע ממנו להידבק לדופן הפנימית של העמודה וכדי לאפשר טיפול עדין, תוך הקפדה שהנוזל לא יעלה על גדותיו.

תוצאות

סקירה כללית של תהליך ההכנה עבור שתלי עצב פריפריאלי אנושי דה-צלול מופיעה ב איור 1. זרימת העבודה כללה קיצוץ של העצב הפריפריאלי הגולמי, הסרת שומנים באמצעות IPA, דה-צלול כימי רצפי עם NaOH ו-SDC, ולאחריהם שטיפה נרחבת וסטריליזציה (איור 1).

מערכת החלפת התמיסות המונעת על ידי משאבה פריסטלטית, המשמשת להסרת שומנים (delipidization), דה-צלולריזציה ושטיפה, מוצגת ב-איור 2A. קיצוף וחלוקה של העצב למקטעים מודגמים ב-איור 2B–D. לאחר השלמת התהליך, העצב הפריפריאלי שמר על המורפולוגיה הכללית שלו ללא שיבוש מבני נראה לעין (איור 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

ניתוח אולטרה-מבני באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM) מוצג ב איור 4. הארגון הסיבי של המטריצה החוץ-תאית (ECM) נותר גלוי בבירור לאחר תהליך הסרת התאים (decellularization), דבר המעיד על שימור המבנה המקורי של ה-ECM (איור 4).

הערכת שאריות הדטרגנט והתאימות התאית מוצגת ב איור 5. רמות ה-SDC השאריות היו מינימליות לאחר שלבי השטיפה (איור 5A). בדיקת ציטוטוקסיות לא הראתה תגובה ציטוטוקסית משמעותית בתאים שהוצבו במגע עם השתלי עצב היקפי שעברו דה-צלולריזציה (איור 5B).

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה להכנת שתלים של עצב פריפריאלי אנושי לאחר דסלולריזציה. מקטעי עצב פריפריאלי אנושיים נתרמים מוכנים תחילה על ידי קיצוץ וחלוקה למקטעים כדי להסיר רקמת חיבור היקפית. לאחר מכן, מקטעי העצב עוברים תהליך של הסרת ליפידים (delipidization) באמצעות החלפת תמיסות מבוססת IPA (יום 1). דסלולריזציה רצפית מבוצעת באמצעות NaOH (יום 2) ו-SDC (יום 3) תחת החלפת תמיסות רציפה במערכת המונעת על ידי משאבה פריסטלטית. השתלים המעובדים נארזים לאחר מכן ועוברים סטריליזציה (יום 4) כדי לקבל שתלי עצב פריפריאלי לאחר דסלולריזציה. קיצורים: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מייצגות של תהליך העיבוד של עצב פריפרי. (A) מערכת להחלפת תמיסות המונעת על ידי משאבה פריסטלטית, המשמשת לדה-ליפידציה, דה-צלולריזציה ושטיפה. (B) עצב פריפרי אנושי נתרם לפני קיצץ. (C) עצב פריפרי במהלך קיצץ. (D) עצב פריפרי לאחר קיצץ ופילוח. (E) עצב פריפרי לאחר השלמת תהליך הדה-צלולריזציה המלא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3הערכת יעילות הדסלולריזציה. (A) תמונות מייצגות של צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&תמונות צבועות ב-H&E של רקמות עצב פריפריאלי אנושי טבעיות ומנוקות-תאים, המראות הפחתה ברכיבים התאיים לאחר תהליך הניקוי התאי. סרגי קנה מידה = 100 µm. (Bכימות תכולת ה-DNA השארית ברקמות עצב טבעיות ומנוקות-תאים, המבוטא כ-ng DNA ל-mg של רקמה יבשה. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (נ" = 3). *p < 0.05. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של המיקרו-ארכיטקטורה של העצב. תמונות SEM מייצגות של רקמות עצב פריפריאלי אנושי מקוריות (משמאל) ודה-צלולות (מימין), המראות שימור של ארכיטקטורת המטריצה החוץ-תאית לאחר תהליך הדה-צלולציה. סרגי קנה מידה = 2 µm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הערכת שאריות דטרגנט וציטוטוקסיות. (A) כרומטוגרמות של סטנדרט SDC (שמאלה) ותמציות משתולי עצב שעברו דסלולריזציה (ימינה) ששימשו להערכת שאריות דטרגנט. המלבן האדום מציין את האזור התואם לזמן השהייה של SDC (~3.2 min). (B) הערכת ציטוטוקסיות של תמציות משתולי עצב שעברו דסלולריזציה באמצעות פיברובלסטים מסוג L929 בהתאם להנחיות ISO 10993-5. תמונות מייצגות לאחר דגירה של 48 h מראות את קבוצת ביקורת הריאגנטים, תמצית משתולי עצב שעברו דסלולריזציה, ביקורת שלילית וביקורת חיובית. סרגי קנה מידה = 50 µm. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

אורך מקטע העצב (ס"מ)טיפול ב-IPA (שעות)טיפול ב-NaOH (שעות)טיפול ב-SDC (שעות)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

טבלה 1: משכי עיבוד ספציפיים לאורך עבור מקטעי עצב פריפריאלי בטווח שנבדק במחקר זה.

דיון

מחקר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לדצולריזציה בסיוע בסיס להכנת גרפטים של עצבי היקף אנושיים דצולריים לצורך רגנרציה של עצבי היקף. הפרוטוקול משלב טיפול מקדים בעצב התורם, דצולריזציה כימית מבוקרת, ומערכת להחלפת תמיסות המופעלת על ידי משאבה פריסטלטית בתוך זרימת עבודה מוגדרת בבירור, מה שמאפשר הסרה יעילה של רכיבים תאיים ואימונוגניים תוך שימור המבנה הטבעי של ה-ECM.

מאפיין מרכזי של שיטה זו הוא השילוב של טיפול בבסיס עם חשיפה מופחתת לדטרגנטים. פרוטוקולים קונבנציונליים המבוססים על דטרגנטים, כגון אלו של Sondell (3% Triton X-100 ו-4% SDC) ושיטת Hudson (sulfobetaine-10, sulfobetaine-16 ו-Triton X-200), נסמכים על טיפולי דטרגנט ממושכים ורב-שלביים כדי להשיג דסלולריזציה יעילה9,10. למרות שגישות אלו מסירות רכיבים תאיים ביעילות, חשיפה ממושכת לדטרגנטים עלולה לפגוע בשלמות ה-ECM ולתרום לרעילות תאית שיורית הקשורה לדטרגנטים19,20,21. בניגוד לכך, הפרוטוקול הנוכחי משלב NaOH כדי להגביר את הסרת התאים תוך הגבלה של החשיפה ל-SDC, ובכך מפחית את עומס הדטרגנטים הכולל ותומך בשימור המבנה הטבעי של ה-ECM.

היבט קריטי נוסף של פרוטוקול זה הוא מערכת החלפת התמיסות המונעת על ידי משאבה פריסטלטית. בניגוד לגישות מבוססות פרפוזיה, שעלולות להפעיל לחץ פנימי על הרקמה ולגרום לסיכון של שיבוש מבני21, מערכת זו מאפשרת החלפת תמיסות רציפה ומבוקרת בתוך עמודת כרומטוגרפיה. יעילותה של גישה זו נתמכת על ידי מספר תוצאות אנליטיות. ניתוח היסטולוגי וכימות של DNA שיורי אישרו הסרה יעילה של רכיבים תאיים, בעוד שניתוח SEM הדגים שימור של ארכיטקטורת ה-ECM הטבעית. בנוסף, רמות נמוכות של SDC שיורי ותוצאות תאיות (cytocompatibility) חיוביות תמכו בביו-תאימות של השתל שהתקבל. יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שהפרוטוקול משיג איזון בין דסלולריזציה יעילה לבין שימור מבני.

מספר שלבים טכניים הם קריטיים לצמצום השונות הפרוצדורלית ולשמירה על תנאי עיבוד מבוקרים. ראשית, טיפול זהיר במקטע העצב במהלך הקיצוץ, ההעברה והשטיפה הוא חיוני. רקמת עצב פריפרית היא שבירה מבחינה מכנית, ודחיסה, קיפול או מתיחה מופרזים עלולים לשבש את המבנה הפנימי ולפגוע בשימור ה-ECM19,20. לכן, יש לשמור על הרקמות לחות ולטפל בהן בעדינות לאורך כל הפרוצדורה. שנית, החלפה אחידה של התמיסה בתוך העמודה היא גורם מפתח בביצועי התהליך. יש לצמצם ככל הניתן בועות אוויר בתוך העמודה, והרקמה צריכה להישאר טבולה וסוספנדית באופן מלא בתמיסה, במקום להיצמד לדופן העמודה או למסנן. היצמדות של הרקמה עלולה להוביל להחלפת תמיסה לא אחידה, מה שיפחית את יעילות השטיפה ויגרום לחשיפה לא עקבית לריאגנטים של העיבוד21,22. שלישית, המערכת המונעת על ידי משאבה פריסטלטית חייבת לפעול בצורה יציבה לאורך כל הפרוצדורה. סירקולציה רציפה נדרשת לצורך דליפידציה, דסלולריזציה ושטיפה; לכן, יש להדק היטב את כל חיבורי הצינורות כדי למנוע ניתוק עקב לחץ או רעידות הנגרמים מהמשאבה. במהלך שליפת הדגימה, יש להימנע מניקוז מלא של העמודה. שמירה על נפח נוזל מספיק מסייעת במניעת היצמדות הרקמה ומקלה על טיפול עדין במהלך האיסוף.

מקטעי עצב באורך 2–3 cm עובדו עם IPA, NaOH ו-SDC למשך 1.5, 6 ו-6 שעות, בהתאמה. מקטעים באורך >3–4 cm עובדו למשך 2, 8 ו-8 שעות, בהתאמה, בעוד שמקטעים באורך >4–5 cm עובדו למשך 2.5, 10 ו-10 שעות, בהתאמה. לפיכך, משכי הטיפול נעו בין 1.5 ל-2.5 שעות להסרת שומנים באמצעות IPA ובין 6 ל-10 שעות לכל שלב של דה-צלולריזציה. כל שאר פרמטרי העיבוד, כולל ריכוזי הריאגנטים, נפחי התמיסות ונהלי השטיפה, נשמרו באופן עקבי בכל קבוצות האורך. בהתאם לתצורת הצינורות, קצב הזרימה נקבע בטווח המוגדר ונשמר קבוע לאורך כל הרצת העיבוד. תנאי העיבוד הספציפיים לאורך מסוכמים ב-טבלה 1. התאמות המבוססות על קוטר העצב, עוביו, המבנה הפסיקולרי או ההרכב התאי והמטריקס לא הוערכו באופן שיטתי ודורשות חקירה נוספת23,24. עבור יישומים של הגדלת קנה מידה (scale-up), מערכת משאבות פריסטלטיות רב-ערוצית עשויה לשפר את התפוקה; עם זאת, יש לוודא בקפידה תנאי זרימה עקביים בין הערוצים כדי להבטיח עיבוד אחיד.

נותרו מספר שיקולים לצורך אופטימיזציה נוספת. על אף שפרוטוקול זה מפחית באופן משמעותי את החשיפה הכוללת לדטרגנטים, SDC עדיין נכלל, ושיפורים עתידיים עשויים להתמקד במיזעור או בהחלפה של השימוש בדטרגנטים תוך שמירה על יעילות הדצולולריזציה ושימור ה-ECM25,26. בנוסף, רקמת עצב היקפית היא מטבעה קשה לסטנדרטיזציה בשל שונות במבנה הפסיקולרי, בקוטר, בעובי ובהרכב התאי והמטריקס23,24. במהלך ייצור רחב היקף, הבדלים אלו, יחד עם שינויים בהעמסת הרקמה ובתנאי הזרימה, עשויים לתרום לשונות בין סדרות ייצור (batch-to-batch variability). עם זאת, השחזור בין תורמים ובין סדרות ייצור לא הוערכו באופן שיטתי במחקר הנוכחי. לפיכך, תיחייב ולידציה נוספת באמצעות רקמות ממספר תורמים ומסדרות ייצור עצמאיות כדי לקבוע קריטריונים הולמים לקבלת רקמה, לבצע סטנדרטיזציה של התהליכים ולהבטיח את השחזור בין הסדרות.

מגבלה נוספת נוגעת לאורך השתל. ביצועי הרגנרציה פוחתים עם הגדלת אורך השתל, ומגבלה תלוית-אורך זו עשויה להיות בולטת יותר בשתלי עצב אלוגרפטים אצלוולריים מאשר באוטוגרפטים3,27. מכיוון שבשתלי עצב אלוגרפטים אצלוולריים חסרים תאי שוואן חיים תושבים, הם תלויים בנדידה ובהתרבות של תאי שוואן מהמארח כדי לתמוך ברגנרציה אקסונלית27. Saheb-Al-Zamani et al. דיווחו כי רגנרציה מוגבלת בשתלי עצב אלוגרפטים אצלוולריים ארוכים הייתה קשורה להגברת הזקנה (senescence) של תאי השוואן27.

עם זאת, מחקר in vivo קודם הראה כי השתלות של עצבי אדם שעברו דה-צלולריזציה (decellularization) על בסיס NaOH תמכו בהחלמה תפקודית ומבנית הדומה לזו של השתלות אוטולוגיות (autografts) בפגם של 15 mm בעצב הסייאטיק של ארנב28. Contreras ועמיתיו הדגימו גם הם רגנרציה אקסונלית והחלמה תפקודית באמצעות אלוגרפט עצבי שעבר דה-צלולריזציה על פני פגם של 70 mm בעצב הפרוניאלי של כבשים29. מחקרים אלו תומכים בפוטנציאל הרגנרטיבי של השתלות עצביות שעברו דה-צלולריזציה, אם כי נדרשת הערכה נוספת של השתלות שהוכנו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי על פני אורכי השתלה הרלוונטיים מבחינה קלינית. השתלות אוטולוגיות מוגבלות גם על ידי זמינות העצב התורם ודורשות הליך קצירה נוסף, מה שמוביל לאתר ניתוחי שני ולתחלואה באתר התרומה4. לפיכך, אלוגרפטים עצביים א-צלולריים עשויים לספק חלופה רלוונטית מבחינה קלינית כאשר רקמה אוטולוגית מספקת אינה זמינה או כאשר קצירת עצב תורם אינה מעשית.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית וניתנת להתאמה להכנת שתלי עצב פריפריאליים דה-צלולריים (decellularized). הדגש שלו על הפחתת החשיפה לדטרגנטים, החלפה מבוקרת של תמיסות וסטנדרטיזציה של התהליך תומכת הן ביישומים מחקריים והן בשימוש טרנסלציוני פוטנציאלי ברגנרציה של עצבים פריפריאליים. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בפיתוח נוסף של גישות נטולות דטרגנטים, ביכולת הרחבה (scalability) של המערכת, ובהערכה מקיפה in vivo של ביצועי הרגנרציה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BT100-1L Multi-channel Peristaltic PumpLonger PumpBT100-1Lמשמשת לספק סירקולציה רציפה והחלפת תמיסות במהלך הסרת השומנים (delipidization), דה-צלולריזציה ושטיפה.
Econo-Column Chromatography Column, 2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512משמש להחזקת מקטעי עצב פריפריאלי במהלך החלפת תמיסות רציפה.
Isopropyl alcohol (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410משמש להסרת שומנים מרקמת עצב פריפריאלי.
Masterflex Tygon E-LFL Pump TubingThermo Scientific06440-16משמש לחיבור משאבת הפריסטלטיקה, עמודת הכרומטוגרפיה ומכלי התמיסות לצורך סירקולציה רציפה של התמיסות.
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma-Aldrich30970-100Gמשמש כדטרגנט לשלב הדה-צלולריזציה השני להסרת רכיבים תאיים שבישרו.
Sodium hydroxide, NaOHDuksan1636לפירוק תאי.

מקורות

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNA
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.