הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השראת שינויי פאזה צירקדיים ביום באמצעות גישות כימוגנטיות וספקטרליות

294 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג אסטרטגיות מבוססות כימוגנטי ואור סגול כדי לאפשר הזזת פאזה צירקדית אמינה ביום.

תקציר

ביונקים, הזזת פאזה צירקדית במהלך היום מוגבלת על ידי ירידה בתגובה הפוטית של הגרעין הסופרכיאזמטי (SCN), מה שמגביל את היכולת לשלוט בשעון הצירקדי בניסוי במהלך שלב זה. לכן, שיטות אמינות להשראת הזזות פאזה ביום הן חיוניות לחקר מנגנוני הפלסטיות הצירקדית והזרמת הפוטים. מתוארות אסטרטגיות גנטיות וספקטרליות משלימות כדי לאפשר מניפולציה עמידה ומדויקת בזמן של השעון הצירקדי במהלך היום. הגישה הראשונה, שמוגבלת כיום לעכברים, עושה שימוש באסטרטגיה כימוגנטית הכוללת אספקה תוך-חגוגית של קולטני מעצבים המופעלים בלעדית על ידי תרופות מעוצבות (DREADDs) כדי להפעיל באופן סלקטיבי תאי גנגליון רשתית רגישים לאור (ipRGCs). גישה זו מאפשרת הפעלה מבוקרת של מסלול הרטינוהיפותלמי ומעוררת שינויים חוזרים בפאזה במהלך היום, ללא תלות בתנאי התאורה הסביבתיים. הגישה השנייה עושה שימוש בגירוי אופטי ייחודי לאורך גל כחלופה לא פולשנית. חשיפה לאור סגול מנצלת את הרגישות הספקטרלית של ipRGCs כדי להפחית את חסימת הדפולריזציה ולקדם הפעלה מתמשכת, מה שמאפשר איפוס פאזה אמין במהלך היום הסובייקטיבי. שיטה זו רלוונטית באופן רחב במערכות יונקים ואינה דורשת מניפולציה גנטית או התערבות פרמקולוגית. מסופקים פרוטוקולים מפורטים להכנה ניסיונית, תזמון גירוי, אימות הזזות פאזה באמצעות פעילות מוטורית, והערכת הפעלת נוירונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה של c-Fos. שיקולים מרכזיים, כולל תזמון צירקדי, פרמטרי גירוי ובקרות ניסיוניות, מפורטים כדי להקל על שחזוריות. ביחד, גישות אלו מספקות כלים גמישים וניתנים לניסוי לגרימת שינויים בפאזה הצירקדית ביום, ומאפשרות חקירה ישירה של המנגנונים העומדים בבסיס תגובתיות צירקדית ביום.

מבוא

הגרעין הסופרכיאזמטי (SCN), השעון הצירקדי הראשי של מוח היונקים, מתאם קצבים יומיים חיוניים בפיזיולוגיה ובהתנהגות, כולל מחזורי שינה–ערות ודפוסי האכילה. כדי לשמור על יישור עם הסביבה החיצונית, ה-SCN מקבל קלט פוטי ישיר מתאי גנגליון רשתית רגישים לאור פנימית (ipRGCs), שמעבירים מידע על אור רשתית כדי לסנכרן את הקצב הצירקדי הפנימי עם יום 1,2 הסולארי.

מאפיין מגדיר של מערכות צירקדיות בין אורגניזמים הוא תגובתיות תלויה בפאזה: אותו גירוי המועבר בזמנים צירקדיים שונים יכול לגרום להשפעות שונות באופן ניכר. ביונקים, אור לילי גורם באופן אמין לשינויים בפאזה של שעון ה-SCN, בעוד שחשיפה במהלך היום הסובייקטיבי גורמת למעט או ללא איפוס 3,4. חוסר הרגישות למראה ביום נצפתה בעקביות הן בהכנות in vivo והן in vitro, שבהן ניסיונות לחקות קלט פוטי אינם מצליחים לעורר שינויים משמעותיים בפאזה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

חוסר הרגישות בשעות היום מיוחס, לפחות בחלקה, לדחף רשתית לא מספק להפעיל מנגנוני איפוס פאזה, לצד מנגנוני שער צירקדי בתוך ה-SCN. בהתאם לרעיון זה, ipRGCs אינם מגיבים באופן אחיד בתנאי פוטופיק; תת-קבוצה נכנסת לחסימת דה-פולריזציה, מה שמגביל את פוטנציאל הפעולה המתמשכתב-17,18,19. מגבלה פיזיולוגית זו עשויה להפחית את יעילות הגירוי הפוטי הקונבנציונלי במהלך היום. התגברות על מגבלה זו תאפשר בדיקה ישירה של פלסטיות השעון ביום, שלב שנחשב מסורתית כעמיד לאיפוס פוטי.

מתוארות שתי שיטות משלימות כדי לאפשר הזזת פאזה חזקה של השעון הצירקדי במהלך היום הסובייקטיבי. הגישה הראשונה משתמשת באסטרטגיה כימוגנטית להפעלה סלקטיבית של ipRGCs ללא תלות בתנאי התאורה הסביבתיים. בפרט, עכבריOpn4 Cre/+ מקבלים זריקות תוך-זכוכיתיות של וירוס אדנו-מקושר (AAV) המקודד את קולטן המעצב המעורר המופעל בלעדית על ידי תרופות מעוצבות (DREADD), hM3Dq, באופן תלוי ב-Cre. מתן קלוזפין-N-אוקסיד (CNO) בזמן צירקדי 4 (CT4) מעורר ירי דמוי פיצוץ של ipRGCs, ומספק הפעלה מתמשכת של מסלול הרטינוהיפותלמוס19. הזזות פאזה נמדדות באמצעות רישום פעילות מוטורית, וההפעלה המולקולרית בתוך ה-SCN מוערכת על ידי אימונוהיסטוכימיה של c-Fos.

הגישה השנייה משתמשת בגירוי אופטי ספציפי לאורך גל כאסטרטגיה לא פולשנית ליישום רחב יותר. עכברים מסוג בר נחשפים לאור סגול (385 ננומטר) בזמן צירקדי 6 (CT6), באמצע היום הסובייקטיבי. אור סגול יוצר חסימת דה-פולריזציה מופחתת ותומך בהפעלה מתמשכת של ipRGC בהשוואה לאור כחול או לבן19. הזזות פאזה כמותות כפי שתואר לעיל.

שתי הגישות שואפות לשפר את האיתות המונע על ידי ipRGC ל-SCN, ובכך להתגבר על ירידה בתגובה הפוטית האופיינית ליום סובייקטיבי. ביחד, שיטות אלו מספקות אסטרטגיות חזקות וניתנות לניסוי למניפולציה של השעון הצירקדי במהלך שלב שהיה מסורתי עמיד לאיפוס פוטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIMH) (ASP-SLCR-01). נעשו כל המאמצים למזער כאב ולהפחית את מספר בעלי החיים בשימוש. כלי המחקר בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. אסטרטגיית כימוגנטיקה

  1. הזרקה תוך-זגוגית של וירוס אדנו-קשור בעכברי Opn4Cre/+
    1. נקה וסטריליזציה של שלב הסטריוטקס וכל כלי הניתוח באמצעות הליכי עיקור מתאימים. התקן את מכשיר ההזרקה וחבר מחט הזרקה קפילרית מזכוכית.
    2. הרדימו את העכבר באמצעות איזופלורן. הגדר את קצב זרימת החמצן לכ-1.5 ליטר לדקה. כוונו את האיזופלוראן ל-3%–5% לאינדוקציה והורדו ל-1–3% לתחזוקה לאורך כל ההליך.
    3. בדוק הרדמה מספקת באמצעות צביטת אצבע. נחשוב על החיה כמונממת לחלוטין כאשר לא נצפית תסמיני גמילה או רפלקס רתיעה.
    4. הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאורך כל התהליך.
    5. משוך מחטים נימיות מזכוכית. המחטים סומנו בגובה ~1.5 מ"מ מהקצה באמצעות טוש דק תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח העברת עומק חדירה עקבית.
    6. הפעילו לחץ עדין על העפעף התחתון באמצעות מלקחיים קהים כדי לבלוט מעט את גלגל העין ולחשוף את הלימבוס הגב. בגישה דורסלית, מכניסים את המחט באופן טנגנציאלי למשטח העין וחדרו את הסקלרה 0.5–1 מ"מ אחורי הלימבוס תוך הימנעות מאזורים וסקולריים של הלימבוס.
    7. הכנס את המחט לתא הזגוגית לעומק שנקבע מראש. נסוג מעט כדי להקל על לחץ תוך-עיני ולמנוע חסימה של קצה המחט על ידי רקמה.
    8. הזרקו נפח כולל של 1.5 מיקרוליטר תמיסת AAV (בגודל 2.4 x 1013 GC/ml), הניתנת כחמש הזרקות רצופות של 300 ננוליטר כל אחת (בקצב של 50nl/s). הפסקה של 5 שניות בין ההזרקות כדי לאפשר דיפוזיה ולמזער את הריפלוקס. אחרי ההזרקה הסופית, המתינו 30 שניות לפני שמחליקים את המחט לאט. חזור על אותו הליך בעין הנגדית עם אותם פרמטרים, תוך שמירה על מזעור טראומה וריפלוקס.
    9. נתנו קטופרופן (10 מ"ג/ק"ג, תת-עורית) מיד לאחר הניתוח.
    10. אפשר לעכברים להחלים לפחות שבועיים כדי להבטיח ביטוי ויראלי מספק לפני העברתם למתקן ההתנהגותי.
  2. פעילות הרצת גלגלים וניהול CNO (איור 1A)
    1. עכברי בית בכלובים המצוידים בגלגלי ריצה. הקלט פעילות ריצת גלגלים באמצעות מערכת איסוף נתונים אוטומטית.
    2. עכברים מחוברים למחזור אור–חושך של 12:12 שעות למשך 4–7 ימים. לאשר התאמה יציבה ואז להעביר את בעלי החיים לחושך קבוע (DD).
    3. קבעו את תחילת הפעילות באמצעות תוכנת ניתוח. הגדר את תחילת הפעילות כ-CT12 במכרסמים ליליים. חשב CT4 בהתאם.
    4. ביום השמיני ב-DD, עכברים מקבלים זריקות תוך-פריטוניאליות של CNO (1 מ"ג/ק"ג) או תמיסת מלח ב-CT4 תחת אור אדום עמום.
    5. החזירו את בעלי החיים לכלובים הביתיים שלהם ושמרו עליהם בחושך מתמיד. תעד פעילות תנועה ברציפות במשך 8 ימים.
    6. קבעו את תחילת הפעילות ובצעו ניתוח רגרסיה בתקופות שלפני ואחרי ההזרקה. חשב הזזות פאזה כהפרש בין תחילת פעילות מוערכת לפעילות נצפית.
  3. אימונוהיסטוכימיה של SCN c-Fos לאחר הפעלה כימוגנטית
    1. עכברים מכוונים למחזור אור–חושך של 12:12 שעות ומשתחררים לחושך מתמיד. ביום השני ב-DD, נתן את CNO ב-CT6. פרפיוז חיות 30 דקות אחרי ההזרקה.
      הערה: CT4 שימש בניסויים התנהגותיים כדי למזער את הסיכוי שהשפעות CNO יימשכו אל תוך הלילה הסובייקטיבי, שכן CNO יכול להישאר פעיל במשך מספר שעות. לעומת זאת, CT6 שימש לניסויי צביעה חיסונית להערכת ההשפעות החריפות של CNO על השעון הצירקדי, כאשר בעלי חיים הושפעו 30 דקות לאחר ההזרקה.
    2. נתח את המוח והטיפול ב-4% פאראפורמלדהיד במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. קריופרוטפרט ב-30% סוכרוז עד שהרקמה שוקעת. חתך קורונלי ב-40 מיקרון.
    3. דגרו חתכים בתמיסת חסימה, ואחריהם דגירה ראשונית של נוגדנים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לשטוף ולדגור עם נוגדנים משניים במשך שעה אחת. צבע נגד עם DAPI וחלקי התקנה.
    4. רכוש תמונות באמצעות הגדרות מיקרוסקופ עקביות. עבד תמונות באמצעות תוכנת ניתוח. זיהוי אזורים נגועים ב-AAV באמצעות תאים חיוביים ל-mCherry.

2. אסטרטגיה ספקטרלית

  1. העבר עכברים מסוג פרא למתקן ההתנהגותי ומחזיק אותם בכלובים המצוידים בגלגלי ריצה, כפי שתואר לעיל. לשמור על בעלי חיים בחושך מתמיד (DD) כדי לעקוב אחרי פעילות צירקדית חופשית ברצינות.
  2. ביום השמיני ב-DD, בזמן צירקדי 6 (CT6), הסר את הכלוב מהארון האטום לאור וחשוף את העכבר לפולס אור של 15 דקות.
  3. חשפו עכברים לפולס אור כחול (λmax = 470 ננומטר; 1.8 × 1014–2.2 × 1014 פוטונים לס"מ 2/שנייה) או לפולס אור סגול (λmax = 385 ננומטר; 1.45 × 1014–3.3 × 1014 פוטונים/ס"מ 2/שנייה), כאשר העוצמה נמדדת במרכז ובכל ארבע פינות הכלוב בגובה עיני בעלי החיים.
  4. בשני תנאי אורך הגל, שמור עכברים בכלובים הביתיים שלהם עם החלק העליון של הכלוב מוסרים. מקמו כלובים ישירות מתחת למקור אור קבוע כך שמרכז קרן האור מיושר עם מרכז הכלוב כדי להבטיח תאורה אחידה.
  5. החזיר מיד את הכלובים למקומם המקורי תחת חושך מתמיד לאחר חשיפה לאור. המשך בפעילות ריצת הגלגלים ללא הפסקה לניתוח הזזת פאזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עכבריOpn4 Cre/+ שהביעו AAV-DREADD שקיבלו מלח ב-CT4 לא הראו שינוי פאזה משמעותי בפעילות הגלגלים (n = 5; איור 1B). לעומת זאת, מתן CNO ב-CT4 יצר עיכוב משמעותי בשלב בתחילת הפעילות (ממוצע ± SEM: 5.03 ± 0.48 שעות; n = 5; איור 1C, D), המדגים שהפעלת DREADD בזמן צירקדי זה משנה את קצב הפעילות המוטורית. סכמטיקה של עיצוב הניסוי מוצגת באיור 2A. באותם עכברים, מתן CNO הגביר את ביטוי c-Fo...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התוצאות מראות כי הפעלה של ipRGCs במהלך היום הסובייקטיבי יכולה לגרום לשינויים בפאזה הצירקדיים בעכברים, תקופה שמאופיינת בדרך כלל ברגישות מופחתת לגירוי פוטי. גישה כימוגנטית אפשרה הפעלה סלקטיבית של ipRGCs ללא תלות באור חיצוני ויצרה עיכובי פאזה חזקים בהתנהגות הרצת גלגלים. הפעלה זו גם גרמה לביטוי חריף של c-Fos ב-SCN, ואישרה את הפעלת קוצב הלב הצירקדי המרכזי. ממצאים אלו מצביעים על כך שגירוי חזק מונע ipRGC של מסלול הרטינוהיפותלמוס מספיק כדי להתגבר על ירידה בתגובתיות היום של מערכת הצירקדית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים מודים לחברי SLCR ב-NIMH ולמעבדת העכברים הביולוגית של ג'ונס הופקינס על דיונים מועילים. מקורות מימון: מענק  המכון הלאומי לבריאות הנפש ZIAMH002964 (S.H.)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361ווקטור ויראלי תלוי Cre המקודד DREADD מרגש (hM3Dq) ממוזג ל-mCherry להפעלה סלקטיבית של ipRGC
נוגדן Anti-c-Fos (מונוקלונלי ארנב)Cell Signaling Technology2250Sנוגדן ראשוני המשמש לזיהוי c-Fos כסמן להפעלה עצבית
נוגדן Anti-tdTomato (עז)LSBioLS-C340696נוגדן ראשוני המשמש לזיהוי ביטוי מדווח mCherry/tdTomato
מפעיל LED כחולThorlabsLEDD1Bספק כוח לבקרת עוצמה ופלט של LED כחול
מקור אור LED כחולThorlabsM470L5מקור LED הפולט אור כחול (λmax ≈ 470 ננומטר) לגירוי פוטי
תוכנת ClockLabActimetricsגרסה 6.0.53תוכנה לרכישה וניתוח של נתוני פעילות לוקומוטורית צירקדית
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGליגנד המשמש להפעלת קולטני hM3Dq DREADD in vivo
DAPIInvitrogen62248צבע גרעיני גרעיני פלואורסצנטי לסימון גרעיני תאים
נוגדן אלכסה פלואורו 555 של עז פרהInvitrogenA21432נוגדן משני פלואורסצנטי לזיהוי נוגדנים ראשוניים של עז
נוגדן אלכסה פלואורו 488 של עז פרהInvitrogenA21206נוגדן משני פלואורסצנטי לזיהוי נוגדנים ראשוניים של ארנב
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02מדיום הרכבה המשמש לשימור פלואורסצנציה בחתכי רקמה
תוכנת ImageJ (Fiji)NIHגרסה 2.16.0/1.54gתוכנה פתוחה לעיבוד תמונות וניתוח כמותי
עכברים Opn4creThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925עכברים המשמשים להפעלה כימוגנטית
מפעיל LED סגולMightexSLA-1000-2ספק כוח לבקרת פלט LED סגול
מקור אור LED סגולMightexBLS-LCS-0385-04-22מקור LED הפולט אור סגול (λmax ≈ 385 ננומטר) לגירוי ספציפי לאורך גל
עכברים מסוג Wild-typeThe Jackson LaboratryJackson strain #101043עכברים המשמשים לניסוי אור סגול

מקורות

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DREADDsc Fos
השראת שינויי פאזה צירקדיים ביום באמצעות גישות כימוגנטיות וספקטרליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.