מאמר שיטה

מודל עכברים קרדיו-אונקולוגי של רעילות לביתית המושרית על ידי אנתרציקלינים בעכברים אימונו-קומפטנטיים הנושאים גידול שד

6 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

1 באוקטובר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מדגמי עכברים רלוונטיים מבחינה קלינית לרעילות לבבית המושרית על ידי anthracycline הם נדירים. כאן מוצע מדגם המשתמש בעכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה הנושאים גידול ומקבלים טיפול נגד סרטן, המדמה את הפרוטוקולים הקליניים של חולי סרטן.

תקציר

העדכון האחרון של האיגוד האירופי לקרדיולוגיה בנושא מודלים פרה-קליניים של תפקוד לבבי לקוי הקשור לטיפול בסרטן מדגיש צורך קריטי במודלים in vivo מייצגים וטרנסלציונליים יותר. הוא מצביע על הצורך בפיתוח מודלים המשתמשים בבעלי חיים בעלי מערכת חיסונית תקינה הנושאים גידול, תוך שילוב של זנים מרובים ושני המינים, כדי לשחזר באופן מדויק יותר את ההטרוגניות הנצפית באוכלוסיות קליניות. לפיכך, נבנה מודל רלוונטי קלינית של רעילות לבבית מושרית על ידי anthracycline (AIC) בבעלי חיים הנושאים גידול שד. בהתאם לרקע הגנטי של העכברים, הוזרקו תאי 4T1Luc (200k cells) או תאי PY8119 (200k cells) לעכברי Balb/c או לעכברי C57Bl/6J, בהתאמה, באופן תת-עורי בבלוטת החלב התחתונה של זכרים ונקבות. הצמיחה של הגידול נשלטה באמצעות ביולומינסנציה ומישוש. ברגע שמסת הגידול הייתה ניתנת לגילוי במישוש, שבועיים לאחר הזרקת תאי הגידול, קיבלו בעלי החיים טיפול נגד סרטן ב-Doxorubicin. הסבילות של העכברים ל-Doxorubicin הייתה תלוית זן. התפקוד הלבבי הוערך לפני תחילת הפרוטוקול (קו בסיס) ולאחר מכן מדי שבוע באמצעות אולטרסאונד לבבי בעכברים תחת הרדמת ketamine. רעילות לבבית הוגדרה כירידה בקיצור השבבי (fractional shortening) של החדר השמאלי בלפחות 10% מקו הבסיס, ערך מוחלט של <50%, וקצב לב של >300 BPM. הפרוטוקול היה הדיר עם 99% הצלחה בפיתוח גידול, ושיעור הישרדות של >80% בעכברים. רעילות לבבית נצפתה ב->90% מהעכברים שטופלו בגידול וב-Doxorubicin.

מבוא

קרדיו-אונקולוגיה שואפת לשפר את התוצאים הקרדיו-וסקולריים בחולי סרטן לפני, במהלך ואחרי כימותרפיה. מודלים פרה-קליניים מילאו תפקיד מרכזי בהבנה טובה יותר של הגומלין בין שתי מחלות אלו. לאחרונה, מחקר ששינה את הפרדיגמה הראה כי עכברים בעלי נטייה מולדת לפוליפים במעי התרחשו יותר מגידולים אלו לאחר אוטם שריר הלב ותקופה של אי-ספיקת לב (HF), מה שמעיד על ההשפעה הישירה של אירוע קרדיו-וסקולרי על צמיחת הגידול1. מאז, מחקרים רבים דיווחו על ממצאים עקביים בסוגי גידולים ובזני עכברים שונים, תוך מעורבות תכופה של מסלולים מולקולריים או חלבונים ספציפיים, ובכך חיזקו את התפיסה כי התקדמות הסרטן מואצת על ידי מחלות קרדיו-וסקולריות (CVDs)2,3,4,5.

בניגוד לכך, השפעת הסרטן על הסיכון לפיתוח CVDs נחקרת כבר מספר עשורים. נתונים אפידמיולוגיים מראים כי שורדי סרטן סובלים יותר מ-CVDs, הן בשל גורמי סיכון משותפים לשתי מחלות אלו והן בשל רעילותן המוכרת של טיפולים נגד סרטן 6,7,8,9,10. מחקרים פרה-קליניים השתמשו לעיתים קרובות במודלים של קכקסיה מושרית סרטן כדי לזהות מטרות ספציפיות שניתן לווסת בבני אדם לשיפור תוצאות קרדיו-וסקולריות ארוכות טווח11,12,13,14. עם זאת, ניתן לטעון כי מודלים אלו בקושי משקפים מצב קליני נפוץ, שכן חולים מטופלים לרוב לפני שהם מגיעים לתסמונת סרטנית מתקדמת זו, אך עדיין קיים חשד כי קכקסיה גלובלית תורמת במידה רבה למקרי מוות כלליים מסרטן15.

בהנחיות הקרדיו-אונקולוגיה הראשונות של האיגוד האירופי לקרדיולוגיה (ESC), נקבע כי נדרש מחקר נוסף כדי להבין טוב יותר את הקשר בין סרטן למחלות קרדיו-וסקולריות (CVDs)16. ליתר דיוק, בעדכון אחרון של קבוצת העבודה של ה-ESC בנושא קרדיו-אונקולוגיה, צוין כי למחקר פרה-קליני יש חשיבות עליונה בגישור על פער ידע זה, במיוחד באמצעות מודלים המשתמשים בבעלי חיים הנושאים גידולים17. יתרה מכך, נדרש מתאם טוב יותר בין מחקרים פרה-קליניים למחקרים קליניים, מכיוון שרוב המחקרים הקליניים כיום נערכים על טיפולים נגד סרטן שנחקרו באופן מועט במסגרות פרה-קליניות18.

אנထרציקלינים (ACs), כגון Doxorubicin (Dox), נמצאים בשימוש נפוץ בכימותרפיה עבור מספר רב של גידולי דם וגידולים מוצקים. אף על פי שכיום קיימים טיפולים מודרניים יותר, מחירם הזול, תופעות הלוואי המתועדות היטב ויעילותם הניכרת יובילו להמשך שימוש בתרופות אלו למשך שנים רבות19,20. כמות עצומה של ראיות מצביעה על כך ש-ACs גורמים לרעילות לבבית תלוית-מינון, הנראית בעיקר כליקוי בתפקוד החדר השמאלי, המהווה את אחד הגורמים המגבילים העיקריים לשימושם הקליני כיום, ולעיתים קרובות מהווה גורם מדאיג עבור הקרדיו-אנקולוג21,22. ספרות זו נובעת בעיקר ממחקרים על סרטן השד בשל שכיחותו הגבוהה בבני אדם, אך מחקרים קליניים על לימפומות, סרטן ריאות ולוקמיות מספקים תצפיות דומות23. לפיכך, מחקרים פרה-קליניים נערכים מזה מספר עשורים כדי להבין את המכניזמים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של רעילות לבבית מושרית-AC (AIC), אשר הדגימו כי עקה חמצונית, נזק ישיר ועקיף ל-DNA, פרופטוזיס (ferroptosis) ונזק מיטוכונדריאלי מעורבים באופן נפוץ23,24.

עם זאת, קיימות למעשה ראיות מוגבלות לגבי האופן שבו ניתן למנוע או לטפל ב-AIC. תרופות נפוצות ל-HF נבחנו בניסויים קליניים עם תוצאות מעורבות, והתזמון של השימוש במספר קטן של מועמדים פוטנציאליים היה קשה לקביעה21,23,25,26,27,28. Dexrazoxane, תרופה לוויסות ברזל, הראתה תוצאות מבטיחות במניעת AIC, אך אינה בשימוש סיסטמטי כיום21. מתן ACs בצורות שאינן חופשיות בדם, לדוגמה, כשהן encapsulated בליפוזומים, הראה גם הוא תוצאות מבטיחות אך עדיין קיימת קושי להחליף ACs קונבנציונליים, בין היתר בשל עלותם21.

הסבר אחד למצב זה הוא המחסור במודלים חייתניים רלוונטיים מבחינה קלינית לחקר AIC17. בבני אדם, Dox ניתן לאורך זמן באמצעות הזרקות חוזרות, ומרבית ה-AIC נצפית במהלך השנה הראשונה לאחר הטיפול. עם זאת, ניתן להבחין בשונות רבה בפרוטוקולים של בעלי חיים בספרות המקצועית, כפי שמוצג בסקירה שפורסמה לאחרונה29. דוגמה קלאסית למודל של קרדיוטוקסיות חריפה היא עכברים ללא גידולים המקבלים הזרקה בודדת של 20 mg/kg של Dox30. במודל טיפוסי של קרדיוטוקסיות כרונית, מחקרים רבים מתארים עכברים ללא גידולים המקבלים הזרקה אחת בשבוע של 5 mg/kg של Doxorubicin, עד למינון מצטבר כולל של 20 mg/kg29,31. ניתן להבחין במודל קרדיוטוקסיות כרוני זה גם בבעלי חיים עם גידולים באותו מינון של Dox; עם זאת, הדבר נותר נדיר מאוד בספרות29,32.

כדי לתרום לצמצום פער ידע זה, נבנה מודל פרגמטי ורלוונטי קלינית של עכברים אימונו-קומפטנטיים הנושאים גידול שד לצורך חקר AIC, וזאת בעכברי Balb/c הנושאים תאי 4T1, וחוסנו אושש בעכברי C57Bl/6J הנושאים תאי PY8119; האחרון מהווה, למיטב ידיעת המחברים, את הפעם הראשונה שבה נבנה מודל קרדיו-אונקולוגי של סרטן שד טריפל-נגטיב בזן C57Bl/6J. הושגה מדידה מדויקת של צמיחת הגידול via כימות ביולומינסנציה לפני הטיפול בבעלי החיים ב-Dox, אשר הדגים קרדיוטוקסיות, ויושם פרוטוקול לאיסוף איברים כדי לחקור את סביבת הגידול המיקרוסופית במקביל לניסוי הקרדיו-אונקולוגי. יתרה מכך, נצפו תוצאות דומות לאלו המתוארות בספרות בנוגע לרגישות לזן ולמין. עבודה זו צפויה לתרום לסטנדרטיזציה ולשיפור של פרוטוקולים בבעלי חיים במחקרי קרדיו-אונקולוגיה עתידיים, שכן עכברי C57Bl/6J בעלי ערך רב בשל שיעור ההישרדות הגבוה שלהם בניסויי AIC29.

היתרון של השיטה המוצעת הוא השימוש בזן C57Bl/6J, אשר קל להנדס גנטית, בעל גנום מאופיין היטב, זול לרכישה ועמיד למנות מצטברות גבוהות של ACs29,33,34. במידה ויש צורך בביטול (knockout) של גן למחקר ספציפי עם ACs, מודל זה מתאים מאוד למטרה זו. יתרה מכך, השימוש בסרטן שד טריפל-נגטיבי הגזורה מזן זה היא בעלת עניין תרגומי, כיוון שנשים עם סרטן שד טריפל-נגטיבי הן החולות בעלות הסבירות הגבוהה ביותר לקבל ACs ואלו שפרוגנוזתן היא הגרועה ביותר35. שימוש במודל זה עשוי לשפר את הידע בנוגע ל-AIC באופן ספציפי עבור חולות אלו.

חוזקו של מודל זה טמון גם בעובדה שהעכברים עוברים התניה מוקדמת עם גידול, דבר שיכול להשפיע באופן ממשי על עיצוב מחדש (remodeling) קרדיו-וסקולרי36,37. כמו כן, מודל זה נמצא בין מודלים חריפים למודלים כרוניים מלאים של AIC, עם אפשרות להארכת משך הניטור של בעלי החיים בשל שיעור ההישרדות הגבוה שלהם, דבר שיכול להיות בעל ערך רב אם נשקלים מחזורי AC נוספים.

עם זאת, מודל זה ככל הנראה אינו המתאים ביותר לאפיון ספציפי של הגידול בסיום הפרוטוקול, וזאת בשל הגישה הפרגמטית להחדרת הגידול. יש לבצע גרסה מותאמת של הזרקת הגידול אם נושא זה מרכזי להשערה המדעית. כמו כן, הזרקת תאי 4T1 לעכברי Balb/c היא מודל מבוסס לגישה אונקולוגית יותר, למשל לצורך חקר גרורות, נושא שאינו מתואר כאן ויש להביאו בחשבון אם גרורות הן חיוניות לשאלה המדעית38. מודל זה מבוצע בעכברים בוגרים; עם זאת, אם המטרה היא לחקור AIC בהקשר פדיאטרי, יש לשקול שימוש בעכברים צעירים יותר, עבורם התגובה לפרוטוקול לא נבחנה כאן.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדת האתיקה לבעלי חיים המקומית (Lariboisière-Villemin) ואושרו על ידי משרד ההשכלה הגבוהה והמחקר הצרפתי (MESRI) תחת מספר הפרוטוקול APAFIS 46086. כללי ה-3R נלקחו בחשבון במהלך תכנון הפרוטוקול. עכברי Balb/c ו-C57Bl/6J נרכשו מיצרן בעלי חיים כגון Janvier Labs או Envigo. עבור פרוטוקול זה, גיל העכברים בעת ההכללה היה בין 10 שבועות ל-18 שבועות כדי להתאים לבוגרים צעירים, בדומה לנשים הסובלות מסרטן שד טריפל-נגטיבי. בעלי החיים נשמרו בקבוצות של 2–5 פרטים בחדר עם מחזורי אור/חושך של 12 h, טמפרטורת חדר שבין 20 °C ל-24 °C, ולחות שבין 30% ל-70%. מים ומזון סופקו ad libitum. במהלך הפרוטוקול, ננקטה זהירות כדי לעקוב אחר נקודות סיום הומניות שהוגדרו מראש לפני תחילת הפרוטוקול, כפי שמתואר ב-Supplementary Table 1. יש לוודא שנעשה שימוש במסנן איזופלורן (isoflurane filter) כדי לאסוף גזים מיותרים למען בטיחותו של המשתמש באיזופלורן. יש לטפל בבעלי החיים בזהירות, תוך חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן בכל שלב בפרוטוקול זה. כל החומרים המסוכנים צריכים להיות מטופלים בהתאם לתקנות המוסדיות המקומיות; במקרה זה, כל הדגימות המזוהמות (דם, מחטים, מבחנות המכילות dox וכו') נזרקו לפחי פסולת רפואית ביו-מסוכנת. סקירת הפרוטוקול מוצגת ב-Figure 1A. الريאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים ב-Table of Materials.

1. שבוע 0: הכנת תאים והזרקתם לבעל החיים

הערה: השלבים הבאים מתוארים עבור תאי 4T1Luc והיו זהים לשימוש בתאי PY8119. עם זאת, יש להתאימם עבור כל שורת תאים, בהתאם להמלצות היצרן. כדי למטב את הפרוטוקול, אדם אחד יכול לטפל בהכנת התאים, בעוד שאדם אחר יטפל בהכנת בעלי החיים.

  1. בעת קבלת בקבוק תרבית תאים שהגיע למצב של התלכדות (confluence של 80%–90%), יש להוסיף 3 mL של trypsin למשך 5 min ב-37 °C ו-5% CO2.
  2. יש להקיש בעדינות על הבקבוק כדי לנתק את כל התאים, למנוע היווצרות גושי תאים, ולהחזיר אותם למצב של תרחף בתוך מצע גידול תאים.
  3. יש לספור את התאים באמצעות תא Malassez (או בטכניקה אחרת, בהתאם לזמינות).
  4. יש לסבב את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 × g למשך 5 min, ולאחר מכן להחזיר אותם למצב של תרחף בנפח שווה של PBS כדי להזריק 200,000 תאים ב-100 µL.
    הערה: מספר התאים נבחר לאחר סקירת ספרות (ראו Supplementary Table 2).
  5. יש לשאוב בעדינות באמצעות מזרק 26 G נפח של 500 µL מתרחף התאים. כדי למנוע שהייה ממושכת של תרחף התאים במזרק, מומלץ למלא את המזרק בנפח קטן יותר מזה הדרוש עבור 5 בעלי חיים.
  6. במקביל (במידת האפשר), יש להניח את העכברים בתא isoflurane ולבצע הרדמה מהירה באמצעות 3% isoflurane בקצב של 1 L/min באוויר סביבתי. ברגע שהבעל חיים נרדם, יש להניחו במצב שכיבה על הגב (supine) כאשר החוטם נמצא בקונוס המכיל isoflurane בריכוז של 1%.
  7. יש למרוח קרם להסרת שיער עדין בעזרת מקלון צמר גפן על דופן בית החזה ועל דופן הבטן השמאלית התחתונה של בעל החיים למשך 1 min. יש להסיר את השיער והקרם בעזרת מים, ולאחר מכן לייבש את העור עם טישיו.
  8. יש לוודא הרדמה מספקת באמצעות צביטה בבהוץ.
  9. יש לזהות את הפטמה של בלוטת החלב השמאלית בבטן העליונה. יש לתפוס אותה בעדינות עם פינצטה ולהרים אותה כלפי מעלה (ראו Figure 1B).
  10. יש להחדיר את מחט המזרק תת-עורית ולהחליקה עד שהמחט תהיה מתחת לבלוטת החלב.
  11. יש להזריק 100 µL מתרחף התאים. בועה תת-עורית אמורה להיווצר מתחת לפטמה (ראו Figure 1C). בעלי חיים מקבוצת הביקורת יקבלו PBS. ניתן לבצע רנדומיזציה באמצעות תוכנת רנדומיזציה (כגון RandoMice, כלי מקוון בחינם) או על ידי הקצאת טיפול לעכברים ביחס מוגדר מראש של 1-ל-1 או 2-ל-2 (או גבוה יותר).
  12. יש להוציא את המחט בעדינות, ולשחרר את הפטמה שנתפסה בפינצטה.
  13. יש לשקול את בעל החיים כדי לקבל משקל בסיס עבור הפרוטוקול.
  14. יש לאפשר לבעל החיים להתעורר באוויר סביבתי לפני השבתו לכלובו.

2. שבוע 1: בקרה על צמיחת הגידול באמצעות ביו-לומינסנציה

הערה: ניתן לבצע זאת בכל יום לאחר ההזרקה כדי לבקר את הצמיחה. יתרה מכך, ניתן לבצע זאת במספר נקודות זמן אם קצב צמיחת הגידול הוא נושא למחקר. עם זאת, לאחר 10–14 ימים, האות עלול להיחלש עקב ברירה טבעית של תאי גידול במהלך צמיחת הסרטן. כמו כן, צמיחה מחודשת של שיער לא אמורה להוות בעיה ללכידת פוטונים תקינה אם הפרוטוקול בוצע נכון בהתחלה. ראו איור 2A,B לתוצאות מייצגות של ביולומניסנציה שנכוונה בימים 2, 5, 8 ו-11 לאחר הזרקת הגידול.

  1. הניחו את בעלי החיים בתא איזופלורן והרדימו אותם במהירות באמצעות 3% isoflurane.
  2. לאחר שבעלי החיים נרדמו, מזמים 10 µL/g ממשקל הגוף של לუციפרין באופן תו-פריטוניאלי (IP) באמצעות מזרק 26-G. הימנעו מהזרקת לუციפרין בצד שמאל בשל נוכחות הגידול, שייתכן שיהיה ניתן למישוש כבר לאחר מספר ימים.
  3. הניחו את העכברים במכשיר הדימות הפוטוני (photon imager) בתנוחה גבהית (supine) כדי למקסם את לכידת הפוטונים, מכיוון שהגידול נמצא בצד הבטני. הניחו את האף בתוך קונוס האף והפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-1%.
    הערה: מיקום נכון של 5 בעלי חיים בלוכד הפוטונים דורש זמן; התחילו במיקומם לפחות 2 דקות לפני תחילת הרכישה.
  4. התחילו את רכישת פעילות הלומינסנציה 10 דקות לאחר הזרקת הלუციפרין, והפעילו אותה למשך 5 דקות (ראו איור 2A). מצב הרכישה עבור המכשיר שנעשה בו שימוש כאן היה BLI ב-89 ms לפריים, עם גודל תמונה של 220 mm x 165 mm וגודל פיקסל BVR של 153 µm.
  5. עם סיום הרכישה, אפשרו לבעל החיים להתעורר באוויר הסביבתי לפני החזרתו לכלוב.
  6. השתמשו בתוכנת כימות המותאמת למכשיר הדימות הפוטוני, בהתאם להמלצות היצרן.

3. שבוע 2: טיפול ב-Doxorubicin

הערה: יש לבצע הערכה אקו-קרדיוגרפית לפני תחילת ההזרקות של Dox. לכן, השתמשו בהרדמה שהושרית לאחר האקו-קרדיוגרפיה כדי להחדיר את ההזרקה בעוד החיה ישנה, ובכך למזער את הלחץ מהזרקת ה-Dox הראשונה. כמו כן, יש להתאים את המינון המצטבר לכל זן של עכבר. במקרה זה, נעשה שימוש ב-16 mg/kg עבור עכברי Balb/c וב-24 mg/kg עבור C57Bl/6J, בהתבסס על נתונים קודמים מהמעבדה ועל הספרות29 (ראו איור 3A–C).

  1. יש להמיס ולדלל את אבקת ה-doxorubicin בתמיסת סליין. יש להכין את הדילול כך ש-4 mg/kg של Dox יתאימו לנפח של 240–360 µL. לפיכך, מומלץ להכין תמיסה בריכוז 2 mg/mL, ולאחר מכן לבצע דילול פי 6 בתמיסת סליין (ריכוז סופי 0.33 mg/mL).
  2. שבועיים לאחר הזרקת הגידול, יש לוודא שהגידול מורגש במישוש בחלק השמאלי התחתון של הבטן, אך גודלו קטן מ-1 cm.
  3. יש לשקול את החיה כדי לבקר את הירידה במשקל לאחר הטיפול ב-Dox.
  4. באמצעות מזרק 26 G, יש להזריק את הנפח המתאים להגעה למינון של 4 mg/kg IP בחלק הימני התחתון של הבטן. בעלי חיים מקבוצת הביקורת יקבלו תמיסת סליין. ניתן לבצע רנדומיזציה כפי שמתואר בשלב 1.11.
  5. יש לחזור על הליך זה מדי יום במשך 4 ימים כדי להגיע למינון מצטבר של 16 mg/kg (יש להוסיף יומיים נוספים כדי להגיע ל-24 mg/kg עבור עכברי C57Bl/6J).

4. שבוע 2–5: ניטור רעילות לבבית

הערה: ניתן לבצע זאת על בסיס שבועי. הערכה תכופה יותר תדרוש זהירות, שכן בעלי החיים הם לרוב הפגיעים ביותר במהלך שבועות 3 ו-4 של הפרוטוקול, ומכיוון שזנים מסוימים של עכברים רגישים להרדמה כללית, דבר שעלול להוביל לעלייה בתמותה. בדיקת אקו-לב (Echocardiography) מבוצעת תחת הרדמה ב-ketamine כדי למקסם את הסיכויים להקלטת תפקוד לבבי לקוי, מכיוון ש-isoflurane גורם לדיכוי של השריר הלבבי; המינונים המשומשים הם 40 mg/kg עבור עכברי Balb/c ו-80 mg/kg עבור עכברי C57Bl/6J39. מומלץ לבצע בדיקת אולטרסאונד אחת לפני הזרקת הגידול כדי לכמת את ההשפעה הפוטנציאלית של גדילת הגידול על התפקוד הלבבי לפני תחילת הטיפול הכימותרפי.

  1. שקלו את החיה. אם נצפתה ירידה משמעותית במשקל, פעלו לפי Supplementary Table 1.
  2. הרדימו את החיות באמצעות הזרקה IP בעזרת מזרק 26 G של ketamine במינון של 40 mg/kg (עכברים מסוג Balb/c) או 80 mg/kg (עכברים מסוג C57Bl/6J) כדי להשיג הרדמה קלה.
  3. הניחו את החיה על פד חימום כדי למנוע היפותרמיה.
  4. ברגע שהחיה נרדמה, גלחו אותה כפי שמתואר בסעיף 1.7 כדי להשיג אזור חזה נטול שיער.
  5. עשר דקות לאחר הזרקת ה-ketamine, בצעו אקו-קרדיוגרפיה למשך מקסימום 5 min. השתמשו בג'ל אולטרסאונד שחומם מראש. בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש, התמקדו ב-M-mode ו/או בצעו כימות מאמץ (strain-quantification).
  6. במידה נעשה שימוש ב-M-mode, הקליטו חתכים מרכזיים של החדר במבט parasternal long-axis, פעימות למשך 4 s לפחות, לפחות 3 פעמים כדי להשיג ממוצע מייצג של תפקוד לב העכבר (ראו Figure 4A,B). כאן, קצב הפריימים נקבע ל-100 frames/s, תדר השידור ל-38.4 MHz בהספק של 100%, תדר הקליטה ל-96 MHz, מהירות הקול ל-1538 ms, ומהירות הסריקה (sweep speed) ל-1200 Hz.
  7. לאחר כ-5 min, החיה תהיה ערה מדי כדי לאפשר אקו-קרדיוגרפיה. החזירו אותה לכלוב לאחר ניקוי הג'ל ששימש לאולטרסאונד.
  8. בצעו כימות עיוור (blindly) של תפקוד הלב39,40. תפקוד לקוי רלוונטי במודל זה מוגדר כ-10% מתחת לערך הבסיס וערך מוחלט של <50% של קיצור סיסטולי של החדר השמאלי (FS) בעוד שקצב הלב נשאר >300 BPM. אם ערך ה-FS לפני הטיפול נמוך מדי, שקלו להוציא את החיה מהניתוח.
    הערה: נדרשים לפחות 3 מחזורי לב לכל כימות מתוך קטעי ה-4 s, אך ניתן להשתמש במחזורים נוספים במידת האפשר. במידת האפשר, השתמשו באותו חוקר לכל הבדיקות האקו-קרדיוגרפיות ובאדם שונה לביצוע הכימות כדי להבטיח ניתוח עיוור. המלצות בנוגע לבקרת איכות של אקו-קרדיוגרפיה פורסמו במקום אחר40.
  9. בצעו ניתוח סטטיסטי (ראו שלב 6). הבדיקה המומלצת לניתוח שתי קבוצות לאורך הפרוטוקול כולו היא two-way ANOVA, מכיוון ששני גורמים מושווים: זמן וטיפול.
  10. בצעו זאת על בסיס שבועי. התפקוד הלקוי מופיע לאחר שבוע אחד בלבד של טיפול ב-doxorubicin.
    הערה: אם נדרשת דגימת דם בנקודת זמן כלשהי לאחר ה-Dox, לדוגמה, למדידת סמנים ביולוגיים של הלב, דגמו את הדם מיד לאחר האקו-קרדיוגרפיה כדי למנוע הזרקת הרדמה נוספת, למזער את הלחץ על החיה ולייעל את הזמן.

5. שבוע 5: הליך הקרבה

הערה: באופן אידיאלי, יש לבצע פרוטוקול זה לאיסוף איברים עם שני אנשים.

  1. לאחר בדיקת האקו-לב האחרונה בשבוע 5, הזרק שוב לבעלי החיים קטמין IP במינון של 100 mg/kg. החל אלחוש מקומי באמצעות טיפה של 1% Tetracaïne לעין שתשמש לדימום.
  2. באמצעות קפילרה עם הפרין, בצע דימום רטרו-אורביטלי כדי לאסוף כמה שיותר דם לשפופרת עם הפרין (או קפילרה של EDTA לשפופרת EDTA).
  3. כאשר לא ניתן להפיק דם נוסף, בצע נתיקה צווארית בהתאם לפרוטוקולים המאושרים במוסד. הנח את הדם שנאסף מיד על קרח עד לטיפול בהמשך, תוך התקדמות בפרוטוקול ההקרבה כפי שמוצג בשלב 5.5.
  4. סבב את הדם בצנטריפוגה ב-2000 x g למשך 10 min ב-4 °C כדי להפריד בין תאי הדם לפלזמה. הקפא במהירות (Snap freeze) את שפופרת הפלזמה בחנקן נוזלי ואחסן ב- -80 °C עד לניתוח נוסף.
  5. הנח את בעל החיים על מכסה של קצף פוליסטירן המכוסה בנייר סופג, ואבטח את 4 הרגליים באמצעות סיכות.
  6. הגידול צריך להיות בגודל משמעותי (לפחות 2 cm). גזור עם שוליים רחבים מסביב לגידול כדי לנתקו. ניתן לבצע נתיחה נוספת לאחר איסוף שאר האיברים המתואר בשלב 5.15.
  7. באזור נפרד, נתח בעדינות את הגידול באמצעות מספריים קטנים וחדים תוך החזקתו במלקחיים. כדי להגביר את המתיחות מבלי לפגוע בגידול, הצמד את עודפי העור למכסה באמצעות סיכות. הדבר יקל על הנתיחה.
  8. לאחר שהגידול נותח היטב, נקה אותו בעדינות עם PBS כדי להסיר דם, שיער ושאריות לא קשורות אחרות. שקול את הגידול.
  9. הנח רשת ניילון של 22 µm בשפופרת צנטריפוגה של 5 mL, הנח עליה בעדינות את הגידול, והשאר אותו על קרח עד לסבב בצנטריפוגה.
  10. סבב את השפופרת בצנטריפוגה ב-100 x g למשך 10 min ב-4 °C כדי לאסוף נוזל בינתי (ראה איור 5A). הנפח המתקבל נע בין 1 ל-20 µL, ולרוב צבעו דמוי אדום (איור 5B). העבר אותו לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 200 µL ואחסן ב- -80 °C עד לניתוח נוסף.
    הערה: ניתן לחתוך את שאר הגידול לחלקים קטנים יותר ולהניחם בשפופרות אחסון, להקפיאם במהירות בחנקן נוזלי ולאחסנם ב- –80 °C עד לניתוח נוסף.
  11. לאיסוף מח עצם, גזור את הרגל הימנית במספריים, נתח בעזרת סכין מנתחים ומלקחיים את ה-femur ואת ה-tibia כך שכל השרירים, רקמת החיבור והשומן יוסרו. גזור את האפיפיזה (epiphysis) משני צדי שתי העצמות בעזרת סכין מנתחים. הנח את העצמות הנקיות ב-PBS בצלחות תרבית של 12 בארות תוך השלמת איסוף האיברים של העכברים כפי שמתואר בשלב 5.15.
    הערה: פרטים מקיפים יותר על בידוד מח עצם פורסמו במקום אחר41.
  12. נקב את תחתיתן של שפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 500 µL בעזרת מחט 18 G, הכנס לתוכן את שתי העצמות, והנח את השפופרת בתוך שפופרת צנטריפוגה של 1.5 mL מלאה ב-400 µL של PBS.
  13. סבב את השפופרות בצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 1 min ב-4 °C. ניתן לראות משקע (pellet) של תאים בתחתית שפופרת ה-1.5 mL; כולם תאי מח עצם, בעוד שסטרומת מח העצם מעורבבת ב-PBS. שאב את כל העלייה (supernatant) (סטרומת מח העצם) לשפופרת אחסון נפרדת, הקפא את החומר במהירות בחנקן נוזלי ואחסן אותו ב- -80 °C.
  14. בעזרת מספריים, בצע חתך רוחבי מתחת לבית החזה בגובה הסרעפת, וגזור את עצם החזה (sternum) לאורך הציר האורכי שלה כדי לחשוף את הריאות והלב.
    הערה: אם נדרש לניתוח נוסף, ניתן לבצע כאן הוצאת דם מלא באמצעות תמיסת סלין.
  15. אסוף את כל האיברים הדרושים לניתוח ביו-מולקולרי והיסטולוגי. שקול אותם וגזור אותם לחלקים קטנים יותר כדי להקל על ניתוח ביו-מולקולרי עתידי. הקפא במהירות את כל השפופרות בחנקן נוזלי מיד לאחר חיתוך האיבר לחלקים קטנים, ולאחר מכן אחסן אותם ב- -80 °C.
  16. עבור הלב, הפרד את חוד הלב (apex) מהחלק העליון של הלב והנח אותו על תבניות פלסטיק מלאות ב-OCT. לאחר ההנחה ב-OCT, הנח אותו באיזופנטאן קר לפני הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואחסון ב- -80 °C.

6. ניתוח סטטיסטי

הערה: כל הניתוחים הסטטיסטיים והגרפים בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית ותוכנה לשרטוט גרפים, ובוצעו בהתאם להמלצות המדריך הסטטיסטי42.

  1. הנתונים המוצגים הם ממוצע ± SEM.
  2. השתמש באותו קנה מידה עבור כל הגרפים של קיצור שברי (fractional shortening).
  3. הצג כל יחידה ניסויית בודדת (עכבר) בכל גרף.
  4. בצע את מבחן Shapiro-Wilk כדי להעריך את נורמליות ההתפלגויות של כל קבוצה ניסויית, כאשר רמת המובהקות אלפא נקבעה ל-p = 0.05.
  5. להשוואה בין שתי קבוצות, השתמש במבחני Welch או Mann-Whitney, בהתאם לנורמליות ההתפלגות (מבחן Welch עבור התפלגויות נורמליות בשתי הקבוצות, ומבחן Mann-Whitney אם לאחת או לשתי הקבוצות התפלגויות שאינן נורמליות). בחר באפשרויות הדו-זנביות, עם רמת ביטחון של 95%.
  6. להשוואה בין יותר משתי קבוצות בנקודת זמן ספציפית אחת, קבע שוב אם התפלגויות הקבוצות הן נורמליות כבשלב 6.4. בצע ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו תיקון Holm-Sidak להשוואות מרובות אם ההתפלגות היא נורמלית.
    הערה: אם ההתפלגות אינה נורמלית, יש לבצע במקום זאת את מבחן Kruskal-Wallis עם תיקון Dunn להשוואות מרובות. סף האלפא המשפחתי נקבע ל-0.05 כדי לקבוע מובהקות.
  7. עבור נתונים אורך (longitudinal data), נעשה שימוש ב-ANOVA דו-כיווני עם מדידות חוזרות ולאחריו תיקון Sidak להשוואות מרובות כדי לבחון הבדלים בין קבוצות בנקודת זמן ספציפית. סף האלפא המשפחתי נקבע ל-0.05 כדי לקבוע מובהקות.

תוצאות

פרוטוקול זה, כפי שמוצג ב- איור 1Aהוא פרוטוקול של 5 שבועות שמוביל לקבוצות הניסוי הבאות: עכברים ללא גידול ללא טיפול ב-dox, עכברים ללא גידול שטופלו ב-dox, עכברים עם גידול ללא טיפול ב-dox, ועכברים עם גידול שטופלו ב-dox. ניתן להכפיל קבוצות אלו בהתאם לשאלה אם נעשה שימוש בשני המינים. השבועיים הראשונים של צמיחת הגידול, לפני תחילת הטיפול ב-Dox, מספיקים לצמיחת הגידול לאחר הזרקת 200,000 תאים לתוך ה-4th הבלוטה השדית השמאלית של בעלי החיים (איור 1Bיש לאשש את ההזרקה התת-עורית באמצעות הופעת בועה מתחת לפטמה בעת הזרקה עדינה של תרחיף תאי הגידול (איור 1C). טבלה 1 מסכם בקצרה את הפרמטרים המרכזיים של הפרוטוקול עבור כל זן עכבר, יחד עם התוצאים העיקריים שיידونو להלן.

איור 2A הוא תמונה מייצגת של אות הביולומינסנציה שהתקבל כאשר עכבר אחד ללא גידול (שמאל) ועכבר אחד עם גידול (ימין) הוזרקו בלוסיפרין, ופוטונים נאספו במשך 5 min. ניתוח זה דורש גידולים המבטאים את הגן luciferase כדי לייצר פוטונים עם הזרקת לוסיפרין. בסך הכל, 33 עכברי Balb/c שהוזרקו בתאי 4T1Luc נוטרו במשך 11 ימים באמצעות ביולומינסנציה, בעוד שנעשה שימוש ב-9 ביקורות. איור 2B מאשר כי הגידול גדל במהירות אך עוצמת האות מתחילה להגיע למישור (plateau) לאחר היום ה-8, ונראה כי קצב הצמיחה הראשוני של הגידול בנקבות מהיר יותר בהשוואה לעכברי Balb/c זכרים, כפי שמוצג באיור 2C. רק 1 מתוך 45 עכברי Balb/c לא פיתח גידול לאחר 5 שבועות, בעוד שכל עכברי C57Bl/6J פיתחו גידול לאחר 5 שבועות (איור 2D).

איור 3A  ו-איור 3B מדגימים כי הפחתה מצטברת במינון ה-Dox מובילה לשיפור בהישרדות 3 שבועות לאחר תחילת הטיפול ב-Dox: בעוד ששום עכבר Balb/c נושא גידול לא שרד במינון של 24 mg/kg, 50% שרדו במינון של 16 mg/kg. עם זאת, עכברי C57Bl/6J נושאי גידול עמידים יותר, אפילו במינון של 24 mg/kg של Dox, שכן >80% מהם שורדים 3 שבועות לאחר תחילת הכימותרפיה (איור 3D). למין הייתה השפעה משמעותית על התוצאה: נקבות הראו שיעורי הישרדות טובים בהרבה מזכרים בעכברי Balb/c (16 מתוך 29 נקבות שרדו בהשוואה ל-3 מתוך 16 זכרים). איור 3C מדגים את ההבדלים בין המינים בעכברי Balb/c שקיבלו 16 mg/kg של Dox (לא בוצע מבחן סטטיסטי בשל המספר הנמוך של הזכרים). בעכברי C57Bl/6J, לא נרשמו הבדלים מובהקים סטטיסטית בהישרדות בין שני המינים (ראו איור 3E).

תמונה מייצגת של תפקוד לבבי תקין בעכבר, שהוערך באמצעות אקו-קרדיוגרפיה לפני טיפול ב-Dox, מוצגת ב-איור 4A, ותמונה של עכבר עם תפקוד לבבי לקוי לאחר Dox מוצגת ב-איור 4B. כימות של FS במצב M-mode ב-17 עכברי C57Bl/6J עם גידולים שקיבלו 24 mg/kg של Dox מראה ירידה משמעותית לאחר שבועיים (59.3% לפני Dox לעומת 44.3% אחרי Dox, p < 0.0001, איור 4C). רק 1 מתוך 12 העכברים שנשרדו (8%) לא עמד בקריטריונים שהוגדרו מראש לרעילות לבבית. קצב הלב יורד באופן קל אך מובהק מ-623 BPM לפני Dox ל-569 BPM אחרי Dox (p < 0.05, איור 4D). כל הפרמטרים שכומימו באמצעות M-mode מופיעים ב-טבלה משלימה 3.

אישור להשפעה הקרדיוטוקסית של Doxorubicin התקבל באמצעות ניתוח מאקרוסקופי ומיקרוסקופי. איור 6A,B מדגים כי משקל הלב המוחלט פחת באופן משמעותי לאחר טיפול ב-Dox במספר קטן של עכברי Balb/c נקבה שומרי גידול ששרדו, אך נורמליזציה של משקל הלב למשקל הגוף הכולל מראה מגמה בלבד. בניסוי בעכברי C57Bl/6 ללא גידולים, מינון של 24 mg/kg של Dox השרא לשינויים צפויים ב-mRNA קרדיאלי של הגנים הבאים שבוע לאחר תחילת הטיפול ב-Dox: עלייה ב- Atrogin וב- Murf1, המעידה על אטרופיה; עלייה ב- NQO1, המעידה על סטרס חמצוני; ועלייה ב- Bax, המעידה על מצב פרו-אפופטוטי (איור 6C–F).

איור 5A הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הנוזל הבין-רקמתי של הגידול. תמונה מייצגת של הנוזל שנאסף מוצגת באיור 5B: הנפח שהתקבל הוא קטן.

figure-results-1
איור 1: איורים מייצגים של הפרוטוקול הניסויי. (A) סקירה סכמטית של הפרוטוקול הניסויי. נוצר באמצעות BioRender (מספר רישיון JE29USE7LU). (B) ייצוג סכמטי של הזרקת גידול תת-עורית. נוצר באמצעות BioRender (מספר רישיון SO29JHW7R6). (C) ייצוג סכמטי של השתלת גידול תת-עורית מוצלחת. נוצר באמצעות BioRender (מספר רישיון SO29JHW7R6). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דימות ביולומינסנציה ושיעור השתבשות הגידול. (A) תמונות ביולומינסנציה מייצגות של עכבר ביקורת (שמאל) ועכבר נושא גידול (ימין). (B) אות ביולומינסנציה לאורך זמן (mean ± SEM; repeated-measures two-way analysis of variance [ANOVA]; *P < 0.05). (C) השוואה בין אותות ביולומינסנציה בעכברי Balb/c זכרים ונקבות (mean ± SEM). (D) שיעורי הצלחת השתבשות הגידול בשני זני העכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח הישרדות של עכברים בעלי גידולים. (A) עקומת הישרדות קפלן-מייר של עכברי Balb/c שטופלו ב-24 mg/kg doxorubicin (Dox). (B) עקומת הישרדות קפלן-מייר של עכברי Balb/c שטופלו ב-16 mg/kg Dox. (C) עקומת הישרדות קפלן-מייר המשווה בין עכברי Balb/c זכרים ונקבות שטופלו ב-16 mg/kg Dox. לא בוצע ניתוח סטטיסטי בשל מספרם המוגבל של העכברים הזכרים. (D) עקומת הישרדות קפלן-מייר של עכברי C57BL/6J שטופלו ב-24 mg/kg Dox. (E) עקומת הישרדות קפלן-מייר המשווה בין עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות שטופלו ב-24 mg/kg Dox (מבחן log-rank, P = 0.86). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הערכה אקוקרדיוגרפית של רעילות לבבית המושרית על ידי דוקסורוביצין. (A) תמונה מייצגת של אקוקרדיוגרם במצב M-mode מעכבר בריא. (B) תמונה מייצגת של אקוקרדיוגרם במצב M-mode מעכבר עם רעילות לבבית המושרית על ידי דוקסורוביצין. (C) קיצור שברי (FS) בעכברי C57BL/6J לפני וב-14 ימים לאחר טיפול בדוקסורוביצין. (D) קצב לב (HR) בעכברי C57BL/6J לפני וב-14 ימים לאחר טיפול בדוקסורוביצין. הנתונים מוצגים עבור n = 17 עכברים. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות Welch's t-test. *P < 0.05; ****P ≤ 0.0001. קיצורים: FS, קיצור שברי; HR, קצב לב. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: פרוטוקול דגימת איברים. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול איסוף נוזל הבין-תאי מהגידול. נוצר באמצעות BioRender (מספר רישיון HV29USD91R). (B) תמונה מייצגת המראה איסוף של נוזל בין-תאי מהגידול במהלך דגימת איברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: רעילות לבבית מושרית על ידי Doxorubicin. (A) משקל הלב שנמדד 3 שבועות לאחר תחילת טיפול ב-16 mg/kg doxorubicin בעכברי Balb/c נושאי גידולים. (B) משקל לב מנורמל למשקל גוף כולל שנמדד 3 שבועות לאחר תחילת טיפול ב-16 mg/kg doxorubicin בעכברי Balb/c נושאי גידולים. (C) ביטוי mRNA של Atrogin בשריר הלב של עכברי C57BL/6J שבוע אחד לאחר תחילת טיפול ב-24 mg/kg doxorubicin. (D) ביטוי mRNA של Murf1 בשריר הלב של עכברי C57BL/6J שבוע אחד לאחר תחילת טיפול ב-24 mg/kg doxorubicin. (E) ביטוי mRNA של NQO1 בשריר הלב של עכברי C57BL/6J שבוע אחד לאחר תחילת טיפול ב-24 mg/kg doxorubicin. (F) ביטוי mRNA של BAX בשריר הלב של עכברי C57BL/6J שבוע אחד לאחר תחילת טיפול ב-24 mg/kg doxorubicin. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות Welch's t-test או מבחן Mann–Whitney U, בהתאם להתפלגות הנתונים. ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

זן עכבריםBalb/cC57Bl/6J
קו התאים שנעשה בו שימוש4T1LucPY8119
כמות התאים שהוזרקו200 000200 000
מין שנעשה בו שימושזכר ונקבהזכר ונקבה
מספר ימי ההזרקה46
מינון יומי4 mg/kg4 מ"ג/ק"ג
מינון מצטבר של דוקסורוביצין16 mg/kg24 מג/ק"ג
מינון קטמין40 mg/kg80 mg/kg
שכיחות רעילות לבבית>90%>90%
שיעור הישרדות19/4516/19

טבלה 1: פרמטרי פרוטוקול מרכזיים עבור כל זן עכבר. השוואה של המשתנים הניסויים העיקריים וריכוזי הרכיבים שנעשה בהם שימוש בפרוטוקולים לעכברי Balb/c ו-C57BL/6J.

טבלה נספחת 1: נקודות סיום לרווחת בעלי חיים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה נלווית 2: סקירה ספרותית של פרוטוקולים ניסיוניים עבור 4T1. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 3: פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים שנמדדו ב-M-mode ב-17 עכברי C57BL/6J עם גידולים שטופלו ב-24 mg/kg doxorubicin. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כאן פותח מודל של רעילות לבבית המושרית על ידי דוקסורוביצין בעכברים הנושאים גידול שאיreי, אשר נחשב בעל רלוונטיות קלינית גבוהה למחקרים עתידיים בתחום הקרדיו-אונקולוגיה. המטרה הייתה לחקות את המצב הקליני של מסלול המטופל, מרגע הגעתו לבית החולים עם אבחנה של סרטן ועד לטיפול בכימותרפיה בעלת פוטנציאל לרעילות לבבית. הפרוטוקול עוקב אחר עיצוב פרגמטי ומשתמש בעכברים בעלי מערכת חיסונית תקינה הזמינים ברחבי העולם, ובכך מאפשר לצוותים אחרים לשחזר אותו במעבדות אחרות. שיעור ההצלחה הגבוה של השתלת הגידול הופך אותו למועמד חזק למחקרי רעילות קרדיו-אונקולוגיים עתידיים.

מכשולים נפוצים בפרוטוקול זה כוללים ביצוע אקו-קרדיוגרפיה בעכברים בעלי קצב לב נמוך, דבר שעלול להוביל לערך נמוך באופן מלאכותי של הקיצור השברי (FS). מתן אפשרות לעכברים להתאושש מההשפעות הכרונוטרופיות השליליות הראשוניות של חומרי ההרדמה לפני ההערכה האקו-קרדיוגרפית מסייע בהבטחת מדידות FS מדויקות. בעכברי Balb/c, ייתכן שיהיה צורך בהפחתה נוספת של מנת ההרדמה אם שיעורי התמותה נשארים גבוהים. אותו נסיין צריך לבצע את כל ההערכות האקו-קרדיוגרפיות לאורך המחקר, כיוון ששונות בין בוחנים עשויה להיות משמעותית43. בהשתלת גידולים, נסיגת המזרק במהלך ההזרקה עלולה ליצור גידול בצורת קו, אשר עשוי לגדול יותר מגידולים שנוצרו בהזרקה נכונה. הזרקה לפטמת השד הנכונה היא קריטית אף היא, שכן מיקום בפטמה העליונה של הבטן עלול להפריע להערכה האקו-קרדיוגרפית בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות הגידול. מומלץ לבצע ספירה ידנית של התאים בתמיחה וערבוב יסודי לפני ההזרקה כדי להבטיח שכל עכבר יקבל מספר תאים דומה, ובכך לצמצם את השונות בגודל הגידול בסוף הפרוטוקול. כאשר נדרשת דגימת דם שבועית, יש לשלוט בקפידה בנפח הנאסף כיוון שהעכברים הופכים לשבירים יותר בעקבות טיפול ב-doxorubicin. מומלץ נפח דם כולל מקסימלי של 50 µL בכל נקודת זמן של דגימה, שכן נפחים גדולים יותר עלולים להגביר את התמותה במהלך הפרוטוקול. תדירות ונפח איסוף הדם צריכים לעמוד גם בדרישות אתיקה מקומיות לבעלי חיים ובהנחיות המתקן המוסדי לבעלי חיים. החלפת נפח הדם שנדגם בנפח שווה של סליין שיוגש תת-עורית יכולה לסייע בפיצוי על אובדן נוזלים לאחר איסוף הדם.

כדי להשוות פרוצדורת Dox זו, סקירה שפורסמה לאחרונה על מודלים של בעלי חיים ל-AIC מצאה כי רוב המודלים הפרה-קליניים (88%) השתמשו בהזרקות חוזרות של Dox ומדידות תוצאות (לעיתים קרובות באמצעות echocardiography) מספר שבועות לאחר מכן29. ברוב המאמרים דווח על שימוש בזן C57Bl/6J (73.8%), ככל הנראה בשל חוסנו ועלותו הנמוכה29. למרבה הצער, מספר משמעותי של מחקרים התעלם מההשפעה של גידול על הביולוגיה של בעל החיים לפני הזרקת ACs17,29. רק 46 מתוך 736 מחקרים דיווחו על מודלים נושאי גידול, 12 מהם השתמשו בקו התאים 4T1 (סרטן שד דמוי triple-negative) בעכברי Balb/c, ורק אחד היה מודל של סרטן שד בעכברי C57Bl/6J (ליתר דיוק, סרטן שד דמוי EGFR2-positive)29. מחקר אחר השתמש ב-C57Bl/6J עם סרטן שד דמוי EGFR-2-positive, אך לא אפשר לצמיחת הגידול להתרחש לפני תחילת הכימותרפיה, דבר המגביל את ההיבט התרגומי של מודל זה32.

מודלים של קסנוגרפט (Xenograft) המשתמשים בעכברים עם חסר חיסוני מאפשרים שימוש בקווי תאי גידול אנושיים אך חסרים מערכת חיסונית תפקודית, דבר המגביל את חקר המנגנוים של רעילות לבבית המתווכת על ידי מערכת החיסון ומהווה מגבלה משמעותית בהינתן הרלוונטיות הגוברת של רעילות לבבית הקשורה למעכבי נקודות בקרה חיסוניות. מודלים של בעלי חיים גדולים מתחילים להופיע בתחום הקרדיאו-אונקולוגיה, אך תמיד יהיו להם החסרונות של עלות גבוהה ויכולת הנדסה גנטית מוגבלת44. מערכות In vitro ומערכות אנושיות מבוססות תאים בדו-ממד או תלת-ממד (למשל, קרדיומיוציטים המופקים מ-iPSC אנושי, אורגנואידים של הלב) מאפשרות סריקה מכניסטית וטוקסיקולוגית בתפוקה גבוהה, אך אינן יכולות לשחזר את הפיזיולוגיה המשולבת של האורגניזם השלם (המודינמיקה, ויסות נוירוהורמונלי, תקשורת חיסונית) הנלכדת במודלים של in vivo. בהשוואה לגישות אלו, מודל סינגנאי זה, בעל מערכת חיסונית תקינה ונושא גידול, מציע הקשר רלוונטי יותר מבחינה קלינית לחקר האינטראקציה בין עומס הגידול לרעילות לבבית המושרה על ידי כימותרפיה, וזאת במחיר של שונות ביולוגית גדולה יותר, שיעורי תמותה גבוהים יותר בזנים מסוימים ותפוקה נמוכה יותר מאשר במודלים פשוטים יותר של in vitro או מודלים של in vivo שאינם נושאי גידול.

מודלים של רעילות לבבית על ידי AC ללא גידולים, שנעשה בהם שימוש רב עד כה, מציעים הדירות גבוהה, עלות נמוכה והערכות קלות יותר של הישרדות ואקו-קרדיוגרפיה, אך אינם לוכדים את ההשפעות הסיסטמיות של נטל הגידול, דלקת הקשורה לסרטן וקכקסיה על הלב, אשר מזוהות יותר ויותר כגורמים מתערבים רלוונטיים לרעילות לבבית בחולים17,45. יתרה מכך, תכנות מחדש מטבולי של הלב, ולפיכך תפקודו המכווץ, עלול להשתנות על ידי אונקומטבוליטים מופרשים, כגון D-2-hydroxyglutarate או succinate14. לכן, אם ברצוננו לבנות מודל קרדיו-אונקולוגי לצורך ניתוח ביוכימי של הלב באמצעות שיטות omics שונות (פרוטאומיקה ומטבולומיקה, למשל), נוכחות הגידול לפני כימותרפיה היא חיונית. קיימות גם ראיות לכך שהגידול כשלעצמו יכול להוביל לתפקוד לבבי לקוי גלוי, אם כי הדבר אינו עקבי בספרות. בעוד שחלק מהמודלים הדגימו השפעה מזיקה של הזרקת הגידול על FS או על פרמטרים של הולכה חשמלית, אחרים מצאו כי נוכחות הגידול הגנה על עכברים מפני העיצוב מחדש (remodeling) המושרה על ידי היצרות אאורטלית רוחבית11,13,46. בעלי חיים ללא גידולים נחוצים אף הם, בהתאם להיפותזה המוקדמת. הם מהווים את המסגרת היחידה שבה ניתן לבודד את ההשפעה הקרדיוטוקסית הישירה של הסוכן הכימותרפי מההשפעה המתערבת של הגידול עצמו, תנאי מוקדם חיוני לביסוס סיבתיות והבהרת מנגנוני פעולה ספציפיים לתרופה. בעלי חיים אלה ישמשו כביקורות להשפעת הטיפול נגד הסרטן ולאינטראקציה שלו עם הגידול על הרעילות הלבבית. ללא השוואה זו, יהיה בלתי אפשרי להבחין איזה מרכיב בפנוטיפ הלבבי שנצפה מיוחס לתרופה, לגידול, או לאינטראקציה ביניהם. הבחנה זו קריטית לא רק להבנה מנגנונית אלא גם לתכנון רציונלי של אסטרטגיות להגנה על הלב. לכן חשוב להכיר בכך שכל אחד מהמודלים הללו עונה על שאלות מדעיות נפרדות ומשלימות, וששום מודל לבדו אינו מספיק כדי לשחזר באופן מלא את המורכבות של קרדיו-אונקולוגיה קלינית; שימוש משולב או רצפי בשני המודלים נדרש לעיתים קרובות כדי להגיע למסקנות מנגנוניות וטרנסלציונליות חסונות.

בפרוטוקול זה, רעילות לבבית הוגדרה בהתאם להנחיות ה-ESC לשנת 2022 בתחום הקרדיאו-אונקולוגיה, המגדירות תפקוד לבבי לקוי במידה מתונה ללא תסמינים הקשור לטיפול בסרטן כהפחתה בסינון פליטה של החדר השמאלי (LVEF) של >10% עם LVEF שבין 40% ל-49%16עם זאת, כימות מדויק של LVEF דורש מודול תלת-ממדי במכשיר האולטרסאונד39על מנת למנוע הערכה שגויה של תפקוד סיסטולי של הלב, ולשמור על פרוטוקול פשוט שניתן ליישם במעבדות המשתמשות במכשירי אולטרסאונד ישנים יותר, הועדף להשתמש ב-FS כסמן לתפקוד לבבי לקוי, שניתן להשיגו באופן מדויק וקל באמצעות ניתוח במצב M (M-mode) בעכברים, על פי אותם קריטריונים שהגדירה ה-ESC. בשימוש בפרוטוקול זה, 90% מהעכברים ששרדו עומדים בקריטריונים לרעילות לבבית (cardiotoxicity), מה שהופך אותו למועמד חזק למחקרי תרגום (translational studies) עתידיים. ההשפעה הרעילה של Dox על הלב אוששה באמצעות הערכה מאקרוסקופית (ירידה במשקל הלב) בעכברי Balb/c. במחקר זה לא נכללה קבוצה של עכברי C57Bl/6 עם גידול בלבד; לפיכך, עדיין אין השוואה רלוונטית לזן זה. יתרה מכך, בעכברי C57Bl/6 ללא גידול, מינון ה-Dox เหนהה שינויים העולים בקנה אחד עם ספרות קודמת בנוגע למנגנוני רעילות לבבית של אנתרצקלינים: עלייה בניוון (atrophy), עקה חמצונית ואפופטוזיס.19,20.

עם זאת, משתנים מודרניים יותר המשמשים בבני אדם, כגון speckle-tracking global longitudinal strain (GLS), לא נמדדו כאן מסיבות טכניות. אם הדבר אפשרי באופן מקומי, למדידת GLS יהיה ערך מוסף, שכן היא נחשבת בדרך כלל לרגישה יותר לזיהוי נזק לבבי מוקדם23. ניתן להעריך גם סמנים ביולוגיים לבביים במחזור הדם, כגון טרופונין, כדי לשפר את הוודאות של זיהוי רעילות לבבית; עם זאת, כמות הפלזמה הנדרשת באופן מסורתי לניתוחים אלה בעכברים עשויה להוות גורם מגביל בשל נפח הדם הכולל הנמוך של בעלי חיים אלה. יתרה מכך, השבריריות של בעלי חיים אלה לאחר טיפול ב-Dox עלולה להעלות את שיעורי התמותה במהלך או לאחר דגימת דם. גורם מגביל אחרון הוא הרגישות של בדיקות אלו לסממנים ביולוגיים כאלה, אשר לעיתים קרובות עלולה להקשות על הפרשנות.

אף על פי שכל רכישות האולטרסאונד בוצעו על ידי אותו חוקר מנוסה, נצפתה שונות שבועית גבוהה באותם עכברי Balb/c, גם ללא טיפול. ניתן להסביר זאת ברגישות של זן זה להרדמה בקטמין47. ואכן, בתחילה נצפו שיעורי תמותה גבוהים במהלך הליכים תחת הרדמה, שהובילו למספר נמוך של בעלי חיים שהגיעו לסוף הפרוטוקול, מה שהוביל להפחתת מנת הקטמין ששימשה מ-80 mg/kg ל-40 mg/kg עבור עכברי Balb/c. במבט על גרפי ההישרדות של Balb/c עם Dox, ניתן לראות כי חלק מהתמותה מתרחשת בנקודת ההרדמה (אקו-לב שבועי), אך מרבית מקרי המוות מתרחשים במכלה לבעלי חיים ללא כל הליך פעיל, מה שמדגיש כי Dox הוא הגורם העיקרי לתמותה בעכברים אלו. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את המוות הקשור להרדמה בעת פירוש גרפי הישרדות עבור מודל זה כאשר משווים בין שני זנים או יותר. כדי להפחית את הסיכון למוות הקשור להרדמה, ניתן לבצע אקו-לב בעכברים בהכרה, אך הדבר דורש אימון והסתגלות לפני הכללת העכברים בפרוטוקול. בנוגע ל-Dox, אפילו במינונים מופחתים, כמעט מחצית מעכברי ה-Balb/c לא הגיעו לסוף הפרוטוקול. ניתן לנסות להשריץ קרדיוטוקסיות עם מינונים נמוכים עוד יותר של Dox, תוך סיכון להפחתת מספר בעלי החיים העומדים בקריטריונים לקרדיוטוקסיות. אסטרטגיה נוספת עשויה להיות מתן זמן רב יותר לבעל החיים להתאושש לאחר כל הזרקת Dox; פעולה זו לא בוצעה כאן, אך קיימות ראיות לשיפור בהישרדות בספרות29.

התצפיות שנעשו במהלך בניית מודל זה, לפיהן עכברי Balb/c רגישים יותר ל-Dox מאשר עכברי C57Bl/6J, ושנקבות עמידות יותר ל-Dox מאשר זכרים, עולות בקנה אחד עם ספרות קודמת29. יתרה מכך, התוצאות הדומות והניתנות לשחזור שהושגו בשני זני העכברים מאשרות עוד יותר את חסונו של המודל המוצע. על ידי הגעה למינונים מצטברים גבוהים באמצעות מינונים יומיים גבוהים באופן מתון לאורך תקופה קצרה, הושגו שיעורים גבוהים של רעילות לבבית לצד שיעורי הישרדות גבוהים. בניית מודל לסרטן השד (PY8119 הוא סרטן שד דמוי טריפל-נגטיב) ב-C57Bl/6J תהיה בעלת תועלת רבה למחקרים עתידיים, שכן עכברים אלו מייצגים את אחד הרקעים הגנטיים העיקריים למודלים טרנסגניים34. שיעור ההצלחה הגבוה של הזרקת הגידולים, התומך ביעילות שיטת ההזרקה שנבחרה, הוא מבטיח גם הוא עבור מודל זה. כמו כן, הסבילות הגבוהה ל-Dox של עכברים אלו פותחת פתח למחקרים ארוכים יותר עם אתגרי Dox חוזרים כדי לדמות את המצב הקליני השכיח של סרטן משני או גרורות. לבסוף, פרוטוקול דגימת האיברים מוביל לאיסוף של כל האיברים המוצקים, הגידולים והנוזל הבין-רקמתי שלהם, וכן מח עצם והסטרומה שלו, מה שמאפשר ניתוח יסודי מאוד של המודל.

למודל זה יש מספר מגבלות. בשל תכנונו הפרגמטי וכדי להימנע מניתוח פולשני, לא ניתן לשלוט במדויק במיקום הגידול (כלומר, בבלוטת החלב הנכונה ולא ברקמה שומנית תת-עורית) באמצעות הזרקה תת-עורית, דבר שעשוי להיות בעל חשיבות רבה בהתאם לשאלה המדעית הנחקרת48. אם נדרשת הזרקה מדויקת לאתר הסרטן, ניתוח נרחב יותר עשוי להתאים יותר לביצוע הזרקה אורתוטופית, אם כי נראה כי הדבר בעל חשיבות ממשית בעיקר אם מתוכנן ניתוח ביוכימי של הגידול, מכיוון שהנפח, זמן החضانה והשכיחות מראים תוצאות דומות ללא קשר לשיטת ההזרקה48. ניתן גם לטעון כי שימוש ב-ACs בלבד אינו נמצא במתאם מושלם עם המצב הקליני, שבו מטופלים מקבלים לעיתים קרובות משטרי שילוב, לדוגמה, cyclophosphamide או cisplatin. זה אכן יכול להיות התכנון הבא לפרוטוקול זה; עם זאת, יש לבצע בקפידה התאמה של המינון עבור כל טיפול כימותרפי המשמש. יתרה מכך, שיעור תמותה של מעל 50% בעכברי Balb/c שלושה שבועות לאחר תחילת הטיפול ב-Dox נותר גבוה מאוד; הפחתת המינון עשויה לשפר את ההישרדות, אולי על חשבון רעילות לבבית פחות בולטת. כמו כן, בנוגע למינונים המשמשים במודל זה, יש לציין שהם גבוהים מאלו המקובלים כיום בבני אדם, דבר שעשוי להגביל את הפוטנציאל התרגומי של מודל זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים ביחס למאמר.

תודות

תודה לצוות מתקן בעלי החיים על עזרתם בניטור היומי של רווחת בעלי החיים. תודה ל-Léanne Borges, Elias Ait Assa ו-Clémence Chabaud על העזרה בבניית הפרוטוקול לבעלי החיים. על תרומת תאי ה-PY8119, תודה ל-Dr Julie Helft מיחידה 932 של INSERM. תודה מיוחדת ל-Dr Sylvain Provost ולסטודנט שלו, Mel Gavens, על עזרתם בנושא הביולומינסנציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי 4T1LucATCCCRL-2539
אבקת דוקסורוביצין (Doxorubicin)קליניסיינס23214-92-8
מכשיר אקו-קרדיוגרףVisual SonicsVEVO LT-200
לוציפריןPerkin Elmer E1605
רשת ניילוןMerckNY2002500
PhotonImager Optimaמעבדת BioSpace
תאי PY8119מתנה מד"ר ג'ולי הלפט (Julie Helft)

מקורות

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל קרדיו-אונקולוגירעילות לבבית הנגרמת מאנתרציקליניםעכברים עם גידול שדטיפול ב-Doxorubicinאולטרסאונד לבביביולומינסנציה של גידולתפקוד החדר השמאליעכברים נושאי גידולרעילות לבבית פרה-קלינית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.